Summary
Burada Sisterna magna cannulation (CMc), minimal invaziv bir şekilde izleyiciler, yüzeyler ve sinyal molekülleri beyin-omurilik sıvısı (BOS) sunmak için gerçekleştirmek için bir protokol açıklayın. Farklı görüntüleme yöntemleri ile birlikte, CMc glymphatic sistemi ve CSF dynamics değerlendirme yanı sıra çeşitli bileşiklerin beyin çapında teslim sağlar.
Abstract
Sisterna magna cannulation (CMc) kafatası veya beyin parankimi operatif zarar vermeden beyin-omurilik sıvısı (BOS) doğrudan erişim sağlayan basit bir işlemdir. İmzalat kemirgen, boyun kasları künt diseksiyon tarafından dura mater pozlama bir kanül Sisterna magna (CM) içine ekleme izin verir. Bir ince eğimli iğne veya kapiller, borosilikat oluşan kanül, polietilen (PE) tüp bir şırınga için eklenir. Bir şırınga pompa kullanarak, molekülleri sonra kontrollü oranları Doğrudan subaraknoid alanı ile sürekli CM, içine enjekte edilebilir. Subaraknoid uzaydan konvektif akımını çözünen exchange interstisyel sıvı (ISF) ile oluştuğu perivasküler boşluk delici arteriyoller içine CSF Cerayanlar izleyebilirsiniz. CMc imzalat veya uyanık, daha sonra enjeksiyon ile kronik implantasyon veya akut enjeksiyonu hemen ardından ameliyat için serbestçe hareket kemirgenler gerçekleştirilebilir. Nefelometri beyin parankimi izleyici dağıtım epifluorescence, 2-foton mikroskobu ve manyetik rezonans görüntüleme (MRG), eklenen moleküller fiziko-kimyasal özelliklerine bağlı olarak gerçekleştirilebilir. Böylece, çeşitli görüntüleme teknikleri ile birlikte CMc değerlendirme glymphatic sistemi ve CSF dynamics ve işlevi için güçlü bir araç sunuyor. Ayrıca, CMc sinyal molekülleri ve aksi takdirde kan beyin bariyerini (BBB) çapraz değil metabolik yüzeylerde, hızlı, beyin çapında teslimat için bir kanal olarak yararlı olabilir.
Introduction
Beyin-omurilik sıvısı (BOS) merkezi sinir sistemi (MSS) ventriküler sistem boyunca ve Subaraknoid boşluk, beyin ve omurilik çevreleyen bir anatomik olarak tanımlanmış alan Devamlılıkta ventrikül ile birlikte banyoları. BOS ana işlevlerinden biri, gümrükleme metabolitleri ve beyin parankimi üzerinden solutes için bir yol sağlamaktır. İzni yeni keşfedilen glymphatic sistem1, periferik lenfatik sisteme analog beyin üzerinden yönetilir. Burada, biz tanımlamak ve cisterna magna cannulation (CMc), moleküller doğrudan teslim bos içine için minimal invaziv bir yöntem tartışıyorlar. CMc glymphatic işlev eğitim için anahtar bir yöntemdir. Ayrıca, CMc ve kan beyin bariyeri (BBB) geçirgen molekülleri hızlı, beyin çapında teslimat perivasküler alanı boyunca beyin parankimi içine CSF dynamics incelenmesi için de uygulanabilir.
CMc CSF hareketi dinamikleri MSS etiketli izleyici molekülleri veya uyuşturucu Sisterna magna (CM) CSF dolu uzaya teslim yoluyla Fizyolojik esasları patlatır. Molekülleri CM. molekülleri sonra CSF toplu akımını Paravasküler alan1ile beyin parankimi içine taşınır atlanto-oksipital dural membran kapak içine implante bir kanül ile enjekte edilir. CMc enjekte izleyici veya kontrast Ajan yoğunluk düzeyleri beyin parankimi girin etiketli moleküllerin miktarının tarafından CSF hareketi ve glymphatic akını değerlendirmesini sağlayan CSF, aynı yönde hareket eder. CMc epifluorescence, 2-foton mikroskobu ve manyetik rezonans görüntüleme (MRG) gibi farklı görüntüleme teknikleri ile uyumludur. Ayrıca, bu değerlendirme olabilir vivo içinde veya ex vivogerçekleştirilen. Önemlisi, CMc anestezi altında veya doğal uyku sırasında hem de uyanık, özgürce hareket hayvanlarda glymphatic sistemi görselleştirme sağlar.
