Summary
כאן, אנו מציגים סדרה סטנדרטית של פרוטוקולים להתבונן sulcus עינית, נעלה את מבנה שזוהתה לאחרונה, והתפאורה אבולוציונית בעיניים חוליות. באמצעות רימות דג זברה, נדגים טכניקות הדרושות כדי לזהות גורמים שתורמים היווצרות וסגירת sulcus עינית מעולה.
Abstract
Coloboma עינית מולדת היא הפרעה גנטית זה בדרך כלל נצפית כמו בקע בהיבט נחות של העין הסגר פיסורה דמית העין לא שלם. לאחרונה, הזיהוי של אנשים עם coloboma בהיבט מעולה של איריס, רשתית, עדשה הובילו הגילוי של מבנה הרומן, מכונה מעולה פיסורה או sulcus עינית סופריור (SOS), כי קיים transiently על מהראש ההיבט של גביע הראייה במהלך התפתחות העין חוליות. למרות המבנה כולו על פני עכברים, חומוס, דג, ניוט, ההבנה הנוכחית שלנו של אות המצוקה היא מוגבלת. כדי להבהיר גורמים שתורמים שלה היווצרות, הסגר, זה הכרחי כדי שניתן יהיה לבחון אותה ולזהות מומים, כגון עיכוב הסגר ה'אס. כאן, אנחנו יצא כדי ליצור סדרה סטנדרטית של פרוטוקולים יכול לשמש ביעילות להמחיש אות המצוקה על ידי שילוב של טכניקות במיקרוסקופ נרחב זמין עם טכניקות ביולוגיה מולקולרית נפוצות כגון צביעת immunofluorescent mRNA ביטוי. בעוד זו קבוצה של פרוטוקולים מתמקד היכולת להתבונן SOS הסגר עיכוב, היא יכולת הסתגלות לצרכים של הנסיין, ניתן לשנות בקלות. בסך הכל, אנו מקווים ליצור שיטה נוחה שדרכו ניתן מתקדמים ההבנה שלנו של אות המצוקה כדי להרחיב את הידע הנוכחי של התפתחות העין חוליות.
Introduction
היווצרות של העין חוליות הוא תהליך מאוד שנשמרת בו מתוזמר בקפידה איתות המסלולים המערכת לקבוע סוגי רקמות, ציין הזהות האזורית1. לפליטת עד תחילת מורפוגנזה עין לגרום פגמים מעמיקה הארכיטקטורה של העין, לעתים קרובות מסנוור2. מחלה אחד כזה נובע הכשל כדי לסגור את פיסורה עינית דמית העין בצד הגחוני של גביע אופטיים3. הפרעה זו, המכונה coloboma עינית, מעריכים כי ב- 1 מתוך 4-5000 לידות חי ו- % 3-11 לגרום לעיוורון בילדים, מפגין נפוץ כמו מבנה דמוי מנעול זה בולטת האישון במרכז עין4, נלסון! 5,6. הפונקציה של פיסורה דמית העין היא כדי לספק נקודת כניסה מוקדמת להערכת גדל לתוך הכוס אופטיים, לאחר מכן צידי פיסורה הפתיל כדי להקיף את כלי7.
בעוד coloboma עינית ידוע מאז ימי קדם, לאחרונה זיהינו תת-קבוצה הרומן של coloboma חולים עם איבוד רקמות המשפיעים על ההיבט סופריור/הגבי של העין. עבודה במעבדה שלנו הובילה לגילוי של מבנה עינית בעין דג זברה הגבי, שאותם אנו מכנים sulcus עינית סופריור (SOS) או פיסורה מעולה8. חשוב לציין כי המבנה יש מאפייני sulcus והן סדק. בדומה sulcus, זה שכבת רקמת מתמיד החובקת מ אפי אל הרשתית טמפורלית. בנוסף, הסגר של המבנה שאינו מתווך על ידי שילוב של השניים מנוגדים קרום המרתף, ונראה לדרוש morphogenetic תהליך שבו המבנה מאוכלס על ידי התאים. עם זאת, בדומה סדק, היא יוצרת מבנה המפריד את האף ובצד הטמפורלי של העין הגבי עם קרום המרתף. עקביות, נתייחס אליו כמו SOS בטקסט זה.
אות המצוקה אבולוציונית כולו לאורך החוליות, להיות גלוי במהלך מורפוגנזה עין דג, צ'יק, ניוט ו העכבר8. בניגוד פיסורה דמית העין, אשר נמצא במקום מ- 20-60 שעות שלאחר ההפריה (hpf) בדג זברה, אות המצוקה הוא מאוד חולף, להיות גלויים בקלות מ- 20-23 hpf, נעדר מאת 26 hpf8. מחקר שנערך לאחרונה במעבדתנו נמצא כי, בדומה פיסורה דמית העין, אות המצוקה ממלאת תפקיד הדרכה כלי הדם בזמן העין מורפוגנזה8. למרות הגורמים השולטים על היווצרות וסגירת אות המצוקה אינם עדיין לגמרי מובנים, הנתונים שלנו הדגש תפקידי עין הגבי הגחוני / תכנים גנים8.
