Summary
Burada, standart bir dizi protokol üstün oküler sulkus gözlemlemek için mevcut bir son zamanlarda tespit, evrimsel korunmuş yapısı omurgalı gözü önünde. Zebra balığı larva kullanarak, oluşumu ve üstün oküler sulkus kapatılması için katkıda faktörleri belirlemek için gerekli teknikleri göstermektedir.
Abstract
Konjenital oküler coloboma genellikle eksik choroid yarığın kapanması sonucu göz aşağı yönüyle bir yarık olarak gözlenen genetik bir hastalıktır. Son zamanlarda, olan bireylerin coloboma Iris, retina ve objektif bir roman yapısı, keşif için liderliğindeki üstün yönüyle üstün çatlak veya dorsal üzerinde geçici mevcut üstün oküler sulkus (SOS), olarak başvurulan kimliği omurgalı gözü geliştirme sırasında optik cup yönünü. Her ne kadar bu yapı fareler, piliç, Balık ve su keleri arasında korunmuş, imdat geçerli anlayışımızı sınırlıdır. Onun oluşumu ve kapatılması için katkıda bulunan faktörler aydınlatmak için gözlemlemek ve anormallikler, imdat kapatma gecikmesi gibi tanımlamak edebilmek için zorunludur. Burada, verimli bir şekilde SOS immünfloresan boyama ve mRNA gibi ortak moleküler biyoloji teknikleri yaygın olarak kullanılan mikroskobu tekniklerle birleştirerek görselleştirmek için kullanılan iletişim kuralları standart bir dizi oluşturmak için yola çıktı overexpression. Bu iletişim kuralları kümesi SOS kapatma gecikme gözlemlemek yeteneği üzerinde duruluyor iken deneyci'nın ihtiyaçlarına adapte edilebilir ve kolayca değiştirilebilir. Genel olarak, biz hangi aracılığıyla SOS anlayışımızı omurgalı gözü geliştirme geçerli bilgisini artırmak için gelişmiş olabilir ulaşılabilir bir yöntem oluşturmak umut.
Introduction
Omurgalı göz oluşumu dikkatle düzenledi hücreler arası sinyal yolları doku türleri oluşturabilir ve bölgesel kimlik1belirtebilirsiniz son derece korunmuş bir süreçtir. Tedirginlikler erken göz morfogenez için derin hataları göz mimarisi için neden ve sık sık2kör. Böyle bir hastalık choroid oküler fissür optik cup3ventral tarafta kapatmak için hata oluşur. Oküler coloboma bilinen bu bozukluk 1 4-5000 canlı doğum ve yaygın olarak kasılır öğrenci göz4ortasına gelen çıkıntı bir anahtar deliği benzeri yapı olarak tezahür Pediatrik körlüğü % neden 3-11 dışında gerçekleşmesi için tahmin edilmektedir, 5,6. Choroid yarığın geçmesi yarığın kenarlarında gemilerin7alın için sigorta optik bardağa büyüyen erken damarlara için bir giriş noktası sağlarlar işlevidir.
Oküler coloboma eski zamanlardan beri bilinen iken, biz son zamanlarda göz çift/dorsal yönünü etkileyen doku kaybı ile yeni bir alt coloboma hastaların belirledik. Son bizim laboratuvar çalışmalarında biz üstün oküler sulkus (SOS) veya üstün fissür8bakın Zebra balığı dorsal göz oküler yapısında keşif açmıştır. Yapı özellikleri bir sulkus ve bir çatlak olduğunu unutmamak gerekir. Benzer şekilde bir sulkus, o zamansal retina nazal yayılan bir sürekli doku katmanıdır. Buna ek olarak, yapısının kapatılması membran karşıt iki bir füzyon tarafından aracılı değil ve görünüşe göre hangi hücreleri tarafından Yapı doldurulur morfogenetik bir süreç gerektirir. Ancak, benzer bir çatlak, bu membran ile dorsal göz burun ve zamansal tarafında ayıran bir yapı oluşturur. Tutarlılık sağlamak için biz ona SOS Bu metinde sevk edecektir.
İmdat örümceklerle omurgalılar, balık, tavuk, newt ve fare8göz morfogenez sırasında görünür olmak arasında korunmuş. Zebra balığı içinde 20-60 saat sonrası döllenme (hpf) üzerinden mevcuttur, choroid yarığın aksine SOS 20-23 hpf kolayca görünür olmak son derece geçici ve yok 26 hpf8tarafından. Son araştırma laboratuarımızın içinde benzer şekilde choroid fissür, SOS bir rol göz morfogenez8sırasında damar rehberlikte oynar, buldu. Olsa da oluşumu ve SOS kapatılması kontrol faktörler henüz tam olarak anlaşılır değil, bizim veri genler8biçimlenme ventral dorsal göz için rolleri vurgulamak.