CMc teknik akışkanlar dinamiği bos içinde farklı yönlerini incelemek için yararlı olabilir, ama glymphatic sistemi eğitimi için özellikle yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Glymphatic aktivite CSF konvektif akışını astrositik kaydırma vasküler endfeet membran gergin aquaporin-4 (AQP-4) su kanalları üzerinden periarterial uzaydan kullanıyor. Konvektif akışı CSF ve interstisyel sıvı (ISF) beyin parankimi içinde değişimi sağlar. CSF/ISF metabolik atık ve solutes içeren sonra perivenous alanı2,3üzerinden beyin parankimi kaldırılır. Sonuçta, CSF/ISF çevre yolu ile son zamanlarda açıklanan dural lenf damarları4,5ulaşır. Glymphatic sistem amiloid-β2gibi zararlı atık metabolitler Temizleme için çok önemli gösterilmiştir. Ayrıca, glymphatic izni yaşlanma6, travmatik beyin hasarı7sonra ve diyabet8 ve Alzheimer hastalığı9hayvan modelleri bozulmuş. Özellikle, glymphatic devlet bağımlı, uyku ve uyanıklık1ile karşılaştırıldığında anestezi sırasında önemli ölçüde daha yüksek faaliyet gösteren bir faaliyettir. Gerçekten de, Genç imzalat hayvanlar en yüksek glymphatic aktivite sergilemek. Böylece, glymphatic faaliyet deneysel miktar rolünü sağlık ve hastalığında okurken çok önemlidir.
Çeşitli çalışmalarda CSF dinamikleri ve onun değişim interstisyel sıvı (ISF) beyin parankimi ile ele sahip. Ancak, hangi tarafından etiketli moleküllerin teslim yöntemleri oldukça invaziv, beyin parankimi hasarı ve kafa içi basınç (ICP) değişimler tetikleyen (bkz:10inceleyin). Bazı örnekler intraventriküler veya kranyotomi veya bir burr sondaj dahil intraparenchymal enjeksiyonları kafatasında delik. ICP, böylece kesintiye glymphatic işlevi2değiştirmek için bu yordamları gösterilmiştir. Ayrıca, tür invaziv yöntemler astrogliosis ikna etmek ve AQP-4 immunoreactivity beyin parankimi hasar alan ve kendi çevresi11,12artırmak. Astrocytes ve AQP-4 glymphatic sisteminin temel unsuru olduğundan, CMc seçim için çalışmalarını yöntemidir. CMc büyük avantajı ile karşılaştırıldığında daha fazla invaziv yordamlar ICP değişiklikler ve astrogliosis, sırasıyla kaçınarak bir bozulmamış kafatası ve beyin parankimi, bakım vardır. Böylece, sadece glymphatic sistemi, aynı zamanda dinamiklerini incelemek için olanaklar geniş bir dizi ve sıvı akış homeostazı, olduğu gibi nörolojik hastalıkların hayvan modellerinde mekanizmaları için CMc farklı görüntüleme araçları ile birlikte açılır.
Sisterna magna cannulation (CMc) yordamı beyin-omurilik sıvısı (BOS) kolay ve doğrudan erişim sağlar. Farklı molekül (Örneğin flüoresan izleyiciler, Mr kontrast ajanlar) enjekte edilerek deneyci CSF bölme içinde onların hareketlerini takip ve glymphatic sistem etkinliğini değerlendirmek. Hem akut CMc, cerrahi ve hangi cerrahi işlem bir sonraki enjeksiyon için hayvan kilitlenme kanül, kronik implantasyonu hemen ardından enjeksiyonları için aşağıdaki protokolünü açıklar. Akut ve kronik implantasyon arasındaki en önemli fark kronik implantasyon glymphatic aktivite uyanık farelerde incelenmesi için izin vermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm yordamlar Avrupa Yönergesi 2010/63/AB hayvan araştırma için uygun olarak gerçekleştirilen ve Danca Bakanlığı çevre ve gıda (2015-15-0201-00535) altında hayvan deneyleri Konseyi tarafından kabul edildi.
1. işlem Cannulation için
- Kanül hazırlık
Not: kanül ile non-steril eldiven dokunmaktan kaçının.- İğne bağı kullanarak 30 G diş iğne eğimli metal ipucu off kır.
- İğne bağı kullanarak eğimli metal uç (yaklaşık 0,3 cm) PE10 30 cm uzunluğunda ekleyerek hazırlamak kanül (126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4 aCSF ile dolu boru (Polietilen boru 0,024" OD 0.011" kimliği x) , 2 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 10 mM glikoz, 26 mM NaHCO3; pH %7,4 95'i O2 ve %5 CO2ile benzin).
- Kanül 30 G iğne ile (30 G x ½" 0,3 x 12) donatılmış 1 mL şırınga kullanarak aCSF ile yıkayın.
