자연의 수준이 다른 세 곳을 방문한 후 생물물리학적, 심리적 스트레스 수준을 측정합니다.

스트레스 수준 상승은 오랫동안 심장병, 비만, 심리적 장애와 같은 많은 심각한 건강 상태와 관련이 있었습니다^1,2,3. 점점 더 많은 연구에서 공원 및 개발되지 않은 풍경과 같은 자연 환경에 가까이 있거나 방문하면 심리적 웰빙에 현저한 영향을 미치고 스트레스 수준을 낮출 수 있습니다^{1,4,5,6,7,8,9,10}. 자연 환경과 스트레스 수준의 영향에 대한 설명은 다음과 같습니다: (1) 자연 환경은 신체 활동을 위한 장소를 제공합니다^8,11 그리고 (2) 자연 환경 방문자는 더 많은 비작업 사고 과정에 집중할 수 있는 능력을 갖게 되어 주의력 피로가 감소합니다¹². 스트레스 감소에 대한 자연의 영향을 결정하기 위해 이 연구는 세 가지 다른 레크리에이션 장소를 방문한 후 심리적 스트레스(PSQ)와 두 가지 타액 기반 바이오마커인 코르티솔 및 α-아밀라아제에 대한 자가 보고서를 활용합니다. 이러한 위치는 "자연스러움" 수준에 따라 다르며 황무지 유형의 환경, 시립 공원, 지역 피트니스 및 레크리에이션 시설을 포함합니다.

본 연구는 다음과 같은 연구 질문을 다루는 것을 목표로 합니다: (RQ₁) 세 부위(즉, 천연, 반자연, 내장)에서 타액 코르티솔과 α-아밀라아제로 측정한 생물물리학적 스트레스 수준에 차이가 있습니까? (질문₂) PSQ에 의해 측정된 심리적 스트레스의 수준(요구, 걱정, 긴장, 기쁨의 네 가지 구조로 나타남)이 세 가지 사이트(즉, 자연적, 반자연적, 건설적)에 대해 비교할 때 차이가 있습니까?

이 연구는 인디애나 대학 기관 검토 위원회의 인간 연구 보호 프로그램의 정책 및 지침을 따릅니다.

1. 위치 선택

1. 다양한 자연 수준에 따라 사이트 수(n)를 선택합니다.
   참고: 우리는 작업을 위해 세 개의 사이트를 선택했습니다. "자연스러움"의 수준을 기반으로 한 연속체를 사용하여 사이트 A는 가장 자연스러운 것으로 간주되었으며 호수와 접해 있고 낙엽수림 내에 위치한 약 1,200에이커의 숲이 우거진 능선으로 구성되어 있습니다. 가장 일반적인 활동으로는 산책과 야생동물 관찰이 있습니다. 사이트 B는 산책로, 모임 장소, 놀이터 및 인과 레크리에이션 활동을 위한 열린 야외 공간을 갖춘 33에이커 규모의 시립 공원이었습니다. 사이트 C는 자연스러움이 가장 낮은 도심 실내 운동 시설이었습니다. 세 곳 모두 미국 중서부의 중간 규모 도시(인구 46,000명으로 추산)와 비교적 가까운 거리에 있습니다.

2. 참가자 심사 및 준비

1. 피험자가 레크리에이션 경험에 참여하기 전에 참가자 모집을 완료하십시오.
   주석: 사이트 A와 B의 경우, 연구원이 공원 입구 주차장에서 피험자에게 접근했습니다. 사이트 C의 경우, 실내 운동 시설의 프론트 데스크에서 피험자에게 접근했습니다. 활동 유형의 차이를 통제하기 위해 사이트 A와 B 모두에 대해 모집된 피험자는 주로 하이킹을 한 반면, 사이트 C에 대해 주요 활동은 실내 트랙에서 달리기 또는 걷기였습니다.
2. 모집하는 동안 피험자에게 타액 코르티솔 샘플 수집과 관련된 지침을 준수하도록 상기시킵니다. 타액 샘플을 제공하기 10분 전에 먹거나 마셔서는 안 됩니다.
   참고: 이 경우 타액 샘플이 부피 또는 희석(농도)에 대해 정규화되지 않았다는 점에 유의해야 합니다(예: 참가자가 적절하게 수화되었는지 및/또는 샘플 채취 간에 수화 변화가 있었는지 여부).
3. 각 참가자에게 빨간 완장(또는 그에 상응하는 눈에 띄는 옷)을 제공하여 약혼이 끝날 때 나타날 때 쉽게 식별할 수 있도록 합니다.
4. 30-40분의 시간을 할당하여 세 사이트의 모든 피험자가 각 사이트에서 비슷한 시간을 보내도록 합니다. 나머지 표본보다 훨씬 더 많거나 적은 시간을 소비하는 피험자를 제외합니다.
5. 참여 유형을 일관되게 유지하세요.
   참고: 이 경우 "중간" 활동은 걷기 또는 하이킹이었습니다. 걷기나 하이킹과 실질적으로 다른 활동에 참여한 피험자는 표본에서 제외되었습니다. 예를 들어, 낚시, 피크닉 또는 역도를 하는 피험자는 각 샘플에 포함되지 않았습니다.

