Summary
Her presenterer vi en standardisert rekke protokoller å observere den overlegne okulær sulcus, en nylig identifisert, evolusjonært bevart struktur i virveldyr øyet. Bruker sebrafisk larver, viser vi teknikker er nødvendig for å identifisere faktorer som bidrar til dannelsen og stenging av den overlegne okulær sulcus.
Abstract
Medfødt okulær coloboma er en genetisk lidelse som er vanligvis observert som en kløft i dårligere aspekt av øyet som følge ufullstendig choroid sprekken nedleggelsen. Nylig enkeltpersoner med coloboma i den overlegne aspektet av iris, netthinnen og linsen førte til oppdagelsen av en ny struktur, referert til som overordnet sprekken eller overlegen okulær sulcus (SOS), som er transiently på det dorsal aspekt av optikk cup under virveldyr øye utvikling. Selv om denne strukturen er bevart mus, kylling, fisk og Salamander, er vår nåværende forståelse av SOS begrenset. For å belyse faktorer som bidrar til dannelsen og nedleggelse, er det viktig å kunne observere og identifisere unormalt, for eksempel forsinkelser i nedleggelsen av SOS. Her satt vi ut for å lage en standardisert serie som kan brukes til å effektivt visualisere SOS ved å kombinere tilgjengelig mikroskopi teknikker med vanlige molekylærbiologi teknikker som immunofluorescent flekker og mRNA overuttrykte. Mens dette settet med protokoller fokuserer på muligheten til å observere SOS nedleggelse forsinkelsen, det tilpasses den eksperimentator behov og kan enkelt endres. Total, vi håper å skape en imøtekommende metode som vår forståelse av SOS kan være avansert for å utvide dagens kunnskap om virveldyr øye utvikling.
Introduction
Dannelsen av virveldyr øyet er en høyt konservert prosess der nøye orkestrert intercellulære signalveier etablere vev typer og angi regionale identitet1. Forstyrrelser til tidlig øye morphogenesis føre til dyp feil arkitektur øyet og er ofte blendende2. En slik sykdom skyldes manglende lukke choroid okulær sprekken i ventral side av optikk cup3. Denne lidelsen, kjent som okulær coloboma, er beregnet for å skje i 1 av 4-5000 levendefødte og sak 3-11% av pediatric blindhet, ofte manifestert som en nøkkelhullet konstruksjon som stikker inferiorly fra Eleven i midten av øyet4, 5,6. Funksjonen av choroid sprekken er å gi et startpunkt for tidlig blodkar vokser i optikk koppen, hvoretter sider av sprekken vil sikring for å vedlegge fartøy7.
Mens okulær coloboma har vært kjent siden antikken, har vi nylig identifisert en roman undergruppe av coloboma pasienter med vev tap påvirker superior/dorsal aspekt av øyet. Siste verk i vår lab har ført til oppdagelsen av en okulær struktur i sebrafisk dorsal øyet, som vi refererer til som overordnet okulær sulcus (SOS) eller overlegen sprekken8. Det er viktig å merke seg at strukturen har både en sulcus og en sprekk. Ligner på en sulcus, det er en kontinuerlig vev lag som strekker seg fra en nasal på timelige netthinnen. I tillegg nedleggelsen av strukturen er ikke formidlet av en blanding av de to motstridende kjelleren membran, og det synes å kreve en Morfogenetiske prosess som strukturen er befolket av celler. Men ligner en sprekk, den danner en struktur som skiller nese og tidsmessige sidene av det dorsal øye med kjelleren membran. For konsistens, vil vi referere til det som SOS i denne teksten.
SOS er evolutionarily bevart over virveldyr, blir synlige under øye morphogenesis i fisk, kylling, newt og mus8. I motsetning til choroid kom ut, som er tilstede fra 20-60 timer etter befruktning (hpf) i sebrafisk, SOS er svært forbigående, er lett synlige fra 20-23 hpf og fraværende av 26 hpf8. Nyere forskning i vår lab har funnet at ligner choroid sprekken, SOS spiller en rolle i vaskulær veiledning under øye morphogenesis8. Selv om faktorene som styrer dannelsen og stenging av SOS ikke er ennå fullt ut forstått, gjorde våre data markere roller for dorsal ventrale øye mønstre gener8.