-
Cerrahi müdahale
Not: Kronik CM cannulation hayvanlar cerrahi işlem kurtarmak izin verir. CM enjeksiyonları kanül implantasyon ertesi günü yapılır ve önemlisi, imzalat ya da uyanık hayvanlarda gerçekleştirilebilir. Bu bir kurtarma ameliyat olduğu için yordamları steril koşullarda yapılmalıdır.- Fare (C57BL/6JRj, her iki cinste, 8 hafta) tartmak ve ketamin ve xylazine karışımı ile anestezi (100 mg/kg; 10 mg/kg, sırasıyla) mayi (IP) enjeksiyon yoluyla. Gerekirse, fare ketamin (50 mg/kg) Yarım doz ile cerrahi işlem sırasında redose. Alternatif olarak, kronik cannulation için fare bu % 2.5-3 isoflurane, adlı bir isoflurane indüksiyon odasına 1 L/min O2yerleştirerek anestezi. Bu durumda, bir burun konisi isoflurane anestezi ameliyat boyunca % 1.5-2 sürdürmek için kullanın.
- Ayak çimdik kes refleksleri ve solunum yavaş ve istikrarlı olur zaman hayvan stereotaksik çerçevede ısıtma yastığını yerleştirin.
- Oftalmik merhem uygulamak. Ameliyat sırasında gerektiğinde yineleyin.
- Baş ve boyun fare tıraş, kürk kaldırmak ve maruz kalan deri ilk bir alkol çubukla ve sonra iki kez klorheksidin (%0,5) veya iyot çözüm (% 2) ile sterilize. Sterilizasyon iki kez daha tekrarlayın.
Not: tıraştan sonra enkaz ve saç kaldırmak için cerrahi örtüsü değiştirin. Sonra steril alanı korumak için hayvan asmak. - 0.5 - 1 ml lidokain/bupivacaine kronik cannulation için yönetmek (1 mg/ml ve 0.25 mg/ml, sırasıyla) subkutan (SC) kesi yerinde. Buprenorfin (0,05 mg/kg; SC) ameliyat sonrası analjezi için yönetmek.
- Fare stereotaksik çerçevede düzeltmek. 120 ° bir açı vücuda (1E rakam) oluşturur böylece fiksasyon, her iki intraural olduktan sonra veya elmacık arch, kafa biraz eğ.
- Hemen boyun kasları - oksipital kret üzerinde çıkıntılı Kafatası parçası bulmak. Örten deri bir çift Cımbız kullanarak kaldırın ve yaklaşık 1 cm orta çizgi boyunca cildin bir badem şekilli parça kesti. Pamuk temizleme bezi kullanın veya herhangi bir sonuç kanamayı kontrol spears göz.
- Oksipital kret bir referans noktası olarak kullanarak, aşağıdaki boyun kasları ortaya çıkarmak için yüzeysel bağ dokusu ayır.
- Orta hat kaslara dikkatle forseps posterior anterior eksen kesi sitedeki ortasında çalıştırarak ayırın. Her el eğri forseps çifti ile kafatasının alt orta ipuçları katılmak ve kasları bir kenara çekin.
Not: Bu beyincik yukarıda ve aşağıda, medulla yarı saydam dural membran (Şekil 1B ve 1 C) arkasında tarafından özetlenen bir küçük ters üçgen olarak görünür CM maruz. - Bir cerrahi göz mızrak veya pamuklu bez kullanarak, CM kapsayan dural membran silin.
-
Kanül CM içine ekleme
- Kanül tüp arka sonu iliştirilmiş 30G iğne tutmak aCSF dolu şırınga kaldırın.
- Bir şırınga pompa bağlı bir distile su 100 µL şırınga 30 G iğne iliştirin.
- Bir hava kabarcığı yaklaşık 1 cm hava bir şırınga pompa yardımıyla çekilerek kanül yerleştirin.
- Bir şırınga pompa kullanarak, istenen CSF izleyici 12 μL kanül geri alıyorum.
- Eğri cımbız dominant el düzenlenen bir çift tüp kaplı iğneyle yakınındaki CSF izleyici ile dolu kanül kavramak. Diğer tarafa kulak çubuğunda sigara dominant el orta parmak dinlenme ve bir dinlenme olarak daha sonra kullanmak için kanül sabit tut.
- Kanül dura gördün mü onun üçgen yönü ile tanımlanan CM, merkezi haline geçen fare başından göre 45 ° açılı yerleştirin. Herhangi bir penetrasyon beyincik veya medulla kaçının. İğne sadece derinliğe kadar 1-2 mm, yani eğim tamamen dura altında nerede noktasına takıldığından emin olun. Kanül elinde cımbız yayın ve sigara dominant el üzerinde dinlenmek kanül izin.
Not: Bazı kuvvet uygulanması CM kapsayan dural membran işlemek için diş iğne eğimli sonu gerektirir. - Gerekirse, bir cerrahi göz mızrak ya da pamuk temizleme bezi kullanarak penetrasyon üzerine herhangi bir CSF sızıntı kapalı kuru.
