Summary
여기, 우리 제시 우수한 눈 고 랑을 관찰 하는 프로토콜의 표준화 된 시리즈 척추 눈에서 최근 발견, 진화론 보존 구조. Zebrafish 애벌레를 사용 하 여, 형성 및 우수한 눈 고 랑의 폐쇄에 기여 하는 요소를 식별 하는 데 필요한 기술을 설명 합니다.
Abstract
선 천 성 안구 coloboma 불완전 한 맥락 막 게 폐쇄에서 발생 하는 눈의 열 등 한 측면에서 분열으로 일반적으로 관찰 되는 유전 질환 이다. 최근, 홍 채, 망막, 및 비 발한 구조의 발견에 지도 하는 렌즈의 우수한 측면에서 coloboma 개인의 식별 이라고 뛰어난 균열 또는 우수한 눈 고 랑 (SOS)는 지 느 러 미에 뚜렷이 존재 하는 척추 동물 눈 개발 시 컵의 측면. 이 구조는 쥐, 병아리, 물고기, 그리고 영원에 걸쳐 보존은, 비록 SOS의 우리의 현재 이해는 제한 됩니다. 그것의 형성 및 폐쇄에 기여 하는 요인, 명료 하 게 하기 위해 그것을 관찰 하 고 이상이, SOS의 폐쇄에 지연 등 식별 수 필수적입니다. 여기, 우리 immunofluorescent 얼룩 및 mRNA와 같은 일반적인 분자 생물학 기술로 널리 현미경 기술을 결합 하 여 SOS를 효율적으로 시각화를 사용할 수 있는 프로토콜의 표준화 된 시리즈를 만들 밖으로 설정 overexpression입니다. 프로토콜의이 세트는 SOS 폐쇄 지연 관찰 하는 능력에 초점을 맞추고, 하는 동안 실험의 요구에 적응할 수 있는 하 고 쉽게 수정할 수 있습니다. 전반적으로, 친근 한 메서드는 SOS의 우리의 이해 척추 눈 개발의 현재 지식을 확장을 고급 수를 만드는 노력 하겠습니다.
Introduction
척추 동물 눈의 형성 과정이 매우 보존는 신중 하 게 조율 된 세포 신호 경로 조직 유형을 설정 하 고 지정 지역 정체성1. 초기 눈 morphogenesis 하 섭 눈의 아키텍처를 깊은 결함 귀착되 고2눈부신 자주 있다. 같은 하나의 질병 시 컵3의 복 부 측에 맥락 막 눈 균열을 실패에서 유래한 다. 눈 coloboma로 알려진이 장애 4-5000 라이브 출생 및 일반적으로 inferiorly 눈4의 중심에 있는 눈동자에서 돌출 하는 열쇠 구멍 모양의 구조로 만들어 낸 소아 실명의 원인 3-11 %1 발생 추정 5,6. 맥락 막 균열의 기능은 후는 균열의 측면 혈관7을 묶는 데 융합 것입니다 시 컵에 성장 초기 맥 관 구조에 대 한 진입점을 제공 하는 것 이다.
눈 coloboma은 고 대부터 알려져 왔다, 하는 동안 우리가 최근 눈의 우수한/등 쪽 측면에 영향을 미치는 조직 손실 coloboma 환자의 소설 부분 집합을 확인 했습니다. 우리 실험실에서 최근 작품 지칭 우수한 눈 고 랑 (SOS) 또는 뛰어난 균열8zebrafish 등 눈에는 눈 구조의 발견을 주도하 고 있다. 구조는 고 랑과는 균열의 특성은 중요 하다. 한 고 랑 마찬가지로 그것은 비음에서 일시적인 망막에 걸쳐 지속적인 조직 계층입니다. 또한, 구조의 폐쇄는 반대 하는 지하실 막, 2의 융합에 의해 중재 하지 고 전체적 프로세스는 구조는 세포에 의해 채워집니다를 나타납니다. 그러나,는 게와 마찬가지로, 그것은 지하실 막 등 눈의 비 강 및 시간적 측면을 구분 하는 구조 형성. 일관성을 위해 우리는 참조할 SOS로이 텍스트에서.
SOS는 진화론 척추 동물, 물고기, 병아리, 영원, 및 마우스8눈 morphogenesis 동안 표시 되 고에서 보존 됩니다. Zebrafish에 20-60 시간 후 수정 (hpf)에서 존재 하는 맥락 막 게 달리 SOS 매우 과도 20-23 hpf에서 쉽게 볼 수 되 고 결 석 26 hpf8. 우리 실험실에서 최근 연구는, 비슷한 맥락 막 균열, SOS 역할 눈 morphogenesis8동안 혈관 가이드에 발견 했다. 형성 및 SOS의 폐쇄를 제어 하는 요소는 아직 완전히 이해 되지 않습니다, 하지만 우리의 데이터 패턴화 유전자8등 복 부 눈에 대 한 역할 강조 했다.