Sebrafisk er en utmerket modell organisme å studere i SOS. Som en modell, det gir en rekke fordeler i å studere øye utvikling: det er en virveldyr modell; hver generasjon utstillinger høy fruktbarhet (~ 200 embryo); dens Genova har vært fullt sekvensielt, som forenkler genetisk manipulasjon; og ca 70% av menneskets gener har minst én sebrafisk orthologue, noe som gjør det til en ideell genetikk-basert modell av menneskelig sykdom9,10. Viktigst, utviklingen tar sted eksternt til moren, og Larven er gjennomsiktig, som gir effekten av tredje øyet med relativ letthet11.
I dette protokoller beskriver vi teknikker som i SOS kan visualiseres i sebrafisk larver. Rekke visualiseringsteknikker som brukes i denne rapporten gjør klart observasjon av SOS under normale øye utvikling, og til å oppdage SOS lukking feil. Våre eksempel protokoller har undersøkelser av Gdf6, BMP lokalisert til den dorsal øye og kjente regulator av SOS nedleggelse. Videre kan disse teknikkene kombineres med eksperimentelle manipulasjoner å identifisere genetiske faktorer eller farmakologiske agenter som påvirker riktig SOS dannelse og nedleggelse. I tillegg har vi inkludert en protokoll som fluorescerende avbilding av alle cellemembraner er mulig, slik at eksperimentator å observere morfologiske endringer i cellene rundt i SOS. Vårt mål er å etablere et sett av standardiserte protokoller som kan brukes i hele det vitenskapelige samfunnet til gir ny innsikt i denne romanen strukturen av tredje øyet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metodene som er beskrevet her er godkjent ved University of Alberta Animal Care og bruk komiteen.
1. protocol 1: Visualisering av SOS omikroskopi og differensial forstyrrelser kontrast (DIC) bildebehandling
- Fosteret samling
- I en tank dechlorinated vann, klargjør du krysser av gdf6a+/- sebrafisk på kvelden ved sammenkobling en mannlig sebrafisk med en kvinnelig sebrafisk. Husk å skille mannlige fra kvinnelige ved en skillelinje til å sikre at embryoene er født innenfor et lite område av tid.
- Neste morgen, dra delelinjen og tillater sebrafisk å rase for lenger enn 30 min. samle embryoene Petri retter med E3 medier, beskrevet i sebrafisk bok12, og plassere dem i en 28,5 ° C inkubator.
- Fjerne 5mas egg eller død embryoer, som vises hvit og ugjennomsiktig.
- Forberedelse og live-imaging av sebrafisk embryo
- 20 hpf, Erstatt E3 media med E3 mediet som inneholder 0.004% 1-fenyl 2-thiourea (PTU) for å hindre pigment produksjon.
NOTE Addisjonen av PTU på en litt senere timepoint, som 22-24 hpf, er usannsynlig å forstyrre forsøket på grunn av tidlig alder av embryoene samtidig med bildebehandling. Det anbefales imidlertid å behandle embryoene tidlig for å helt unngå pigmentering som det er en gjeng pigmentering som vises i dorsal øyet, som kan forstyrre avbilding av i SOS. - Kontroller at alle embryoer er på de riktige utviklingsstadier på forskjellige steder frem til tidspunktet for observasjon. Det anbefales at dette gjøres i etapper på hvilke somite tall er synlig som skissert av Kimmel et al.13. Fjern de som er developmentally umodne.
- Plasser embryoene under dissecting mikroskop, og dechorionate embryoene ved forsiktig trekke fra hverandre i plasmocitara ved hjelp av fine tang. Visualisere SOS i rygg øynene. SOS kan vises som et innrykk ved dorsal marg i øyet, og en linje skal vises over dorsal øyet. For normal SOS nedleggelse, observere embryoer på rundt 20-23 hpf. For undersøkelse av forsinket SOS nedleggelse fenotyper, observere embryoene på 28 hpf eller senere.
- Sortere embryo som viser SOS nedleggelse forsinkelsen fra som.
- For å fotografere disse Foster bruker dissecting mikroskop, forberede en Petriskål som inneholder 1% agarose i E3. Lett stikk midten av agarose opprette grunt hull der eggeplomme av embryoet kan sitte når embryoet er plassert på agarose. Dette sikrer at fosteret ikke er i en skrå vinkel når blir fotografert.
- Bedøve embryo med 0.003% tricaine på E3 og sted sidelengs på agarose.