- Cyanoacrylate tutkal kanül çevreleyen dural membran üzerine 2-3 damla damla. Tutkal hemen tedavi için tutkal hızlandırıcı bir damla ekleyin. Kafatası ve iğne diş çimento (yaklaşık 0.5 mg) ve cyanoacrylate tutkal (3-5 damla) karışımı ile kapağı. Hemen sonra bir damla tutkal Hızlandırıcı tedavi uygulanır.
- Kronik cannulation için (yaklaşık 2-3 cm kanül için bağlı bırakarak) boru kesme ve kafa içi basınç (ICP) düzeyleri CSF kaçak tüp yoluyla engelleyerek korumak için cerrahi bir kaynak ile kapatın.
- Carprofen (5 mg/kg; SC) Kronik cannulation için yönetmek
- Kronik cannulation için hayvanın anesteziden tamamen iyileşti kadar vücut ısısını korumak için bir ısıtma yastığı üzerinde tutmak bir kafeste fareyi getirin.
Not: Hayvanlar tek başına onların kafes kanül sağlam kalmasını sağlamak için yer. Bir kağıt havlu veya diğer katı yüzey üzerinde fareyi yerleştirerek burun yatak açık olduğundan emin olun.
Not: Otelde hayvanlar kanül sokmak için yapılan cerrahi müdahale kurtarıldı, ertesi gün onlar CSF izleyicileri ile enjekte edilebilir. Anestezi altında enjeksiyon için ketamin/xylazine karışımı yönetmek (100 mg/kg; 10 mg/kg, sırasıyla; IP) ve bölüm 2' de açıklanan adımlara devam edin. Uyanık hayvanlarda enjeksiyon için bölüm 3' e geçin.
2. bos tarayıcıları üzerinden akut implante CM kanül imzalat hayvanlarda enjeksiyon
Not: CSF tarayıcıları üzerinden akut implante CM kanül imzalat hayvanlarda enjeksiyon hemen sonra adım 8 önceki bölümünden için CSF izleyici enjeksiyon için aşağıda açıklandığı gibi devam edin.
- Bir şırınga pompa kullanarak sırasıyla 5 µL veya 10 µL, toplam hacim içinde kaynaklanan bos CM izleyiciler 5 veya 10 dakika, 1 μL/dk hızında içine enjeksiyon başlatın. Enjeksiyon sonunda CSF izleyici beyin için rahatsız edilmeden kanül ile 30 dk boyunca dolaşmaya izin.
- 30 dk sonra kanül (yaklaşık 4 cm mesafeden iğne ucu) bağlı boru kesme ve cerrahi bir kaynak kullanarak sona mühür.
- Derin anestezi altında hayvan tarafından işten çıkarma ötenazi. Hızlı bir şekilde beynini incelememize ve doku tamponlanmış fosfat salin seyreltilmiş daldırma %4 paraformaldehyde (PFA) sabitleyin (PBS; 0.01M; pH 7,4) gecelik (o/n) 4 ° C'de
3. bos tarayıcıları üzerinden kronik implante CM kanül uyanık hayvanlarda enjeksiyon
- Bir şırınga pompa kullanarak, 7 µL veya istenen CSF izleyici 12 µl yaklaşık 30 cm PE10 boru 0.5 cm eğimli diş iğne ucu ile oluşan bir kanül içine geri alıyorum.
- Yavaşça hayvan dizginlemek ve yaklaşık 1 cm kanül için bağlı hortumunun kesti.
- Hala nazik frenleyici altında hızlı bir şekilde CSF izleyici için implante CM kanül ile dolu kanül bağlamak.
- Bir şırınga pompa kullanarak, 1 µL/dk. 7 enjekte µL oranında bos CM izleyiciler içine enjeksiyon başlatmak veya 12 µL CSF son hacmi elde etmek için böylece implante kanül kalan aCSF karşılayan izleyici 5 µL veya 10 µL enjekte. Enjeksiyon sonunda CSF izleyici beyin için rahatsız edilmeden kanül ile 30 dk boyunca dolaşmaya izin. Tüp enjeksiyon ve kan dolaşımı dönemlerde bağlı kalır emin olun.