דג זברה היא אורגניזם מודל מצויין ללמוד אות המצוקה. כמערכת מודל, היא מספקת מספר יתרונות בלימוד התפתחות העין: זה מודל חוליות; כל דור תערוכות פוריות גבוהה (~ 200 עוברי); הגנום שלו יש כבר וסודרו באופן מלא, אשר מקלה על מניפולציה גנטית; כ- 70% של גנים אנושיים יש לפחות אחד orthologue דג זברה, שהופך אותו מודל אידיאלי מבוסס-גנטיקה של מחלות אנושיות9,10. והכי חשוב, התפתחותו לוקח מקום חיצוני עם האמא, הזחלים שלה הם שקופים, מה שמאפשר עבור הפריט החזותי של העין לפתח בקלות יחסית11.
בקבוצה זו של פרוטוקולים, נתאר את הטכניקות שדרכו ניתן לאבחן אות המצוקה של דג זברה הזחלים. מגוון רחב של טכניקות הדמיה השתמשו בדוח זה יאפשר התבוננות ברור ה'אס במהלך התפתחות העין נורמלי, כמו גם את היכולת לזהות פגמים הסגר SOS. הפרוטוקולים בדוגמה שלנו יכלול חקירות של Gdf6, BMP מקומית מהראש ועין וסת הידועות של SOS הסגר. יתרה מזאת, טכניקות אלה יכול להיות משולב עם ניסיוני מניפולציות כדי לזהות גורמים גנטיים או סוכנים תרופתי המשפיעים על היווצרות SOS הנכונה וסגירת. בנוסף, כללנו פרוטוקול שדרכו אפשרית ההדמיה פלורסנט של כל קרום התא, המאפשר הנסיין לבחון שינויים מורפולוגיים לתאים שסביבה אות המצוקה. המטרה שלנו היא להקים קבוצה של פרוטוקולים סטנדרטיים יכול לשמש בכל רחבי הקהילה המדעית להציע תובנות חדשות זה מבנה הרומן של העין המתפתח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי אוניברסיטת אלברטה חיה אכפת והוועדה שימוש.
1. פרוטוקול 1: ויזואליזציה של SOS באמצעות stereomicroscopy ודימות ניגודיות (DIC) התערבות דיפרנציאלית
- אוסף העובר
- בתוך מיכל מים dechlorinated, הכן חוצה של gdf6a+ /- דג זברה בשעות הערב על ידי זיווג דג זכר עם דג הנשי. להיות בטוח להפריד את הזכר הנקבה באמצעות מחיצה כדי להבטיח העוברים נולדו בטווח קטן של הזמן.
- למחרת בבוקר, למשוך את המפריד, לאפשר את דג זברה להתרבות במשך יותר מ-30 דקות לאסוף את העוברים בתוך צלחות פטרי עם מדיה E3, תיאר את הספר דג זברה12, ולמקם אותם בתוך חממה 28.5 ° C.
- להסיר את כל הביצים מופרית או עוברי המת, אשר תופיע לבנה ואטומה.
- הדמיה חיה של דג זברה העוברים והכנה
- בגיל 20 hpf, החלף E3 מדיה עם E3 המדיה המכילה 0.004% 1-phenyl 2-thiourea (פרופילתיואוראציל) כדי למנוע ייצור פיגמנט.
הערה: תוספת של פרופילתיואוראציל ב timepoint מעט מאוחר יותר, כגון hpf 22-24, סביר להתערב עם הניסוי בגלל גילו מוקדם של העוברים בזמנו של הדמיה. עם זאת, מומלץ להתייחס העוברים מוקדם כדי למנוע פיגמנטציה לחלוטין כמו שיש להקה של פיגמנטציה המופיעה בעיניים הגבי, אשר עלולים להפריע ההדמיה ה'אס. - להבטיח כי כל העוברים בשלבים התפתחותיים הנכון בנקודות שונות שהובילו הזמן של התבוננות. מומלץ כי זאת בשלבים-somite איזה מספר הוא נראה בבירור כפי שתואר על ידי קימל ואח13. הסר את אלה הן ילדותי נכה.
- מקם את העוברים תחת מיקרוסקופ ויבתר ולאחר dechorionate בסדר העוברים על ידי משיכה עדינה לגזרים את chorion באמצעות מלקחיים. דמיינו את SOS בעיניים הגבי. אות המצוקה עשוי להופיע ההזחה בקצה תחום הגבי של העין, קו צריך להיות גלויים על פני העין הגבי. לסגירה SOS נורמלי, לבחון את העוברים-סביב hpf 20-23. בחינת פנוטיפים הסגר SOS מושהית, לבחון את העוברים בגיל 28 hpf או מאוחר יותר.
- למיין את העוברים המציגים SOS עיכוב הסגר מאלה אינם.
- לצלם אלה העוברים באמצעות מיקרוסקופ ויבתר, להכין צלחת פטרי המכיל 1% agarose ב E3. . שמוק בקלילות במרכז agarose כדי ליצור בור רדוד שבו החלמון של העובר יכול לשבת כאשר העובר מניחים על agarose פעולה זו תבטיח כי העובר הוא לא בזווית אלכסונית כאשר להצטלם.