Zebra balığı SOS çalışmaya bir mükemmel model organizmadır. Bir modeli sistem olarak bir çok göz geliştirme eğitim avantaj sağlar: omurgalı bir model; her nesil sergileyen yüksek verimlilik (~ 200 embriyo); genomunu tam olarak, hangi genetik manipülasyon kolaylaştırır sıralı; ve insan genlerinin yaklaşık % 70'i en az bir Zebra balığı orthologue, yapım o bir ideal genetik tabanlı modeli insan hastalık9,10. En önemlisi, onun gelişme dışarıdan anneye gerçekleşir ve onun larva göreceli kolaylığı11ile gelişmekte olan göz görselleştirme için sağlayan şeffaf,.
Bu iletişim kuralları kümesi içinde hangi aracılığıyla SOS Zebra balığı larva görselleştirildiği teknikleri açıklar. Bu raporda kullanılan görselleştirme teknikleri çeşitli sos sırasında normal göz kalkınma açık gözlem yanı sıra SOS kapatma hataları algılama yeteneğini sağlayacak. Bizim örnek protokolleri Gdf6 araştırmalar yer alacak, bir BMP dorsal için yerelleştirilmiş göz ve SOS kapatma bilinen regülatörü. Ayrıca, bu teknikleri genetik faktörler veya uygun SOS oluşumu ve kapatma etkiler farmakolojik ajanlar tanımlamak için deneysel manipülasyonlar ile kombine edilebilir. Ayrıca, biz deneyci SOS çevreleyen hücreleri morfolojik değişiklikler gözlemlemek izin veren bir protokol üzerinden mümkündür, tüm hücre zarlarında floresan görüntüleme dahil ettik. Amacımız bilimsel topluluk gelişmekte olan göz bu roman yapısı yeni görüşler sunmak için kullanılan standart iletişim kuralları kümesi oluşturmaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm yöntem tanımlamak burada University of Alberta hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından onaylanmış olması.
1. Protokolü 1: Görsel olarak kullanarak stereomicroscopy ve diferansiyel girişim kontrast (DIC) görüntüleme SOS
- Embriyo koleksiyonu
- Dechlorinated su tankında bir erkek Zebra balığı dişi bir Zebra balığı ile eşleyerek akşam gdf6a+ /- Zebra balığı haçlar hazırlayın. Erkek dişi--dan embriyo küçük bir zaman aralığı içinde doğarlar emin olmak için bir ayırıcı kullanarak ayırın emin olun.
- Ertesi sabah, bölücü çekin ve 30 dk. toplamak daha Petri yemeklerinde E3 medya, Zebra balığı kitap12açıklanan ile embriyo için artık üremeye Zebra balığı izin ve 28.5 ° C kuluçka makinesine koyun.
- Tüm döllenmemiş yumurta ve beyaz ve donuk görünür ölü embriyo kaldırın.
- Hazırlık ve Zebra balığı embriyo canlı görüntüleme
- 20 hpf, Değiştir E3 medya %0,004 1-fenil 2-Tioüre (PTU pigment üretimi önlemek için) içeren E3 medya ile.
Not: PTU adlı bir biraz daha timepoint, 22-24 hpf gibi ek görüntüleme saat erken yaşta embriyoların nedeniyle deneme müdahale mümkün değildir. Ancak, bu gibi bir grup SOS görüntüleme ile engelleyebilir dorsal göz altı çizilerek pigmentasyon pigmentasyon tamamen önlemek için erken embriyo tedavi etmek için önerilir. - Tüm embriyoların gözlem zamanının önde gelen çeşitli noktalarda doğru gelişim dönemleri itibariyle olduğundan emin olun. Bu hangi somite numarası Kimmel vd.13tarafından belirtildiği gibi açıkça görülmeye başlıyor aşamalarında yapılır önerilir. Gelişimsel olarak olgunlaşmamış kaldırın.
- Embriyo bir diseksiyon mikroskop ve dechorionate altında embriyo yavaşça ince forseps kullanarak koryon ayrı çekerek yerleştirin. Dorsal gözünde SOS görselleştirin. İmdat göz dorsal kenar boşluğuna bir girinti görünebilir ve bir çizgi dorsal göz görünür olmalıdır. Normal SOS kapatılması için embriyo çevresinde gözlemlemek 20-23 hpf. Gecikmeli SOS kapatma fenotipleri sınav için embriyo 28 gözlemlemek hpf veya daha sonra.
- SOS kapatma gecikme yok o göstermek embriyo sıralayın.
- Bu embriyoların diseksiyon mikroskop kullanarak fotoğraf için E3% 1'özel içeren bir petri hazırlayın. Hafifçe embriyo üzerinde özel yerleştirildiğinde, embriyo sarısı oturabilir miyim sığ bir delik oluşturmak için özel ortasına pislik. Bu embriyo bir eğik açıyla fotoğraflandı edilmektedir kaldığında olmadığını garanti eder.
- Embriyo %0,003 tricaine E3 ve özel yerinde yanal ile anestezi.
