Summary
ここでは、網膜色素変性症に関連付けられているロドプシン変異体の輸送を定量化する高コンテンツ イメージング法について述べる。多波長得点分析は、タンパク質ロドプシン細胞表面に、または全体のセルを定量化に使用されました。
Abstract
ロドプシンもって変異は常染色体優性支配的な網膜色素変性症 (RP)、まばゆいばかりの効果的な治療法がない疾患進行として明示されるロッド視細胞死に します。我々 は誤って折りたたまれたロドプシン変異体の細胞毒性が薬理学的変異型ロドプシン蛋白を安定化により軽減できることを仮定します。他のクラス II ロドプシン遺伝子の変異の中で、P23H の突然変異は野生型ロドプシン、哺乳類の細胞膜に輸送されるに対し小胞体 (ER) の蓄積は構造的に不安定なロドプシンの変異体タンパク質をエンコードします。セルです。以前発光による高スループット画面 (HTS) を行い細胞膜と小胞体から P23H ロドプシンのトランスポートを救出した薬理学的シャペロンのグループを識別します。ここでは、高コンテンツ イメージング解析に続いて免疫染色法を使用すると、セル全体で膜上の変異型ロドプシン蛋白の量を数値化。この方法は有益であり誤次の HTS. から真のヒット数を識別するために効果的ですさらに、高コンテンツ画像解析では、各化合物の薬理学的特性評価のための単一の実験から複数のパラメーターを数値化することができました。6 関連する RP ロドプシン変異体、これらロドプシン変異体の構造安定性に関する定量的および定性的な理解のための 2 D の薬理学的プロファイルを取得に向けて 11 さまざまな化合物の効果を行ったこの試金を使用して、これらの変異体に向けてさまざまな化合物の有効性と。
Introduction
タンパクは、筋ジストロフィー、神経変性、網膜色素変性症 (RP)1を含む、まばゆいばかりの病気に関与しています。RP は継承と進歩的な網膜変性と機能とロッド視細胞や網膜色素 epitheliums (RPEs)2,3の恒常性に影響を与える 60 以上の遺伝子の突然変異に関連付けられているです。RP には現在効果的な治療法はありません。ロドプシンの突然変異は、RP の場合優性 (ad) の約 25-30% を占めています。クラス II 変異以上 150ロドプシン変異4 (ひと遺伝子変異データベース、http:/ www.hgmd.cf.ac.uk/) 中、ロッド視細胞死に貢献するロドプシン蛋白構造不安定になるとビジョンの損失5,6,7,8。P23H は北アメリカの最も頻繁なロドプシンの突然変異もクラス II ロドプシン変異9,10の典型的な例であります。その固有の構造不安定性野生型ロドプシン細胞膜5にあるに対し、誤って折りたたまれたロドプシンは哺乳類細胞の小胞体 (ER) に蓄積されます。誤って折りたたまれたロドプシン P23H 突然変異体展示支配的否定的な細胞毒性ハプロ不全により、原因ではないが、小胞体の活性化に関連しては、タンパク質分解経路と中断された棒外側セグメント組織に関連付けられます。棒の光受容器細胞ストレスを軽減するために 1 つの戦略は、薬理学的シャペロンを用いた変異型ロドプシンの折りたたみでネイティブを安定させるためにです。
この目標を達成するために行ったプラズマ輸送 P23H ロドプシンの突然変異体を定量化する β-ガラクトシダーゼ フラグメント否定回路試金を使用して細胞を用いた高スループット画面 (HTSs)11,12,13膜。この HTS アッセイの堅牢でシンプルなプロトコルでは、各画面の約 79,000 小分子の活動を探索することができました。しかし、この HTS アッセイは、発光信号を読み取っているので偽陽性 β gal 阻害剤を含む色または細胞毒性化合物に含まれますセカンダリ分析によって識別される待っているヒット リスト。
伝統的な染色と蛍光イメージング法は、哺乳類細胞5,14,,1516におけるロドプシン輸送を研究に長年使用されています。ただし、信頼性の高い画像解析が必要である非常に一貫した条件の下で撮影した画像の数が多いために、ロドプシン輸送に向けて 10 以上の化合物の薬理学的効果を定量化するこれらの従来の方法は使用できません。従来の撮像方法で不適法。ここでは、我々 は誤って折りたたまれたロドプシン変異体11,13,17のセル表面輸送を定量化する二次試験として免疫染色による高コンテンツ イメージング プロトコルを開発しました。ロドプシン細胞膜上にラベルを付ける、我々 手順をスキップした細胞膜透過と immunostained のロドプシン変異体細胞の細胞外の側でロドプシンの N 末端エピトープを認識モノクローナル抗体 (B6 30) 反ロドプシン膜18。全細胞で変異型ロドプシンを視覚化するには、金星蛍光タンパク質ロドプシンを融合しました。異なる蛍光管内の蛍光強度の定量化、我々 は細胞表面との比、セル全体で合計ロドプシン強度を含む 1 つの単一の実験から複数のパラメーターを取得することができます。ロドプシン セル全体を細胞表面に蛍光します。この方式では、合計六つの誤って折りたたまれたロドプシンの変異体を発現する細胞を安定した、これらの突然変異体の方の複数の小さい分子シャペロンの薬理学的プロファイルを生成できます。このプロトコルではすべて細胞は 384 ウェル プレートで immunostained、非常に一貫した撮像条件下で自動イメージング システムを使用してイメージを作成します。セル形状とタンパク質発現レベルの変動と細胞の不均一性による変動を低減し、600 以上細胞の画像を含む、各ウェルの画像解析が実行されます。このプロトコルのワークフローは、図 1のとおりです。このメソッドの利点は、画像ベースの分析からマルチパラ メーターの数量だけでなく、高解像度画像を得る我々 ことです。一般に、このプロトコルを変更および興味のすべての誤って折りたたまれた膜蛋白質の輸送の定量化に適用できます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
注: ロドプシン輸送アッセイ.