- For å bilde embryo bruker sammensatte eller AC confocal mikroskop, overføre embryoet til 35 mm Petriskål som inneholder en liten bolus av ikke-gelled 1% lav-smeltende punkt agarose i E3 (w/v). Raskt plassere embryoet sidelengs med en fin fiskesnøre eller en øyenvippe og vente på agarose å kjøle. Når agarose er fast, hell nok E3 i retten til å dekke agarose. For mer informasjon, kan du se Distel og Köster14.
Merk: Hvis bruker en invertert mikroskop, fosteret kan plasseres mot glasset av en glass-dekkglassvæske-bunnen rett og fotografert med en standard 20 X objektive linsen. - Bruk en vann nedsenking 20 x linsen for å visualisere SOS med sammensatte mikroskop. Etter visualisering, forsiktig trekke agarose fra embryoene og fikse i 4% paraformaldehyde (PFA) eller kunne fortsette sin utvikling.
- 20 hpf, Erstatt E3 media med E3 mediet som inneholder 0.004% 1-fenyl 2-thiourea (PTU) for å hindre pigment produksjon.
2. protocol 2: Hele-mount immunofluorescent farging av laminin
- Hele-mount immunofluorescent farging av laminin: dag 1
- Dechorionate embryo som beskrevet i trinn 1.2.3, hvis ikke allerede har gjort. Fastsette embryo i et microcentrifuge rør på den ønskede timepoint i nystekte 4% PFA 2 h på en romtemperatur (22-25 ° C) shaker. Vask i 1 x PBST i 5 minutter, fire ganger.
Merk: Etter gastrulation, embryo kan fikse bedre etter dechorionation. - Permeabilize embryo i 10 mg/mL proteinasen K ved romtemperatur for 5 min. inkubasjon tid avhenger det utviklingen scenen der embryoene er løst (se Thisse og Thisse15).
- Vask i 1 x PBST i 5 minutter, fire ganger.
- Blokkere embryo i en løsning av 5% geit serum og 2 mg/mL bovin serum albumin (BSA) i 1xPBST for 1-2 h på en romtemperatur shaker.
- Klargjør primære antistoff løsning ved å fortynne kanin anti-laminin antistoffer i blokk løsning på en 1:200 fortynning.
- Inkuber embryo i anti-laminin primære antistoff overnatter på en 4 ° C shaker.
- Dechorionate embryo som beskrevet i trinn 1.2.3, hvis ikke allerede har gjort. Fastsette embryo i et microcentrifuge rør på den ønskede timepoint i nystekte 4% PFA 2 h på en romtemperatur (22-25 ° C) shaker. Vask i 1 x PBST i 5 minutter, fire ganger.
- Hele-mount immunofluorescent farging av laminin: dag 2
- Vask i 1 x PBST i 15 min, fem ganger.
- Klargjøre sekundære antistoff løsning fortynne geit anti-kanin Alexa Fluor 488 antistoff 1 x PBST til en fortynning av 1:1000.
Merk: Det er mulig å tilpasse dette trinnet etter tilgjengelige ressurser til eksperimentator ved hjelp av en annen sekundær antistoff. - Inkuber embryo i sekundære antistoff overnatter på en 4 ° C shaker. Skjerme fra lys så mye som mulig dette trinnet og utover.
- Vask i 1 x PBST i 15 min, fire ganger. Embryoene kan lagres ved 4 ° C i opptil en uke, om nødvendig.
- Disseksjon og montering av embryonale øyne
- Eventuelt plassere embryoene i en liten Petriskål og deyolk embryoene i 1 x PBST. Gjør dette ved å forsiktig forstyrre eggeplomme med fine tang og fjerne eggeplomme cellene til mild skraping av plommesekken.
- Klargjør følgende konsentrasjonen av PBS-glyserol serien løsninger i microcentrifuge rør: 30%, 50% og 70% glyserol i PBS. Overføre embryo til 30% glyserol/PBS, og pass på å plassere embryoene på løsningen og overføre så lite av den forrige løsningen som mulig. Vent til embryoene til synke å bunnen av røret.
- Når embryoer har sunket til bunns, overføre dem til 50% glyserol/PBS. Gjenta og overføre til 70% glyserol/PBS.
- Når embryoene har sunket i 70% glyserol/PBS, flytte dem til en liten plast rett for disseksjoner.
- Sever embryoet bakenfor hindbrain, og bruke den bakre vev for genotyperingteknologi, hvis nødvendig.