- Bir bileşik veya confocal mikroskop kullanarak embriyo resim için 35 mm Petri kabına genellikle sigara % 1 düşük erime noktası özel E3 küçük bir bolus içeren içine embriyo transfer (w/v). Hızlı bir şekilde yan yana ince Misina veya bir kirpik kullanarak embriyo getirin ve özel soğumasını bekleyin. Özel firma olduğunda, yeterli E3 özel kapsayacak şekilde çanağı içine dökün. Daha fazla bilgi için bkz:14Distel ve Köster.
Not: ters bir mikroskop kullanarak Eğer embriyo bir cam-coverslip-alt tabak bardak karşı yerleştirilen olabilir ve o bir standart 20 X objektif lens görüntüsü. - Bir su daldırma 20 x objektif lens bileşik mikroskop ile SOS görselleştirmek için kullanın. Görselleştirme, ardından hafifçe özel embriyo üzerinden çekin ve % 4 paraformaldehyde (PFA) düzeltmek veya geliştirmeye devam etmek için izin.
- 20 hpf, Değiştir E3 medya %0,004 1-fenil 2-Tioüre (PTU pigment üretimi önlemek için) içeren E3 medya ile.
2. Protokolü 2: Bütün Dağı immünfloresan laminin boyama
- Bütün Dağı immünfloresan laminin boyama: gün 1
- Eğer zaten bitmiş 1.2.3, adımda anlatıldığı gibi Dechorionate embriyo. Taze yapılmış %4 istenen timepoint, microcentrifuge tüpü embriyo fix PFA bir oda sıcaklığında (22-25 ° C) shaker 2 h için. Yıkama 1 x PBST 5 dk, dört kez.
Not: gastrulasyon embriyo daha iyi dechorionation sonra çözebilir. - 5 dk. kuluçka süresi embriyoların sabit gelişimsel sahnede bağlıdır için oda sıcaklığında 10 mg/mL İndinavir K embriyo permeabilize (bkz: Thisse ve Thisse15).
- Yıkama 1 x PBST 5 dk, dört kez.
- Embriyo % 5 keçi serum ve 2 mg/mL sığır serum albumin (BSA) 1xPBST için 1-2 h bir oda sıcaklığında shaker içinde bir çözümde engelleyin.
- Birincil antikor çözüm tavşan anti-laminin antikor, 1: 200 seyreltme blok çözümde sulandrarak hazırlayın.
- Gecede 4 ° C shaker üzerinde anti-laminin birincil antikor embriyo kuluçkaya.
- Eğer zaten bitmiş 1.2.3, adımda anlatıldığı gibi Dechorionate embriyo. Taze yapılmış %4 istenen timepoint, microcentrifuge tüpü embriyo fix PFA bir oda sıcaklığında (22-25 ° C) shaker 2 h için. Yıkama 1 x PBST 5 dk, dört kez.
- Bütün Dağı immünfloresan laminin boyama: 2 gün
- 1 yıkama x PBST 15 dakika, beş kez.
- Keçi Anti-tavşan Alexa Fluor 488 antikor 1 sulandrarak ikincil antikor çözüm hazırlamak x PBST 1: 1000 seyreltme için.
Not: Farklı bir ikincil antikor kullanarak deneyci için kullanılabilir kaynakları uygun için bu adımı uyum sağlamak mümkündür. - Gecede 4 ° C shaker üzerinde ikincil antikor embriyo kuluçkaya. Bu adımdaki itibaren mümkün olduğu kadar gelen ışık kalkan.
- 1 yıkama x PBST 15 dakika, dört kez. Embriyo gerekirse 4 ° C'de için bir haftaya kadar saklanabilir.
- Diseksiyon ve embriyonik gözleri montajı
- İsterseniz, küçük bir kabında embriyo yerleştirin ve embriyo 1 deyolk x PBST. Nazikçe sarısının iyi Forseps ile kesintiye ve hafif sarısı sac kazıma ile sarısı hücreleri kaldırarak bunu.
- PBS-gliserol serisi çözümleri microcentrifuge tüpler içinde aşağıdaki konsantrasyonları hazırlamak: PBS % 30, % 50 ve % 70 gliserol. % 30 gliserol/PBS, üstünde tepe-in belgili tanımlık eriyik ve az önceki çözüm mümkün olduğunca transfer embriyoların yerleştirdiğinizden emin yapım içine embriyo transfer. Tüp altına batmaya embriyo bekleyin.
- Embriyo dibe battı, onları % 50 gliserol/PBS aktarın. Tekrarlayın ve % 70 gliserol/PBS için transfer.
- Bir kez embriyoların % 70 gliserol/PBS içinde battı, küçük bir plastik tabak gruptakiler için taşımak.
- Arka beyin için posterior embriyo sever ve posterior doku Genotipleme için kullanın.