3. 조건 및 실험 설계

1. 준실험적 사전 테스트/사후 테스트 설계를 사용합니다.
2. 피험자를 식별하고 참여에 동의한 후, 각 피험자에게 연구의 자발적 성격, 목적 및 절차를 설명하는 IRB 양식을 읽고 서명하도록 요청합니다.
3. 이 과정에 따라, 피험자에게 향후 식별을 위해 옷 한 벌(예: 빨간 완장)을 주고 스트레스 수준에 대한 생리적, 심리적 측정(예: PSQ, 시험관에 침을 뱉거나 침을 흘리는 1-2mL)을 얻습니다. 늦은 오후부터 이른 저녁까지 샘플을 채취합니다.
   참고: 이 데이터는 1) 피험자가 현장에 들어가기 직전과 2) 현장 방문이 종료된 직후 연구원들에 의해 수집되었습니다.

4. 타액 샘플

1. 검체 희석을 피하기 위해, 피험자에게 타액 검체를 제공하기 10분 전에 먹거나 마시거나 입을 헹구지 말라고 요청한다.
2. 피험자에게 레크리에이션 경험 직전과 경험 종료 직후 1-2mL의 타액 샘플(거품 제외)을 제공하도록 요청합니다.
3. 수동 침 흘림 방법을 사용하여 타액 샘플을 수집합니다.
   1. 피험자에게 2인치 플라스틱 빨대를 제공하여 2mL 냉동 용액에 침을 흘리게 합니다(재료 표 참조).
   2. 피험자에게 침이 입에 고이도록 지시한 다음, 빨대를 타고 내려와 냉동 용기로 침을 흘리도록 지시합니다. 타액 채취 및 취급 조언(2011)에 따르면 대부분의 검사에는 1mL(거품 제외)가 적합합니다.
   3. 데이터 수집 시기를 나타내기 위해 할당된 3자리 ID 번호(즉, 001)와 문자로 샘플에 레이블을 지정합니다(즉, A는 사전 테스트, B는 사후 테스트를 나타냄, 여기서 001A는 레크리에이션 경험을 수행하기 전에 참가자 001이 제공한 타액 샘플을 나타냄).
   4. 샘플을 채취하고 라벨을 붙인 후에는 드라이아이스로 가득 찬 스테로이드 폼 상자에 2시간 이상 동안 임시로 냉동 보관해야 합니다.
   5. 표시된 샘플을 실험실로 운반하고 분석할 때까지 -80°C에서 보관합니다.

5. α-아밀라아제의 정량화

참고: 이 분석에서 α-아밀라제는 2-클로로-p-니트로페닐-α-D-말토트리오시드를 2-클로로-니트로페놀로 가수분해하고 포도당, 2-클로로-p-니트로페닐-α-D-말토사이드, 말토트리오스 및 포도당을 형성합니다. 반응은 샘플의 α-amylase 활성에 해당하는 405nm의 흡광도에서 모니터링됩니다. 이 분석은 0에서 2000 U/L 사이의 선형성을 보여줍니다.

1. 자료
   1. 타액 샘플에서 α-아밀라아제를 정량화하기 위해 액체 아밀라아제 시약 세트(재료 표 참조)를 사용했습니다. 모든 시약은 바로 사용할 수 있는 액체로 제공되며 0-4 °C에서 보관됩니다.
   2. 분석 중에 37°C로 온도를 제어하고 405nm에서 광학 밀도를 판독할 수 있는 다중 모드 리더(재료 표 참조)를 사용합니다.
2. 분석
   1. 분석하기 전에 얼음 위에서 샘플을 해동합니다.
   2. 1x PBS(타액 10μL + PBS 90μL)로 샘플을 1:10으로 희석합니다.
   3. 각 샘플을 복제하여 분석합니다.
   4. 아밀라아제 시약을 30분 이상 동안 20-25°C로 평형화합니다.
   5. 각 샘플에 대해 0.1mL의 아밀라아제 시약을 96웰 마이크로플레이트에 추가합니다.
   6. 마이크로플레이트를 37°C에서 최소 5분 동안 사전 배양합니다.
   7. 시료 2.5μL를 아밀라아제 시약에 첨가합니다.
   8. 60초 후에 초기 판독값을 취합니다.
   9. 추가로 60분 동안 2초마다 계속 읽습니다.
   10. 분당 평균 흡광도 차이(ΔAbs/min)를 계산합니다.
3. 계산
   1. 아밀라아제 활성을 계산하려면 다음 공식을 사용하십시오.
      