1. 調製と細胞の培養
- 野生型 (WT) または変異マウス ロドプシン-金星の融合蛋白質を表現する低温保持 U2OS 安定した細胞を復活させます。バイアルに小さな氷の結晶だけが残るまで、37 ° C で細胞を解凍します。
注: U2OS 細胞が使用されるこのプロトコルでの in vitro研究光受容細胞ラインはありませんロドプシンの前毛様体の生合成は哺乳類細胞で同様の分子メカニズムによって調整されます。さらに、U2OS セルはプレートの底にしっかりと接続、ロドプシン輸送アッセイに最適ですので大型の細胞体があります。7 U2OS 安定細胞 WT、T4R、P23H、P53R、C110Y、D190N と P267L ロドプシンの突然変異体を使用ここでは品質と分析の信頼性を示す例として。他のロドプシンの変異体または他の膜タンパク質を発現する安定細胞は、アッセイの目的に応じて使用できます。利用可能な場合、ヒト ロドプシンを発現する安定細胞はこの試金で使用できます。マウスとヒト ロドプシン蛋白 95% の相同性を共有し、テスト生体内でモデルを使用マウス adRP P23H 変異8ロドプシンを運ぶこの試金によって同定された化合物になりますので、マウス ロドプシンはここに使いました。安定した細胞は、19を前述のように生成されました。WT と変異型ロドプシンのトラン スクリプトの q-PCR による定量を行った、WT と変異型ロドプシンのトラン スクリプトの同じようなレベルを発現する安定細胞のクローンがこの試金のために選ばれました。ロドプシン タンパク質の発現は、イムノブロットおよび免疫染色によって確認されました。この試金で使用されるセルの通路は 20 よりも低いはずです。 - (高グルコース ダルベッコ改変イーグルの 10% 牛胎児血清 (FBS) の培地 (DMEM) と 5 μ G/ml Plasmocin) 成長培地 10 ml、15 mL の円錐管にセルのそれぞれの行を転送します。
- 上清 200 x gで 5 分間破棄でチューブを遠心し、各セルライン細胞成長培地 5 mL を細胞ペレットを再懸濁します。60 mm の組織培養皿に細胞懸濁液のそれぞれの行を転送し、, 5% CO2と 37 ° C で。
- 参照12に記載されている細胞培養皿として 90% の合流点に達するとサブカルチャー。
2. ウェルあたり 5,000 の細胞に細胞を播種
注: は、ティッシュ文化フードの次の手順を実行します。
- ポリ リジンとプレートを扱います。
- 細胞を播種する前に 1 日を扱う黒壁しポリ リジン溶液中 30 分間の 20 μ L/ウェルの 384 ウェル プレートを底をクリアします。
- 液体を吸引し乾燥 1 h. プレート蓋を戻すためにすべての井戸を許可し、細胞の播種のために夜通し 4 ° C でプレートを格納します。
- 細胞懸濁液を準備します。
- 90% 合流まで 100 mm 細胞培養用ディッシュの培地に各セルラインの文化.
- リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) でそれぞれ皿を洗うし、0.05 %1 mL の細胞をデタッチ 37 ° C でトリプシン
- アッセイ培地 (10 %fbs、100 単位/ml ペニシリン ストレプトマイシン 100 μ g/mL と高グルコース DMEM) の 10 mL のセルのそれぞれの行を再懸濁します。
- セルを数えるし、105セル/mL アッセイ中 x 1.25 にセルのそれぞれの行を希釈します。
- 細胞を播きます。
- セルの線と塗りつぶしの列 1-21 384 ウェル プレート (図 2) のあたりの 3 つの列に細胞懸濁液 40 μ L/ウェル分注するのに電子マルチ チャンネル ピペットまたは自動試薬ディスペンサーを使用します。
- U2OS の 40 μ L/ウェルを追加 (P23H-ロドプシン-ヴィーナス) と列 22-23 および U2OS の 40 μ L/ウェル (ロドプシン-金星) コントロールとして 24 の列に。
- 300 x g 30 でプレートを遠心分離機 384 ウェル プレートの下のすべてのセルをダウンさせる s。
注: は、細胞播種後プレートに物理的な衝撃を避けてください。それ以外の場合、セルは、各井戸の 1 つのコーナーに押しつぶされるが、プレートは高コンテンツ撮影に適したできません。 - 5% CO2プレートの底に付けるセルの 3 h の 37 ° C で 384 ウェル プレートを孵化させなさい。
3. 化合物とセルを扱う
- 図 2に示すように、処理条件とプレート マップを生成します。
- 96 ウェル プレートで最大 15 化合物の作業ソリューション x 5 の 300 μ L を準備します。
- Cps 1 に 15 (図 2 a) プレート 96 ウェルの井戸 A1 G2 を最終濃度 5 倍アッセイ培地を希釈します。よく H2 のアッセイ培地 300 μ L を追加します。
注: 各化合物の最終的な集中を HTS12,13P23H ロドプシンのトランスポートを救出するため最も効果的な濃度で使用は。 - 2% ジメチルスルホキシド (DMSO) ウェルあたり 100 μ L を追加し、25 μ M の 9 -cis-それぞれ列 11 と 12 にアッセイ培地で希釈されて網膜。追加 9 -シス-薄明かりの中で網膜。
- Cps 1 に 15 (図 2 a) プレート 96 ウェルの井戸 A1 G2 を最終濃度 5 倍アッセイ培地を希釈します。よく H2 のアッセイ培地 300 μ L を追加します。
- 5 x 働くと細胞 (図 2 b) 384 ウェル プレートにソリューションの井戸あたり 10 μ L を追加します。
- 列 1 に 21 (図 2) から行 A、C、E、G、I、K、M、および O に 1、3、5、7、9、11、13、および 15 の化合物を追加するのに、電子マルチ チャンネル ピペットを使用します。化合物を追加 2、4、6、8、10、12、14 と 21 に 1 列から行 B、D、F、H、J、L、N、P、M。
- 10 μ L/2 %dmso のウェルを 22 と 24 の列に追加します。9-25 μ m ウェルあたり 10 μ l 添加cis-列 23 に網膜。
注: すべての化合物は最初株式として DMSO に溶解したため、DMSO が車両制御として使用をされます。DMSO 処理セルを含む 22、P23H を表現するロドプシン 0% コントロールとして使用される、列。9 -シス-P23H ロドプシンを発現する網膜の扱われた細胞は 100% コントロールとして使用されます。
- アルミ箔で 384 ウェル プレートをカバーし、24 h の 37 ° C でプレートを孵化させなさい。
4. 膜透過ロドプシン細胞表面タンパク質を染色することがなく免疫染色。
注: は、そのまま細胞膜を維持する全体染色プロセスで任意の洗剤を避けるため。
- 16% 希釈することによって 4% パラホルムアルデヒド (PFA) の準備 1:4 容積比で化学の発煙のフードで PBS で PFA。転送 4 %pfa 試薬リザーバーで。
- 薄暗い赤い光で暗い部屋で 384 ウェル プレートを取り出してください。真空ボトルに接続された 8 ch アスピレータを使用して、軽く培地を吸引します。電子マルチ チャンネル ピペットを使用して作りたての 4% の井戸あたり 20 μ L を追加する全体の 384 ウェル プレートに PFA と室温で 20 分間インキュベートします。細胞の剥離を避けるためには、常に願望の中に各ウェルの同じ側を吸引の先端をポイントします。各ウェルの下部中央のエリアを触れないでください。画像を撮るときは、アスピレータ感動領域を避けるためにフィールドを選択します。10 分以上の孵化、蒸発を避けるためにそのふた付き 384 ウェル プレートをカバーしてください。
注: セルは 100% コントロールの結果に影響する再生バソの変質を避けるために暗い部屋で固定されます。固定後は、通常の光の下で 384 ウェル プレートを出せます。 - 各ウェルに PFA を吸引し、電子マルチ チャンネル ピペットを使用して PBS のウェルあたり 50 μ L を追加する 8 ch の吸引器を使用します。PBS で 3 つの洗浄を実行する 2 回を繰り返します。
注意: 廃棄物液体含む PFA キャップ ボトルに収集され、実験後有害化学廃棄物として処分することです。 - 全体の 384 ウェル プレートに 5% ヤギ血清の井戸あたり 20 μ L を追加することによって、細胞をブロックし、30 分間室温でインキュベートします。
- 5% ヤギ血清を吸引し、二次抗体だけ制御グループの行 P 1% ヤギ血清の O. 追加 15 μ L/ウェルに行 A に 1% ヤギ血清中 20 μ g mL-1 B6 30 反ロドプシン抗体の井戸あたり 15 μ L を追加します。
- 90 分間室温で 4 ° c または 384 ウェル プレート、一晩インキュベートします。384 ウェル プレート、fluorophores の変質を避けるためにアルミ箔をカバーします。
- PBS のウェルあたり 50 μ L で 3 回プレートを洗います。
- PBS を吸引し、5 μ g mL-1 Cy3 標識ヤギ抗マウス IgG 抗体の井戸あたり 15 μ L を追加します。アルミ箔で 384 ウェル プレートをカバーし、一晩 4 ° C、1 時間室温で孵化させなさい。
- PBS のウェルあたり 50 μ L で 3 回プレートを洗います。1 μ g mL-1 15 分間室温で核を染色するヘキスト 33342 を含む PBS のウェルあたり 50 μ L を追加します。
- イメージングの前に透明フィルムで 384 ウェル プレートをシールします。アルミ箔で 384 ウェル プレートをカバーし、画像がすぐにとられる場合週まで 4 ° C で保管します。
5. イメージング.
