Summary
Hier beschrijven we een protocol voor het uitvoeren van de cisterna magna cannulation (CMc), een minimaal invasieve manier om verklikstoffen, substraten en signalering moleculen in de cerebrospinale vloeistof (CSF). In combinatie met de verschillende beeldvormende modaliteiten, kan CMc glymphatic systeem en CSF dynamics beoordeling, zowel als hersenen bestrijkende levering van verschillende verbindingen.
Abstract
Cisterna magna cannulation (CMc) is een eenvoudige procedure die het mogelijk directe toegang tot de cerebrospinale vloeistof (CSF) zonder operatieve schade aan de schedel of de hersenen parenchym maakt. Bij narcose knaagdieren kan de blootstelling van de dura mater door botte dissectie van de nekspieren het inbrengen van een canule in de cisterna magna (CM). De canule, samengesteld door een fijne schuine naald of borosilicaat capillaire, is via een buis van polyethyleen (PE) aan een spuit gekoppeld. Met behulp van een spuitpomp, kunnen moleculen vervolgens worden geïnjecteerd op gecontroleerde tarieven rechtstreeks in de CM, die continu met de subarachnoïdale ruimte. Van de subarachnoïdale ruimte, kunt wij CSF fluxen traceren door convectie stroom in de ruimte van de gerelateerde rond doordringende arteriolen, waar de opgeloste uitwisseling met de interstitiële vloeistof (ISF) optreedt. CMc kan worden uitgevoerd voor acute injecties onmiddellijk na de operatie, of chronische implantatie, met later injectie in narcose of wakker, vrij bewegende knaagdieren. Kwantificatie van tracer distributie in de hersenen parenchym kan worden uitgevoerd door epifluorescence, 2-foton microscopie en magnetische resonantie beeldvorming (MRI), afhankelijk van de fysisch-chemische eigenschappen van de geïnjecteerde moleculen. Dus, CMc in combinatie met verschillende beeldvormingstechnieken biedt een krachtig instrument voor de beoordeling van het stelsel van glymphatic CSF dynamiek en functie. Bovendien, CMc kan worden gebruikt als een kanaal voor snelle, hersenen bestrijkende levering van signalering van moleculen en metabole substraten die de bloed-hersenbarrière (BBB) anders niet kunnen overschrijden.
Introduction
Cerebrospinale vloeistof (CSF) baadt het centrale zenuwstelsel (CNS) gedurende de ventriculaire systeem en langs de subarachnoïdale ruimtes, een anatomisch gedefinieerde ruimte in continuüm met de ventrikels, die rondom de hersenen en het ruggenmerg. Een van de hoofdfuncties van het CB is bedoeld als een route voor goedkeuring van de metabolieten en opgeloste stoffen uit de hersenen parenchym. Goedkeuring wordt bevorderd via de recent ontdekte glymphatic systeem1, de hersenen analoog naar de perifere lymfatisch systeem. Hierin, we beschrijven en bespreken de cisterna magna cannulation (CMc), een minimaal-invasieve methode voor de rechtstreekse levering van moleculen in het CB. De CMc is de belangrijkste methode voor het bestuderen van de glymphatic functie. CMc kan bovendien ook worden toegepast voor de studie van CSF dynamiek en voor een snelle, hersenen bestrijkende levering van niet-blood-brain barrière (BBB) permeabele moleculen in de hersenen parenchym, langs de gerelateerde ruimte.
De CMc exploiteert fysiologische principes van CSF dynamiek van het verkeer door middel van het centraal zenuwstelsel aan het leveren van gelabelde tracer moleculen of drugs in de CSF gevulde ruimte van de cisterna magna (CM). Moleculen zijn ingespoten via een canule de Atlantisch-occipitale dural membraan bekleding die de CM.-moleculen dan door CSF bulk stroom in de hersenen parenchym via de paravascular ruimte1 gedragen wordeningeplant. Tracer of contrast agent geïnjecteerd via de CMc volgt de beweging van CB, waarmee de beoordeling van CSF beweging en glymphatic instroom door de intensiteitsniveaus van gelabelde moleculen die worden ingevoerd door de hersenen parenchym kwantificeren. De CMc is compatibel met verschillende beeldvormingstechnieken, inclusief epifluorescence, 2-foton microscopie en magnetische resonantie beeldvorming (MRI). Ook deze evaluatie kan worden uitgevoerd zowel in vivo of ex vivo. Bovenal zorgt CMc voor de visualisatie van het systeem van de glymphatic onder anesthesie of tijdens de natuurlijke slaap, evenals in wakker, vrij bewegende dieren.