- CSF izleyici dolaşım zaman sonunda, ötenazi için hayvan derin anestezi temin işten çıkarma tarafından bineceksiniz. Hızlı bir şekilde beynini incelememize ve doku tamponlanmış fosfat salin seyreltilmiş daldırma %4 paraformaldehyde (PFA) sabitleyin (PBS; 0.01M; pH 7,4) gecelik (o/n) 4 ° C'de
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fare ya da sıçan stereotaksik çerçevesindeki fiksasyonu, oksipital kret bölgenin etrafında boyun kasları Sisterna magna (CM) ortaya çıkarmak için açık açık kesmiştim. CM üçgen yapısını kolayca beyincik kaudal kısmını ve medulla (Şekil 1A-1 C) arasında kabul edilmektedir. Kanül 1-2 mm CM yavaşça atlanto-oksipital membran (Şekil 1 d) piercing tarafından eklenir. Dura zar zor bir yapıdır ve kanül yerleştirilmesi 120 ° ile ilgili olarak vücut tarafından hayvan başını eğerek artırıldı. Bir enjeksiyon pompası yardımıyla, farklı etiketli molekülleri sonra Sisterna magna kontrollü hesaplı (Şekil 1E) içine enjekte edilir. CSF izleyici dolaşım izin vermek için bir zaman aralığından sonra hayvan are euthanized. Beyin dikkatle disseke ve % 4 daldırma tarafından İngiltere'de yılın o/n 4 ° C'de sabit Beyincik subaraknoid sarnıçlar, olfaktör ampul ve orta serebral arter (MCAs) (Şekil 1F boyunca Paravasküler boşluğa CSF izleyiciler dağıtımını CM enjekte kemirgenler hasat beyin makroskopik dorsal görünümleri göster ). Beyin ventral bölümünde, Willis daire (Şekil 1G) CSF izleyici dağıtım makroskopik görünümleri gösterir. Histolojik kesitler CM enjekte beyin daha fazla izleyiciler içinde beyin parankimi Paravasküler dağılımını ortaya koyuyor. Anestezi (Şekil 1 H) altında (veya doğal uyku, bkz:1) enjekte fareler dikkate değer bir artış izleyici dağıtım enjekte fareler karşılaştırıldığında beyin parankimi içine uyanık ve serbestçe hareket içinde onların ev kafes (Şekil gösterirken 1I).
Şekil 1: izleyicileri enjeksiyon içine Sisterna magna. (A)fare baş ve beyin beyin ve beyin yapıları ile ilgili olarak Sisterna magna (CM) yerini gösteren Şematik Özeti. (B) Photomicrograph çevresindeki boyun kasları edilmiş açık açık disseke ve taraf için itti sonra maruz cm. (C) CM (kesik çizgi) ve konumu ile ilgili olarak çevredeki yapıları, yani oksipital sorguç, beyincik ve medulla ters üçgen yapısını gösteren B (siyah dikdörtgen), tasvir çevrenin yüksek büyütme. (D) CM. (E) düzeni fare sabit kafa yanal görüş içine eklenen kanül Photomicrography biraz vücut ile ilgili olarak 120 ° bir açıyla eğik. İç metin kesikli dikdörtgenin alanı gösterir bir parasagittal görünümü düzeni fare beyin parasagittal görünümün düzenini CM eklenen kanül ile E. içinde belirtildiği gibi ayrılmış Bir enjeksiyon pompaya akuple, bir şırınga CM üzerinden ince bir 30 G iğne bağlı bir tüp içine CSF tarayıcıları veya kontrast ajanlar sunmak için kullanılır. Tüm fare beyin CM enjeksiyon dorsal (F) ve ventral (G) yönleri floresan bir izleyici ile dolduktan sonra 30 dk temsilcisi görüntüler. (H, ı,) Temsilcisi koronal beyin bölümleri 1 µL/dak'ya 5 µL oranında imzalat (H) ve anestezi (film) (ı), CM enjeksiyon dolduktan sonra 30 dk altında CM CSF izleyicileri ile enjekte farelerin DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole; PBS 1 µg/mL) ile counterstained ovalbumin-AF647 eşlenik (OA, 45kDa; aCSF % 2) ve dextran-FITC eşlenik (DEX, 3kDa; aCSF % 2) karışımı hacmi. Ölçek çubukları, B, C, F, G için 5 mm; 2 mm D ve H, ben Cb, beyincik 500 µm için; CM, Sisterna magna; CTX, korteks; ve OB, olfaktör ampul. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz Sisterna magna cannulation (CMc), etiketli molekülleri CSF bölmenin sunmak için basit bir yöntem sunan için detaylı bir yordam açıklanır bir protokol sundu. CMc CSF dinamikleri, in vivo ve ex vivo, farklı görüntüleme yöntemleri veya Histoloji kullanarak sonraki görselleştirme sağlar.
CMc tekniği ana avantajlarından biri Subaraknoid boşluk beyin kranyotomi tarafından ortaya çıkarmak için gerek kalmadan doğrudan erişimini yatıyor. Kafatası pencere veya iğne ucu ile beyin parankimi penetrasyon tarafından gerektirmeyen, CMc teslim CSF bölmenin içine moleküllerin ve değerlendirme glymphatic sistemi sadece kısa bozukluğu görülür minimal invaziv bir yordam tarafından sağlar kafa içi basınç (ICP).