- Flytte hodet til et glass lysbilde, overføre som liten glyserol som mulig. Bruk tang eller andre fine disseksjon verktøy til å holde på den bakre enden å holde hodet stasjonære. Bruk en fin minutien eller andre fine disseksjon verktøy å forsiktig inn forebrain ventrikkel fra det fremre og skyv nedover skille de høyre og venstre halvdelene av hodet fra hverandre. Gjenta dette mens du flytter posteriorly gjennom mellomhjernen og i hindbrain ventrikkel, hovedsakelig fileting hodet ned midtlinjen. Dette minimerer manuell manipulasjon av øyet og omkringliggende vev, og dermed forlater SOS uskadet.
- Montere hver side av hodet midtlinjen ned, øye opp. Posisjon 4 innlegg av vakuum fett i hjørnene (en passende avstand fra hverandre for dekkglassvæske brukes) og dekk med et glass dekkglassvæske, skyve ned sekvensielt på hvert innlegg til dekkglassvæske kommer i kontakt med prøvene. Pipetter 70% glyserol på kanten av dekkglassvæske slik at glyserol trekkes under, fyller mellomrommet mellom dekkglassvæske og lysbildet.
- Bilde prøver innen en dag, eller forsegle rundt dekkglassvæske med neglelakk og bilde eksempler bare etter på neglelakk har tørket. Lagre i mørket på 4 ° C.
3. protokoll 3: Visualisering av SOS bruker eGFP-CAAX mRNA
- Syntese av eGFP-CAAX mRNA
- Linearize 1 mg pCS2-eGFP-CAAX plasmider16 med NotI i en reaksjon mengde 40 mL for 4 timer på 37 ° C.
- For å stoppe begrensning digest reaksjonen, tilsett 10 mL RNase gratis vann, 2,5 mL 10% SDS og 2.0 mL 10 mg/mL proteinasen K.
- Inkuber 1 time ved 50 ° C.
- Legge til følgende reaksjonen (totalt volum 200 mL) og videre til neste trinn: 50 mL RNase gratis vann, 20 mL 3 M natrium acetate pH 5.2 og 75.5 mL RNase uten vann
Merk: RNase-fritt vann legges i to separate anledninger å forhindre overdreven fortynning av natrium acetate.
- Rensing av DNA gjennom fenol/kloroform utvinning og etanol nedbør
- Legge 200 mL fenol: kloroform: isoamyl alkohol og vortex for 20 s. separat vandige og organiske fasene gjennom sentrifugering 18.000 x g i 5 min.
- Overføre øvre vandig laget til en ny microcentrifuge tube, sørge for å unngå overføring av organisk botnlaget. Legge til en lik mengde kloroform det nye røret.
NOTE Addisjonen av kloroform er valgfritt, men anbefales å sikre fullstendig fjerning av fenol fra utvalget. - Vortex for 20 s. egne vandige og organiske fasene gjennom sentrifugering 18.000 x g i 5 min.
- Som før, overføre øvre vandig laget til en ny microcentrifuge tube, sørge for å unngå overføring av organisk botnlaget.
- Legg til 1/10 volumet av 3 M natrium acetate pH 5.2.
- Utløse DNA ved å legge 3 mengder 100% RNase-fri etanol og chill på 20 ° C i 15 min. sentrifuge 18.000 x g for 20 min på 4 ° C. Pellets skal vises. Dekanter nedbryting.
- Vask pellets med 100 mL kaldt 70% etanol/RNase-gratis vann. Etter miksing forsiktig for å løsne pellet, sentrifuge 18.000 x g i 15 min på 4 ° C. Pellets skal vises. Dekanter nedbryting.
- Air-Dry pellets for 5 min og resuspend DNA i 7 mL vann.
Merk: Pellet må tørkes lenger enn 5 minutter avhengig av luftstrømmen tilgjengelig.
- Transkripsjon og rensing av eGFP-CAAX mRNA
- I en RNase-fri måte, Forbered en i vitro transkripsjon reaksjon med en kommersielt tilgjengelig Sp6 RNA polymerase kit, bruker ca 1 mg av renset linearisert plasmider DNA innhentet i trinn 3.2. Inkuber 2 h på 37 ° C.
Merk: Sp6 RNA polymerase må brukes for produksjon av avkortet mRNA. - Legge 1 mL av DNase (2 U/mL; RNase gratis) og Inkuber i 30 min på 37 ° C.
- Rense mRNA med alle kommersielt tilgjengelig RNA rensing kit. Aliquot mRNA å unngå gjentatte fryse-tine, og lagre på-80 ° C.