De CMc-techniek kan worden gebruikt om verschillende aspecten van fluid dynamics in het CB studeren, maar heeft bewezen te zijn met name handig voor het bestuderen van het glymphatic-systeem. Glymphatic activiteit rijdt de convectie stroom van CB van de periarterial ruimte via aquaporin-4 (AQP-4) water kanalen, die in het membraan van astrocytic vasculaire-inwikkeling endfeet worden aangebonden. De convectie stroom maakt de uitwisseling van CB en interstitiële vloeistof (ISF) binnen de hersenen parenchym. CSF/ISF met metabolische afval en opgeloste stoffen wordt vervolgens verwijderd uit de hersenen parenchym via de perivenous ruimte2,3. Uiteindelijk bereikt de CSF/ISF de periferie via het recent beschreven dural lymfevaten4,5. Het glymphatic systeem is cruciaal voor de goedkeuring van schadelijk afval metabolieten zoals amyloid-β2aangetoond. Verder is de glymphatic klaring verminderde in veroudering6, na traumatische hersenen letsel7, en in dierlijke modellen van diabetes8 en9van de ziekte van Alzheimer. Glymphatic activiteit is met name afhankelijk, tonen beduidend hogere activiteit tijdens de slaap of anesthesie in vergelijking met wakkerheid1staat. Inderdaad, jonge narcose dieren vertonen de hoogste glymphatic-activiteit. Experimentele kwantificering van glymphatic activiteit is dus kritisch bij de studie van haar rol in gezondheid en ziekte.
Verschillende studies hebben aangepakt CSF dynamiek en de gegevensuitwisseling met interstitiële vloeistof (ISF) in de hersenen parenchym. De methoden waarmede gelabelde moleculen worden geleverd zijn echter tamelijk invasieve, triggering parenchym hersenbeschadiging en veranderingen in de intracraniële druk (ICP) (Zie review10). Voorbeelden hiervan zijn intraventricular of intraparenchymal injecties waarbij craniotomy of boren van een burr gat in de schedel. Deze procedures hebben aangetoond dat het ICP, aldus verstoren glymphatic functie2wijzigen. Ook, dergelijke invasieve methoden induceren astrogliosis en AQP-4 immunoreactivity in de hersenen parenchym beschadigd gebied en haar omgeving11,12te verhogen. Zoals astrocyten en AQP-4 sleutelelementen van het glymphatic-systeem zijn, is de CMc de methode van keuze voor haar studies. De belangrijkste voordelen van CMc in vergelijking met meer invasieve procedures zijn de handhaving van een intact schedel en hersenen parenchym, vermijden van ICP wijzigingen en astrogliosis, respectievelijk. Dus, opent CMc in combinatie met verschillende imaging tools voor een breed scala aan mogelijkheden om te studeren het glymphatic systeem, maar ook de dynamiek en de mechanismen van vloeistofstromen in homeostase, evenals in diermodellen van neurologische aandoeningen.
De cisterna magna cannulation (CMc) procedure biedt gemakkelijke en directe toegang tot de cerebrospinale vloeistof (CSF). Door het injecteren van verschillende moleculen (bijvoorbeeld TL verklikstoffen, MRI-contrastmiddelen) kan de experimentator hun beweging binnen de CSF compartiment te volgen en de activiteiten beoordelen van het glymphatic-systeem. Het volgende protocol beschrijft zowel de acute CMc, voor injecties onmiddellijk na de chirurgie en chronische innesteling van de canule, waarbij het dier van de chirurgische ingreep voor een latere injectie herstelt. Het belangrijkste verschil tussen de acute en chronische implantatie is dat de chronische implantatie voor de studie van glymphatic activiteit in wakker muizen toestaat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures werden uitgevoerd overeenkomstig de Europese richtlijn 2010/63/EG voor dierlijke onderzoek en goedgekeurd door de Raad van dier experimenten onder het Deense Ministerie van milieu en de voedselveiligheid (2015-15-0201-00535).
1. procedure voor de Cannulation
- Voorbereiding van de canule
Opmerking: Raak de canule met niet-steriele handschoenen.- Breek af het schuine metalen uiteinde van een 30G tandheelkundige naald met behulp van een naald houder.
- De canule met behulp van een naald houder, bereid door de afgeschuinde metalen tip (ongeveer 0,3 cm) invoegen in een lengte van 30 cm van PE10 buis (polyethyleen slang 0.024" OD x 0.011" ID) gevuld met aCSF (126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4 , 2 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, glucose van 10 mM, 26 mM NaHCO3; pH 7.4 wanneer vergast met 95% O2 en 5% CO2).
- Spoel de canule met behulp van een spuit van 1 mL uitgerust met een naald 30G (30 G x ½" 0.3 x 12) aCSF.