Zebrafish는 SOS를 공부 하는 우수한 모델 생물 이다. 모델 시스템으로 공부 눈 개발에 장점을 제공 합니다: 그것은 척 추가 있는 모델; 각 세대 전시 높은 통치 (~ 200 배아); 그것의 게놈 완전 시퀀싱 된 유전자 조작;를 용이 하 게 그리고 인간의 유전자의 약 70% 이상의 zebrafish orthologue, 그것은 인간의 질병9,10의 이상적인 유전학 기반 모델을 만드는. 가장 중요 한 것은, 그것의 개발 외부 어머니, 그리고 그것의 애벌레는 투명, 쉽게11와 개발 눈의 시각화에 대 한 수 있습니다.
프로토콜의이 세트에서 우리는 SOS zebrafish 애벌레에 구상 될 수 있다 기술을 설명 합니다. 이 보고서에 사용 되는 시각화 기법의 다양 한 정상적인 눈 개발 하는 동안 SOS의 명확한 관측 뿐만 아니라 SOS 폐쇄 결함을 감지 하는 능력 수 있습니다. 우리의 예제에서는 프로토콜 Gdf6의 조사 기능을 한다는 BMP는 등 지역화 눈과 SOS 폐쇄의 알려진된 레 귤 레이 터. 또한, 이러한 기술은 유전적 요인 또는 약리 에이전트에 적절 한 조 난 신호 형성 및 폐쇄에 영향을 식별 하는 실험 조작 결합 될 수 있다. 또한, SOS를 주변 세포를 형태학 상 변화를 관찰 하는 실험을 수 있도록 프로토콜을 통해 모든 세포 막의 형광 이미징이 가능, 포함 시켰습니다. 우리의 목표는 개발 눈의이 소설 구조에 새로운 통찰력을 제공 하는 과학적 사회 전반에 걸쳐 사용할 수 있는 표준화 된 프로토콜의 집합을 설정 하는.
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Protocol
여기에 설명 된 모든 메서드는 앨버타 동물 관리 및 사용 위원회의 대학에 의해 승인 되었습니다.
1. 프로토콜 1: stereomicroscopy와 미분 간섭 콘트라스트 (DIC) 이미징 사용 하 여 SOS의 시각화
- 배아 컬렉션
- Dechlorinated 물 탱크에서 여성 제 브라와 남성 zebrafish를 페어링 하 여 저녁에 gdf6a+ zebrafish의 십자가 준비 합니다. 배아는 시간의 작은 범위 내에서 태어난 되도록 구분선을 사용 하 여 여성에서 남성을 구분 해야 합니다.
- 다음 아침, 구분선을 끌어 E3 미디어, Zebrafish 책12에 설명 되어 있는 접시에 배아를 수집 하는 30 분 보다 더 이상에 대 한 번 식을 zebrafish를 허용 하 고 28.5 ° C 배양 기에 넣어.
- 모든 unfertilized 계란 또는 흰색과 불투명 나타납니다 죽은 태아를 제거 합니다.
- 준비 및 zebrafish 태아의 라이브 영상
- 20 hpf, E3 미디어 0.004 %1-페 닐 2-thiourea (PTU) 안료 생산을 방지 하기 위해 포함 된 교체는 E3 미디어.
참고: 22-24 hpf 같은 약간 나중 timepoint에 PTU의 추가 화상의 시간에는 배아의 초기 나이 실험을 방해할 가능성이 크다. 그러나, SOS의 이미징 방해할 수 있는 등 눈에 나타나는 색소의 밴드는 완전히 착 색을 방지 하기 위해 초기 배아를 치료 하는 것이 좋습니다. - 모든 태아 관찰의 시간을 다양 한 지점에서 올바른 발달 단계에 있는지 확인 하십시오. 이 somite에 수는 명확 하 게 보이는 Kimmel 외.13에 의해 설명 하는 단계에서 이루어집니다 하는 것이 좋습니다. 그 발달 성숙 하지 않은 제거 합니다.
- 부드럽게 떨어져 chorion 미세 집게를 사용 하 여 당겨 해 현미경, 및 dechorionate에서 배아 배아를 놓습니다. 등 눈에 SOS를 시각화 합니다. SOS, 눈의 등 쪽 여백에서 들여쓰기로 나타날 수 있으며 선 지 눈에서에 표시 되어야 합니다. 일반 SOS 폐쇄에 대 한 주위에 배아 관찰 hpf 20-23. 지연된 SOS 폐쇄 고기 검사, 28에서 배아 관찰 hpf 이상.