注: この高コンテンツ イメージング手順、材料表に記載されているイメージング システムに適応。プロシージャは、他高コンテンツ イメージング システムを使用している場合は異なることがあります。
- ふたを外すし、プレートの左上隅に配置されている A1 と高コンテンツ イメージャに 384 ウェル プレートを入れた。
- 画像のパラメーターを設定できる画像集録ソフトを開きます。
- プレート取得セットアップ ウィンドウを開くと新しい設定を作成または既存の設定ファイルを読み込みます。
- 20 × 対物を選択し、ピクセルビニング 2 として校正のピクセル サイズは 0.80 × 0.80 μ m 設定スキャン ライン 2,000 とイメージのサイズ (W × H) サイトあたり 1,000 x 1,000 ピクセル (800.00 800.00 μ m x) として。
- イメージを作成するプレートの種類を選択します。384 ウェル プレートの製造元によって提供される情報を使用して、プレートの寸法を記入します。
- 384 ウェル プレートのイメージを作成する井戸を選択します。
- ウェルあたりイメージを作成する 4 つのサイトを選択します。吸引のヒントも感動の側面を避けてください。
- 405、励起レーザを選択 488 561 nm。排出フィルター DAPI、FITC とテキサスの赤のチャンネルを選択します。レーザー パワーを最適化し、肯定的な制御の井戸から撮影した画像の明るさを確保するため各チャンネルのゲインは飽和のしきい値未満。
- オート フォーカスのための井戸からもフォーカスを選択します。最初よくサンプルを見つけることは、初期として取得を選択します。すべてのサイトにサイトのオート フォーカスを設定します。
- 各チャンネルに 1 回線あたり 4 つの平均値を選択します。各チャンネルの Z オフセットの値を最適化します。
- 画像を確認する 384 ウェル プレートの対角コーナーで 2-3 井戸があるフォーカスの以上 40% の合流およびすべてのチャンネルの蛍光強度と細胞すべてテスト井戸、井戸ごとのすべてのサイトからの画像の約半分で飽和する 100% テスト 井戸を制御します。
- 画像の取得方法を保存します。
- プレート全体を実行します。撮像素子を出発する前に画像の品質を再確認するプレートの最初の列から画像の取り込みが完了するまでは、撮像素子を見る。384 ウェル プレートを取るし、将来の使用のための 4 ° C で保存します。
注: も、撮影したチャンネルごとに選択したサイトの数、に応じてイメージング 1 384 ウェル プレートを完了する 3 h 40 分がかかります。
6. 画像解析。
- 高コンテンツ イメージ解析ソフトウェアを使用してイメージ データを引き出します。パラメーターを設定する 100% コントロール井戸 (列 23) のいずれかを選択します。
- 分析方法として多波長セル得点を選択し、設定の構成を開始します。
- DAPI チャネルからのイメージを使用して核を定義します。プレビュー選択した定義された核形も核のイメージとうまく合っているかどうかを確認します。
- ロドプシン-金星のイメージ、FITC チャンネルでセルの形状を定義します。
- テキサスの赤チャネルのロドプシン細胞表面の染みの領域を定義します。
- 5 井戸の設定が最適化されたかどうかを決定するために現在のアルゴリズムをテストします。設定を保存し、設定ウィンドウを閉じます。
- 最適化された解析メソッドですべての井戸を実行します。
- そのまま携帯番号としてオブジェクト番号をエクスポートします。ロドプシン-金星の輝度 (ロドプシン-金星は INT) を FITC チャンネルの平均強度をエクスポートします。細胞膜 (細胞膜におけるロドプシン INT) のロドプシンの強度としてテキサス赤チャネルの平均強度をエクスポートします。
- 表計算ソフトでエクスポートしたデータを開きます。MEM 率としてロドプシン-金星 INT によって細胞膜におけるロドプシンの強度を分割します。Z を計算する '-要因分析の質を評価するパラメーターごとに。スプリアス = 1−3X (STD100% 制御+STD0% 制御)/|100% コントロール−Mean0% 制御を意味 |
注: Z'-0 高コンテンツ画面と Z のため十分な適度なアッセイより高い係数 ' 0.5 ~ 1 の係数は、高スループット画面20,21に必要な優れたアッセイを示唆しています。 - 表計算ソフトを使用して、各パラメーターの 2 色ヒート マップを生成します。X 軸の細胞と y 軸上の化合物の名前を配置します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
我々 は 3 つのパラメーターを持つロドプシン トランスポートを特徴付けられる: 全体のセル (ロドプシン-金星は INT)、ロドプシンの細胞膜 (細胞膜におけるロドプシン INT) の染色強度との比でロドプシン-金星強度ロドプシン ロドプシン-金星度のセル全体 (MEM 総比率) 細胞表面の汚れ。ロドプシン輸送アッセイの代表的な結果を図 3 図 4に示します。DMSO と 9 を使用してcis-網膜治療、それぞれ 0 と 100% コントロール P23H ロドプシン金星を表現するセル Z'-これらの 3 つのパラメーターは、0 から 0.5、アッセイは、中程度の品質を持っていることを示唆している間の範囲のための要因高コンテンツ画像21のために十分。にもかかわらず、最適化された Z'-要因は、HTS アッセイに比べて、比較的複雑なプロシージャのための 0.5 よりも低く、この試金はまだ堅牢で信頼性の高い画像ベースの分析。誤って折りたたまれたロドプシンを救う活性化合物細胞の表面と MEM 率P値が 0.05 よりも低く、DMSO よりもロドプシン INT の高い値が表示されます。3 つの 2-d ヒート マップは、平均ロドプシン量とセル (図 4) ごとの局在を比較するこれらの 3 つのパラメーターから生成されました。トリプリケートで繰り返し、WT と 6 ロドプシン変異体が水平方向に表示されます、垂直複合治療の効果を比較します。