-
Chirurgische ingreep
Opmerking: De chronische CM cannulation maakt het mogelijk de dieren om te herstellen van de chirurgische ingreep. CM injecties zijn gemaakt de dag na implantatie van de canule en, nog belangrijker is, kunnen worden uitgevoerd in narcose of wakker dieren. Aangezien dit een herstel operatie, moeten de procedures worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden.- Weeg de muis (C57BL/6JRj, beide geslachten, 8 weken) en het anesthetize met een mengsel van ketamine en xylazine (100 mg/kg; 10 mg/kg, respectievelijk) via intraperitoneaal (i.p.) injectie. Indien nodig, redose de muis met een halve dosis van ketamine (50 mg/kg) gedurende de chirurgische ingreep. Als alternatief voor chronische cannulation, anesthetize muis door deze te plaatsen in een Isofluraan inductie kamer op 2,5-3% Isofluraan, in circa 1 L/min O2. In dat geval kunt een neus kegel Isofluraan anesthesie bij 1.5-2% gedurende de operatie ondersteunen.
- Wanneer teen snuifje staken reflexen en de ademhaling langzame en gestage wordt, plaats het dier in een stereotaxic frame boven een verwarming pad.
- Ophthalmic zalf toepassen. Tijdens de operatie indien nodig herhalen
- Scheren van het hoofd en de nek van de muis, verwijderen van bont en steriliseren van de blootgestelde huid eerst met een alcohol doekje en klik vervolgens twee keer met chloorhexidine (0,5%) of jodiumoplossing (2%). Herhaal de sterilisatie nog tweemaal.
Opmerking: Wijzig de chirurgische gordijn voor het verwijderen van puin en haren na het scheren. Vervolgens drape het dier ter bescherming van de steriele veld. - Beheren voor de chronische cannulation, 0,5 - 1 ml lidocaïne/bupivacaine (1 mg/ml en 0,25 mg/ml, respectievelijk) subcutaan (SC) op de site van de snede. Buprenorfine (0,05 mg/kg; s.c.) voor post chirurgische analgesie beheren.
- Corrigeer de muis in het stereotaxic frame. Als u zeker bent van fixatie, hetzij intraural of door het jukbeen boog, kantel het hoofd lichtjes zodat het vormt een hoek van 120° met het lichaam (figuur 1E).
- Vind het deel van de schedel uitsteken onmiddellijk boven de nekspieren - de occipital kuif. Til de bovenliggende huid met behulp van een pincet, en snijd een amandel gevormde stukje huid van ongeveer 1 cm langs de middellijn. Gebruik katoenen wissers of oog spears om te controleren elke resulterende bloeden.
- Met behulp van de occipital crest als referentiepunt, trek het oppervlakkige bindweefsel om de onderstaande nekspieren bloot te stellen uit elkaar.
- De spieren aan de middellijn scheiden door de verlostang zorgvuldig uit te voeren in het midden van de site van de incisie in de anterior-posterior-as. Met een paar van gebogen verlostang in elke hand, Word lid van de tips in het midden in de buurt van de onderkant van de schedel en trekken de spieren opzij.
Opmerking: Dit moet de CM, die wordt weergegeven als een kleine omgekeerde driehoek, geschetst door het cerebellum boven en de medulla hieronder achter het doorschijnende dural membraan (figuur 1B en 1 C) bloot. - Met behulp van een chirurgische oog speer of katoenen doekje, veeg het dural membraan die betrekking hebben op de CM.
-
Inbrengen van de canule in de CM
- Verwijder de canule uit de aCSF gevulde spuit, de 30G naald gekoppeld aan het achterste uiteinde van de buis te houden.
- Bevestig de naald 30G aan een gedestilleerd water gevulde 100 µL spuit aangesloten op een spuitpomp.
- Plaats een luchtbel van ongeveer 1 cm in de canule door intrekking van de lucht met behulp van een spuitpomp.
- Met behulp van een spuitpomp, trekken 12 μL van gewenste CSF tracer in de canule.
- Pak de canule, gevuld met de CSF-tracer, in de buurt van de buis bedekte naald met een gebogen pincet in de dominante hand gehouden. De middelvinger van de niet-dominante hand op de bar van het oor van de overkant rusten en houd het gestage voor later gebruik als een rust voor de canule.
- Plaats de canule onder een hoek van 45° ten opzichte van het hoofd van de muis, passeren in het midden van de CM, geïdentificeerd door zijn driehoekige aspect gezien door de dura. Vermijd elke penetratie van het cerebellum of medulla. Controleer of de naald alleen tot een diepte van 1-2 mm, dat wil zeggen tot het punt waar de schuine rand volledig onder de dura is is geplaatst. Laat de pincet houden de canule en laat de canule stilhoudt boven de niet-dominante hand.
Opmerking: De schuine einde van de dentale naalden vergt de toepassing van enige kracht te doorboren het dural membraan die betrekking hebben op de CM. - Indien nodig drogen uit elke CSF lek bij penetratie met behulp van een chirurgische oog speer of katoenen wissers.
