Summary
Este protocolo descreve um método recentemente estabelecido para a entrega do vírus para a próstata murino. Usando tecnologia CRISPR/Cas9, superexpressão do gene ou entrega de recombinase Cre, a técnica permite ortotópico alteração da expressão gênica e implementa um modelo de romance do rato para câncer de próstata.
Abstract
Com um aumento da incidência de câncer de próstata, identificação de novos drivers de tumor ou moduladores é crucial. Modelos de rato geneticamente modificados (GEMM) para câncer de próstata são dificultados pela heterogeneidade do tumor e sua dinâmica complexa de microevolução. Câncer de próstata tradicional rato modelos incluem, entre outros, da linha germinal e condicionais nocautes, transgénico expressão de oncogenes e modelos de enxerto. Geração de mutações de novo nesses modelos é complexa, demorada e dispendiosa. Além disso, a maioria dos modelos tradicionais alvo a maioria do epitélio da próstata, Considerando que o câncer de próstata humano é bem conhecido a evoluir como um evento isolado em apenas um pequeno subconjunto de células. Modelos valiosos precisa simular não só a iniciação do câncer de próstata, mas também progressão de doença avançada.
Aqui nós descrevemos um método para algumas células no epitélio da próstata por transducing células-alvo por partículas virais. A entrega de um vírus projetado para a próstata murino permite a alteração da expressão gênica no epitélio da próstata. Quantidade e tipo de vírus pelo presente irão definir o número de células alvo para a alteração do gene por transducing algumas células para iniciação de cancro e muitas células para a terapia de gene. Através de injeção com base em cirurgia no lóbulo anterior, distal da trilha urinária, o tumor neste modelo pode expandir sem prejudicar a função urinária do animal. Além disso, pela segmentação apenas um subconjunto de células epiteliais da próstata a técnica permite a expansão clonal do tumor e, portanto, imita a iniciação de tumor humano, progressão, bem como a invasão através da membrana basal.
Esta nova técnica fornece um modelo poderoso câncer de próstata com maior relevância fisiológica. Sofrimento dos animais é limitado, e desde que a procriação não adicional for necessária, contagem global animal é reduzida. Ao mesmo tempo, análise de novos genes candidatos e caminhos é acelerada, que, por sua vez, é mais custo eficiente.
Introduction
Detecção e tratamento do câncer de próstata têm melhorado significativamente na última década. Ainda assim, a incidência de câncer de próstata está aumentando, seguindo a expectativa de vida. Com um estimado 1,1 milhões de novos casos em todo o mundo, está entre as causas mais comuns de morte por cancro em homens 1. Câncer de próstata é lento em seu desenvolvimento, mas quando o câncer progrediu para um estado metastático avançado, o prognóstico é pobre devido a opções de tratamento limitado. Até agora, apenas alguns genes têm sido identificados como os drivers comuns nesse tipo de câncer, e sua heterogeneidade e multifocality impede a deteção de biomarcadores e doença targetable motoristas2,3.
Técnicas clássicas de geração GEMMs são muitas vezes prejudicadas pela sua complexidade, oportunas despesas e custos. Modelos de nocaute condicionais foram amplamente utilizados para estudar os genes candidatos de câncer de próstata, que resultam em embrionária letalidade quando inativado no germline4. Modelos mais comuns envolvem uma recombinase Cre de específico da próstata guiado por qualquer um Probasin modificado5 ou um promotor de6 PSA integrado no GEMM por cruzamentos adicionais. Nestes modelos, o gene de interesse será orientado na maioria das células epiteliais da próstata, gerando hiperplasia no órgão inteiro, que pode prejudicar trato urinário função7 do animal.
Entrega viral da proteína Cre por injeção para o lobo anterior da próstata murino pode resolver esse problema, orientando apenas algumas células8. Os pré-requisitos técnicos de laboratórios, expertise e objectivos, tendo em conta os benefícios do método de uma ampla gama de variações possíveis. Abordagens de sucesso utilizando adenovírus visando JunB e Pten9 ou Lentivirus direcionamento Pten e Trp5310 foram mostradas entre outros. Adição de transgenes, tais como luciferase, para construção de viral ou o GEMM além disso permitirá monitoramento não-invasivo de progressão da doença através de bioluminescência imagem11.
Genoma de edição com base na tecnologia CRISPR/Cas9 revela uma oportunidade nova e rápida para estudar o câncer através de geração rápida de nocautes somática12. Viral entrega de RNAs de guia única (sgRNAs) direcionada para o lobo anterior da próstata murino estabelece um modelo fisiologicamente mais relevante do câncer de próstata. Por este meio, únicas pilhas carregando mutações escolhidas podem formar clones que são capazes de expansão e invasão. Além disso, o uso da guia RNAs para múltiplos genes alvo irá gerar clones de células com alterações em genes diferentes. Isso permitirá que a heterogeneidade do tumor e uma pressão de seleção natural na progressão do câncer, que pode revelar a importância de cada alteração do gene ou mecanismos epistatic.