- עזים ומתנגד העוברים עם 0.003% tricaine E3 ובמקום רוחבית על agarose.
- לשיקוף העוברים באמצעות מיקרוסקופ מורכב או קונאפוקלית, להעביר את העובר לתוך 35 מ מ פטרי המכילות סיילין קטנים שאינם הג'לי 1% התכה נמוכה נקודת agarose ב E3 (w/v). במהירות הצב העובר רוחבית באמצעות חוט דיג בסדר או עפעף ולחכות agarose להתקרר. לאחר agarose המשרד, שופכים מספיק E3 לתוך המנה כדי לכסות את agarose. לקבלת פרטים נוספים, עיין Distel ו- Köster14.
הערה: אם משתמשים במיקרוסקופ הפוכה, העובר ניתן להציב נגד הזכוכית של צלחת זכוכית-coverslip-התחתון ו עם תמונה של 20 תקן X עדשה אובייקטיבית. - השתמש עדשה המטרה מים 20 x טבילה להמחיש את אות המצוקה עם מיקרוסקופ המתחם. בעקבות ויזואליזציה, בעדינות למשוך את agarose מן העוברים לתקן ב 4% paraformaldehyde (PFA) או מאפשרים המשך התפתחותם.
- בגיל 20 hpf, החלף E3 מדיה עם E3 המדיה המכילה 0.004% 1-phenyl 2-thiourea (פרופילתיואוראציל) כדי למנוע ייצור פיגמנט.
2. פרוטוקול 2: כולה-הר immunofluorescent כתמים laminin
- כולה-הר immunofluorescent כתמים laminin: יום 1
- Dechorionate עוברי כפי שמתואר בשלב 1.2.3, אם לא עשית. לתקן את העוברים בצינור microcentrifuge-timepoint הרצוי טרי 4% PFA כבר שעתיים על מטרף בטמפרטורת החדר (22-25 ° C). תשטוף 1 x PBST במשך 5 דקות, ארבע פעמים.
הערה: בעקבות gastrulation, העוברים עשויה לפתור יותר לאחר dechorionation. - Permeabilize עוברי ב 10 מ"ג/מ"ל proteinase K בטמפרטורת החדר במשך זמן הדגירה 5 דק תהיה תלויה השלב ההתפתחותי שבו קבועים העוברים (ראה Thisse ו- Thisse15).
- תשטוף 1 x PBST במשך 5 דקות, ארבע פעמים.
- לחסום את העוברים בריכוז של 5% עז סרום ו- 2 מ"ג/מ"ל שור אלבומין (BSA) ב- 1xPBST עבור 1-2 h במטרף בטמפרטורת החדר.
- להכין נוגדן ראשוני פתרון על ידי דילול ארנב נוגדן anti-laminin בפתרון בלוק-לדילול 1:200.
- דגירה העוברים ב- anti-laminin נוגדן ראשוני בן לילה על מטרף 4 ° C.
- Dechorionate עוברי כפי שמתואר בשלב 1.2.3, אם לא עשית. לתקן את העוברים בצינור microcentrifuge-timepoint הרצוי טרי 4% PFA כבר שעתיים על מטרף בטמפרטורת החדר (22-25 ° C). תשטוף 1 x PBST במשך 5 דקות, ארבע פעמים.
- כולה-הר immunofluorescent כתמים laminin: יום 2
- תשטוף 1 x PBST למשך 15 דקות, 5 פעמים.
- להכין נוגדן משני פתרון על ידי דילול עז ארנב נגד נוגדן אלקסה עבור חיל הים 488 1 x PBST לדילול 1:1000.
הערה: זה אפשרי להתאים את שלב זה כדי להתאים את המשאבים הזמינים כדי הנסיין באמצעות נוגדנים משניים שונים של... - דגירה העוברים ב נוגדן משני בן לילה על מטרף 4 ° C. להגן מפני אור במידת האפשר משלב זה ואילך.
- תשטוף 1 x PBST למשך 15 דקות, 4 פעמים. ניתן לאחסן את העוברים ב 4 מעלות צלזיוס במשך שבוע, במידת הצורך.
- דיסקציה, הרכבה של העיניים עובריים
- אם רצונך בכך, למקם את העוברים בצלוחית קטנה, deyolk את העוברים 1 x PBST. לעשות זאת באמצעות שיבוש החלמון עם מלקחיים בסדר והסרת התאים חלמון דרך גירוד עדין של שק החלמון בעדינות.
- להכין את ריכוזי PBS-גליצרול סדרת פתרונות microcentrifuge צינורות הבאים: גליצרול 30%, 50% ו- 70% ב- PBS. העברת העוברים לתוך 30% גליצרול/PBS, מקפיד למקם את העוברים על הפתרון והעברת קטן. של הפתרון הקודם ככל האפשר. המתן העוברים לשקוע לתחתית הצינור.
- כאשר עוברי טבענו לתחתית, להעביר אותם ל 50% גליצרול/PBS. חזור על ולהעביר ל-70% גליצרול/PBS.
- ברגע העוברים טבענו ב-70% גליצרול/PBS, להעביר אותם אל צלחת פלסטיק קטן עבור ניתוח.