- Drop 2-3 druppels voor Cyanoacrylaat lijm op het dural membraan rondom de canule. Voeg een druppel lijm versneller te genezen van de lijm onmiddellijk. Dekking van de schedel en de naald met een mengsel van tandheelkundige cement (ongeveer 0.5 mg) en Cyanoacrylaat lijm (3-5 druppels). Onmiddellijk daarna toepassing een druppel lijm versneller te genezen.
- Voor chronische cannulation, gesneden van de buis (vertrekt ongeveer 2-3 cm op de canule aangesloten) en verzegel het met een chirurgische Las te behouden van de intracraniële (ICP) drukniveaus, door het voorkomen van CSF lekkage via de buis.
- Voor chronische cannulation, beheren carprofen (5 mg/kg; s.c.)
- Voor chronische cannulation, plaatst u de muisaanwijzer in een kooi, houden het over een verwarming pad om te handhaven lichaamstemperatuur totdat het dier is volledig hersteld van de verdoving.
Opmerking: De dieren moeten afzonderlijk worden gehuisvest in hun kooi om te verzekeren dat de canule intact blijft. Zorg ervoor dat de neus van beddengoed duidelijk door het plaatsen van de muis op een papieren handdoek of andere stevige ondergrond.
Opmerking: De volgende dag, wanneer de dieren zijn hersteld van de chirurgische ingreep uitgevoerd voor het inbrengen van de canule, ze kunnen worden geïnjecteerd met CSF verklikstoffen. Voor injectie onder verdoving, het beheren van een mengsel van ketamine/xylazine (100 mg/kg; 10 mg/kg, respectievelijk; i.p.) en gaat u verder met de stappen die worden beschreven in sectie 2. Voor injectie in wakker dieren, gaat u verder met sectie 3.
2. injectie van CB Tracers via Acute geïmplanteerde CM canule in narcose dieren
Opmerking: Voor injectie van CSF traceurs via acute geïmplanteerde CM canule in narcose dieren, onmiddellijk na stap 8 van de vorige sectie, gaat u verder met CSF tracer injectie zoals hieronder beschreven.
- Start met behulp van een spuitpomp de injectie in de CM van CB traceurs met een snelheid van 1 μL/min voor 5 of 10 min, resulterend in een totaal volume van 5 µL of 10 µL, respectievelijk. Aan het einde van de injectie, toestaan de CSF-tracer te laten circuleren in de hersenen voor 30 min met de canule ongestoord.
- Na 30 min, snijd de slang aangesloten op de canule (ongeveer 4 cm afstand van het puntje van de naald) en verzegel het einde met behulp van een chirurgische las.
- Euthanaseren onder diepe verdoving, het dier door onthoofding. Snel ontleden de hersenen en het weefsel herstellen door onderdompeling in 4% paraformaldehyde (PFA) verdund in een fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS; 0.01M; pH 7.4) overnachting (o/n) bij 4 ° C.
3. injectie van CB Tracers via chronisch geïmplanteerd CM canule in wakker dieren
- Met behulp van een spuitpomp, trekken 7 µL of 12 µl van gewenste CSF tracer in een canule bestaat uit ongeveer 30 cm van PE10 buizen met een schuine tandheelkundige naald puntje van 0,5 cm.
- Het dier voorzichtig te bedwingen en snijden van ongeveer 1 cm van de slang gekoppeld aan de canule.
- Nog steeds onder de beteugeling van de zachte, snel sluit de canule gevuld met CSF tracer aan de canule CM geïmplanteerd.
- Met behulp van een spuitpomp, start de injectie in de traceurs CM van CB met een snelheid van 1 µL/min. 7 injecteren µL of 12 µL, tot een eindvolume van CB geïnjecteerd tracer 5 µL of 10 µL, dus de aCSF die nog in de geïmplanteerde canule te compenseren. Aan het einde van de injectie, toestaan de CSF-tracer te laten circuleren in de hersenen voor 30 min met de canule ongestoord. Ervoor dat de slang aangesloten injectie en verkeer perioden blijft.