Aqui nós apresentamos um método para entregar partículas virais para a próstata murino para alteração da expressão genética. Por uma pequena incisão abdominal, o lobo da próstata anterior murino é exposto e partículas virais são injetadas para o lobo. Cinco dias clipes pós-cirurgia, cirurgia podem ser retirados a pele e o câncer da próstata pode ser analisado de 8 semanas depois. Globalmente, este é um procedimento rápido e eficiente, que tem pouco impacto sobre o mouse e permite maior tumor desenvolver sem comprometer o mouse.
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Protocol
Este protocolo envolve um procedimento cirúrgico em ratos de laboratório. Todas as experiências em animais devem ser revisadas e aprovadas por um cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) individualmente. Como a abordagem é baseada na sobrevivência e recuperação animal, certifique-se de anestesia adequada, controle da dor e um ambiente cirúrgico asséptico em todos os tempos. Use uma almofada de aquecimento para evitar a hipotermia durante a cirurgia e até a recuperação da anestesia.
1. considerações de partida
- Dependendo o vírus usado, podem aplicar os requisitos de título diferente; Dilua o vírus em conformidade.
Nota: Neste exemplo, um vírus Adeno-associado, diluído em PBS é injetado em um título de 1 x 1012 UI/mL. O vírus tem serótipo 9 e contém RNA guia a Pten e expressão da proteína Cre sob um promotor da ubiquitina (Figura 1). Perda de Pten aumentou pAKT e proliferação do epitélio prostático13. - Use Camundongos machos em idade de 8 semanas no momento da cirurgia para garantir o adequado desenvolvimento da próstata.
Nota: Ratos mostrados neste experimento são ratos de knockin Rosa26-LSL-Cas9-EGFP em C57BL/6J fundo12 (Figura 1). - Recentemente, preparar uma mistura de anestesia geral e se possível mantê-lo estéril.
Nota: Para melhor recuperação animal após a cirurgia, um antídoto de anestesia é altamente recomendado.- Para preparar um volume total de 5 mL de anestésico, misture cloridrato de medetomidina 0,15 mL (1 mg/mL), 0,4 mL midazolam (5 mg/mL) e butorfanol 0,25 mL (10 mg/mL) com 4,2 mL água salina estéril.
Nota: Métodos alternativos de anestesia, como isoflurano inalável, podem ser usados de acordo com as orientações institucionais cuidados com animais. - Para reverter o efeito do pós-operatório cloridrato de medetomidina, misture atipamezole 0,1 mL (5 mg/mL) com 4,9 mL de água salina estéril.
- Para preparar um volume total de 5 mL de anestésico, misture cloridrato de medetomidina 0,15 mL (1 mg/mL), 0,4 mL midazolam (5 mg/mL) e butorfanol 0,25 mL (10 mg/mL) com 4,2 mL água salina estéril.
- Prepare um ambiente asséptico cirúrgico adequada desinfecção e esterilização. Instrumentos cirúrgicos de autoclave antes de usar.
2. vírus-entrega à próstata murino
- Anestesia o animal por injeção intraperitoneal com uma seringa estéril 1 mL e uma agulha 27 x ½". Use uma dose de anestesia de 0,01 mL/g de massa corporal. Se o procedimento dura mais de 30 min, manter anestesia pela injeção de 1/3 do iniciar dose a cada 30 min.
- Examine a profundidade anestésica avaliando o relaxamento muscular, retirada de pedal e reflexos palpebrais. Quando observa-se perda de reflexos, raspe o abdômen inferior do animal.
- Cuidadosamente, cubra os olhos do animal com veterinária pomada oftálmica usando um cotonete estéril para prevenir a cegueira devido à falta de reflexo corneal.
- Limpe o abdômen raspado com 70% de etanol e 10% povidona iodo para desinfetar a área cirúrgica. Esfregue a área cirúrgica do centro da área cirúrgica em direção a periferia.
- Realize uma incisão vertical da pele na linha baixa-abdominal de aproximadamente 1 cm, usando uma tesoura cirúrgica estéril.
- Levante o peritônio usando uma pinça de ponta fina para não danificar os órgãos que estão lançando por baixo. Cuidadosamente fazer uma incisão de 8 mm de < usando tesoura cirúrgica através do peritônio.
Nota: Em contraste com os humanos, glândula de próstata de um roedor é composto por quatro lóbulos separados. O lobo anterior é anexado para a vesícula seminal. - Movimente suavemente o tecido gordo à parte para descobrir a vesícula seminal. Usando uma pinça de anel, levante cuidadosamente a vesícula seminal até a próstata anterior pode ser identificado (Figura 1).