- Baş mümkün olduğunca küçük gliserol olarak aktarılması bir cam slayt için hareket ettirin. Forseps veya diğer ince diseksiyon araçları kafa sabit tutmak için posterior sonuna tutmak için kullanın. Yavaşça ön ventrikül anterior üzerinden yerleştirin ve sağ ve sol yarım baş birbirinden ayırmak için aşağı doğru itin için iyi minutien PIN veya diğer ince diseksiyon araçları kullanın. Bu özafagusu orta ve arka beyin ventrikül içine aslında baş aşağı orta hat fileting hareket ederken işlemi yineleyin. Bu göz ve böylece İmdat hasarsız bırakarak çevreleyen doku manuel manipülasyon en aza indirir.
- Her iki tarafında aşağı, göz baş orta hat binin. Pozisyon dört köşe (bir uygun mesafe kullanılan coverslip için) vakum yağ mesajları ve cam coverslip ile kapak, sırayla her yazı üzerine coverslip kadar iterek örnekleri ile temas. Gliserol coverslip ve slayt arasındaki boşluğu doldurma altında çekilir böylece % 70 gliserol coverslip kenarında pipet.
- Bir gün veya mühür coverslip oje ve tırnak cilası sadece kuruduktan sonra resim örnekleri ile çevresinde örnek. Karanlıkta 4 ° C'de depolayın
3. Protokolü 3: Görselleştirme , SOS kullanarak eGFP-CAAX mRNA
- EGFP-CAAX mRNA sentezi
- 37 ° C'de 4 saat boyunca 1 mg 40 mL tepki hacmine pCS2-eGFP-CAAX plazmid16 NotI linearize
- Kısıtlama Özet reaksiyonu durdurmak için 10 mL RNase ücretsiz su, 2.5 mL % 10 SDS ve 2.0 mL ilave 10 mg/mL İndinavir K.
- 50 ° C'de 1 saat kuluçkaya
- Aşağıdaki reaksiyon ekleyin (Toplam birim 200 mL) ve sonraki adıma geçin: 50 mL RNase ücretsiz su, 20 mL 3 M sodyum asetat pH 5.2 ve 75.5 mL RNase ücretsiz su
Not: Sodyum asetat aşırı sulanma önlemek için iki ayrı durumlarda RNase free su eklenir.
- DNA'ın arıtma fenol/kloroform çıkarma ve etanol yağış aracılığıyla
- 200 mL fenol: kloroform: izoamil alkol ve girdap 20 s. ayrı için Santrifüjü 18.000 x g, sulu ve organik aşamalardan 5 min için ekleyin.
- Üst sulu katmana alt organik tabaka transferini önlemek emin bir yeni microcentrifuge tüp için transfer. Kloroform eşit bir hacmi yeni tüp ekleyin.
Not: Kloroform eklenmesi isteğe bağlıdır, ancak bu örnekten fenol tümüyle kaldırılmasını sağlamak için önerilir. - Girdap 20 s. ayrı Santrifüjü 18.000 x g, sulu ve organik aşamalardan 5 min için.
- Daha önce olduğu gibi üst sulu katmana alt organik tabaka transferini önlemek emin bir yeni microcentrifuge tüp için transfer.
- 3 M sodyum asetat pH 5.2 hacmi 1/10 ekleyin.
- DNA 18.000 x g 4 ° C'de 20 dk de 15 dk. santrifüj-20 ° C'de % 100 RNase free etanol ve chill 3 cilt ekleyerek çökelti Bir Pelet görünür olmalıdır. Süpernatant dikkatle boşaltmak.
- Pelet 100 mL etanol/RNase-Alerjik soğuk % 70 su ile yıkayın. Pelet gevşek kırmak için hafifçe karıştırdıktan sonra 18.000 x g 4 ° C'de 15 dakika, santrifüj kapasitesi Bir Pelet görünür olmalıdır. Süpernatant dikkatle boşaltmak.
- 5 min için Pelet kurumasına ve DNA 7 mL suda resuspend.
Not: Pelet bağlı olarak hava akımı temin 5 dk daha uzun süre kuru gerekebilir.
- Transkripsiyon ve eGFP-CAAX mRNA arıtma
- RNase ücretsiz bir şekilde vitro transkripsiyon reaksiyon arıtılmış doğrusallaştırılmış plazmid DNA adım 3.2 elde edilen yaklaşık 1 mg kullanarak ticari olarak mevcut Sp6 RNA polimeraz kiti ile hazırlayın. 37 ° C'de 2 h için kuluçkaya
Not: Sp6 RNA polimeraz kepli mRNA üretimi için kullanılması gerekir. - Dnaz 1 mL ekleyin (2 U/mL; RNase free) ve 37 ° C'de 30 dk için kuluçkaya
- Piyasada bulunan herhangi bir RNA arıtma kiti ile mRNA arındırmak. Aliquot tekrarlanan donma-çözülme önlemek ve-80 ° C'de depolamak için mRNA
- RNase ücretsiz bir şekilde vitro transkripsiyon reaksiyon arıtılmış doğrusallaştırılmış plazmid DNA adım 3.2 elde edilen yaklaşık 1 mg kullanarak ticari olarak mevcut Sp6 RNA polimeraz kiti ile hazırlayın. 37 ° C'de 2 h için kuluçkaya
- Enjeksiyon ve görselleştirme
- Embriyo elde etmek protokol 1. 1'belirtildiği gibi.