- סבר האחורי כדי hindbrain העובר, ולהשתמש הרקמה האחורי עבור genotyping, במידת הצורך.
- להזיז את הראש שקופית מזכוכית, העברת כמו גליצרול קטן ככל האפשר. להשתמש מלקחיים או כלים אחרים של דיסקציה בסדר להיאחז הסוף האחורי כדי לשמור את הראש נייח. השתמש בסדר minutien pin או כלים אחרים של דיסקציה בסדר בעדינות להכניס לתוך החדר הקדמי של הקדמי ולדחוף כלפי מטה כדי להפריד את החצאים ימין ועל שמאל של הראש אחד מהשני. חזור על זה תוך כדי תנועה posteriorly דרך המוח האמצעי ולתוך החדר hindbrain, בעיקרו של דבר fileting את הראש למטה האמצע. פעולה זו ממזערת מניפולציה ידנית של העין ואת הרקמה הסובבת, ומותיר את SOS ניזוק.
- כסף בכל צד של הקו האמצעי ראש העין.. מיקום ארבע הודעות של גריז ואקום בפינות (הולם מרחק חוץ coverslip בשימוש) ולכסות עם coverslip זכוכית, דוחף ברצף על כל פוסט עד coverslip יוצר קשר עם הדגימות. פיפטה 70% גליצרול בקצה coverslip כך גליצרול נמשך מתחת, מילוי הרווח בין coverslip של השקופית.
- תמונה דגימות תוך יום, או לאטום סביב coverslip עם לק ודוגמאות תמונה רק לאחר הלק יבש. לאחסן בחושך ב 4 º C.
3. פרוטוקול 3: ויזואליזציה של SOS באמצעות eGFP-CAAX mRNA
- סינתזה של mRNA eGFP-CAAX
- Linearize 1 מ ג של pCS2-eGFP-CAAX פלסמיד16 עם NotI באמצעי אחסון התגובה של 40 מ ל 4 שעות ב- 37 מעלות צלזיוס.
- כדי להפסיק את התגובה תקציר הגבלה, להוסיף 10 מ"ל RNase ללא מים, 2.5 מ ל 10% מרחביות, 2.0 mL 10 מ"ג/מ"ל Proteinase K.
- דגירה 1 שעה ב 50 º C.
- להוסיף את הקוד הבא כדי התגובה (נפח כולל 200 מ ל) והמשך לשלב הבא: 50 מ ל RNase ללא מים, 20 מ"ל 3 מ' סודיום אצטט pH 5.2 ו- 75.5 mL RNase ללא מים
הערה: מוסיפים מים נטולי RNase בשתי הזדמנויות שונות כדי למנוע לדילול יתר סודיום אצטט.
- טיהור של ה-DNA באמצעות פנול/כלורופורם משקעים החילוץ ואתנול
- להוסיף אלכוהול פנול: כלורופורם: isoamyl 200 מ ל, מערבולת של נפרדות ס' 20 השלבים מימית ואורגניים באמצעות צנטריפוגה ב g 18,000 x עבור 5 דקות.
- העברה מימית השכבה העליונה צינור microcentrifuge, מוודא למנוע ההעברה של השכבה התחתונה אורגני. להוסיף אמצעי שווה של כלורופורם הצינור החדש.
הערה: תוספת של כלורופורם הוא אופציונלי, אך מומלץ להבטיח הסרה מלאה של פנול מדגם. - מערבולת עבור נפרד ס' 20 השלבים מימית ואורגניים באמצעות צנטריפוגה ב 18,000 x g במשך 5 דקות.
- כמו קודם, העברה מימית השכבה העליונה צינור microcentrifuge, מוודא למנוע ההעברה של השכבה התחתונה אורגני.
- הוסף 1/10 נפח של 3 מ' סודיום אצטט pH 5.2.
- לזרז את ה-DNA על-ידי הוספת שלושה כרכים של 100% נטול RNase אתנול וביו -צ'יל ב-20 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות צנטריפוגה-g x 18,000 עבור 20 דקות ב 4 º C. גלולה צריך להיות גלוי. Decant את תגובת שיקוע.
- לשטוף את גלולה עם 100 מ ל מים קרים 70% אתנול/RNase-חינם. לאחר ערבוב בעדינות כדי להשתחרר בגדר, צנטריפוגה ב g 18,000 x למשך 15 דקות ב 4 º C. גלולה צריך להיות גלוי. Decant את תגובת שיקוע.
- מילה נהדרת בגדר במשך 5 דקות, resuspend ה-DNA של 7 מ ל מים.
הערה: בגדר ייתכן שתצטרך להיות יבשים יותר מ 5 דקות בהתאם זרימת האוויר זמין.
- תמלול ולטיהור mRNA eGFP-CAAX
- באופן נטול RNase, להכין לתגובה שעתוק במבחנה עם ערכת פולימראז Sp6 RNA זמינים מסחרית, באמצעות כ- 1 מ ג של פלסמיד ליניארית מטוהרים DNA ב 3.2 שלב. תקופת דגירה של 2 h ב- 37 מעלות צלזיוס.
הערה: Sp6 RNA פולימראז חייב לשמש לייצור mRNA רצ'ט. - להוסיף 1 מ"ל של DNase (2 U/mL; RNase חינם) דגירה למשך 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.