- Injete um volume total de solução de vírus (3 x 1010 partículas virais) 30 µ l no epitélio anterior da próstata, utilizando uma seringa de insulina de 0,5 mL com agulha 30 x 8 mm. Minimizar o escapamento e garantir que o fluido é absorvido dentro do tecido, formando uma pequena bolha. Coloque a vesícula seminal volta na cavidade abdominal.
- Suture o peritônio com 2-3 pontos interrompidos simples, usando 6-0 reabsorvível com um 13 mm, 3/8 círculo e uma agulha de ponta cónica.
- Grampo da pele com 3 clipes de estéril 4.8 x 6.5 mm, levantando a pele com pinças para não danificar o peritônio.
- Para melhor recuperação, aplica o antídoto de anestesia em dose de 0,01 mL/g de massa corporal por injeção intraperitoneal, usando uma seringa estéril 1 mL e uma agulha 27 x ½". Cuidadosamente coloque a animal de volta em sua jaula.
3. pós-operatório procedimentos
- Manter a gaiola com ratos que passou por uma cirurgia em uma almofada de aquecimento para 1 h após o procedimento, para evitar a hipotermia até totalmente recuperado. Se o antídoto for aplicado, o animal deve ser acordado alguns minutos após a injeção.
- Monitore os animais diariamente para indicações de cura e dor ferida apropriado. Se necessário, administre analgésicos adicionais de acordo com as orientações institucionais cuidados com animais.
- Remova os clipes de pele após 4-5 dias, uma vez que a ferida é fechada.
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Representative Results
Para avaliar a entrega do vírus para a próstata murino, as amostras foram analisadas três meses após a cirurgia. O Rosa26-LSL-Cas9-EGFP ratos12 express GFP nas células que foram expostas à proteína Cre expressa pelo vírus. As amostras da próstata foram examinadas com uma microscopia de fluorescência para identificar áreas com sinal GFP (Figura 2A). O sinal GFP indica atividade Cre no epitélio da próstata, mas não se gene edição tem sido induzida pelo guia CRISPR. Seções de imuno-histoquímica mostraram áreas focais de células com alta expressão de pAKT (Figura 2B), indicando a perda de Pten13. Uma imunofluorescência co manchar pAKT e GFP identificadas células positivas duplas (Figura 2). Isso confirmou a transformação das células da próstata pelo vírus Adeno-associado. Em geral, esses resultados mostram que vivo em CRISPR/Cas9 gene edição pode ser executada no epitélio da próstata usando o vírus Adeno-associado e o mouse Rosa26-LSL-Cas9-EGFP.
Figura 1: ilustração do procedimento. O procedimento é realizado no mouse Rosa26-LSL-Cas9-EGFP gerado pelo Platt et al 12 a próstata anterior (AP) é anexada para a vesícula seminal (SV). Partículas de vírus expressando guia RNA e uma proteína Cre são injetadas na próstata anterior para alterar a expressão gênica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: alteração do Gene na próstata murino através da entrega de vírus ortotópico. camundongos machos de Rosa26-LSL-Cas9-EGFP 7 semanas de idade foram injetados com vírus Adeno-associado, contendo um guia do RNA para Pten e codifica para uma proteína Cre. As amostras foram analisadas 3 meses após a injeção do vírus. Imagens de fluorescência (A) GFP da próstata anterior. (B) seção histológica (4 µm) manchada para pAKT (marrom) marca a área clonal com perda de Pten expressão. A caixa tracejada marca a alta magnificação arquivada. (C) imunofluorescência mancha para GFP (verde) e pAKT (vermelho). Ácidos nucleares foram corados com DAPI. Esquerda: coloração do lobo anterior não injectada não mostrando nenhum sinal de GFP ou pAKT. Direita: coloração do lobo injetado mostrando localização co de GFP (coloração citoplasmática) e pAKT (localização de membrana celular). (D) Ptenflox/flox ratos injetados com Cre-expressando adenovírus. H & E mancha de uma seção histológica (4 µm) do lóbulo anterior 6 meses após a entrega do vírus. Pontilhada elipse marca a área de neoplasia intra-epitelial prostática de alto grau. Para obter detalhes, consulte referência 9. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Neste protocolo, descrevemos um método para alterar a expressão do gene no lóbulo anterior da próstata murino pela injeção do vírus, criando um novo modelo de rato poderoso para câncer de próstata (Figura 2). A administração bem sucedida de um adenovírus foi primeiramente descrita por Leow et al . em 20058. Anteriormente mostramos como um adenovírus que codifica para uma proteína de recombinase Cre pode substituir demorado cruzamento de um alelo Cre para exclusão de tecido-específica 9 (Figura 2D). Desde que o vírus infecta algumas células9, este modelo imita o cenário humano da expansão clonal de14,15 e é ideal para estudos de câncer (Figura 2B).