- I en RNase-fri måte, Forbered en i vitro transkripsjon reaksjon med en kommersielt tilgjengelig Sp6 RNA polymerase kit, bruker ca 1 mg av renset linearisert plasmider DNA innhentet i trinn 3.2. Inkuber 2 h på 37 ° C.
- Injeksjon og visualisering
- Få embryo som protokollen 1.1.
- Bruker en microinjection apparater, injisere 300 pg av eGFP-CAAX mRNA på 1-celle scenen.
- Skjermen for embryoer med lyse uttrykk for eGFP i øynene med en fluorescens stereoscope.
- Bilde av embryo som beskrevet i protokollen 1.2.
- Eventuelt dechorionate og fikse embryoene på den ønskede timepoint i 4% PFA 4 timer ved romtemperatur eller over natten på 4° C. Legg embryoene i 1 x PBST i 5 minutter, fire ganger og dechorionate, hvis ikke tidligere gjort. Dissekere øynene og montere dem på lysbilder som beskrevet i protokollen 2.3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sebrafisk SOS vises på 20 hpf i presumptive dorsal netthinnen8. 23 hpf til SOS overganger fra sin første smale arkitektur til et bredt innrykk og 26 hpf det er ikke lenger synlig8. Derfor, for å undersøke SOS under normale sebrafisk øye utvikling, embryoene må følges mellom 20-23 hpf. I denne perioden er SOS observerbare gjennom dissecting mikroskopet og via DIC imaging som en tynn linje i rygg øynene som skiller nese og tidsmessige halvdelene av utvikle netthinnen (figur 1). I tillegg kan en subtil innrykk være synlig i dorsal grensen av øyet (figur 1). Etter immunofluorescent flekker av laminin, den tynne linjen kan bekreftes kjelleren membranen (figur 1).
For å undersøke molekylær veier som fører til forsinket SOS nedleggelse, valgte vi å observere embryoene på 28 hpf som dette er en timepoint som er tilstrekkelig fjernet fra tidspunktet for normal SOS nedleggelse og er derfor et pålitelig merke av SOS nedleggelse forsinkelsen skyldes eksperimentell manipulasjoner. Gjennom direkte visualisering av 28 hpf sebrafisk under dissecting mikroskop er det mulig å vurdere SOS nedleggelse forsinkelsen skyldes eksperimentelle manipulasjon. Når SOS nedleggelse er forsinket, sees nærværet langvarig uttales leppe dorsal side av øyet under dissecting mikroskopet (figur 2). Når observert under sammensatte mikroskop med DIC eller Nomarski optikk, denne funksjonen er enda mer fremtredende, og nese og tidsmessige sidene av øyet er atskilt med SOS, som er synlig som en linje i dorsal øyet (Figur 3).
SOS er foret med basal lamina komponenter, inkludert laminin. Derfor gir immunofluorescent flekker en utfyllende metoden av vurderer SOS nedleggelse i fast embryoer. Når imaging embryonale øyet fra en lateral visning, den basale lamina demarcates den utvendige margen i øyet, både okulær sprekker, og grensen mellom linsen og netthinnen (Figur 4). SOS orienteres direkte motsatt choroid kom ut i det dorsal aspektet av øyet. Hele embryo kan monteres lateralt, med noe bedre optisk klarhet hvis øyne er tidligere microdissected. Av 28 hpf, i wildtype sebrafisk, laminin flekker viser tydelig at SOS er helt lukket, som gjør dette til det ideelle stadiet for overvåking forsinkelser i sprekken nedleggelse.
Injeksjon av eGFP-CAAX mRNA tillater visualisering av celle membraner av en levende eller fast embryo (figur 5). Vellykket en celle scenen injeksjon er tilstrekkelig til å produsere embryo med komplett cellemembranen fluorescens. I visningen lateral alle mobilnettet grenser skal være preget av GFP fluorescens og slik celle morfologi er også tydelig observert. Dette gjør at effekten av cellene fører til SOS nedleggelse morfologiske endringer.