- SOS 폐쇄 지연 하지 않는 보여 주는 배아를 정렬 합니다.
- 이러한 배아 해 현미경을 사용 하 여 사진, e 3에서 1 %agarose 포함 하는 배양 접시를 준비 합니다. 가볍게 태아의 노 른 자 태아는 agarose에 배치 되 면 앉을 수 있는 얕은 구멍 생성 하기 agarose의 중심을 찌 르 기. 이렇게 하면 태아 아니다는 것을 경사 각도에서 촬영 되 고 때.
- 배아는 agarose 옆에 e 3에 0.003 %tricaine anesthetize
- 35 mm 페 트리 접시 포함 gelled 비 1% 낮은 녹는 포인트 agarose e 3에서의 작은 bolus로 배아 배아 화합물 또는 confocal 현미경을 사용 하 여 이미지를 전송 (w/v). 신속 하 게 옆으로 잘 낚 싯 줄 또는 속눈썹을 사용 하 여 태아를 놓고을 agarose를 기다립니다. agarose는 회사, 일단 충분 한 e 3는 agarose를 접시에 붓으십시오. 자세한 내용은 Distel 및 Köster14를 참조 하십시오.
참고: 경우는 거꾸로 한 현미경을 사용 하 여, 태아 수 유리 coverslip 아래 접시의 유리에 대 한 배치 되며 X 객관적 렌즈 표준 20 군데. - 물 침수 20 배 대물 렌즈를 사용 하 여 복합 현미경으로 SOS를 시각화. 시각화, 다음 부드럽게 당겨 배아에서 agarose 4 %paraformaldehyde (PFA)에서 수정 또는 그들의 개발을 계속 하 허용.
- 20 hpf, E3 미디어 0.004 %1-페 닐 2-thiourea (PTU) 안료 생산을 방지 하기 위해 포함 된 교체는 E3 미디어.
2. 2 프로토콜: laminin의 전체-마운트 immunofluorescent 얼룩
- 전체-마운트 immunofluorescent laminin의 얼룩: 1 일
- 단계에서 설명한 1.2.3, 완료 되지 않은 경우에 배아를 Dechorionate 갓 만든된 4%에서 원하는 timepoint에 microcentrifuge 튜브 배아 수정 PFA 실 온 (22-25 ° C) 통에 2 h. 1에서 세척 5 분, 4 회 x PBST.
참고: gastrulation, 다음 배아 수를 해결할 더 나은 dechorionation 후. - 5 분 보육 시간 배아는 고정 발달 단계에 따라 달라 집니다 대 한 실 온에서 10 mg/mL 가수분해 K에에서 배아를 permeabilize (Thisse 및 Thisse 참조15).
- 1에서 세척 5 분, 4 회 x PBST.
- 5% 염소 혈 청 및 2 mg/mL 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 실 온 통에 1-2 h에 대 한 1xPBST에서의 솔루션에 배아를 차단 합니다.
- 1: 200 희석에 블록 솔루션에서 토끼 안티 laminin 항 체를 희석 하 여 1 차적인 항 체 솔루션을 준비 합니다.
- 4 ° C 통에 하룻밤 안티 laminin 1 차 항 체에 태아를 품 어.
- 단계에서 설명한 1.2.3, 완료 되지 않은 경우에 배아를 Dechorionate 갓 만든된 4%에서 원하는 timepoint에 microcentrifuge 튜브 배아 수정 PFA 실 온 (22-25 ° C) 통에 2 h. 1에서 세척 5 분, 4 회 x PBST.
- 전체-마운트 laminin의 immunofluorescent 얼룩이 지기: 주 2
- 1에서 세척 15 분, 5 번에 대 한 x PBST.
- 1에서 염소 안티 토끼 알 렉 사 Fluor 488 항 체를 diluting 하 여 이차 항 체 솔루션을 준비 1:1000의 희석을 x PBST.
참고:이 단계는 다른 이차 항 체를 사용 하 여 사용할 수 있는 리소스는 실험에 맞게 적응 가능 하다. - 4 ° C 통에 하룻밤 이차 항 체에 태아를 품 어. 앞으로이 단계에서 가능한 한 많은 빛에서 방패.
- 1에서 세척 15 분, 4 회 x PBST. 필요한 경우 최대 1 주일, 4 ° C에서 배아를 저장할 수 있습니다.
- 해 부 및 미 발달 눈의 설치
- 원하는 경우 배아 작은 페 트리 접시에 놓고 1에서 배아 deyolk x PBST. 부드럽게 잘 집게와 노른자위를 방해 하 고 노 른 자 색의 가벼운 스크 통해 노 른 자 세포를 제거 하 여 이렇게 합니다.