先行研究と一致して、ロドプシン細胞表面と MEM 合計比 INT を 6 変異体の取り扱いを DMSO (図 4)5,22,23WT ロドプシンと比較して低くなっています。セルの表面と MEM の率そのロドプシン INT 増加 9 -cis-網膜治療、T4R、P23H、D190N、P267L がない P53R または C110Y 変異体の示唆 9 -cis-網膜を救う、T4R の輸送P23H、D190N、P267L ロドプシンの変異体。すべての cps は、T4R、P23H、D190N の細胞膜におけるロドプシンの INT でさまざまなレベルの増加を示した。Cps 3、4、5、7、8、11 には、ロドプシン-金星 INT はなく、これらのロドプシンの変異体は、これらの化合物のみロドプシン量を増加したことを示唆しているの MEM の合計の比が増加しました。Cps 1, 2 6, 9 では、これらの化合物が細胞膜にはこれらロドプシンの突然変異体の輸送を救うことを示唆、T4R、P23H、D190N、P267L のロドプシン突然変異体の MEM の合計比率大幅増加しました。2 D プロファイルは、さまざまな薬理学的治療で軽減できる、これらの関連付けられた adRP の突然変異によって影響を受けるロドプシン トランスポートの包括的な概観を提供します。
図 1: ロドプシン輸送アッセイのワークフロー 。ロドプシン トランスポートの試金のための膜透過せずロドプシンの細胞表面染色の手順。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 5 x 作業ソリューションおよび 384 ウェル プレートに 96 ウェル プレートから液体転送の準備のためイラスト。(A) 作業ソリューション x 5 の 96 ウェル プレート レイアウト。G2 に井戸 A1 列 1 および 2 の示すため、作業ソリューションおよびアッセイ ミディアム (M) x 15 5 までの井戸あたり 300 μ L をあります。14 と 15 の化合物は 2 %dmso、25 μ M の 9 -シス-網膜、WT と変異型ロドプシンを表現する 7 つの細胞を治療のためにそれぞれ。11 と 12 の列が 2 %dmso の 9-25 μ M ウェルあたり 100 μ L をあるまた、cis-網膜を制御する, Z の計算のための P23H ロドプシンを発現している細胞に扱われる '-要因。(B) セルの種類と治療条件の 384 ウェル プレート レイアウト。WT、T4R、P23H、P53R、C110Y を発現している U2OS 細胞、D190N と P267L ロドプシン-金星が示すようにシードされます。処理条件は、青で表示されます。ピンクとブルーのヒントは、マルチ チャンネル ピペットを使用して 384 プレートに 96 ウェル プレートから井戸-井戸液体搬送を実演します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 代表的な画像化ロドプシン輸送アッセイのコントロール。(A) 金星蛍光 (緑) と WT または P23H ロドプシン-金星を発現する U2OS 細胞の細胞表面免疫染色 (赤) DMSO や 9-5 μ M で治療シス-レチナール。スケール バー = 200 μ m。 (B) A 列のプロット (ロドプシン-金星は INT) セル全体でロドプシン量を表すセルごとの平均震度の金星。p< 0.0001。Z'-要因は黒い線の下に表示します。列の値とエラー バーは、平均と標準偏差 (標準偏差) 16 複製のそれぞれ。(C) A 列プロットのロドプシンの細胞膜 (細胞膜におけるロドプシン INT) 上のステンド グラスを表すセルあたり Cy3 強度を意味します。(D) の列はセルあたりの平均 cy3 強度比の全細胞のレベル (メモリの合計比率) 細胞膜におけるロドプシンのレベルの比を表すセルあたり金星強度を意味するプロット。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: として 2 色ヒート マップを示すロドプシン輸送アッセイの代表的なハイコン テント分析します。(A) のヒート マップは、全細胞のロドプシン レベル (ロドプシン-金星は INT) を表すセルあたり金星強度を意味します。各ブロックは、データ ポイントを表し、各条件は 3 通で試験しました。色の凡例は、左側に表示されます。Cp、化合物。(B) のヒート マップは、ロドプシンの細胞膜 (細胞膜におけるロドプシン INT) 上のステンド グラスを表すセルあたり Cy3 強度を意味します。(C) 平均細胞レベル (メモリの合計比率) 細胞膜におけるロドプシンのレベルの比を表すセルあたり金星強度平均値にセルごと Cy3 強度の熱マップ。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ここでは、ヒット、HTS. から識別の特性評価に使用される高いコンテンツ イメージング アッセイを示したこれらのプロトコルに関連する唯一のオートメーションは高固体撮像素子です。染色とロドプシンの蛍光イメージングは、ロドプシン5,14,15,16のローカリゼーションを特徴付けるために一般的に使用されています。しかし、従来の撮像方法で撮影した画像の定量化は、1 つの条件、実験、あたりのイメージの低容量で品質管理パラメーターの不足十分な細胞像の欠如によって制限されます。我々 は 384 ウェル フォーマットに伝統的な染色プロトコルに適応、高コンテンツ イメージングに伝統的なイメージングを置き換え。この高コンテンツ イメージング プロトコルを使用して、我々 は正常に選択され、HTS11,13,17によって識別されるヒットの活動が特徴します。伝統的な染色とイメージングの方法と比較して、このプロトコルは大幅撮影条件、イメージングの容量、および薬理学的効果を定量的に比較することができたイメージ分析力の一貫性を増加6 adRP の輸送に向けて 11 化合物の変異体ロドプシンを関連付けられています。