Özellikle, enjeksiyon CM içine CSF, ventriküler sistemde bulunan choroid Pleksi ana kaynakları aşağı (yanal, üçüncü ve dördüncü ventrikül). Lateral ventrikül, intraventriküler foramina (Monro deliği) üzerinden üçüncü ventrikül CSF akar ve serebral su kemeri (Sylvius su kemeri) beyin sapı ve omurilik (3 gözden üzerinden üçüncü-dördüncü ventrikül ). Medyan diyafram (veya Magendie deliği) aracılığıyla akan tarafından CM üzerinden Subaraknoid boşluk CSF ulaşır ve böylece CMc enjeksiyonları ventriküler sistemin tamamı bypass. Bu CSF/ISF dinamikler ventrikül aracılığıyla bazı modellerinde sorunlu olabilir, ancak, izleyiciler ventrikül içine direkt enjeksiyon burr deliği kafatası windows ve uygulanması, delme gibi invaziv cerrahi işlemler gerektirir ventrikül enjeksiyonları önemli ölçüde ICP13bozabilir. Aynı şekilde, izleyiciler basınçlı enjeksiyona bizim ellerde Subaraknoid boşluk13,14 içine CSF izleyiciler Paravasküler alanı boyunca akı onuntemsilcilerini yasakladı Buna ek olarak, CMc ponksiyon dural membran gerektirir rağmen ICP sadece geçici tedirgin ve hızlı bir şekilde geri yüklenen2' dir.
CMc kullanarak, glymphatic etkinliği akut CMc sonra imzalat hayvanlarda, hem de bir 24 saatlik iyileşme döneminde kanül implantasyon üzerine gözlemleyerek uyanık hayvanlarda ölçülebilir. Akut CMc için kombinasyonu 2-Imaging, yaklaşık 200 µm1,2derinliğe korteks içindeki glymphatic etkinliği hakkında ayrıntılı bilgi sağlayan foton ile uygundur. Önemlisi, akut CMc affords de nerede izleyici dağıtım dinamik olarak bireysel temel görüntüyü CSF izleyici enjeksiyon15, başlanmasından önce satın göre izlenir tarafsız Mr çalışmaları destekleyen avantajı 16 , 17. için MRG, CMc için kullanılan diş iğne PE boru bağlı bir borosilikat kapiller (yaklaşık 1 cm uzunluk, uç çapı yaklaşık 20 µm) tarafından değiştirilmesi.
Akut cannulation aksine kronik CMc deneyci yanı sıra CSF izleyici enjeksiyon hayvanlarda doğal uyku sırasında ya da anestezi altında gerçekleştirmek de uyanık, hayvanların serbestçe hareket sağlar. Glymphatic etkinliği son derece devlet bağımlı olduğundan bu önemli bir faktör olduğunu; İzleyici akını parankimi için çok daha fazla anestezi altında enjekte edildi hayvanlarda veya uyku modunda hayvanlarda uyanık devlet1' enjekte edildi. Ayrıca, kronik olarak yerleştirilmiş bir kanül hayvanlarla CSF izleyici ev onların kafes içinde böylece karıştırıcı faktörler nedeniyle stres ve uyarılma glymphatic aktivite üzerine etkileri en aza indirme alabilirsiniz. Anestezi, ketamin/xylazine karışımı altında kronik enjeksiyonlar için (100 mg/kg; 10 mg/kg, sırasıyla) önerilir. %1,5 üzerinde konsantrasyonlarda Isoflurane beyin şişliği neden olmaktadır ve glymphatic etkinliği için uyanık durum1karşılaştırıldığında geliştirmez. CMc implantasyon sonra hayvanlar implante CMc hayvanlar birbirlerinin kanül zarar vermeyeceğini sağlamak için yer alan tek olması unutmayın. Ayrıca, CMc kronik implantasyon kurtarma cerrahi bir müdahale olduğu için steril koşullarda gerçekleştirilmesi gereken ve hayvanlar post-operational analjezik almanız gerekir.
Önemlisi, CMc CSF izleyiciler farelerde olduğu gibi protokol minimal değişiklikler ile rats teslim etmek için bir yöntem olarak kullanılabilir. Uygun anestezi doz idare ve ventrikül ve Subaraknoid boşluk boyutunu iki tür arasındaki farklılıkları nedeniyle 30 µL Rat enjekte CSF izleyici, maksimum birimdir.