- Microcentrifuge 튜브에서 PBS 글리세롤 시리즈 솔루션의 다음 농도 준비: PBS에서 30%, 50% 및 70% 글리세롤. 30% 글리세롤/PBS, 솔루션 및 가능한 이전 솔루션의 조금 전송 배아를 확인으로 배아를 전송 합니다. 튜브의 바닥에 침 몰 하기 위하여 배아를 기다립니다.
- 배아 바닥에 침 몰 할 때, 50% 글리세롤/PBS에 그들을 전송 합니다. 반복 하 고 70% 글리세롤/PBS에 전송.
- 일단 태아 70% 글리세롤/PBS에서 침 몰, 해에 대 한 작은 플라스틱 접시에 그들을 이동 합니다.
- 태아는 hindbrain에 후부를 베 고 필요한 경우 유전형, 후부 조직을 사용 합니다.
- 가능한 작은 글리세롤으로 전송 하는 유리 슬라이드에 머리를 이동 합니다. 집게 또는 다른 정밀한 해 부 도구를 사용 하 여 유지 하는 고정 후부 끝에 개최. 좋은 minutien 핀 또는 다른 정밀한 해 부 도구를 사용 하 여 부드럽게는 앞쪽에서 개 심 실에 삽입 하 고 서로 머리의 오른쪽과 왼쪽 반쪽을 아래로 밀어. 이동 하면서 뒤로 midbrain를 hindbrain 심 실에 기본적으로 중간 선 아래로 머리를 fileting 이것을 반복 합니다. 눈 및 그로 인하여 손상 되지 않은 SOS을 떠나 주변 조직의 수동 조작을 최소화 됩니다.
- 위로 아래로, 눈 머리 중간의 각 측면을 탑재 합니다. 위치 4 모서리 (적절 한 거리를 사용 하는 coverslip 떨어져)에서 진공 그리스의 게시물 및 유리 coverslip 커버, 예제와 함께 접촉 하 게 아래로 밀어 순차적으로 각 게시물에는 coverslip까지. 플라스틱 70% 글리세롤은 coverslip의 가장자리에는 글리세롤은 coverslip 슬라이드 사이의 공간을 채우고, 아래 가져온 있도록.
- 하루, 또는 매니큐어와 이미지 샘플 매니큐어 건조 했다 후에 coverslip 주위 인감 이미지 샘플. 4 ° c.에 어둠 속에서 저장
3. 프로토콜 3: 시각화의 의 조 난 신호를 사용 하 여 eGFP CAAX mRNA
- EGFP CAAX mRNA의 합성
- 37 ° c.에서 4 시간 동안 1mg pCS2 eGFP CAAX 플라스 미드16 노트 40 mL의 반응 볼륨에서의 선형화
- 제한 다이제스트 반응을 중지, 추가 10 RNase 무료 물, 2.5 mL 10 %SDS 및 2.0 mL 10 mg/mL 가수분해 공화국
- 50 ° c.에 1 시간을 품 어
- 다음 반응에 추가 (전체 용량 200ml) 다음 단계로 진행: RNase 무료 50 mL 물, 20 mL 3 M 나트륨 아세테이트 pH 5.2와 75.5 RNase 무료 물
참고: RNase 무료 물 나트륨 아세테이트의 과도 한 희석을 방지 하기 위해 두 개의 별도 경우에 추가 됩니다.
- 페 놀/클로 프롬 추출 및 에탄올 강 수를 통해 DNA의 정화
- 추가 200 mL 페 놀: 클로 프롬: isoamyl 알콜과 소용돌이 20 미 분리에 대 일 분에 대 한 18000 x g에서 원심 분리를 통해 수성 및 유기 단계.
- 새로운 microcentrifuge 튜브, 하단 유기 층의 전송 방지를 위 수성 층 전송. 새로운 튜브를 클로 프롬의 동일한 볼륨을 추가 합니다.
참고: 클로 프롬의 추가 선택 사항 이지만 샘플에서 페 놀의 완전 한 제거를 보장 하는 것이 좋습니다. - 20 미 분리 5 분 18000 x g에서 원심 분리를 통해 수성 및 유기 단계에 대 한 소용돌이.
- 이전, 새로운 microcentrifuge 튜브, 하단 유기 층의 전송 방지를 위 수성 층 전송.
- 3 M 나트륨 아세테이트 pH 5.2의 1/10 볼륨을 추가 합니다.