- Aan het einde van CSF tracer omloop tijd, overgaan tot euthanasie door onthoofding, verzekeren dat het dier diep is verdoofd. Snel ontleden de hersenen en het weefsel herstellen door onderdompeling in 4% paraformaldehyde (PFA) verdund in een fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS; 0.01M; pH 7.4) overnachting (o/n) bij 4 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bij fixatie van muizen of ratten in een stereotaxic frame, worden de nekspieren rond de regio occipital crest ronduit ontleed om de cisterna magna (CM) bloot te stellen. De driehoekige structuur van het GH wordt gemakkelijk herkend tussen het caudal gedeelte van het cerebellum en de medulla (figuur 1A-1 C). De canule wordt de CM 1-2 mm ingevoegd door zachtjes piercing de Atlantisch-occipitale membraan (Figuur 1 d). De dura-membraan is een taaie structuur en het inbrengen van de canule wordt verbeterd door het kantelen van de dierlijke hoofd door een 120° ten opzichte van het lichaam. Met de hulp van een inspuitpomp, worden anders gelabelde moleculen vervolgens geïnjecteerd in de cisterna magna op gecontroleerde tarieven (figuur 1E). Na een interval dat CSF tracer verkeer, zijn dieren euthanized. De hersenen is zorgvuldig ontleed en vaste door onderdompeling in 4% PFA o/n bij 4 ° C. Macroscopische dorsale uitzicht op hersenen geoogst van CM-geïnjecteerd knaagdieren Toon de verdeling van CSF verklikstoffen in de subarachnoïdale stortbakken van het cerebellum, in de bulbus olfactorius en in de paravascular ruimte langs de middelste cerebrale bloedvaten (MCAs) (figuur 1F ). In het ventrale gedeelte van de hersenen tonen macroscopische weergaven CSF tracer distributie langs de cirkel van Willis (figuur 1G). Histologische secties van CM-geïnjecteerd hersenen verder onthullen de paravascular verdeling van de traceurs binnen de hersenen parenchym. Muizen geïnjecteerd onder verdoving (Figuur 1 H) (of tijdens een natuurlijke slaap, Zie1) vertonen een opmerkelijke stijging tracer distributie in de hersenen parenchym in vergelijking met muizen geïnjecteerd terwijl wakker en vrij bewegen in hun kooi (figuur 1i).
Figuur 1: injectie van de verklikstoffen in de cisterna magna. (A) schematisch overzicht van de muis hoofd en de hersenen toont de locatie van de cisterna magna (CM) ten opzichte van de hersenen en de craniale structuren. (B) gekleurd van blootgestelde CM nadat de omliggende nekspieren bot zijn ontleed en geduwd aan de zijkanten. (C) hogere vergroting van het gebied afgebeeld in B (zwarte rechthoek), waarin de omgekeerde driehoekige structuur van de CM (gestippelde lijn) en de ligging ten opzichte van de omliggende structuren, d.w.z. occipital crest, cerebellum en medulla weergegeven. (D) Photomicrography van de canule ingevoegd in de CM. (E) regeling van de laterale weergave van de muis vaste kop, licht gekanteld in een hoek van 120 ° ten opzichte van het lichaam. Inzet van gestreepte rechthoek afgebakend gebied toont de regeling een weergave van het stelsel van de parasagittal van een parasagittal weergave van de hersenen van de muis met de canule ingevoegd van de CM, zoals uiteengezet in de E. Een spuit, die is gekoppeld aan een inspuitpomp, wordt gebruikt voor het leveren van CSF verklikstoffen of contrastmiddelen in de CM door een buis verbonden met een fijne naald 30G. Beelden van de vertegenwoordiger van een hele muis hersenen op 30 min na het einde van CM injectie met een fluorescerende tracer gezien vanuit de dorsale (F) en het ventrale (G) aspecten. (H, I,) Representatieve coronale hersenen secties counterstained met DAPI (4' 6-diamidino-2-phenylindole, 1 µg/mL in PBS) van muizen met CSF verklikstoffen in de CM onder narcose (H) en wakkerheid (I), 30 min na het einde van CM injectie ingespoten met een snelheid van 1 µL/min voor een 5 µL volume van een mengsel van ovoalbumine-AF647 geconjugeerde (OA, 45kDa, 2% in aCSF) en dextran-FITC-conjugaat (DEX, 3kDa, 2% in aCSF). Schaal bars, 5 mm voor de B, C, F, G; 2 mm voor D en 500 µm voor H, I. Cb, cerebellum; CM, cisterna magna; CTX, cortex; en OB, bulbus olfactorius. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We hebben een protocol dat wordt beschreven van een procedure voor de cisterna magna cannulation (CMc), die biedt een eenvoudige methode om te leveren van gelabelde moleculen tot het compartiment CSF gepresenteerd. CMc kan de volgende visualisatie van CSF dynamiek, zowel in vivo en ex vivo, met behulp van verschillende beeldvormende modaliteiten of histologie.
Een van de belangrijkste voordelen van de CMc-techniek ligt in de directe toegang tot de subarachnoïdale ruimte zonder de noodzaak om het blootstellen van de hersenen door craniotomy. Doordat er niet een cranial venster of de penetratie van de hersenen parenchym met een naald tip, kan CMc de levering van moleculen in de CSF compartiment en de beoordeling van het glymphatic-systeem door een minimaal invasieve procedure, met alleen korte verstoring van intracraniële druk (ICP).