ロドプシン免疫染色・ イメージングのために以前使用されているプロトコルと比較してこのプロトコルの主要な変更: クリア下 384 ウェル プレート; (1) 成長と免疫細胞(2); 高固体撮像素子を用いた細胞のイメージング高コンテンツ画像解析ソフトの (3) の分析データ。これらの変更により初期最適化は最高の細胞播種数、抗体濃度、撮像条件、および画像解析アルゴリズムを見つけるために必要です。
プロトコルの重要なステップが含まれます: (1) 固定; 前に 50-70% の合流ができる細胞を播種(細胞の剥離を避けるために 2) 注意してください願望(2) 画像焦点上にあるかどうかを確認し、すべてのチャンネルの蛍光を発する全体のプレートの間でいくつかの井戸をイメージング全体の板をイメージングする前に肯定的な制御井戸用撮像素子のしきい値の半分を超えていない(3) Z'-因子分析の信頼性の確保に 0 より大きい。
このプロトコルのため発生する可能性が最も一般的な問題は、細胞の剥離と低 Z'-要因。最初の問題を避けるためには、細胞接着を促進し Hek293 細胞など簡単にデタッチ セルラインを使用しないようにポリ-L-リジンの 384 ウェル プレートを前処理します。また、吸引中に各ウェルの片側のみをタッチして選択するイメージングの各ウェルの反対側に吸引チップを制限します。Z を改善するために '-因子と細胞細胞の形またはソフトウェアによって定義された核形は各蛍光チャネル内の各オブジェクトとよく合うように番号と画像の解析パラメーターを播種を最適化分析品質。
すべての細胞で細胞表面ターゲット蛋白質のレベルを計算するロドプシン輸送、細胞表面 ELISA など β-ガラクトシダーゼ フラグメント否定回路試金を定量化するための他の方法と比べてこの高コンテンツ イメージング法の定量化します。セルあたりの平均タンパク質レベルこのユニークな機能は、重要な変動要因、その他の方法で最終の読み出しに影響を与えるセル数を回避できます。さらに、イメージし、高コンテンツ イメージング法による定量化のセル数が多いためパラメーターはレプリケートします、したがって、アッセイの信頼性の変化が少なく、よく示したあたりのすべてのセルの平均。
このプロトコルの制限の 1 つは、高温超伝導、その比較的複雑な手順と時間をイメージング プレートごと 2 h のための最高のアッセイではないことです。したがって、我々 は 5,000 以上の化合物を大規模な小分子ライブラリをスクリーニングするための代替記者アッセイをお勧めします、集束特性試金未満 100 化合物に限定にこの高コンテンツ イメージング プロトコルを使用します。このプロトコルの第 2 の制限は、金星蛍光または染色蛍光強度がセルあたりロドプシン蛋白量の量で線形相関にかどうかを表示する標準の欠如です。免疫染色による飽和を避けるため、テストおよび第一次および二次抗体の濃度の異なる培養細胞の染色強度をプロットをお勧めします。蛍光変化の線形範囲内抗体濃度を選択します。
現在のアプリケーションから拡大画像からこれらの化合物の薬理学的データベースを生成 10 の化合物までで治療中 28 異なるロドプシンの変異体と一過性トランスフェクション細胞のロドプシン トランスポートを定量化します。指導これらロドプシンの突然変異を運んでいる adRP 患者に潜在的な治療のための活動。このプロトコルには、他のタンパク質フォールディング病の薬の発見の役に立つでしょう興味のあらゆる膜蛋白質の転置の試金に簡単に適応することができます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
我々 は博士マーク E. Schurdak に感謝し、ピッツバーグ大学創高コンテンツ イメージャと初期研修を提供する研究所します。博士クシシュトフ ・ Palczewski (ケース ウェスタン リザーブ大学) は寛大 B630 反ロドプシン抗体と 1 4 を共有しました。マウス ロドプシン-金星コンストラクトの cDNA を含んでいるプラスミッド博士ネビン ・ ランバート (オーガスタ大学) で共有されていました。この仕事は、健康からの助成金 EY024992 YC と P30EY008098 にピッツバーグ大学ビジョン研究コア付与の国立研究所によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| U2OS (rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (T4R-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P23H-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P53R-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (C110Y-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (D190N-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P267L-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| DMEM high glucose | Genesee Scientific | 25-500 | With L-Glutamine, sodium pyruvate |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16140071 | Heat inactivated |
| Plasmocin | InvivoGen | ant-mpt | Mycoplasma elimination reagent |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Gibco | 15140122 | 100X concentrated antibiotic solutions to prevent bacteria contamination of cell cultures |
