Summary
Denne protokollen beskriver en nyetablerte metode for virus levering til murine prostata. Bruker enten CRISPR/Cas9 teknologi, gene overuttrykte eller grobunn recombinase levering, teknikken tillater orthotopic endring av genuttrykk og implementerer en ny musemodell for prostatakreft.
Abstract
Med et økende forekomst av prostatakreft er identifisering av nye svulst drivere eller modulatorer avgjørende. Genmodifiserte musen modeller (GEMM) for prostatakreft er hemmet av svulst heterogenitet og dets komplekse microevolution dynamikk. Tradisjonelle prostatakreft musen modeller inkluderer, blant annet germline og betinget knockouts, transgene uttrykk for oncogenes og xenograft modeller. Generasjon av de novo mutasjoner i disse modellene er komplekse, tidkrevende og kostbare. I tillegg rette de fleste av tradisjonelle modeller flertallet av prostata epitel, mens menneskelig prostata kreft er kjent for å utvikle seg som en isolert begivenhet i bare en undergruppe av celler. Verdifulle modeller må simulere ikke bare prostatakreft innvielsen, men også progresjon til avansert sykdom.
Her beskriver vi en metode for å målrette noen celler i prostata epitel av transducing celler av virus partikler. Levering av en konstruert virus til murine prostata tillater endring av genuttrykk i prostata epithelia. Virus type og antall definerer herved antall målrettet celler for genet endring av transducing noen celler for kreft initiering og mange celler for genterapi. Gjennom kirurgi-baserte injeksjon i fremre flik, distale fra urin spor, kan svulst i denne modellen utvide uten at dette skader funksjonen urin av dyret. Videre av målretting bare et delsett av prostata epitelceller teknikken gjør klonal ekspansjon av svulsten, og derfor etterligner menneskelige svulst innvielsen, progresjon, samt invasjonen gjennom basale membran.
Denne teknikken gir en kraftig prostatakreft modell forbedret fysiologiske relevans. Dyr lider er begrenset, og siden det kreves ingen ekstra avl, samlet dyr antall reduseres. Samtidig, er analyse av ny kandidat gener og veier akselerert, som er mer kostnadseffektivt.
Introduction
Oppdagelse og behandling av prostatakreft har forbedret det siste tiåret. Likevel, er forekomsten av prostatakreft er økende, etter levealder. Med en anslått 1,1 millioner nye tilfeller på verdensbasis er blant de vanligste årsakene til kreft-relaterte dødsfall i menn 1. Prostatakreft er treg i sin utvikling, men når kreften har kommet til en avansert metastatisk tilstand, prognosen er dårlig på grunn av begrenset behandlingstilbud. Så langt bare noen gener har blitt identifisert som vanlige drivere i denne kreft, og heterogenitet og multifocality hindrer oppdagelsen av biomarkers og targetable sykdom drivere2,3.
Klassiske teknikker for genererer GEMMs er ofte nedsatt av sin kompleksitet, betimelig utgifter og kostnader. Betinget knockout modeller har vært mye brukt til å studere prostatakreft kandidat gener, som resulterer i embryonale dødelighet når inaktivert i germline4. Vanligste modeller innebære en prostata-spesifikt grobunn recombinase drevet av enten en modifisert Probasin5 eller en PSA6 promoter integrert i GEMM flere krysset-formering. I disse modellene, skal genet av interesse nås i de fleste prostata epitelceller, generere hyperplasia i hele orgel, som kan forringe dyrets urinveisinfeksjon funksjon7.
Viral levering av grobunn protein ved injeksjon i den fremre lobe av murine prostata kan løse dette problemet ved bare målretting noen celler8. Hensyntatt laboratorier tekniske forutsetninger, ekspertise og mål, metoden fordelene fra et bredt spekter av mulige variasjoner. Vellykkede tilnærminger utnytte Adenovirus rettet mot JunB og Pten9 eller Lentivirus rettet mot Pten og Trp5310 vist seg blant andre. Legger til effekter av transgener, som luciferase, viral Konstruer eller GEMM gjør videre ikke-invasiv overvåking av sykdomsprogresjon via bioluminescens imaging11.