- -20 ° C에서 4 ° c.에 20 분에 대 한 18000 x g 15 분 원심 분리기에서 100 %RNase 무료 에탄올과 오의 3 볼륨을 추가 하 여 DNA를 침전 펠 릿은 표시 되어야 합니다. 상쾌한을 가만히 따르다.
- 70% 에탄올/RNase 무료 찬물 100ml와 펠 릿을 세척. 부드럽게 혼합 후 판이 펠 릿을, 4 ° c.에서 15 분 18000 x g에서 원심 펠 릿은 표시 되어야 합니다. 상쾌한을 가만히 따르다.
- 5 분 동안 펠 릿 건조 하 고 7 mL 물에 DNA를 resuspend.
참고: 펠 릿 해야 사용할 수 있는 공기 흐름에 따라 5 분 이상 건조 합니다.
- 전사 및 eGFP CAAX mRNA의 정화
- RNase 없는 방식으로 한 체 외에 녹음 방송 반응 상용 Sp6 RNA 중 합 효소 키트, 순화 선형화 플라스 미드 DNA 단계 3.2에서의 약 1 밀리 그램을 사용 하 여 준비 합니다. 2 h 37 ° c.에 대 한 품 어
참고: Sp6 RNA 중 합 효소 출장된 mRNA의 생산을 위해 사용 해야 합니다. - 1 mL DNase 추가 (2 U/mL; RNase 무료) 37 ° c.에 30 분 동안 품 어와
- 어떤 상용 RNA 정화 키트와 mRNA를 정화. 약 수-80 ° c.에 저장 반복된 동결-해 동을 피하기 위해 mRNA
- RNase 없는 방식으로 한 체 외에 녹음 방송 반응 상용 Sp6 RNA 중 합 효소 키트, 순화 선형화 플라스 미드 DNA 단계 3.2에서의 약 1 밀리 그램을 사용 하 여 준비 합니다. 2 h 37 ° c.에 대 한 품 어
- 사출 및 시각화
- 1.1 프로토콜에에서 명시 된 배아를 얻을.
- Microinjection 장치를 사용 하 여 1 셀 단계에서 eGFP CAAX mRNA의 300 pg를 주사.
- EGFP 형광 stereoscope를 사용 하 여 눈에서의 밝은 표정으로 배아에 대 한 화면.
- 프로토콜 1.2에 설명 된 대로 배아를 이미지.
- 또는, dechorionate 4%에서 원하는 timepoint에 배아를 수정 하 고 실내 온도에 또는 하룻밤 4 ° c.에서 4 시간 동안 PFA 이전 일 경우 5 분 PBST, 4 번, 그리고 dechorionate, x 1에 배아를 씻어. 눈을 해 부하 고 프로토콜 2.3에 설명 된 대로 슬라이드에 그들을 마운트.
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Representative Results
Zebrafish SOS 20에 나타납니다 hpf 추정 등 망막8에. 넓은 들여쓰기의 초기 좁은 아키텍처에서 23 hpf SOS 전환 및 26 hpf 그것은 더 이상 볼 수8. 따라서, 정상적인 zebrafish 눈 개발 하는 동안 SOS를 검사, 태아는 20-23 hpf 사이 관찰 해야 합니다. 이 기간 동안 SOS와 DIC 이미징 개발 망막 (그림 1)의 비 강 및 시간 반으로 구분 하는 등 눈에 얇은 선으로 통해 해 현미경을 통해 관찰 이다. 더하여, 미묘한 들여쓰기 (그림 1) 눈의 등 쪽 경계에서 볼 수 있습니다. Immunofluorescent laminin의 얼룩, 다음 얇은 라인 될 지하실 멤브레인 (그림 1)를 확인할 수 있습니다.
지연된 SOS 폐쇄의 결과로 분자 경로 조사, 우리는 28에서 태아를 관찰 하기로이 hpf는 충분히 정상적인 SOS 폐쇄의 시간에서 제거 되 고는, 그러므로, SOS 폐쇄 지연 때문에 실험의 신뢰할 수 있는 마커를 timepoint 조작입니다. 해 현미경 28 hpf zebrafish의 직접적인 시각화를 통해 평가 하는 실험 조작 인해 SOS 폐쇄 지연 가능 하다. SOS 폐쇄 지연 되 면 장기간된 입지 해 현미경 (그림 2) 눈의 등 쪽 측에 있는 발음된 분열으로 볼 수 있습니다. DIC 또는 Nomarski 광학을 사용 하 여 화합물 현미경 관찰,이 기능은 훨씬 더 저명한 고 눈의 비 강 및 시간적 측면 등 눈 (그림 3)에서 선으로 명확 하 게 표시는 SOS에 의해 구분 됩니다.