| Trypsin-EDTA | Genesee Scientific | 25-510 | 0.25%, 1mM EDTA in HBSS without calcium and magnesium |
| Poly-L-lysine solution | Sigma-Aldrich | P4707-50ML | Mol wt 70,000-150,000, 0.01%, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| CellCarrier-384 Ultra Microplates | PerkinElmer | 6057300 | 384-well tissue culutre-treated microplates with black well walls and an optically -clear cyclic olefin bottom for imaging cells in high content analysis |
| Sterile 96-well plate | Eppendorf | 30730119 | Tissue culture treated with lid flat bottom, sterile, free of detectable pyrogens, Rnase, DNase and DNA. Non-cytotoxic |
| Phosphate Buffered Sailine (PBS) | Invitrogen | AM9625 | 10 x PBS Buffer, pH 7.4 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D4540 | >99.5%, cell culture tested |
| 9-cis-retinal | Sigma-Aldrich | R5754 | |
| Compounds tested | Selleckchem/Life Chemicals/Custom synthesized | NA | Compounds were purchased from different vendors or custom synthesized |
| B6-30 anti-rhodopsin antibody | Novus | NBP2-25160 | Gift from Dr. Krzysztof Palczewski |
| Cy3-conjugated goat anti-mouse secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc | 115-165-146 | |
| 16% paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Methanol-free |
| 10% Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | 50062Z | Blocking buffer |
| Hoechst 33342, Trihydroch | Invitrogen | H3570 | Nuclear staining solution |
| High-content imager | Molecular Devices | ImageXpress | ImageXpress® Micro Confocal High-Content Imaging System |
| MetaXpress high-content image acquisition and analysis software | Molecular Devices | MetaXpress | High-content image acquisition and analysis software |
| Multichannel pipette (0.5-10 µL) | Rainin | 17013802 | Manual 8-channel pipette, 0.5-10 µL |
| Multichannel pipette (0.5-10c | Rainin | 17013805 | Manual 8-channel pipette, 20-200 µL |
| Electronic multichannel pipette (10-200 μL) | Thermo Scientific | 14-3879-56BT | Electronic multichanenel pipette for 96- and 384-well microplate pipetting tasks |
| 50ml Reagent Reservoir | Genesee Scientific | 28-125 | Reagent reservior for multichannel pippte dispensing |
| 8-Channel aspirator | ABC Scientific | EV503 | 8-Channel stainless steel adaptor for aspirating liquids from 96- or 384-well plates |
| Excel spreadsheet software | Microsoft | Excel2016 | The spreadsheet software for data analysis and heatmap generation |
| Origin2018 scientific data analysis and graphing software | OriginLab | Origin2018 | The data analysis software for generating the dose response curves |
References
- Gregersen, N., Bross, P., Vang, S., Christensen, J. H.