- לטהר את ה-mRNA עם כל ערכת טיהור RNA זמינים מסחרית. Aliquot ה-mRNA להימנע ההקפאה חוזרות ונשנות-הפשרה, ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס.
- באופן נטול RNase, להכין לתגובה שעתוק במבחנה עם ערכת פולימראז Sp6 RNA זמינים מסחרית, באמצעות כ- 1 מ ג של פלסמיד ליניארית מטוהרים DNA ב 3.2 שלב. תקופת דגירה של 2 h ב- 37 מעלות צלזיוס.
- הזרקת והדמיה
- להשיג את העוברים כפי שמתואר פרוטוקול 1.1.
- באמצעות מנגנון microinjection, להזריק pg 300 של mRNA eGFP-CAAX בשלב 1-cell.
- מסך עבור עוברי עם הביטוי החיובי של eGFP בעיניים באמצעות סטריאוסקופ על-ידי קרינה פלואורסצנטית.
- תמונה העוברים כמתואר ב- 1.2 פרוטוקול.
- לחלופין, dechorionate ולתקן את העוברים-timepoint הרצוי ב- 4% PFA למשך 4 שעות בטמפרטורת החדר או ללון ב- 4 מעלות צלזיוס. לשטוף את העוברים 1 x PBST במשך 5 דקות, ארבע פעמים, dechorionate, אם לא קודם לכן. לנתח את העיניים והר אותם בשקופיות כמתואר ב- 2.3 פרוטוקול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
דג זברה SOS מופיע בגיל 20 hpf ב רשתית הגבי הרב, שעורר8. 23 hpf אות המצוקה מעברים מן הארכיטקטורה צר הראשונית כניסה רחב ועל ידי 26 hpf. זה כבר לא נראה לעין8. לכן, כדי לבחון את SOS במהלך התפתחות העין נורמלי דג זברה, העוברים יש להקפיד בין hpf 20-23. במהלך תקופה זו, הוא אות המצוקה נצפות מבעד למיקרוסקופ ויבתר, דרך הדמיה DIC כקו דק בעיניים הגבי שמפריד את החצאים האף ואת זמני של הרשתית המתפתח (איור 1). בנוסף, כניסה עדין עשוי להיות גלוי בקו התפר הגבי של העין (איור 1). בעקבות immunofluorescent כתמים laminin, הקו הדק יכול להיות מאושרות להיות קרום המרתף (איור 1).
לבחון מסלולים מולקולריים וכתוצאה מכך הסגר SOS מושהית, בחרנו לבחון את העוברים בגיל 28 hpf כמו זה הוא timepoint זה מספיק יוסר מועד סגירתה SOS רגיל, ולכן, סמן אמין של SOS השהיית סגירה עקב ניסיוני מניפולציות. באמצעות פריט חזותי ישיר של דג זברה hpf 28 תחת המיקרוסקופ ויבתר, זה אפשרי להעריך SOS השהיית סגירה עקב מניפולציה ניסויית. בעת סגירת SOS מעוכבת, נוכחותו הממושכת ניתן לראות בקע בולטת בצד הגבי של העין תחת המיקרוסקופ ויבתר (איור 2). כאשר הבחינו תחת המיקרוסקופ המתחם באמצעות אופטיקה DIC או Nomarski, תכונה זו בולט עוד יותר, צידי האף ואת זמני העין מופרדים על-ידי אות המצוקה, אשר ברור כקו בעיניים הגבי (איור 3).
אות המצוקה רצוף רכיבים פרופריה הבזליים, כולל laminin. לכן, צביעת immunofluorescent מספק שיטה משלימה להערכת SOS הסגר ב קבוע עוברי. כאשר הדמיה העין עובריים מתוך תצוגה לרוחב, הנדן הבזליים demarcates השוליים החיצוניים של העין, סדקים עינית וגם הגבול בין העדשה הרשתית (איור 4). אות המצוקה מכוון ישירות מול פיסורה דמית העין בהיבט הגבי של העין. ניתן להרכיב כל העוברים רוחבית, עם קצת יותר טוב אופטי בהירות מושגת אם העיניים בעבר microdissected. על ידי 28 hpf, ב- wildtype דג זברה, צביעת laminin מדגים בבירור כי אות המצוקה סגור לחלוטין, מה שהופך את זה השלב האידיאלי עבור ניטור מעיכובים פיסורה הסגר.
הזרקה של mRNA eGFP-CAAX מאפשר הדמיה של קרום התא של העובר חיים או קבוע (איור 5). שלב אחד-תא מוצלחת הזרקת מספיקה לייצר העוברים עם קרום התא מלא קרינה פלואורסצנטית. בתצוגה לרוחב, כל הגבולות הסלולר צריך להיות מסומן על-ידי קרינה פלואורסצנטית GFP, ככזה, מורפולוגיה תאים נצפית גם בבירור. פעולה זו מאפשרת את החזיית שינויים מורפולוגיים על התאים שמובילים SOS הסגר.