SOS는 laminin를 포함 하 여 기저 lamina 부품 늘어서 있다. 따라서, immunofluorescent 착 고정된 배아에 SOS 폐쇄 평가의 보완 방법을 제공 한다. 측면 보기에서 배아 눈, 이미징 때 기저 lamina 정하는 눈의 외부 여백 눈 균열, 그리고 렌즈와 망막 (그림 4)의 경계. SOS는 눈의 등 쪽 측면에서 맥락 막 게 반대 직접. 전체 배아는 약간 더 나은 광학 선명도 눈 microdissected 이전 경우 달성 측면, 장착할 수 있습니다. 28에 의해 hpf, wildtype zebrafish laminin 얼룩을 보여줍니다 명확 하 게는 SOS 완전히 닫혀,이 게 지연 균열 폐쇄에 모니터링을 위한 이상적인 무대.
EGFP CAAX mRNA의 주사 (그림 5) 라이브 또는 고정 태아의 세포 막의 시각화 수 있습니다. 성공적인 1 셀 단계 주입은 완전 한 세포 막 형광으로 배아를 생성 하기에 충분. 측면 보기에서 GFP 형광에 의해 모든 세포 경계를 표시 해야 하 고 같은 셀 형태 또한 명확 하 게 관찰. SOS 폐쇄 이어질 셀 형태학 변화 시각화 수 있습니다.
그림 1: 정상적인 zebrafish 눈 개발 하는 동안 SOS의 관찰. Zebrafish 태아 수집 되었고 22 군데 hpf. A-b. 라이브-몇 군데 해 현미경 (A)와 DIC 이미징 (B), 각각을 통해 22 hpf 배아의 측면 볼 수 있습니다. SOS 빨간색 별표로 표시 됩니다. C. Laminin immunofluorescent 얼룩 22 hpf 태아의. 태아는 4%에 고정 했다 PFA laminin의 전체-마운트 immunofluorescent 얼룩에 대 한 취득. 배아 fileted 하 고 70% 글리세롤/PBS에 탑재 했다. 단일 슬라이스 이미지 소프트웨어와 함께 confocal 영상 통해 얻은 했다. SOS 흰색 별표로 표시 됩니다. 모든 주석 했다 고 어도비 일러스트 레이 터 소프트웨어를 사용 하 여 조립. 스케일 바 대표 50 m m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: SOS 폐쇄 지연 zebrafish 애벌레의 현미경 이미지를 해 부. Wildtype 및 gdf6a-/- 배아 했다 수집 및 라이브-에 몇 군데 28 hpf. 닫힌된 SOS와 wildtype 배아의 A. 측면 보기. B. SOS 폐쇄 지연 (별표) gdf6a-/- 태아의 측면. 날카로운 우울증을 적절 하 게 SOS의 실패 눈의 등 쪽 측면에서 볼입니다. 스케일 바 대표 50 m m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: zebrafish 배아 눈에 SOS의 담당자 DIC 이미지. Wildtype 및 gdf6a-/- 배아 수집, 취, 되었고 1% 초순 낮은 녹는 포인트 agarose E3에서 35 mm 페 트리 접시에에 옆으로 배치. 접시에 채워졌다 E3, 그리고 물 찍기 목표 x 20 화합물 현미경 사용 되었다 DIC 이미징에 대 한. 닫힌된 SOS와 wildtype 배아의 A. 측면 보기. B. SOS 폐쇄 지연 (별표) gdf6a-/- 태아의 측면. SOS 눈의 등 쪽 부분에 얇은 선으로 관찰 이다. 스케일 바 대표 50 m m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: immunofluorescent 배아 zebrafish 눈에서 얼룩 laminin의 대표 이미지. Wildtype 및 gdf6a-/- 배아 수집 되었고 4%에서 고정 28 PFA hpf. 기저 lamina는 immunostained, 그리고 배아 했다 fileted 70% 글리세롤/confocal 영상에 대 한 PBS에. 단일 슬라이스 이미지 선 소프트웨어를 사용 하 여 얻은 했다. 닫힌된 SOS와 wildtype 배아의 A. 측면 보기. B. SOS 폐쇄 지연 (별표) gdf6a-/- 태아의 측면. 기저 lamina SOS gdf6a-/- 배아에 눈의 등 쪽 부분에 표시 된 녹색에서 눈 윤곽 표시 됩니다. 스케일 바 대표 50 m m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: eGFP caax mRNA 주입 다음 zebrafish 배아 눈의 이미징. Wildtype 배아 eGFP caax mRNA의 300 pg와 함께 1 셀 단계에서 주입 했다. 22 hpf와 28 hpf, 각각, 배아 취 되었고 1% 초순 낮은 녹는 포인트 agarose E3에서 35 mm 페 트리 접시에에 옆으로 탑재. 그리고 물 찍기 목표 x 20 confocal 현미경 이미징, 사용 단일 슬라이스 이미지 소프트웨어를 사용 하 여 얻은 했다. A. 측면 보기 22 gdf6a-/- 태아의 hpf 보이는 오픈 소스 (별표)와 함께. 2. 22 gdf6a-/- 태아의 패널 확대 hpf. C. 28 gdf6a-/- 태아의 측면 보기 SOS 폐쇄와 hpf 지연. D. 패널 28 gdf6a-/- 태아의 확장 hpf. 스케일 바 50 m m 및 패널 A와 C, 그리고 B와 D, 10 m m를 각각 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
여기, 선물이 발전 zebrafish 태아에서 조 난 신호를 관찰 하는 프로토콜의 표준화 된 시리즈. 확인 하려면 폐쇄 지연 고기, 우리의 프로토콜에 초점을 맞춘 눈, 비슷한 맥락 막 게 폐쇄 지연 시각화 하는 데 사용 하는 기술을의 지 강과 등 시간적 측면의 두 개의 개별 돌출부의 분리를 구별할 수 있는 능력 복 부 눈에 고기입니다.