- Daiger, S. P., Bowne, S. J., Sullivan, L. S. Perspective on genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Archives of Ophthalmology. 125 (2), 151-158 (2007).
- Daiger, S. P., Sullivan, L. S., Bowne, S. J. Genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Clinical Genetics. 84 (2), 132-141 (2013).
- Stenson, P. D., et al. The Human Gene Mutation Database: towards a comprehensive repository of inherited mutation data for medical research, genetic diagnosis and next-generation sequencing studies. Human Genetics. 136 (6), 665-677 (2017).
- Sung, C. H., Schneider, B. G., Agarwal, N., Papermaster, D. S., Nathans, J. Functional heterogeneity of mutant rhodopsins responsible for autosomal dominant retinitis pigmentosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (19), 8840-8844 (1991).
- Athanasiou, D., et al. The molecular and cellular basis of rhodopsin retinitis pigmentosa reveals potential strategies for therapy. Progress in Retinal and Eye Research. 62, 1-23 (2018).
- Chiang, W. C., et al. Robust Endoplasmic Reticulum-Associated Degradation of Rhodopsin Precedes Retinal Degeneration. Molecular Neurobiology. 52 (1), 679-695 (2015).
- Sakami, S., et al. Probing mechanisms of photoreceptor degeneration in a new mouse model of the common form of autosomal dominant retinitis pigmentosa due to P23H opsin mutations. Journal of Biological Chemistry. 286 (12), 10551-10567 (2011).
- Dryja, T. P., et al. Mutations within the rhodopsin gene in patients with autosomal dominant retinitis pigmentosa. New England Journal of Medicine. 323 (19), 1302-1307 (1990).
- Sohocki, M. M., et al. Prevalence of mutations causing retinitis pigmentosa and other inherited retinopathies. Human Mutation. 17 (1), 42-51 (2001).
- Chen, Y., et al. A novel small molecule chaperone of rod opsin and its potential therapy for retinal degeneration. Nature Communications. 9 (1), 1976 (2018).
- Chen, Y., Tang, H. High-throughput screening assays to identify small molecules preventing photoreceptor degeneration caused by the rhodopsin P23H mutation. Methods in Molecular Biology. 1271, 369-390 (2015).
- Chen, Y., et al. A High-Throughput Drug Screening Strategy for Detecting Rhodopsin P23H Mutant Rescue and Degradation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (4), 2553-2567 (2015).
- Noorwez, S. M., et al. Pharmacological chaperone-mediated in vivo folding and stabilization of the P23H-opsin mutant associated with autosomal dominant retinitis pigmentosa. Journal of Biological Chemistry. 278 (16), 14442-14450 (2003).
- Saliba, R. S., Munro, P. M., Luthert, P. J., Cheetham, M. E. The cellular fate of mutant rhodopsin: quality control, degradation and aggresome formation. Journal of Cell Science. 115, 2907-2918 (2002).
- Kaushal, S., Khorana, H. G. Structure and function in rhodopsin. 7. Point mutations associated with autosomal dominant retinitis pigmentosa. Biochemistry. 33 (20), 6121-6128 (1994).
- Chen, Y., Brooks, M. J., Gieser, L., Swaroop, A., Palczewski, K. Transcriptome profiling of NIH3T3 cell lines expressing opsin and the P23H opsin mutant identifies candidate drugs for the treatment of retinitis pigmentosa. Pharmacological Research. 115, 1-13 (2016).
- Adamus, G., et al. Anti-rhodopsin monoclonal antibodies of defined specificity: characterization and application. Vision Research. 31 (1), 17-31 (1991).
- Goodson, H. V., Dzurisin, J. S., Wadsworth, P. Generation of stable cell lines expressing GFP-tubulin and photoactivatable-GFP-tubulin and characterization of clones. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (9), pdb prot5480 (2010).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Bray, M. A., Carpenter, A., et al. Advanced Assay Development Guidelines for Image-Based High Content Screening and Analysis. Assay Guidance Manual. Sittampalam, G. S., et al. , Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. Bethesda (MD). (2004).
- Sung, C. H., Davenport, C. M., Nathans, J. Rhodopsin mutations responsible for autosomal dominant retinitis pigmentosa. Clustering of functional classes along the polypeptide chain. Journal of Biological Chemistry. 268 (35), 26645-26649 (1993).
- Krebs, M. P., et al. Molecular mechanisms of rhodopsin retinitis pigmentosa and the efficacy of pharmacological rescue. Journal of Molecular Biology. 395 (5), 1063-1078 (2010).