Genomet redigering basert på CRISPR/Cas9 teknologi avslører en ny og rask mulighet til å studere kreft gjennom rask generasjon somatiske fortrenging12. Viral levering av enkelt guide RNAs (sgRNAs) til den fremre flik av murine prostata etablerer en fysiologisk mer relevante modell av prostatakreft. På denne måten, kan enkeltceller bærer valgte mutasjoner danne kloner som kan ekspansjon og invasjon. Videre genererer bruk av guide RNAs for flere mål gener cellen kloner med endringer i ulike gener. Dette vil tillate svulst heterogenitet og en naturlig utvalg press på kreft progresjon, som kan avsløre betydningen av hver genet endring eller epistatic mekanismer.
Her presenterer vi en metode for å levere virus partikler til murine prostata for endring av genuttrykk. En liten mage snitt, den murine fremre prostata lobe er utsatt og virus partikler som injiseres i lobe. Fem dager etter operasjonen, kirurgisk klipp kan fjernes fra huden og prostatic kreft kan analyseres fra 8 uker etter. Samlet sett er dette en rask og kostnadseffektiv prosedyre, som har liten effekt på musen og tillater større svulst å utvikle uten at musen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokollen innebærer en kirurgisk prosedyre i laboratoriet mus. Alle dyreforsøk må være individuelt vurdert og godkjent av en institusjonell Animal Care og bruk Committee (IACUC). Som tilnærmingen er basert på dyr utvinning og overlevelse, sikre riktig anestesi, smertelindring og et aseptiske kirurgisk miljø hele tiden. Bruke en varmeputen for å hindre nedkjøling under operasjonen og til utvinning fra anestesi.
1. Start hensyn
- Avhengig av viruset brukes, kan annen titer krav påløpe. fortynne viruset tilsvarende.
Merk: En Adeno-assosiert virus fortynnet i PBS injiseres i dette eksemplet på en titer 1 x 1012 IU/mL. Viruset har serotype 9 og inneholder guide RNA Pten og uttrykk for grobunn protein under en ubiquitin-utbyggeren (figur 1). Tap av Pten økte pAKT og spredning av prostatic epitel13. - Bruk mannlige mus i en alder av 8 uker ved kirurgi for å sikre tilstrekkelig prostata utvikling.
Merk: Mus i dette eksperimentet er Rosa26-LSL-Cas9-EGFP knockin mus på C57BL/6J bakgrunn12 (figur 1). - Fersk forberede en generell anestesi blanding og hvis mulig holde det sterilt.
Merk: For bedre dyr gjenoppretting etter kirurgi, en bedøvelse motgift anbefales.- For å forberede et totalvolum på 5 mL anesthetic, bland 0,15 mL medetomidine hydroklorid (1 mg/mL), 0.4 mL midazolam (5 mg/mL) og 0,25 mL butorphanol (10 mg/mL) med 4,2 mL steril saltholdig vann.
Merk: Alternative anestesi metoder, for eksempel inhalable isoflurane, kan brukes i henhold til dyr institusjon retningslinjer. - Du reverserer effekten av medetomidine hydroklorid etter operasjonen, bland 0,1 mL atipamezole (5 mg/mL) med 4,9 mL steril saltholdig vann.
- For å forberede et totalvolum på 5 mL anesthetic, bland 0,15 mL medetomidine hydroklorid (1 mg/mL), 0.4 mL midazolam (5 mg/mL) og 0,25 mL butorphanol (10 mg/mL) med 4,2 mL steril saltholdig vann.
- Forberede en steril kirurgisk miljø ved riktig desinfeksjon og sterilisering. Autoclave Kirurgiske instrumenter før bruk.
2. virus-levering til Murine prostata
- Bedøve dyret ved intraperitoneal injeksjon med en bakteriefri 1 mL sprøyte og en 27G x ½" nål. Bruk en bedøvelse dose 0,01 mL/g kroppsvekt. Hvis prosedyren varer lenger enn 30 minutter, opprettholde anestesi ved å injisere 1/3 av Start dose enhver 30 min.
- Undersøke bedøvende dybden ved å vurdere muskelavslapping, pedal uttak og palpebral reflekser. Når tap av reflekser er observert, barbere nedre del av magen på dyret.
- Nøye dekk dyrets øyne med veterinær ophthalmica salve bruke en steril bomull swab for å hindre blindhet skyldes mangel på hornhinnen refleks.