이러한 시각화 기술은 SOS의 폐쇄에 그들의 역할을 공부 하는 특정 유전자의 표정을 유도 또는 억제의 효과 연구 하는 다양 한 유전자 조작 기술 함께에서 사용할 수 있습니다. 우리와 같이 우리는 이전에 gdf6a-/- 배아를 사용 하 여 이러한 프로토콜의 손실 영향을 미칠 수는 SOS의 적절 한 폐쇄 하지만 조작으로 어떤 유전자의 표현 효과 공부 하는 프로토콜을 사용할 수 수 하기로 했습니다. 필수. 등 눈에 어떤 형태학 변화 관측 해 현미경을 사용 하 여 예비 공부는 하는 것이 좋습니다. 초기 링크를 결정적으로, 그들은 더 많은 시간과 낮은 처리량 설정 되 면 다른 기법을 사용 한다.
프로토콜은 실험의 요구에 맞게 쉽게 수정할 수 있습니다, 신중 하 게 따라야 합니다 몇 가지 측면이 있습니다. 이 구조체의 일시적인 특성으로 인해 모두 같은 발달 단계의 배아는 관찰을 보장 하기 위해 필수적입니다. 우리의 일, 우리 시간을 번 식의 작은 창만 하 고 주기적으로 초기 개발 통해 배아를 정렬 하는 것이 중요 찾으십시오. 20 단계를 똑같게 하는 가장 중요 한 단계는 hpf, somites (24)17, 아직도 정확 하 게 계산할 수 있습니다 그리고 우리는 28 시간 윤곽을 그리 다 준비 서비스 보다 훨씬 더 안정적이 찾을 때 hpf. 또한, 염색 저해 합니다 또는 구조의 성공적인 시각화 되도록 제거. 우리 눈에 염색 약 22를 시작 하기 시작 관찰 hpf, SOS의 적절 한 시각화를 방해할 수 있는 등 눈에 착 색의 패턴을 있다. 따라서, 그것 매우 성공적인 시각화를 위해 염색 전에 PTU와 배아를 치료 하 고 좋습니다. 또한, 이전에 손상 초래 없이 슬라이드 장착 배아 눈의 해 부 연습이 필요 합니다. 그것도 옆으로 슬라이드를 최대한 병렬 눈을 탑재 하는 것이 필수적입니다. 실험 실험 전에 여분의 배아와 함께 이러한 기술을 연습 하는 것이 좋습니다.
예외는 immunofluorescent 얼룩 기저 lamina의, 여기에 설명 된 프로토콜의 모든 라이브 배아를 사용 하 여 완료할 수 있습니다. 초기 embryogenesis 통해 SOS SOS의 폐쇄에 관련 된 형태학 적 변화의 시간 경과 연구에 실험을 수 있도록 지속적인 시각화 수 있습니다. 과거에는, 우리 Tg(rx3:eGFP), 초기 개발. 동안 신경 망막을 표시 등 망막 특정 transgenes 사용 비록 세포 막 시각화 하는 능력 부족, Tg(rx3:eGFP) 를 사용 하 여 microinjections를 요구 하지 않기의 이점이 있다 하 고 실시간으로 SOS 건축 총 형태학 상 변화를 시각화 우리의 기본 방법 되었습니다. 해당 프로토콜 되지 않았습니다 포함 여기,로 유사한 방법 이전이 저널18,19에서 논의 되었습니다. 그러나, SOS 형성 및 폐쇄의 세포 생물학 기초의 조사 막 형광 단백질을 필요 합니다. 특히, eGFP CAAX mRNA의 주입 필요한 적절 한 SOS 폐쇄 등 눈에 셀 모양 변경의 역학 연구를 수 있는 그림 5에서 보듯이 SOS 주위 세포 막의 시각화 수 있습니다. EGFP CAAX SOS 폐쇄의 라이브 이미징 수행 하는 데 유용할 수 있습니다, 그것은 어려운 의해 이루어집니다 zebrafish에 무기력 계층의 존재. 또한, 해야 합니다 주의 mosaicism, 배아 eGFP 식 힘의 부 량에 따라 직접 비교 하기 어렵게 될 수 있기 때문에 mRNA 주사에서 결과 분석할 때. 이 유전자 변형 zebrafish 라인 세포 막 특히 Tg(vsx2.2:GFP-caax)같은 개발 망막에에서 붙일 라벨을 통해 ameliorated 수 있습니다.