איור 1: התבוננות SOS במהלך התפתחות העין נורמלי דג זברה. דג זברה העוברים היו נאספים וכוח עם תמונה בגיל 22 hpf. א- נוף רוחבי של העוברים hpf 22 חי-עם תמונה עם המיקרוסקופ ויבתר (א) וויה DIC הדמיה (B), בהתאמה. אות המצוקה מסומן על ידי כוכבית אדומה. ג Laminin immunofluorescent כתמים העובר hpf 22. עוברי תוקנו ב- 4% PFA והשיג עבור צביעת immunofluorescent כולה-הר של laminin. העוברים היו fileted, רכוב ב-70% גליצרול/PBS. פרוסה אחת התמונות התקבלו באמצעות הדמיה קונאפוקלית עם תוכנה. אות המצוקה מסומן על ידי מכוכבית לבן. כל הדמויות היו מוערת, באמצעות תוכנת Adobe Illustrator. סולם העמודות מייצגות 50 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: לנתח תמונות מיקרוסקופ של SOS הסגר לעיכוב דג זברה הזחלים. Wildtype ו gdf6a- / - העוברים היו שנאספו ו- live-עם תמונה-28 hpf. א מבט צדדי העובר wildtype עם SOS סגור. B. מיסרו תצוגה של העובר gdf6a- / - בהשהייה הסגר SOS (כוכבית). גומה חדה היא נצפות בהיבט הגבי של העין עקב הכשל ה'אס להיסגר כראוי. סולם העמודות מייצגות 50 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: נציג DIC תמונות ה'אס בעיניים עובריים דג זברה. Wildtype ו gdf6a- / - העוברים היו שנאספו, מרדימים, להציב רוחבית 1% הנדסה גנטית התכה נמוכה נקודת agarose ב E3-35 מ מ פטרי. המנה היה מלא E3, מיקרוסקופ תרכובת של 20 x המטרה טובלים במים נעשה שימוש עבור הדמיה DIC. א מבט צדדי העובר wildtype עם SOS סגור. B. מיסרו תצוגה של העובר gdf6a- / - בהשהייה הסגר SOS (כוכבית). אות המצוקה היא נצפות כקו דק בהיבט הגבי של העין. סולם העמודות מייצגות 50 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: להחליפן בתמונות של laminin immunofluorescent מכתים בעין דג זברה עובריים. Wildtype ו gdf6a- / - עוברי היו נאספים וכוח קבוע ב- 4% כדורגלן בגיל 28 hpf. הנדן הבזליים הייתה immunostained, העוברים היו fileted והוקמה ב-70% גליצרול/PBS עבור הדמיה קונפוקלי. פרוסה אחת התמונות התקבלו באמצעות תוכנה זן. א מבט צדדי העובר wildtype עם SOS סגור. B. מיסרו תצוגה של העובר gdf6a- / - בהשהייה הסגר SOS (כוכבית). הנדן הבזליים מוצג חלוקה לרמות את העין בצבע ירוק, עם אות המצוקה גלוי בחלק הגבי של העין בעוברי- / - gdf6a. סולם העמודות מייצגות 50 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: הדמיה של העין דג זברה עובריים בעקבות הזרקת ה-mRNA eGFP-caax. Wildtype עוברי הוזרקו pg 300 של mRNA eGFP-caax בשלב 1-cell. בגיל 22 hpf ו 28 hpf, בהתאמה, העוברים היו מרדימים, רכוב רוחבית ב 1% הנדסה גנטית התכה נמוכה נקודת agarose ב E3-35 מ מ פטרי. מיקרוסקופ קונפוקלי של 20 x המטרה טובלים במים היה המשמש הדמיה, פרוסה אחת התמונות התקבלו באמצעות תוכנה. א לרוחב תצוגה של העובר gdf6a- / - בגיל 22 hpf עם פתח גלוי SOS (כוכבית). B. מוגדל לוחות של העובר gdf6a- / - בגיל 22 hpf. ג. נוף רוחבי העובר gdf6a- / - -28 hpf עם סגר SOS לעכב. ד מוגדל לוחות של העובר gdf6a- / - -28 hpf. סרגלי קנה מידה מייצגים 50 מ מ, 10 מ מ פאנלים A ו- C, ו- B, D, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן, אנו מציגים סדרה סטנדרטית של פרוטוקולים להתבונן על המצוקה של העובר המתפתח דג זברה. כדי לקבוע פנוטיפים עיכוב הסגר, פרוטוקולים שלנו התמקדו היכולת להבחין בהפרדה בין שתי האונות דיסקרטית של הצד הגבי-אפיים ואת הגבי-טמפורלית של העין, דומה טכניקות השתמשו כדי להמחיש פיסורה דמית העין הסגר עיכוב פנוטיפים בעיניים הגחון.
טכניקות הדמיה אלה יכול לשמש בשילוב עם מגוון רחב של טכניקות מניפולציה גנטית כדי לחקור את ההשפעות של עיכוב או גרימת ביטוי של גנים מסוימים כדי ללמוד את התפקידים שלהם לסגירת אות המצוקה. בחרנו להדגים פרוטוקולים אלה באמצעות עוברי gdf6a- / - כפי שאנחנו בעבר הראו כי אובדנו יכול להשפיע על סגירה נכונה של אות המצוקה, אבל הפרוטוקולים יכול לשמש כדי לחקור את ההשפעות של מניפולציה הביטוי של כל גן כ נדרש. מומלץ כי כל שינוי מורפולוגי לעין הגבי נלמדים preliminarily עם תצפיות באמצעות המיקרוסקופ ויבתר. טכניקות אחרות, אמור לשמש לאחר קישור הראשוני הוא הוקם בוודאות, כפי שהם תפוקה זמן רב יותר, נמוך יותר.