- Mikroenjeksiyon cihazları kullanarak, eGFP-CAAX mRNA 300 pg 1-hücre aşamada enjekte et.
- EGFP gözünde bir floresan stereoscope kullanarak parlak ifade ile embriyo için ekran.
- Embriyo Protokolü 1.2 ile açıklandığı gibi görüntü.
- Alternatif olarak, dechorionate ve embriyoların istenen timepoint %4 düzeltmek için 4 saat oda sıcaklığında veya gecede 4° C'de PFA Embriyolardan 1 x 5 min için PBST, dört kez ve dechorionate, daha önce yapılırsa yıkayın. Gözleri teşrih ve protokol 2.3 içinde açıklandığı gibi slaytlarda mount.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
20, Zebra balığı SOS görünür hpf meşru dorsal retina8. İlk dar mimarisi 23 hpf İmdat geçiş için geniş bir girinti ve 26 tarafından hpf artık görünür8olduğunu. Bu nedenle, normal Zebra balığı göz geliştirme sırasında SOS incelemek için embriyo arasında 20-23 hpf uyulmalıdır. Bu dönemde, gözlemlenebilir diseksiyon mikroskop ve DIC görüntüleme gelişmekte olan retina (şekil 1) burun ve temporal yarısı ayıran dorsal gözde ince bir çizgi olarak üzerinden SOS var. Buna ek olarak, ince bir girinti göz (şekil 1) dorsal kenarlığını görünür olabilir. İmmünfloresan laminin ardından boyama, ince çizgi membran (şekil 1) olmak onaylanabilir.
Moleküler yollar gecikmeli SOS kapatma kaynaklanan incelemek için embriyo 28 gözlemlemek açmadı hpf bu yeterince normal SOS kapatma zaman kaldırılır ve, bu nedenle, güvenilir bir işaretleyici SOS kapatma gecikme nedeniyle deneysel bir timepoint olduğunu manipülasyonlar. 28 hpf Zebra balığı diseksiyon mikroskop altında doğrudan görselleştirme ile SOS kapatma gecikme deneysel manipülasyon nedeniyle değerlendirmek mümkündür. SOS kapanması gecikmiş, uzun süreli varlığını göz diseksiyon mikroskop (Şekil 2) altında sırt tarafındaki belirgin bir yarık olarak görülebilir. Bileşik DIC veya Nomarski optik kullanma mikroskop altında gözlenen zaman, bu özellik daha da belirgindir ve göz burun ve temporal kenarlarına SOS tarafından açıkça görünen bir satır dorsal göz (şekil 3) olarak ayrılır.
İmdat laminin dahil olmak üzere Bazal lamina bileşenleri ile kaplı olduğu. Bu nedenle, immünfloresan boyama sabit embriyo SOS kapatma değerlendirme tamamlayıcı bir yöntem sağlar. Ne zaman bir yan görünümden embriyonik göz görüntüleme, dış kenar boşluğunda göz, Bazal lamina demarcates oküler çatlaklar hem objektif ve retina (şekil 4) arasındaki sınır. İmdat doğrudan karşısında göz dorsal yönüyle choroid fissür aydınlatmaktadır. Tüm embriyoların yanal, gözlerini daha önce microdissected varsa elde biraz daha iyi optik netlik ile monte edilebilir. 28 tarafından hpf, wildtype Zebra balığı içinde-laminin boyama açıkça var SOS tamamen, bu yarığın kapanması gecikmeler izlemek için ideal sahne kılan kapalı olduğunu göstermektedir.
Enjeksiyon eGFP CAAX mRNA bir canlı ya da sabit embriyo (şekil 5) hücre zarı görselleştirme sağlar. Başarılı bir hücreli sahne enjeksiyon embriyo ile tam hücre zarı Floresans üretmek yeterli olur. Yanal görünümünde tüm hücresel sınırları GFP Floresans tarafından işaretlenmiş olmalıdır ve bu nedenle, hücre morfolojisi de açıkça görülmektedir. Bu SOS kapatmaya neden hücrelere morfolojik değişiklikler görselleştirme sağlar.