Figur 1: observasjon av SOS under normale sebrafisk øye utvikling. Sebrafisk embryo var samlet og fotografert på 22 hpf. AB. Lateral visning av 22 hpf embryo live-fotografert med dissecting mikroskopet (A) og via DIC imaging (B), henholdsvis. SOS er merket med en rød stjerne. C. Laminin immunofluorescent flekker på en 22 hpf fosteret. Embryo ble fikset i 4% PFA og til hele-mount immunofluorescent farging av laminin. Embryoene var fileted og montert i 70% glyserol/PBS. Enkelt stykke bildene ble innhentet gjennom AC confocal bildebehandling med en programvare. SOS er merket med en hvit stjerne. Alle tall ble kommentert og sammen med Adobe Illustrator-programvare. Skala stolper representerer 50 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: dissekere mikroskop bilder av SOS nedleggelse forsinkelsen i sebrafisk larver. Wildtype og gdf6a- / - embryo var samlet og live-fotografert på 28 hpf. A. Lateral visning av en wildtype embryoet med en lukket SOS. B. Lateral visning av en gdf6a- / - fosteret med en SOS nedleggelse forsinkelse (stjerne). En skarp depresjon er dorsal aspekt av øyet på grunn av SOS lukke riktig. Skala stolper representerer 50 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: representant DIC bilder av SOS i sebrafisk embryonale øyet. Wildtype og gdf6a- / - embryo var samlet, anesthetized, og plassert sidelengs i 1% Ultrapure lav-smeltende punkt agarose i E3 på 35 mm Petriskål. Parabolen var fylt med E3, og en satt mikroskop med en 20 x vann-dipping mål ble brukt for DIC bildebehandling. A. Lateral visning av en wildtype embryoet med en lukket SOS. B. Lateral visning av en gdf6a- / - fosteret med en SOS nedleggelse forsinkelse (stjerne). SOS er som en tynn linje i dorsal aspekt av øyet. Skala stolper representerer 50 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: representant bilder av laminin immunofluorescent farging i embryonale sebrafisk øye. Wildtype og gdf6a- / - embryo var samlet og løst i 4% PFA på 28 hpf. Den basale lamina var immunostained, og embryoene var fileted og montert i 70% glyserol/PBS for AC confocal bildebehandling. Enkelt stykke bildene ble oppnådd ved hjelp av ZEN programvare. A. Lateral visning av en wildtype embryoet med en lukket SOS. B. Lateral visning av en gdf6a- / - fosteret med en SOS nedleggelse forsinkelse (stjerne). Den basale lamina vises beskriver øyet i grønt, med SOS synlig i dorsal del av øyet i gdf6a- / - embryoer. Skala stolper representerer 50 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Imaging av sebrafisk embryonale øyet etter eGFP-caax mRNA injeksjon. Wildtype embryo ble injisert med 300 pg av eGFP-caax mRNA på 1-celle stadium. På 22 hpf og 28 hpf, henholdsvis embryoene var anesthetized og montert sidelengs i 1% Ultrapure lav-smeltende punkt agarose i E3 på 35 mm Petriskål. AC confocal mikroskop med en 20 x vann-dipping mål ble brukt for bildebehandling og enkelt stykke bildene ble oppnådd ved hjelp av en programvare. A. Lateral visning av en gdf6a- / - fosteret på 22 hpf med en synlig åpne SOS (stjerne). B. forstørret paneler på en gdf6a- / - fosteret på 22 hpf. C. Lateral visning av en gdf6a- / - fosteret på 28 hpf med en SOS nedleggelse forsinkelsen. D. forstørret paneler på en gdf6a- / - fosteret på 28 hpf. Skala barer representerer 50 mm og 10 mm paneler A og C, og B og D, henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her presenterer vi en standardisert rekke protokoller å observere SOS i utviklingsland sebrafisk embryo. For å finne nedleggelse forsinkelsen fenotyper, har våre protokoller fokusert på muligheten til å skille separasjon av to atskilte fliker av dorsal-nese og dorsal-temporal sidene i øyet, ligner på teknikker som brukes til å visualisere choroid sprekken nedleggelse forsinkelsen fenotyper i ventrale øyet.
Disse visualiseringsteknikker kan brukes sammen med en rekke genetisk manipulasjon teknikker for å studere virkningene av hemme eller inducing uttrykk for visse gener å studere deres roller i nedleggelsen av SOS. Vi har valgt å vise disse protokollene ved hjelp gdf6a- / - embryo som vi tidligere har vist at sine tap kan påvirke riktig nedleggelsen av SOS, men protokollene kan brukes til å studere virkningene av manipulere uttrykk for alle genet som nødvendig. Det anbefales at morfologiske endringer dorsal øyet er studert foreløpig med observasjoner av dissecting mikroskopet. Andre teknikker bør brukes når en innledende koblingen opprettes definitivt, som de er mer tidkrevende og lavere ytelse.