우리의 프로토콜의 과제 중 하나는 완전히 침투 어떤 치료와 거짓말. 우리는 이전 지적 했다 SOS 지연 28 hpf8, 제어 배아의 약 10%에서 볼 수 있습니다 어떤 주어진 실험적인 그룹 SOS와 배아의 기본이 존재 그것은 실험의 미묘한 효과 관찰 하기 어렵게 만들 수 있다 조작입니다. 이 눈부신 실험 바이어스를 줄이기 위해 실험 하 고 각 실험 그룹 내에서 실험의 힘을 증가 하는 데 사용 하는 배아의 수를 증가 하 여 해결 될 수 있습니다. 또한, 분석의 단계는 29-30 hpf 이동 수 있습니다.
프로토콜의이 세트로, 우리는 SOS 폐쇄 지연 시각화는 방법 표준화를 추구 합니다. 위에서 설명한 기술을 감지 하 고 시각화 하는 다양 한 실험 설정에에서 SOS 폐쇄 지연에 신뢰할 수 표시 하 고 실험의 요구에 적응할 수 있다. 우리의 목표는 여기 높은 처리량 실험적인 의무가 있는 프로토콜 표준화 된 집합을 만드는 것입니다 우리가 자세히 조 난 신호를 시각화 하 스캐닝 전자 현미경 검사 법 또는 유전자 변형 태아의 시간 경과 영상 같은 기법을 사용 하는 동안 점수 폐쇄 지연 고기 능력에 중점을 두고 하루에 많은 수의 배아를 시각화를 디자인 합니다. Gdf6a-/- 배아와 그것의 사용 이외에 우리 SOS 폐쇄 지연 고기 약리학 적인 치료, morpholino 주사와 RNA overexpression 학문이 시각화 기술을 사용 하 여 관찰할 수 있다. 눈 개발에 SOS의 역할은 해명으로 하겠습니다, 다양 한 수단을 통해 더이 표준화 된 프로토콜 집합이 제공 사회 과학 공통 언어를 통해이 소설의 구조는 공부.
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Disclosures
저자는 선언에 전혀 상반 되는 관심사를 있다.
Acknowledgments
이 작품은 캐나다 연구소의 건강 연구 (CIHR), 자연과학 및 공학 연구 위원회 (NSERC), 앨버타 혁신 기술 선물, 그리고 여 성과 어린이 건강 연구 연구소 (WCHRI)에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-phenyl 2-thiourea | Sigma Aldrich | P7629-10G | |
| 100 mm Petri dish | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 35 mm Petri dish | Corning | CLS430588 | |
| Agarose | BioShop Canada Inc. | AGA001.1 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A7906-100G | |
| DIC/Fluorescence microscope | Zeiss | AxioImager Z1 | |
| Dissection microscope | Olympus | SZX12 | |
| Dissection microscope camera | Qimaging | MicroPublisher 5.0 RTV | |
| Dow Corning High-vacuum grease | Fisher Scientific | 14-635-5D | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Sigma Aldrich | A5040-25G | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150077 | |
| Goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Image capture software | Zeiss | ZEN | |
| Incubator | VWR | Model 1545 | |
| Microscope Cover Glass (22 mm x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Microscope slide | Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| Minutien pin | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit | Invitrogen | AM1340 | |
| NotI | New England Biolabs | R0189S | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148-500G | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol pH 6.7 +/- 0.2 | Fisher Scientific | BP1752-100 | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | P4850 | |
| Rabbit anti-laminin antibody | Millipore Sigma | L9393 | |
| TURBO Dnase (2 U/µL) | Invitrogen | AM2238 | |
| Ultrapure low-melting point agarose | Invitrogen | 16520-100 | |
| UltraPure Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Invitrogen | 15525017 |
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