Şekil 1: normal Zebra balığı göz geliştirme sırasında SOS gözlem. Zebra balığı embriyo toplanmış ve 22, yansıma hpf. A-b Görüntülü canlı-diseksiyon mikroskop ile (A) ve (B), sırasıyla Imaging DIC üzerinden 22 hpf embriyo yanal görünümünü. SOS bir kırmızı yıldız işaretiyle işaretlenir. C. Laminin 22 hpf embriyo immünfloresan boyama. Embriyo %4 oranında sabit İngiltere'de yılın ve bütün Dağı immünfloresan laminin boyama için elde edilen. Embriyo fileted olduğunu ve % 70 gliserol/PBS monte. Tek dilim görüntüleri ile a bilgisayar yazılımı confocal görüntüleme yoluyla elde edilmiştir. İmdat beyaz bir yıldız işareti ile işaretlenir. Tüm rakamlar açıklamalı ve Adobe Illustrator yazılımı kullanılarak toplandı. Ölçek çubukları temsil 50 mm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: SOS kapatma gecikme Zebra balığı larvalar mikroskop görüntülerini dissekan. Wildtype ve gdf6a- / - embriyo vardı toplanan ve canlı-görüntüsü itibariyle 28 hpf. A. Lateral görünüm wildtype embriyo kapalı bir SOS ile. B. gdf6a- / - embriyo bir SOS kapatma gecikmesi (yıldız işareti) ile görünümünü Lateral. Keskin bir depresyon uygun şekilde kapatmak için SOS yetersizliği nedeniyle göz dorsal yönüyle gözlemlenebilir olduğunu. Ölçek çubukları temsil 50 mm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Zebra balığı embriyonik gözünde SOS görüntülerini temsilcisi DIC. Wildtype ve gdf6a- / - embriyo, anestezi, toplanmış ve yanal % 1 ultrasaf düşük erime noktası özel E3 içinde 35 mm Petri kabına yerleştirilir. Çanak E3 ile doluydu ve bileşik mikroskop 20 x su daldırma amacı ile kullanılan DIC görüntüleme için. A. Lateral görünüm wildtype embriyo kapalı bir SOS ile. B. gdf6a- / - embriyo bir SOS kapatma gecikmesi (yıldız işareti) ile görünümünü Lateral. İmdat göz dorsal yönüyle ince bir çizgi olarak gözlemlenebilir var. Ölçek çubukları temsil 50 mm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: laminin embriyonik Zebra balığı göz boyama immünfloresan temsilcisi görüntülerini. Wildtype ve gdf6a- / - embriyo toplanmış ve %4 oranında sabit PFA 28 hpf. Bazal lamina immunostained ve embriyo fileted ve % 70 gliserol/PBS confocal görüntüleme için monte. Tek dilim görüntüleri ZEN yazılım kullanarak elde edilmiştir. A. Lateral görünüm wildtype embriyo kapalı bir SOS ile. B. gdf6a- / - embriyo bir SOS kapatma gecikmesi (yıldız işareti) ile görünümünü Lateral. Bazal lamina gdf6a- / - embriyo gözüne sırt kısmında görünür SOS ile yeşil gözlerine özetleyen gösterilir. Ölçek çubukları temsil 50 mm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: eGFP-caax mRNA enjeksiyon takip Zebra balığı embriyonik göz Imaging. Wildtype embriyo eGFP-caax mRNA 300 pg ile 1-hücre aşamada enjekte edildi. 22 hpf ve 28 hpf, sırasıyla, embriyo anestezi ve yanal % 1 ultrasaf düşük erime noktası özel E3 içinde 35 mm Petri kabına üzerinde monte. 20 x su daldırma amaç confocal mikroskopla görüntüleme için kullanılan ve tek dilim görüntüleri bir yazılım kullanarak elde edilmiştir. A. Lateral gdf6a- / - embriyo 22 görünümünü hpf görünür açık SOS (yıldız işareti) ile. B. gdf6a- / - embriyo 22 panelleri genişlemiş hpf. C. gdf6a- / - embriyo 28 görünümünü Lateral hpf SOS kapatma ile gecikme. Ö. 28 gdf6a- / - embriyo panelleri genişlemiş hpf. Ölçek çubukları 50 mm ve 10 mm panelleri A ve C ve B ve D, sırasıyla temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, standart bir dizi gelişmekte olan Zebra balığı embriyo SOS gözlemlemek için protokolleri mevcut. Kapatma gecikmesi fenotipleri belirlemek için bizim iletişim kuralları yeteneği göz choroid fissür kapatma gecikme görselleştirmek için kullanılan teknikler için benzer burun dorsal ve zamansal dorsal tarafında iki ayrı lobları ayrılması ayırt odaklı olması fenotipleri ventral gözünde.
Bu görselleştirme teknikleri inhibe veya rolleri SOS kapatılması içinde çalışmaya bazı genlerin ifade inducing etkilerini incelemek için çeşitli genetik manipülasyon teknikleri ile birlikte kullanılabilir. Biz daha önce gördüğümüz gibi gdf6a- / - embriyo kullanarak bu protokollerin onun kaybı SOS uygun kapatılması etkileyebilir ama herhangi bir gen ifade manipüle etkilerini incelemek için protokollerin kullanılacağını göstermek seçtik Gerekli. Dorsal göz morfolojik değişiklikler buradan diseksiyon mikroskop kullanarak gözlemleri ile incelendiği önerilir. Daha zaman alıcı ve alt işlem hacmi oldukları gibi kesin olarak, ilk bir bağlantı oluşturulduğunda diğer teknikler kullanılmalıdır.