- Tørk barbert magen med 70% etanol og 10% povidon jod å disinfect det kirurgiske området. Skrubbe det kirurgiske området fra midten av det kirurgiske området mot periferien.
- Utføre en loddrett huden snitt på lav-abdominale midtlinjen på ca 1 cm med en bakteriefri kirurgisk saks.
- Løft peritoneum bruke en fin spiss tang for å hindre skade organer som legger under. Nøye gjør et < 8 mm snitt med kirurgisk saks gjennom peritoneum.
Merk: I motsetning til menneskelige, en gnager prostatakjertel består av fire separate flekker. Den fremre lobe er knyttet til seminal vesicle. - Forsiktig flytte fettvev side for å avdekke seminal vesicle. Ved hjelp av en ring pinsett, nøye løft seminal vesicle til fremre prostata kan være identifisert (figur 1).
- Sette inn et totalt volum på 30 µL virus (3 x 1010 virus partikler) løsning i fremre prostata epitel 0,5 mL insulinsprøyte med en 30G x 8 p. Redusere lekkasje og sikre væsken absorberes i vevet, danner en liten boble. Plass seminal vesicle tilbake i bukhulen.
- Sutur peritoneum med 2-3 enkle avbrutt sting med 6-0 absorberbare suturer med en 13 mm, 3/8 sirkel og en taper poeng nål.
- Stift huden med 3 sterilt 4.8 x 6,5 mm klipp løfte huden med tang å unngå å skade peritoneum.
- For bedre utvinning, bruke anestesi motgift i en dose på 0,01 mL/g kroppsvekt ved intraperitoneal injeksjon sterilt 1 mL sprøyte og en 27G x ½" nål. Forsiktig plassere dyr baksiden i buret sitt.
3. etter kirurgi prosedyrer
- Holde buret med musene som gjennomgikk kirurgi på en varmeputen 1t etter inngrepet, å hindre nedkjøling til helt frisk. Hvis motgift, bør dyr være våken noen minutter etter injeksjon.
- Overvåke dyrene daglig for riktig sår helbredelse og smerte indikasjoner. Hvis nødvendig, administrere flere smertestillende ifølge dyr institusjon retningslinjer.
- Fjerne hud klipp etter 4-5 dager, en gang såret er stengt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å vurdere virus levering til murine prostata, ble prøver analysert tre måneder etter operasjonen. Rosa26-LSL-Cas9-EGFP mus12 uttrykke GFP i celler som har vært utsatt for grobunn protein uttrykt av viruset. Prostata prøvene ble undersøkt med en fluorescens mikroskopi identifisere områder med GFP signal (figur 2A). GFP signalet angir grobunn aktivitet i prostata epitel men ikke om genet redigering har blitt indusert av CRISPR guide. Immunohistochemical deler viste fokal områder av celler med høy uttrykk for pAKT (figur 2B), som angir tap Pten13. En immunofluorescence co-farging pAKT og GFP identifisert dobbel positiv celler (figur 2C). Dette bekreftet transformasjonen av prostatic celler av Adeno-assosiert virus. Samlet sett viser disse resultatene at i vivo CRISPR/Cas9 gene redigering kan utføres i prostata epitel ved hjelp av Adeno-assosiert virus og Rosa26-LSL-Cas9-EGFP mus.