בעוד הפרוטוקולים ניתן לשנות בקלות בהתאם לצרכים של הנסיין, ישנם מספר היבטים שיש לבצע בזהירות. בשל אופי ארעי של המבנה הזה, זה הכרחי כדי להבטיח כי כל נצפתה העוברים הם של השלב ההתפתחותי אותו. על העבודה שלנו, אנו מוצאים זה חשוב כדי לאפשר רק חלון קטן של זמן הרבייה, מעת לעת למיין את העוברים לאורך התפתחות מוקדמת. הצעד החשוב ביותר של משווה שלבים הוא בגיל 20 hpf, כאשר אתה יכול עדיין במדויק לסמוך somites (24)17, אנו מוצאים את זה הרבה יותר אמין מאשר מבוקשם הזמני המדגישים זמן בגיל 28 hpf. בנוסף, פיגמנטציה חייב להיות מעוכבים או הוסר כדי להבטיח הדמיה מוצלחת של המבנה. הבחנו הפיגמנטציה בעיניים מתחילה להתחיל בסביבות 22 hpf, יש דפוס של פיגמנטציה בעיניים הגבי יכול להפריע נאות ויזואליזציה של אות המצוקה. לכן, מומלץ מאוד לטיפול העוברים עם פרופילתיואוראציל לפני פיגמנטציה כדי להבטיח ויזואליזציה מוצלחת. בנוסף, דיסקציה של העין עובריים לפני השקופית הרכבה ללא גרימת נזק דורש אימון. . זה גם הכרחי להר רוחבית העיניים מקבילים ככל האפשר לשקופית. מומלץ כי הנסיין מתרגל טכניקות אלה עם עוברי נוספת לפני הניסוי.
למעט צביעה immunofluorescent של הנדן הבזליים, כל הפרוטוקולים המתוארים כאן ניתן להשלים באמצעות עוברי בשידור חי. פעולה זו מאפשרת הדמיה מתמיד של אות המצוקה ברחבי מופרה מוקדם, המאפשר הנסיין לבצע מחקרים בצילום מואץ של שינויים מורפולוגיים מעורב הסגר ה'אס. בעבר השתמשנו transgenes רשתית ספציפי, כגון Tg(rx3:eGFP), אשר מסמנת הרשתית עצבית במהלך התפתחות מוקדמת. למרות זאת חסר את היכולת לדמיין את קרום התא, השימוש Tg(rx3:eGFP) יש את היתרון של לא דורש microinjections ומאז השיטה העיקרית שלנו של ויזואליזציה דוחה שינויים מורפולוגיים SOS לאדריכלות בזמן אמת. פרוטוקול זה לא נכלל כאן, כמו שיטות דומות נדונו בעבר זה יומן18,19. עם זאת, חקירת תא הבסיס הביולוגי של היווצרות SOS וסגירת ידרוש קרום חלבונים פלורסנט. באופן ספציפי, ההזרקה של mRNA eGFP-CAAX מאפשר הדמיה של קרום התא סביב אות המצוקה כפי שניתן לראות באיור 5, אשר מאפשרת לנו ללמוד את הדינמיקה של שינויי הצורה תא בעיניים הגבי הנדרשים עבור סגירת SOS נכונה. בזמן eGFP-CAAX יכול להיות שימושי עבור ביצוע הדמיה חיה של SOS הסגר, הוא עשוי קשה על ידי הנוכחות של השכבה מקיפות ולהצפנה של דג זברה. בנוסף, יש לנקוט בעת ניתוח תוצאות של mRNA זריקות כי זה יכול לגרום פסיפס, ולכן קשה להשוות ישירות עוברי בהתבסס על כימות של כוח הביטוי eGFP. זה יכול להיות יושבחו באמצעות קווים דג זברה מהונדס fluorescently תווית קרום התא ברשתית המתפתח באופן ספציפי, כגון Tg(vsx2.2:GFP-caax).
אחד האתגרים מהפרוטוקולים שלנו נמצא עם כל טיפול שאינו מלא penetrant. שציינו קודם לכן, כי ניתן לראות SOS עיכובים על 10% שליטה העובר ב hpf 288, נוכחות זו כבסיס של העוברים עם קריאת בתוך כל קבוצה ניסיונית נתון יכול לעשות את זה קשה להתבונן עדין השפעות ניסיוני מניפולציה. זה יכול להתייחס מסנוור הנסיין כדי להפחית את הטיית הנסיין ועל ידי הגדלת מספר העוברים בשימוש בתוך כל קבוצה ניסיונית לחיזוק כוחו של הניסוי. בנוסף, השלב של ניתוח יכול להיות מוזז ל 29-30 hpf.