Protokoller deneyci gereksinimlerine uyacak şekilde kolayca değiştirilebilir iken, dikkatle takip edilmesi gereken birkaç yönleri vardır. Bu yapı geçici doğası nedeniyle, tüm aynı gelişim aşaması embriyo vardır gözlenen sağlamak için zorunludur. Çalışmalarımız için biz önemli zaman doğurmak sadece küçük bir pencere sağlamak için ve embriyo erken gelişimi boyunca düzenli olarak sıralamak için bulabilirsiniz. 20, aşamaları Dengeleme en önemli bir adım olduğunu hala doğru bir şekilde somites (24)17güvenebilirsiniz ve biz bulmak bu çok daha güvenilir--dan 28 anda betimlemek hazırlama işaretlerinden hpf hpf. Buna ek olarak, pigmentasyon inhibe veya yapısı başarılı görselleştirme sağlamak için kaldırılması gerekir. Gözde pigmentasyon başlar yaklaşık 22 başlatmak gözlemledim hpf, ve pigmentasyon SOS doğru görselleştirme ile engelleyebilir dorsal gözünde bir kalıp. Bu nedenle, PTU ile embriyo pigmentasyon başarılı görselleştirme emin olmak için önce tedavi etmek için önerilir. Ayrıca, slayt montaj yok olmasına neden olmadan önce embriyonik göz diseksiyon biraz pratik gerektirir. Gözleri slayt için mümkün olduğu kadar paralel yanal monte etmek zorunludur. Deneyci bu teknikleri ile deneme önce ekstra embriyolar uygulamaları önerilir.
İmmünfloresan Bazal lamina boyama hariç, tüm burada açıklanan protokoller canlı embriyolar kullanılarak tamamlanabilir. Bu deneyci morfolojik değişiklikler SOS kapatma ilgili hızlandırılmış çalışmalar yapmak izin sos erken embriyogenez boyunca sürekli görselleştirme sağlar. Geçmişte, biz-si olmak kullanılmış gibi sinirsel retina. erken geliştirme sırasında işaretleri Tg(rx3:eGFP), retina özel transgenes Her ne kadar hücre zarlarında görselleştirmek için yeteneği yoksun, Tg(rx3:eGFP) kullanımı microinjections gerektirmeyen bir avantaja sahiptir ve SOS mimarisinde gerçek zamanlı brüt morfolojik değişiklikler görselleştirmenin bizim birincil yöntem olmuştur. Benzer yöntemleri daha önce bu günlük18,19' tartışılan var bu protokol, dahil olmamıştır. Ancak, hücre biyolojik temeli SOS oluşumu ve kapatma incelenmesi floresan membran proteinlerinin gerektirir. Özellikle, eGFP-CAAX mRNA enjeksiyon hücre zarları etrafında uygun SOS kapatılması için gerekli olan hücre şekil değişiklikleri dorsal gözünde dinamiklerini incelemek için bize izin verir Şekil 5'te görüldüğü gibi SOS görselleştirme sağlar. EGFP-CAAX canlı görüntüleme SOS kapatma gerçekleştirmek için yararlı olabildiği halde, Zebra balığı zarflama katmanda varlığı ile zor yapılır. Buna ek olarak, Mozaik, doğrudan eGFP ifade gücü miktar üzerinde dayalı embriyo karşılaştırmak zorlaştırır, neden olabilir çünkü mRNA enjeksiyonları sonuçları çözümlerken özen göstermelidir. Bu fluorescently hücre zarlarında özellikle de Tg(vsx2.2:GFP-caax)gibi gelişen retina etiket transgenik Zebra balığı hatları kullanılarak iyileştirmiştir.
Bizim iletişim kurallarının zorluklardan biri tamamen penetrant değil herhangi bir tedavi ile yatıyor. Biz daha önce denetim embriyo 28 hpf8yaklaşık % 10 SOS gecikmeler görülebilir ve embriyolar herhangi bir verilen deney grubu içinde bir SOS ile bu temel varlığı deneysel ince etkileri gözlemlemek zor yapabiliriz kaydetti var. manipülasyon. Bu deneyci önyargı azaltmak için deneyci kör ve deneysel her grup içinde deneme gücünü artırmak için kullanılan embriyo sayısını artırma tarafından ele. Ayrıca, analiz aşaması için 29-30 hpf kaydırılır.