Figur 1: illustrasjon av prosedyren. Prosedyren utføres i Rosa26-LSL-Cas9-EGFP mus generert av Platt et al. 12 fremre prostata (AP) er knyttet til seminal vesicle (SV). Viruspartikler uttrykke guide RNA og en grobunn protein er injisert i fremre prostata å endre genuttrykk. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Gene endring i murine prostata gjennom orthotopic virus levering. 7-uke-gamle mannlige Rosa26-LSL-Cas9-EGFP musene ble injisert med Adeno-assosiert virus som inneholder en guide RNA for Pten og koding for en grobunn protein. Prøvene ble analysert 3 måneder etter virus injeksjon. (A) GFP fluorescens avbilding av fremre prostata. (B) histologiske delen (4 µm) farget for pAKT (brun) markerer klonal området med tap av Pten uttrykk. Stiplede boksen markerer forstørring arkivert. (C) Immunofluorescence flekker for GFP (grønn) og pAKT (rød). Kjernefysisk syrer var farget med DAPI. Venstre: farging av den ikke-injisert fremre lobe viser ingen signal for GFP eller pAKT. Høyre: farging av den injiserte lobe viser co lokalisering av GFP (cytoplasma flekker) og pAKT (cellemembranen lokalisering). (D) Ptenflox/flox mus injisert med grobunn-uttrykke Adenovirus. H & E flekker på en histologiske inndeling (4 µm) av den fremre lobe 6 måneder etter virus. Prikket ellipse markerer området av høy klasse prostatic intraepithelial neoplasi. For mer informasjon se referansen 9. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokollen beskriver vi en metode for å endre genuttrykk i fremre flik av murine prostata ved virus injeksjon, opprette en kraftig ny musemodell for prostatakreft (figur 2). Vellykket administrasjonen av en Adenovirus ble først beskrevet av Leow et al. i 20058. Vi har tidligere vist hvordan en Adenovirus koding for en grobunn recombinase protein kan erstatte tidkrevende krysset-formering av en grobunn allelet for vev-spesifikke sletting 9 (figur 2D). Siden viruset infiserer noen celler9, denne modellen etterligner menneskelige scenariet klonal ekspansjon14,15 og er optimal for kreft studies (figur 2B).
Oppdagelsen av CRISPR/Cas9 teknologi har åpnet nye muligheter for i vivo genet redigering. Det er nå mulig å endre flere gener samtidig gir en svært verdifull teknikk for heterogenic kreft på en kostnadsbesparende og tidkrevende måte. Forskning ved hjelp av dyremodeller har fordelen av generere genet endringer ikke bare i germline, men også i voksen vev. Videre gir utvikling av Cas9 uttrykke mus viral levering av både grobunn og sgRNAs (figur 1). Som guidene har ingen innvirkning på genomet Cas9 uttrykk, er arbeidet med dette viruset ikke farlig.
Adeno-assosiert virus indusere svært lav immunreaksjoner, og selv om stede for opp til ett år, viruset integrere ikke i vert genomet, som gjør det best i vivo knockout studier16. I denne sammenheng, må det bemerkes at ulike serotyper kan påvirke signaltransduksjon effektivitet i forskjellige vev typer. Derfor er optimalisering for målrettet vevet avgjørende for å oppnå høy effektivitet. Bruke genomet-integrere Lentivirus kan derimot tillate langsiktige oncogene uttrykk10.
Menneskelig prostata er ikke skilt i atskilte fliker og det har vært diskutert som av murine prostata flikene beste representerer menneskelig prostata. Mens den laterale lobe ble foreslått, har det vært vist ingen signifikant forskjell mellom forskjellige lobes forhold til svulst, innvielsen,9,,17,,18,,19. En annen viktig del av virus levering er mulig infeksjon av andre celler i kroppen. Vi har observert prostata stroma celler som har vært transduced. Risikoen kan reduseres under orthotopic levering prosedyren, unngå blodårene og hindrer lekkasje mens sprøytebruk. Videre kan virus design inkludert en prostata bestemt promoter, som Probasin arrangøren og serotype, øke celle-spesifisitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
MR ble finansiert av et fellesskap fra den danske Kreftforeningen (R146-A9394-16-S2). MFB og MKT ble finansiert av AUFF NOVA (AUFF-E-2015-FLS-9-8). MR og MFB var delfinansiert av Graduate School, helse, AU. E.F.W. laboratorium støttes av tilskudd fra det spanske departementet for økonomi (SAF2015-70857, delfinansiert av ERDF-EU) og en EUCLID (741888 - CSI-moro).