Deneyci CMc başarıyla gerçekleştirmek yordam sadeliği rağmen bazı eğitim ve uygulama gereklidir. CM boyutunda türler ve bireysel hayvanlar arasında değişir bu yana, uygulama yapısını tanınması için tavsiye edilir. Evans mavi (aCSF % 2) kullanarak yordamı uygulamak doğru iğne ekleme onaylamak deneyci sağlar. Bazen, bunun üzerine iğne gemi bitişik eklenmesi gereken ama orta hat olabildiğince yakın gibi bir gemi doğrudan CM midline yer alacaktır. Bu gibi durumlarda, daha sonra onay izleyiciler eşit olarak, iğne ucu kapalı merkezi yerleşim rağmen dağıtıldığını olması gerekmektedir. Önemlisi, atlanto-oksipital membran CM kapsayan mekanik zordur ve eğimli iğne ucu eklemek için yeterli basınç uygulanmalıdır. Ancak, uygulanan basınç iğne ucu medulla veya beyincik dalan yol açmaz önemlidir. CM içine iğne ekleme kolaylaştırmak için aşağıya doğru membran uzanan vücut göre 120 ° açılı hayvanlar Başkanı eğik. Önemlisi, dikkatli solunum engel değil için bu baş fleksiyon tarafından alınmalıdır. İğne ucu beyincik girmeniz gerekir, izleyiciler doku korunacak ve Subaraknoid boşluk dağıtmak başarısız olur. Medulla hasar sık sık ölümcül ise kronik cannulations beyincik zarar secde ve hayvanlar davranışını genel anormallikleri neden olabilir. Bu olasılığa riskini en aza indirmek için daha küçük bir eğim uzunluğu iğnelerle kullanılabilir.
Kasları kanül CM eklemek için dura membran kapsar boyun bölgesinde taşırken, kanama oluşabilir. Pamuk temizleme bezi kanamayı emmek için kullanılabilir ancak alternatif olarak, ferrik klorid çözüm uygulanabilir. Ferrik klorid bir kan durdurucu sargı etkisi18var ve de böylece doğru iğne ekleme kokladığı CM. klorür de kafatası ve dural membran kurur elde etmek için yardımcı boyun kasları kesi site çevresinde sertleşme tetikler, daha iyi yüzeyler kanül yapışma için sunma. CMc için uygulamak 1-2 damla ferrik klorid çözüm (% 10) (yaklaşık 1 mL) içine bir pamuklu çubukla ve boyun kasları ve oksipital taç kurulamak. Ancak, topikal ferrik klorid-muhtemelen anlaşılmak membran-beyin homeostazı bilinmeyen etkileri ile bos içine. Ferrik klorid kullanımı endişe meselesi ise, bir yara ekartör kesi site açık tutmak için kullanabilirsiniz. Dikkatli kesi sitesine yanlışlıkla eki cyanoacrylate tutkal uygulandıktan sonra yara ekartör kaldırılmasını önler.
CMc moleküller doğrudan CSF bölmesine sunmak için basit ve tekrarlanabilir bir işlemdir. CMc minimal invaziv olduğundan, glymphatic sistemi görselleştirme için tercih edilen yöntemdir ve epifluorescence ve 2-foton mikroskopi veya MRI gibi farklı görüntüleme yöntemleri ile birlikte. Böylece, CMc çalışmalar akışkanlar dinamiği, yani CSF ve ISF ve aynı zamanda beyin sıvı giriş izni için harika bir araç temsil eder. Glymphatic sistem makroskopik kapsamı nedeniyle, CMc molekülleri beyin çapında teslim etmek için kullanılan potansiyeline sahiptir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser NINDS/NIH (M.N.) Novo Nordisk Vakfı ve sinir hastalıkları Ulusal Enstitüsü ve inme, tarafından desteklenmiştir. A.L.R.X. ve S.H-R bir doktora sonrası Bursu ve Doktora Bursu Lundbeck temelden alıcılarını sırasıyla vardır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SOPIRA Carpule 30G 0.3 x 12mm | Kulzer | AA001 | |
| Polyethylene Tubing 0.024” OD x 0.011” ID | Scandidact | PE10-CL-500 | |
| 30G x ½” 0.3 x 12 mm Luer-Lock | Chirana T. Injecta | CHINS01 | |
| Chlorhexidine 0.5% (chlorhexidine digluconate) | Meda AS | no catalogue number, see link in comments | http://www.meda.dk/behandlingsomrader/desinfektion/desinfektion-af-hud/klorhexidin-sprit-medic-05/ |
| Alcohol Swab 70% Isopropyl Alcohol 30 x 60mm | Vitrex Medical A/S | 520213 | |
| Viskoese Oejendraeber Ophtha | Ophtha | 145250 | |
| Wooden applicator, Double cotton bud (Ø appr. 4 - 5 mm, length appr. 12 mm) | Heinz Herenz | 1032018 | |
| Eye spears | Medicom | A18005 | |
| Ferric chloride 10% solution | Algeos | NV0382 | |
| Kimtech Science Precision Wipes Tissue Wipers | Kimberly Clark Professional | 05511 | |