Met name de injectie in de CM is stroomafwaarts van de belangrijkste bronnen van CB, de choroideus plexi gelegen in de ventriculaire systeem (laterale, derde en vierde ventrikels). Van de laterale ventrikels, CSF stromen naar de derde ventrikel via de intraventricular Foramen (het foramen van Monro) en van de derde tot en met vierde ventrikels via het cerebrale aquaduct (het aquaduct van Sylvius) aan de hersenstam en ruggenmerg (herzien in3 ). CSF bereikt de subarachnoïdale ruimte via de CM door die door de mediaan diafragma (of het foramen van Magendie) stroomt, en dus CMc injecties omzeilen de hele ventriculaire systeem. Echter, hoewel dit problematisch in sommige modellen van CSF/ISF dynamiek door de ventrikels wellicht, directe injectie van de verklikstoffen in de ventrikels vereist invasieve chirurgische ingrepen zoals het boren van burr gaten in de ramen van de schedel, en de toepassing van ventriculaire injecties verstoren aanzienlijk de ICP-13. Injectie van de druk van de verklikstoffen in de subarachnoïdale ruimte13,14 in onze handen schaft ook de flux van CSF traceurs langs de paravascular ruimte. In tegenstelling, hoewel CMc aanprikken van het dural membraan inhoudt, ICP is alleen Transient verstoord en is snel herstelde2.
Met behulp van de CMc, kan glymphatic activiteit worden gemeten in narcose dieren na acute CMc, evenals in wakker dieren, een 24-uurs herstelperiode na implantatie van de canule observeren. Acute CMc is geschikt voor combinatie met 2-photon imaging, die gedetailleerde informatie over glymphatic activiteit binnen cortex tot een diepte van ongeveer 200 µm1,2 bevat. Nog belangrijker is, biedt acute CMc ook het voordeel van het ondersteunen van de onbevooroordeelde MRI-onderzoeken, waar tracer distributie is dynamisch, gevolgd ten opzichte van een individuele basislijn afbeelding verworven vóór de inleiding van CSF tracer injectie15, 16 , 17. voor MRI, de tandheelkundige naald gebruikt voor CMc moet worden vervangen door een borosilicaat capillaire (ongeveer 1 cm lengte, tip diameter van circa 20 µm) gekoppeld aan de PE-buis.
In tegenstelling tot acute cannulation staat chronische CMc de experimentator CSF tracer injectie bij dieren tijdens de natuurlijke slaap of onder verdoving uitvoeren, evenals in wakker, vrij bewegende dieren. Dit is een cruciale factor, aangezien glymphatic activiteit zeer situatieafhankelijke is; Tracer toestroom naar het parenchym is veel groter bij dieren die werden geïnjecteerd onder verdoving of in slaap dan in dieren die werden geïnjecteerd in de wakker frame1. Bovendien, kunnen dieren met een chronisch geïmplanteerde canule ontvangen CSF tracer in hun kooi, dus het minimaliseren van storende factoren als gevolg van de effecten van stress en opwinding op glymphatic activiteit. Voor chronische injecties onder verdoving, een mengsel van ketamine/xylazine (100 mg/kg; 10 mg/kg, respectievelijk) wordt aanbevolen. Isofluraan bij concentraties van meer dan 1,5% induceert zwelling van de hersenen en doet niet verhogen glymphatic activiteiten ten opzichte van de wakker staat1. Opmerking dat dieren na implantatie van de CMc, één moeten worden gehuisvest, om te verzekeren dat CMc geïmplanteerde dieren geen schade aan de canule van elkaar toebrengen zal. Ook, aangezien de CMc chronische inplanting een chirurgische procedure van de terugwinning is, het moet worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden en dieren verdient vóór analgetica.
Bovenal kan CMc worden gebruikt als een methode te leveren CSF verklikstoffen in muizen en ratten, met minimale wijzigingen in het protocol. Passende verdoving dosis moet worden beheerd en het maximale volume van CSF-tracer die is geïnjecteerd in ratten is 30 µL, vanwege de verschillen in de grootte van de ventriculaire en subarachnoïdale ruimtes tussen de twee soorten.