עם קבוצה זו של פרוטוקולים, אנו שואפים לתקנן את האופן שבו שדרכו הם דמיינו SOS הסגר עיכובים. השיטות המתוארות לעיל הוכחו להיות אמינים גילוי והצגה של SOS עיכובים הסגר במגוון של הגדרות ניסיוני, להתאמה לצרכים של הנסיין. כאשר השתמשנו בטכניקות כגון סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים או הדמיה בצילום מואץ של עוברי הטרנסגניים כדי להמחיש את אות המצוקה בפירוט רב יותר, מטרתנו כאן היא ליצור ערכה תקנית של פרוטוקולים נתונות תפוקה גבוהה ניסיוני עיצובים לדמיין מספר גדול של עוברי ביום אחד עם דגש על היכולת ניקוד הסגר פנוטיפים עיכוב. בנוסף השימוש בו עם עוברי- / - gdf6a, היינו מסוגלים להבחין SOS הסגר עיכוב פנוטיפים באמצעות טכניקות הדמיה אלה לצד טיפולי תרופתי, זריקות מורפולינו ו RNA ביטוי מחקרים. כפי הובהר תפקידם של אות המצוקה בפיתוח עין נוספת באמצעים שונים, אנו מקווים כי זו קבוצה סטנדרטית של פרוטוקולים מספקים הקהילה המדעית שפה משותפת שדרכו מבנה הרומן הזה הוא למד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים יש אין אינטרסים סותרים להכריז.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי קנדי מוסדות של הבריאות מחקר (CIHR), מדעי הטבע, המועצה מחקר הנדסי (NSERC), אלברטה מתפתחת טכנולוגיה עתידיות, ונשים, מכון מחקר בריאות (WCHRI לילדים).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-phenyl 2-thiourea | Sigma Aldrich | P7629-10G | |
| 100 mm Petri dish | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 35 mm Petri dish | Corning | CLS430588 | |
| Agarose | BioShop Canada Inc. | AGA001.1 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A7906-100G | |
| DIC/Fluorescence microscope | Zeiss | AxioImager Z1 | |
| Dissection microscope | Olympus | SZX12 | |
| Dissection microscope camera | Qimaging | MicroPublisher 5.0 RTV | |
| Dow Corning High-vacuum grease | Fisher Scientific | 14-635-5D | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Sigma Aldrich | A5040-25G | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150077 | |
| Goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Image capture software | Zeiss | ZEN | |
| Incubator | VWR | Model 1545 | |
| Microscope Cover Glass (22 mm x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Microscope slide | Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| Minutien pin | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit | Invitrogen | AM1340 | |
| NotI | New England Biolabs | R0189S | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148-500G | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol pH 6.7 +/- 0.2 | Fisher Scientific | BP1752-100 | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | P4850 | |
| Rabbit anti-laminin antibody | Millipore Sigma | L9393 | |
| TURBO Dnase (2 U/µL) | Invitrogen | AM2238 | |
| Ultrapure low-melting point agarose | Invitrogen | 16520-100 | |
| UltraPure Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Invitrogen | 15525017 |
References
- Chow, R. L., Lang, R. A.
- Slavotinek, A. M. Eye development genes and known syndromes. Molecular Genetics and Metabolism. 104 (448-456), (2011).
- Gregory-Evans, C. Y., Williams, M. J., Halford, S., Gregory-Evans, K. Ocular coloboma: a reassessment in the age of molecular neuroscience. Journal of Medical Genetics. 41 (12), (2004).
- Onwochei, B. C., Simon, J. W., Bateman, J. B., Couture, K. C., Mir, E.
- Williamson, K. A., FitzPatrick, D. R. The genetic architecture of microphthalmia, anophthalmia and coloboma. European Journal of Medical Genetics. 57, 369-380 (2014).
- Chang, L., Blain, D., Bertuzzi, S., Brooks, B. P. Uveal coloboma: clinical and basic science update. Current Opinion in Ophthalmology. 17, 447-470 (2006).
- Kaufman, R., et al. Development and origins of Zebrafish ocular vasculature. BMC Developmental Biology. 15 (18), (2015).
- Hocking, J. C., et al. Morphogenetic defects underlie Superior Coloboma, a newly identified closure disorder of the dorsal eye. PLOS Genetics. 14 (3), (2018).
- Lawson, N. D., Wolfe, S. A. Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish. Developmental Cell. 21 (1), (2011).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), (2013).
- Bilotta, J., Saszik, S. The zebrafish as a model visual system. International Journal of Developmental Neuroscience. 19, 621-629 (2001).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book; A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 5th edition, University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2007).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- Distel, M., Köster, R. W. In vivo time-lapse imaging of zebrafish embryonic development. Cold Spring Harbor Protocols. , (2007).
- Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3, 59-69 (2008).
- Kwan, K. M., Otsuna, H., Kidokoro, H., Carney, K. R., Saijoh, Y., Chien, C. A complex choreography of cell movements shapes the vertebrate eye. Development. 139, 359-372 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullman, B., Schilling, T. F.
- Gfrerer, L., Dougherty, M., Liao, E. C. Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (79), e50525 (2013).
- Percival, S. M., Parant, J. M. Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo. J. Vis. Exp. (113), e54218 (2016).