Bu iletişim kuralları kümesi ile hangi aracılığıyla SOS kapatma gecikmeler görüntülenir şekilde standartlaştırmak arıyoruz. Yukarıda açıklanan teknikleri algılama ve SOS kapatma gecikmeler deneysel ayarları çeşitli görselleştirme güvenilir olduğu gösterilmiştir ve deneyci'nın ihtiyaçlarına adapte edilebilir. SOS daha ayrıntılı görselleştirmek için elektron mikroskopisi ya da hızlandırılmış görüntüleme transgenik embriyo tarama gibi teknikleri kullandık, buradaki amacımız üretilen deneysel yüksek-iş için mükellef olan iletişim kurallarının bir standart oluşturmaya iken kapatma gecikmesi fenotipleri puanı için yeteneği üzerinde durularak tek bir gün içinde çok sayıda embriyo görselleştirmek için tasarlar. Gdf6a- / - embriyo ile kullanımı ek olarak, biz SOS kapatma gecikme fenotipleri farmakolojik tedaviler, morpholino enjeksiyonları ve RNA overexpression çalışmalar yanında bu görselleştirme teknikleri kullanarak gözlemlemek mümkün olmuştur. SOS göz gelişiminde rolü aydınlatılmamıştır çeşitli yollarla, umarız daha da bu standart iletişim kuralları kümesi içinden bu roman yapısı okudu ortak bir dil bilimsel topluluk sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar bildirmek için çakışan hiçbir ilgi alanlarına sahip.
Acknowledgments
Bu eser, arayan sağlık Kanada Enstitüleri araştırma (CIHR), Doğa Bilimleri ve mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC), Alberta teknoloji Futures, yeniliklerin ve kadın ve çocuk sağlığı Araştırma Enstitüsü (WCHRI) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-phenyl 2-thiourea | Sigma Aldrich | P7629-10G | |
| 100 mm Petri dish | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 35 mm Petri dish | Corning | CLS430588 | |
| Agarose | BioShop Canada Inc. | AGA001.1 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A7906-100G | |
| DIC/Fluorescence microscope | Zeiss | AxioImager Z1 | |
| Dissection microscope | Olympus | SZX12 | |
| Dissection microscope camera | Qimaging | MicroPublisher 5.0 RTV | |
| Dow Corning High-vacuum grease | Fisher Scientific | 14-635-5D | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Sigma Aldrich | A5040-25G | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150077 | |
| Goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Image capture software | Zeiss | ZEN | |
| Incubator | VWR | Model 1545 | |
| Microscope Cover Glass (22 mm x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Microscope slide | Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| Minutien pin | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit | Invitrogen | AM1340 | |
| NotI | New England Biolabs | R0189S | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148-500G | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol pH 6.7 +/- 0.2 | Fisher Scientific | BP1752-100 | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | P4850 | |
| Rabbit anti-laminin antibody | Millipore Sigma | L9393 | |
| TURBO Dnase (2 U/µL) | Invitrogen | AM2238 | |
| Ultrapure low-melting point agarose | Invitrogen | 16520-100 | |
| UltraPure Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Invitrogen | 15525017 |
References
- Chow, R. L., Lang, R. A.
- Slavotinek, A. M. Eye development genes and known syndromes. Molecular Genetics and Metabolism. 104 (448-456), (2011).
- Gregory-Evans, C. Y., Williams, M. J., Halford, S., Gregory-Evans, K. Ocular coloboma: a reassessment in the age of molecular neuroscience. Journal of Medical Genetics. 41 (12), (2004).
- Onwochei, B. C., Simon, J. W., Bateman, J. B., Couture, K. C., Mir, E.
- Williamson, K. A., FitzPatrick, D. R. The genetic architecture of microphthalmia, anophthalmia and coloboma. European Journal of Medical Genetics. 57, 369-380 (2014).
- Chang, L., Blain, D., Bertuzzi, S., Brooks, B. P. Uveal coloboma: clinical and basic science update. Current Opinion in Ophthalmology. 17, 447-470 (2006).
- Kaufman, R., et al. Development and origins of Zebrafish ocular vasculature. BMC Developmental Biology. 15 (18), (2015).
- Hocking, J. C., et al. Morphogenetic defects underlie Superior Coloboma, a newly identified closure disorder of the dorsal eye. PLOS Genetics. 14 (3), (2018).
- Lawson, N. D., Wolfe, S. A. Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish. Developmental Cell. 21 (1), (2011).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), (2013).
- Bilotta, J., Saszik, S. The zebrafish as a model visual system. International Journal of Developmental Neuroscience. 19, 621-629 (2001).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book; A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 5th edition, University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2007).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- Distel, M., Köster, R. W. In vivo time-lapse imaging of zebrafish embryonic development. Cold Spring Harbor Protocols. , (2007).
- Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3, 59-69 (2008).
- Kwan, K. M., Otsuna, H., Kidokoro, H., Carney, K. R., Saijoh, Y., Chien, C. A complex choreography of cell movements shapes the vertebrate eye. Development. 139, 359-372 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullman, B., Schilling, T. F.
- Gfrerer, L., Dougherty, M., Liao, E. C. Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (79), e50525 (2013).
- Percival, S. M., Parant, J. M. Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo. J. Vis. Exp. (113), e54218 (2016).