Ondanks zijn procedurele eenvoud is wat opleiding en praktijk vereist voor de experimentator voor het succesvol uitvoeren van CMc. Aangezien de CM in grootte tussen soorten en individuele dieren varieert, is het raadzaam om de erkenning van de structuur van de praktijk. Het beoefenen van de procedure met behulp van Evans Blue (2% in aCSF) staat de experimentator te bevestigen van de juiste naald inbrengen. Soms zal een vaartuig worden gevestigd direct bij de middellijn van de CM, waarna de naald grenzend aan het vaartuig moet worden ingevoegd, maar zo dicht mogelijk aan de middellijn. Hierbij moeten worden opgemerkt, om later bevestiging dat verklikstoffen zijn gelijkmatig verdeeld, ondanks de plaatsing uit het midden van de nld-tip. Nog belangrijker is, het Atlantisch-occipitale membraan die betrekking hebben op de CM is mechanisch taai en voldoende druk moet worden toegepast om in te voegen de afgekante nld-tip. Het is echter essentieel dat de uitgeoefende niet leidt tot het uiteinde van de naald in de medulla of het cerebellum storten. Om te vergemakkelijken de naald inbrengen in de CM, moet het hoofd van dieren worden gekanteld naar beneden onder een hoek van 120° ten opzichte van het lichaam, dat zich uitstrekt van het membraan. Nog belangrijker is, moet voorzichtigheid worden genomen om niet te hinderen ademhaling door dit hoofd flexie. Als de naald tip het cerebellum invoert moet, verklikstoffen zullen worden bewaard in het weefsel en niet verspreiden in de subarachnoïdale ruimte. Schade aan de medulla is vaak fataal, terwijl cerebellum schade in chronische cannulations leiden prostration en algemene afwijkingen in het gedrag van de dieren tot kan. Om het risico van deze eventualiteit, kunnen naalden met een kleinere lengte van de schuine kant worden gebruikt.
Wanneer het bewegen van de spieren in de nek regio, dat betrekking heeft op het membraan van de dura in wilt invoegen de canule de CM, kan bloeden optreden. Katoenen wissers kunnen worden gebruikt om te absorberen het bloeden, maar anderzijds ferrichloride oplossing kan worden toegepast. Ferrichloride heeft een hemostatische effect18, en activeert ook de verstijving van de nekspieren rond de plaats van de incisie, hetgeen zal bijdragen tot het verkrijgen van de juiste inbrengen van de naald in de CM. electrolytisch chloride ook de schedel en dural membraan droogt, presentatie beter oppervlakken voor de hechting van de canule. Voor CMc, 1-2 druppels ferrichloride oplossing (10%) van toepassing (ongeveer 1 mL) in een katoenen wisser en schar de nekspieren en de occipital crest. Echter kan actueel ferrichloride eventueel via het membraan sijpelen in het CB, met onbekende effecten op hersenen homeostase. Als het gebruik van ferrichloride een kwestie van bezorgdheid is, kan men in plaats daarvan wond OPROLMECHANISMEN gebruiken om open te houden de insnijding site. Zorgvuldige verwijdering van het oprolmechanisme van de wond na het toepassen van de Cyanoacrylaat lijm vermijdt onbedoelde gehechtheid aan de incisie site.
CMc is een eenvoudig en reproduceerbare procedure om moleculen rechtstreeks in de CSF compartiment. Aangezien de CMc minimaal invasieve is, het is de voorkeursmethode voor de visualisatie van het glymphatic-systeem en kan gecombineerd worden met verschillende beeldvormende modaliteiten zoals epifluorescence en 2-foton microscopie of MRI. CMc vormt aldus, een geweldig hulpmiddel voor studies van stromingsleer, namelijk CB en ISF, en ook van de hersenen vloeistof clearance. Als gevolg van de macroscopische dekking van het glymphatic systeem heeft CMc het potentieel om te worden gebruikt voor het leveren van moleculen hersenen-wide.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de Novo Nordisk Foundation en het National Institute of Neurological Disorders en de beroerte, NINDS/NIH (M.N.). A.L.R.X. en S.H-R zijn begunstigden van een postdoctorale fellowship en een PhD beurs van de Stichting Lundbeck, respectievelijk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SOPIRA Carpule 30G 0.3 x 12mm | Kulzer | AA001 | |
| Polyethylene Tubing 0.024” OD x 0.011” ID | Scandidact | PE10-CL-500 | |
| 30G x ½” 0.3 x 12 mm Luer-Lock | Chirana T. Injecta | CHINS01 | |
| Chlorhexidine 0.5% (chlorhexidine digluconate) | Meda AS | no catalogue number, see link in comments | http://www.meda.dk/behandlingsomrader/desinfektion/desinfektion-af-hud/klorhexidin-sprit-medic-05/ |