| Loctite Super Glue Precision 5g | Loctite | no catalogue number, see link in comments | http://www.loctite-consumer.dk/da/produkter/superglue-liquid.html |
| Insta-Set CA Accelerator | Bob Smith Industries | BSI-152 | |
| Dental Cement Powder | A-M Systems | 525000 | |
| Surgical weld | Kent Scientific Corporation | INS750391 | |
| Hamilton syringe GASTIGHT® , 1700 series, 1710TLL, volume 100 μL, PTFE Luer lock | Hamilton syringes | 1710TLL | |
| LEGATO 130 Syringe pump | KD Scientific | 788130 | |
| Paraformaldehyde powder, 95% | Sigma Aldrich | 158127 | |
| Phosphate buffered saline (PBS; 0.01M; pH 7.4) | Sigma Aldrich | P3813 | |
| Ovalbumin, Alexa Fluor 647 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | O34784 | |
DAPI (diamidino-2-phenylindole) Solution (1 mg/mL) |
Thermo Fisher Scientific | 62248 | |
| Dextran, Fluorescein, 3000 MW, Anionic | Thermo Fisher Scientific | D3305 | |
| E-Z Anesthesia EZ-7000 Classic System | E-Z Systems | EZ-7000 | |
| Attane Isofluran 1000 mg/g | ScanVet | 55226 | |
| Euthanimal 200mg/mL (sodium pentobarbital) | ScanVet | 545349 | |
| Ketaminol Vet 100 mg/mL (ketamine) | Intervet International BV | 511519 | |
| Rompin Vet 20 mg/mL (xylazin) | KVP Pharma + Veterinär Produkte GmbH | 148999 | |
| Xylocain 20 mg/mL (lidocain) | AstraZeneca | 158543 | |
| Marcain 2.5 mg/mL (bupivacain) | AstraZeneca | 123918 | |
| Bupaq Vet 0.3 mg/mL (buprenorphine) | Richter Pharma AG | 185159 |
References
- Xie, L., et al. Sleep Drives Metabolite Clearance from the Adult Brain. Science. , 373-377 (2013).
- Iliff, J. J., et al. A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid β. Sci. Transl. Med. 4, 147ra111 (2012).
- Jessen, N. A., Munk, A. S. F., Lundgaard, I., Nedergaard, M. The Glymphatic System: A Beginner's Guide. Neurochem. Res. 40, 2583-2599 (2015).
- Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. , (2015).
- Aspelund, A., et al. A dural lymphatic vascular system that drains brain interstitial fluid and macromolecules. J. Exp. Med. 212, 991-999 (2015).
- Kress, B. T., et al. Impairment of paravascular clearance pathways in the aging brain. Ann. Neurol. 76, 845-861 (2014).
- Plog, B. A., et al. Biomarkers of Traumatic Injury Are Transported from Brain to Blood via the Glymphatic System. J. Neurosci. 35, 518-526 (2015).
- Jiang, Q., et al. Impairment of glymphatic system after diabetes. J. Cereb. Blood Flow Metab. , Under Revi (2016).
- Peng, W., et al. Suppression of glymphatic fluid transport in a mouse model of Alzheimer's disease. Neurobiol. Dis. 93, 215-225 (2016).
- Orešković, D., Klarica, M. The formation of cerebrospinal fluid: Nearly a hundred years of interpretations and misinterpretations. Brain Res. Rev. 64, 241-262 (2010).
- Dusart, I., Schwab, M. E. Secondary Cell Death and the Inflammatory Reaction After Dorsal Hemisection of the Rat Spinal Cord. Eur. J. Neurosci. 6, 712-724 (1994).
- Eide, K., Eidsvaag, V. A., Nagelhus, E. A., Hansson, H. -A. Cortical astrogliosis and increased perivascular aquaporin-4 in idiopathic intracranial hypertension. Brain Res. , (2016).
- Pullen, R. G., DePasquale, M., Cserr, H. F. Bulk flow of cerebrospinal fluid into brain in response to acute hyperosmolality. Am. J. Physiol. 253, F538-F545 (1987).
- Ichimura, T., Fraser, P. A., Cserr, H. F. Distribution of extracellular tracers in perivascular spaces of the rat brain. Brain Res. 545, 103-113 (1991).
- Iliff, J. J., et al. Brain-wide pathway for waste clearance captured by contrast-enhanced MRI. J. Clin. Invest. 123, 1299-1309 (2013).
- Ratner, V., et al. Optimal-mass-transfer-based estimation of glymphatic transport in living brain. Proc. SPIE--the Int. Soc. Opt. Eng. 9413, (2015).
- Lee, H., et al. The Effect of Body Posture on Brain Glymphatic Transport. J. Neurosci. 35, 11034-11044 (2015).
- Nouri, S., Sharif, M. R., Sahba, S. The effect of ferric chloride on superficial bleeding. Trauma Mon. 20, e18042 (2015).