A descoberta da tecnologia CRISPR/Cas9 abriu novas oportunidades para na vivo gene edição. Agora é possível alterar vários genes simultaneamente, proporcionando uma técnica altamente valiosa para esse tipo de câncer heterogêneo de forma custo e tempo-eficiente. Pesquisas usando modelos animais beneficiam a vantagem de gerar alterações gene não só no germline, mas também em tecidos adultos. Além disso, o desenvolvimento de camundongos expressando Cas9 permite entrega viral do Cre e sgRNAs (Figura 1). Como os guias não têm impacto no genoma sem expressão Cas9, o trabalho com este vírus é não-perigosos.
Vírus adeno-associado induzem muito baixo de respostas imunes, e apesar de presentes por até um ano, o vírus não se integra no genoma hospedeiro, que o torna preferível para na vivo nocaute estudos16. Neste contexto, deve-se notar que diferentes sorotipos podem afetar a eficiência de transdução em tipos distintos de tecido. Portanto, a otimização para o tecido-alvo é crucial para alcançar alta eficiência. Usando a integração do genoma de Lentivirus por outro lado pode permitir a longo prazo do oncogene expressão10.
A próstata humana não é separada em lóbulos distintos e isso tem sido discutido que dos lobos da próstata murino melhores representa a próstata humana. Enquanto o lóbulo lateral foi proposto, não foi mostrada nenhuma diferença significativa entre os lóbulos diferentes em relação ao tumor iniciação9,17,18,19. Outro aspecto crítico da entrega do vírus é a possível infecção de outras células do corpo. Observamos que as células do estroma da próstata que têm sido transfectadas. O risco pode ser minimizado durante o procedimento de entrega ortotópico, evitando os vasos sanguíneos e impedem fugas enquanto injetando. Projeto de vírus, incluindo um promotor específico da próstata, tais como o promotor Probasin e sorotipo, poderia aumentar ainda mais celular-especificidade.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Senhor foi financiado por uma bolsa de estudos da sociedade dinamarquesa do câncer (R146-A9394-16-S2). MFB e MKT foram financiados por AUFF NOVA (AUFF-E-2015-FLS-9-8). Senhor e MFB foram co-financiados pela escola de pós-graduação, saúde, AU. O laboratório E.F.W. é suportado por subvenções do Ministério espanhol de economia (SAF2015-70857, co-financiado pela União Europeia FEDER-) e um ERC avançado grant (741888 - CSI-diversão).
Queremos agradecer a Liliana Fajardo Mellor (Genes, desenvolvimento e doença; National Cancer Research Center) para uma leitura crítica do manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| B6J.129(B6N)-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J mice | The Jackson Laboratory | 26175 | |
| 0,5 ml U-100 insulin syringe | BD | 324825 | for virus injection |
| 1 ml syringe | BD | 300013 | for anesthesia injection |
| 30 G 1/2'' needle | BD | 304000 | for anesthesia injection |
| 6-0 Polysorb Suture | Medtronic | GL889 | to close the peritoneum |
| Disposable sterilized surgery drape | multiple suppliers | ||
| Heating pad | multiple suppliers | ||
| Povidone-Iodine Prep Pad | Fisher Scientific | 06-669-70 | |
| Trimming machine | Aesculap | GT415 | to shave the abdomen |
| Dumont Forceps | F.S.T | 11252-00 | |
| Halsey Micro Needle Holder | F.S.T | 12500-12 | |
| Iris Scissors | F.S.T | 14094-11 | |
| Narrow Pattern Forceps | F.S.T | 11002-12 | |
| Ring Forceps | F.S.T | 11106-09 | |
| Wound Clip System Handle incl. Clips | F.S.T | 12030-01 | to close the skin |
| Wound Clip System Remover | F.S.T | 12030-04 | |
| Microscope | Leica | different models have been used | |
| Reagents | |||
| 1x PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Antisedan | obtained from the animal facility | ||
| Butorphanol | obtained from the animal facility | ||
| Medetomidinhydrochlorid | obtained from the animal facility | ||
| Midazolam | obtained from the animal facility | ||
| 100% Ethanol | Fisher Scientific | 22-032-103 | |
| Eye ointment | Takeda | 7242 | |
| Virus (AAV, AV) | multiple suppliers | virus used in this protocol is an in-house production | |
| pAKT antibody | CST | 4060 | used 1:200 dillution |
| GFP anitbody | CST | 2956 | used 1:100 dillution |
References
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