| Alcohol Swab 70% Isopropyl Alcohol 30 x 60mm | Vitrex Medical A/S | 520213 | |
| Viskoese Oejendraeber Ophtha | Ophtha | 145250 | |
| Wooden applicator, Double cotton bud (Ø appr. 4 - 5 mm, length appr. 12 mm) | Heinz Herenz | 1032018 | |
| Eye spears | Medicom | A18005 | |
| Ferric chloride 10% solution | Algeos | NV0382 | |
| Kimtech Science Precision Wipes Tissue Wipers | Kimberly Clark Professional | 05511 | |
| Loctite Super Glue Precision 5g | Loctite | no catalogue number, see link in comments | http://www.loctite-consumer.dk/da/produkter/superglue-liquid.html |
| Insta-Set CA Accelerator | Bob Smith Industries | BSI-152 | |
| Dental Cement Powder | A-M Systems | 525000 | |
| Surgical weld | Kent Scientific Corporation | INS750391 | |
| Hamilton syringe GASTIGHT® , 1700 series, 1710TLL, volume 100 μL, PTFE Luer lock | Hamilton syringes | 1710TLL | |
| LEGATO 130 Syringe pump | KD Scientific | 788130 | |
| Paraformaldehyde powder, 95% | Sigma Aldrich | 158127 | |
| Phosphate buffered saline (PBS; 0.01M; pH 7.4) | Sigma Aldrich | P3813 | |
| Ovalbumin, Alexa Fluor 647 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | O34784 | |
DAPI (diamidino-2-phenylindole) Solution (1 mg/mL) |
Thermo Fisher Scientific | 62248 | |
| Dextran, Fluorescein, 3000 MW, Anionic | Thermo Fisher Scientific | D3305 | |
| E-Z Anesthesia EZ-7000 Classic System | E-Z Systems | EZ-7000 | |
| Attane Isofluran 1000 mg/g | ScanVet | 55226 | |
| Euthanimal 200mg/mL (sodium pentobarbital) | ScanVet | 545349 | |
| Ketaminol Vet 100 mg/mL (ketamine) | Intervet International BV | 511519 | |
| Rompin Vet 20 mg/mL (xylazin) | KVP Pharma + Veterinär Produkte GmbH | 148999 | |
| Xylocain 20 mg/mL (lidocain) | AstraZeneca | 158543 | |
| Marcain 2.5 mg/mL (bupivacain) | AstraZeneca | 123918 | |
| Bupaq Vet 0.3 mg/mL (buprenorphine) | Richter Pharma AG | 185159 |
References
- Xie, L., et al. Sleep Drives Metabolite Clearance from the Adult Brain. Science. , 373-377 (2013).
- Iliff, J. J., et al. A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid β. Sci. Transl. Med. 4, 147ra111 (2012).
- Jessen, N. A., Munk, A. S. F., Lundgaard, I., Nedergaard, M. The Glymphatic System: A Beginner's Guide. Neurochem. Res. 40, 2583-2599 (2015).
- Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. , (2015).
- Aspelund, A., et al. A dural lymphatic vascular system that drains brain interstitial fluid and macromolecules. J. Exp. Med. 212, 991-999 (2015).
- Kress, B. T., et al. Impairment of paravascular clearance pathways in the aging brain. Ann. Neurol. 76, 845-861 (2014).
- Plog, B. A., et al. Biomarkers of Traumatic Injury Are Transported from Brain to Blood via the Glymphatic System. J. Neurosci. 35, 518-526 (2015).
- Jiang, Q., et al. Impairment of glymphatic system after diabetes. J. Cereb. Blood Flow Metab. , Under Revi (2016).
- Peng, W., et al. Suppression of glymphatic fluid transport in a mouse model of Alzheimer's disease. Neurobiol. Dis. 93, 215-225 (2016).
- Orešković, D., Klarica, M. The formation of cerebrospinal fluid: Nearly a hundred years of interpretations and misinterpretations. Brain Res. Rev. 64, 241-262 (2010).
- Dusart, I., Schwab, M. E. Secondary Cell Death and the Inflammatory Reaction After Dorsal Hemisection of the Rat Spinal Cord. Eur. J. Neurosci. 6, 712-724 (1994).
- Eide, K., Eidsvaag, V. A., Nagelhus, E. A., Hansson, H. -A. Cortical astrogliosis and increased perivascular aquaporin-4 in idiopathic intracranial hypertension. Brain Res. , (2016).
- Pullen, R. G., DePasquale, M., Cserr, H. F. Bulk flow of cerebrospinal fluid into brain in response to acute hyperosmolality. Am. J. Physiol. 253, F538-F545 (1987).
- Ichimura, T., Fraser, P. A., Cserr, H. F. Distribution of extracellular tracers in perivascular spaces of the rat brain. Brain Res. 545, 103-113 (1991).
- Iliff, J. J., et al. Brain-wide pathway for waste clearance captured by contrast-enhanced MRI. J. Clin. Invest. 123, 1299-1309 (2013).
- Ratner, V., et al. Optimal-mass-transfer-based estimation of glymphatic transport in living brain. Proc. SPIE--the Int. Soc. Opt. Eng. 9413, (2015).
- Lee, H., et al. The Effect of Body Posture on Brain Glymphatic Transport. J. Neurosci. 35, 11034-11044 (2015).
- Nouri, S., Sharif, M. R., Sahba, S. The effect of ferric chloride on superficial bleeding. Trauma Mon. 20, e18042 (2015).