Vi ønsker å takke Liliana Fajardo Mellor (gener, utvikling og sykdom; National Cancer Research Center) for kritisk lesing av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| B6J.129(B6N)-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J mice | The Jackson Laboratory | 26175 | |
| 0,5 ml U-100 insulin syringe | BD | 324825 | for virus injection |
| 1 ml syringe | BD | 300013 | for anesthesia injection |
| 30 G 1/2'' needle | BD | 304000 | for anesthesia injection |
| 6-0 Polysorb Suture | Medtronic | GL889 | to close the peritoneum |
| Disposable sterilized surgery drape | multiple suppliers | ||
| Heating pad | multiple suppliers | ||
| Povidone-Iodine Prep Pad | Fisher Scientific | 06-669-70 | |
| Trimming machine | Aesculap | GT415 | to shave the abdomen |
| Dumont Forceps | F.S.T | 11252-00 | |
| Halsey Micro Needle Holder | F.S.T | 12500-12 | |
| Iris Scissors | F.S.T | 14094-11 | |
| Narrow Pattern Forceps | F.S.T | 11002-12 | |
| Ring Forceps | F.S.T | 11106-09 | |
| Wound Clip System Handle incl. Clips | F.S.T | 12030-01 | to close the skin |
| Wound Clip System Remover | F.S.T | 12030-04 | |
| Microscope | Leica | different models have been used | |
| Reagents | |||
| 1x PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Antisedan | obtained from the animal facility | ||
| Butorphanol | obtained from the animal facility | ||
| Medetomidinhydrochlorid | obtained from the animal facility | ||
| Midazolam | obtained from the animal facility | ||
| 100% Ethanol | Fisher Scientific | 22-032-103 | |
| Eye ointment | Takeda | 7242 | |
| Virus (AAV, AV) | multiple suppliers | virus used in this protocol is an in-house production | |
| pAKT antibody | CST | 4060 | used 1:200 dillution |
| GFP anitbody | CST | 2956 | used 1:100 dillution |
References
- Ferlay, J., et al. Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. Int J Cancer. 136, E359-E386 (2015).
- Gerlinger, M., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N Engl J Med. 366, 883-892 (2012).
- Robinson, D., et al. Integrative Clinical Genomics of Advanced Prostate Cancer. Cell. 162, 454 (2015).
- Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R., Elder, G. A. Animal transgenesis: an overview. Brain Struct Funct. 214, 91-109 (2010).
- Wu, X., et al. Generation of a prostate epithelial cell-specific Cre transgenic mouse model for tissue-specific gene ablation. Mech Dev. 101, 61-69 (2001).
- Ma, X., et al. Targeted biallelic inactivation of Pten in the mouse prostate leads to prostate cancer accompanied by increased epithelial cell proliferation but not by reduced apoptosis. Cancer Res. 65, 5730-5739 (2005).
- Chen, Z., et al. Crucial role of p53-dependent cellular senescence in suppression of Pten-deficient tumorigenesis. Nature. 436, 725-730 (2005).
- Leow, C. C., Wang, X. D., Gao, W. Q. Novel method of generating prostate-specific Cre-LoxP gene switching via intraductal delivery of adenovirus. Prostate. 65, 1-9 (2005).
- Thomsen, M. K., et al. Loss of JUNB/AP-1 promotes invasive prostate cancer. Cell Death Differ. 22, 574-582 (2015).
- Cho, H., et al. a novel GEM model for metastatic prostate cancer analysis and therapy, reveals myc as a driver of Pten-mutant metastasis. Cancer Discov. 4, 318-333 (2014).
- Cho, H., et al. Rapid in vivo validation of candidate drivers derived from the PTEN-mutant prostate metastasis genome. Methods. 77-78, 197-204 (2015).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159, 440-455 (2014).
- Wang, S., et al. Prostate-specific deletion of the murine Pten tumor suppressor gene leads to metastatic prostate cancer. Cancer Cell. 4, 209-221 (2003).
- Liu, W., et al. Copy number analysis indicates monoclonal origin of lethal metastatic prostate cancer. Nat Med. 15, 559-565 (2009).
- Haffner, M. C., et al. Tracking the clonal origin of lethal prostate cancer. J Clin Invest. 123, 4918-4922 (2013).
- Daya, S., Berns, K. I. Gene therapy using adeno-associated virus vectors. Clin Microbiol Rev. 21, 583-593 (2008).
- Price, D. Comparative Aspects of Development and Structure in the Prostate. Natl Cancer Inst Monogr. 12, 1-27 (1963).
- McNeal, J. E. Anatomy of the prostate: an historical survey of divergent views. Prostate. 1, 3-13 (1980).
- Thomsen, M. K., et al. SOX9 elevation in the prostate promotes proliferation and cooperates with PTEN loss to drive tumor formation. Cancer Res. 70, 979-987 (2010).