Mens protokollene kan enkelt endres for å passe behovene til eksperimentator, er det flere aspekter som må følges nøye. På grunn av forbigående denne strukturen er det viktig å sikre at alle observert embryoer er den samme utviklingsstadiet. For vårt arbeid finner vi det viktig å tillate bare et lite vindu avl tid og regelmessig sortere embryoene gjennom tidlig utvikling. Viktigste av equalizing stadier er 20 hpf, når du kan fortsatt telle somites (24)17, og vi finner denne mye mer pålitelig enn mellomlagring kjennetegnene som avgrense tid på 28 hpf. I tillegg må pigmentering være hemmet eller fjernet for å sikre vellykket visualisering av strukturen. Vi har observert pigmentering i øynene starter rundt 22 hpf, og det er et mønster av pigmentering i rygg øynene som kan forstyrre riktig visualisering av SOS. Derfor er det sterkt anbefalt å behandle embryoene med PTU før pigmentering å sikre vellykket visualisering. I tillegg krever Disseksjon av embryonale øyet før lysbildet montering uten å forårsake skade litt øvelse. Det er også viktig å montere lateralt øynene som parallell som mulig på lysbildet. Det anbefales at eksperimentator praksis teknikkene med ekstra embryo før eksperimentet.
Med unntak av immunofluorescent farging av den basale lamina, kan alle protokollene beskrevet her fullføres med live embryoer. Dette tillater kontinuerlig visualisering av SOS gjennom tidlig embryogenesis, slik at eksperimentator utføre time-lapse studier morfologiske endringene i nedleggelsen av SOS. Tidligere har vi brukt retina-spesifikke effekter av transgener, som Tg(rx3:eGFP), som markerer neural netthinnen under utviklingen. Selv om den mangler muligheten til å visualisere cellemembraner, bruk av Tg(rx3:eGFP) har fordelen av ikke krever microinjections og er vår primære metode for å visualisere brutto morfologiske endringer til SOS arkitektur i sanntid. Denne protokollen er ikke inkludert her, som lignende metoder har blitt diskutert tidligere i denne journalen18,19. Undersøkelse av cellen biologiske grunnlaget for SOS dannelse og nedleggelse krever imidlertid membran fluorescerende proteiner. Spesielt kan injeksjon av eGFP-CAAX mRNA visualisering av celle membraner rundt SOS som vist i figur 5, som tillater oss å studere dynamikken i cellen figurendringene i dorsal øyet som er nødvendig for riktig SOS nedleggelse. Mens eGFP-CAAX kan være nyttige for å utføre live bildebehandling SOS nedleggelsen, er det gjort vanskelig av tilstedeværelsen av omsluttende laget i sebrafisk. I tillegg må utvises ved analysere resultatene fra mRNA injeksjoner fordi det kan føre til mosaicism, gjør det vanskelig å direkte sammenligne embryo basert på kvantifisering av eGFP uttrykk styrke. Dette kan bedres ved hjelp av transgene sebrafisk linjer som fluorescently etiketten cellemembraner spesielt i utviklingsland netthinnen, som Tg(vsx2.2:GFP-caax).
En av utfordringene våre protokoller ligger med noen behandling som ikke er fullt penetrant. Vi har tidligere bemerket at SOS forsinkelser kan ses i ca 10% av kontroll embryo 28 hpf8, og dette underliggende tilstedeværelsen av embryo med en SOS innenfor en gitt forsøksgruppen kan gjøre det vanskelig å observere subtile effekter av eksperimentell manipulasjon. Dette kan rettes ved blendende eksperimentator for å redusere eksperimentator bias og øke antall embryo brukes innenfor hver forsøksgruppen for å øke kraften i eksperimentet. I tillegg kan scenen av analyse bli forskjøvet til 29-30 hpf.
Med disse protokollene søker vi å standardisere måten der SOS nedleggelse forsinkelser er visualisert. Teknikkene ovenfor har vist seg å være pålitelige i å oppdage og visualisere SOS nedleggelse forsinkelser i en rekke eksperimentelle innstillinger og kan tilpasses den eksperimentator behov. Mens vi har brukt teknikker som elektronmikroskop eller tidsinnstilt bildebehandling av transgene embryo for å visualisere SOS nærmere, er vårt mål her å skape en standardisert sett med protokoller som er mottakelig for høy gjennomstrømming eksperimentell design for å visualisere mange embryoer på en enkelt dag med vekt på muligheten til å score nedleggelse forsinkelsen fenotyper. I tillegg til bruk med gdf6a- / - embryo, har vi kunnet observere SOS nedleggelse forsinkelsen fenotyper bruke disse visualiseringsteknikker sammen med farmakologiske behandlinger, morpholino injeksjoner og RNA overuttrykte studier. Som rollen SOS i øye utvikling er belyst videre gjennom ulike virkemidler, håper vi at denne standardisert sett med protokoller gir det vitenskapelige samfunnet et felles språk som denne romanen strukturen er studert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen motstridende interesser å erklære.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av kanadiske institutter for helse forskning (CIHR), naturvitenskap og Engineering Research Council (NSERC), Alberta fornyer teknologi Futures, og kvinner og barns helse Research Institute (WCHRI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-phenyl 2-thiourea | Sigma Aldrich | P7629-10G | |
| 100 mm Petri dish | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 35 mm Petri dish | Corning | CLS430588 | |
| Agarose | BioShop Canada Inc. | AGA001.1 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A7906-100G | |
| DIC/Fluorescence microscope | Zeiss | AxioImager Z1 | |
| Dissection microscope | Olympus | SZX12 | |
| Dissection microscope camera | Qimaging | MicroPublisher 5.0 RTV | |
| Dow Corning High-vacuum grease | Fisher Scientific | 14-635-5D | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Sigma Aldrich | A5040-25G | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150077 | |
| Goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Image capture software | Zeiss | ZEN | |
| Incubator | VWR | Model 1545 | |
| Microscope Cover Glass (22 mm x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Microscope slide | Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| Minutien pin | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit | Invitrogen | AM1340 | |
| NotI | New England Biolabs | R0189S | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148-500G | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol pH 6.7 +/- 0.2 | Fisher Scientific | BP1752-100 | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | P4850 | |
| Rabbit anti-laminin antibody | Millipore Sigma | L9393 | |
| TURBO Dnase (2 U/µL) | Invitrogen | AM2238 | |
| Ultrapure low-melting point agarose | Invitrogen | 16520-100 | |
| UltraPure Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Invitrogen | 15525017 |
References
- Chow, R. L., Lang, R. A.
- Slavotinek, A. M. Eye development genes and known syndromes. Molecular Genetics and Metabolism. 104 (448-456), (2011).
- Gregory-Evans, C. Y., Williams, M. J., Halford, S., Gregory-Evans, K. Ocular coloboma: a reassessment in the age of molecular neuroscience. Journal of Medical Genetics. 41 (12), (2004).
- Onwochei, B. C., Simon, J. W., Bateman, J. B., Couture, K. C., Mir, E.
- Williamson, K. A., FitzPatrick, D. R. The genetic architecture of microphthalmia, anophthalmia and coloboma. European Journal of Medical Genetics. 57, 369-380 (2014).
- Chang, L., Blain, D., Bertuzzi, S., Brooks, B. P. Uveal coloboma: clinical and basic science update. Current Opinion in Ophthalmology. 17, 447-470 (2006).
- Kaufman, R., et al. Development and origins of Zebrafish ocular vasculature. BMC Developmental Biology. 15 (18), (2015).
- Hocking, J. C., et al. Morphogenetic defects underlie Superior Coloboma, a newly identified closure disorder of the dorsal eye. PLOS Genetics. 14 (3), (2018).
- Lawson, N. D., Wolfe, S. A. Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish. Developmental Cell. 21 (1), (2011).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), (2013).
- Bilotta, J., Saszik, S. The zebrafish as a model visual system. International Journal of Developmental Neuroscience. 19, 621-629 (2001).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book; A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 5th edition, University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2007).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- Distel, M., Köster, R. W. In vivo time-lapse imaging of zebrafish embryonic development. Cold Spring Harbor Protocols. , (2007).
- Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3, 59-69 (2008).
- Kwan, K. M., Otsuna, H., Kidokoro, H., Carney, K. R., Saijoh, Y., Chien, C. A complex choreography of cell movements shapes the vertebrate eye. Development. 139, 359-372 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullman, B., Schilling, T. F.
- Gfrerer, L., Dougherty, M., Liao, E. C. Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (79), e50525 (2013).
- Percival, S. M., Parant, J. M. Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo. J. Vis. Exp. (113), e54218 (2016).