      여기서 ΔAbs/min = 분당 흡광도 차이의 변화; TV = 총 분석 부피(0.1025mL); *1000 = U/mL를 U/L로 변환; MMA = 2-클로로-p-니트로페놀의 밀리몰 흡수율 = 12.9; SV = 시료 부피(0.0025mL); LP = 광 경로 (1cm). 대체하면 다음과 같습니다 :
      
      따라서 ΔAbs/min에 희석 계수(10)의 3178배를 곱하여 U/L 단위의 아밀라아제를 얻습니다.
   2. 2000 U/L(분석 선형성) 이상의 시료의 경우 추가로 희석하고(PBS를 사용하여 최소 2배) 다시 분석한 다음 α-amylase 결과에 추가 희석 계수를 곱합니다.

6. 코르티솔의 정량화

참고: 이 분석법에서 유리 코르티솔은 코르티솔 표준 곡선을 사용하여 타액에서 정량화됩니다. 표준물질 및 희석된 샘플은 항체로 사전 코팅된 마이크로타이터 플레이트에 추가됩니다. 코르티솔-과산화효소 접합체를 웰에 첨가한 다음 코르티솔에 단클론 항체를 추가합니다. 코티솔/과산화효소 접합체 결합의 양은 샘플의 코티솔 농도가 증가함에 따라 감소합니다.

1. 자료
   1. Cortisol Enzyme Immunoassay Kit(재료 표 참조)를 사용하여 타액 샘플의 코티솔을 정량화합니다. 이 분석을 수행하는 데 필요한 모든 시약이 키트에 포함되어 있습니다. 키트의 모든 구성 요소는 만료 날짜에 도달하기 전에 0-4 °C에서 보관됩니다.
   2. 450 nm에서 광학 밀도(OD)를 판독할 수 있는 분광 광도계(재료 표 참조)와 플레이트 리더의 OD 기록을 사용하여 4-파라미터 물류 곡선(4 PLC) 피팅을 수행할 수 있는 소프트웨어를 사용합니다.
2. 시약 준비
   1. 모든 시약이 최소 30분 동안 20-25°C로 평형을 이루도록 합니다.
   2. 코티솔 분석 완충액을 탈이온수를 사용하여 1:5로 희석합니다.
   3. 탈이온수를 사용하여 세척 버퍼를 1:20으로 희석합니다.
      참고: 분석 및 세척 버퍼는 0-4 °C에서 보관할 때 3개월 동안 안정적입니다.
3. 시료 전처리
   1. 분석하기 전에 얼음 위에서 샘플을 해동합니다.
   2. 샘플을 코티솔 분석 완충액(타액 20μL + 완충액 180μL)으로 1:10으로 희석하고 준비 후 2시간 이내에 사용합니다.
4. 표준 준비
   1. 라벨 유리 시험관 #1-#7.
   2. 파이펫 225 μL의 분석 완충액을 튜브 #1에 삽입하고 125 μL의 완충액을 튜브 #2-#7에 주입합니다.
   3. 25 μL의 코티솔 스톡 용액을 튜브 #1 및 와류에 추가합니다.
   4. 튜브 #1에서 125μL의 버퍼를 제거하고 튜브 #2에 추가한 다음 와류에 추가합니다.
   5. 튜브 #3-#7.
      에 대해 연속 희석을 반복합니다. 참고: 각 표준의 최종 코르티솔 농도는 표 1에 나와 있습니다.
   6. 표준물질은 준비 후 2시간 이내에 사용해야 합니다.

표 1: 표준 곡선 준비 표.

1. 분석
   1. 아래 그림 1의 플레이트 레이아웃을 가이드로 사용하여 마이크로플레이트를 설정합니다.
   2. 시약 첨가를 위해 다중 채널 피펫을 사용하는 것이 좋습니다.
   3. 50μL의 샘플 또는 표준물질을 플레이트의 적절한 수의 웰에 추가합니다. 샘플과 표준물질은 중복으로 실행되어야 합니다.
   4. 분석 버퍼(75μL)를 비특이적 결합(NSB) 웰에 추가합니다.
   5. 분석 버퍼(50μL)를 최대 결합(B0) 웰과 0 표준물질(블랭크) 웰에 추가합니다.
   6. 각 웰에 25μL의 코티솔 접합체를 추가합니다.
   7. NSB 웰을 제외한 각 웰에 25μL의 코르티솔 항체를 추가합니다.
   8. 접시의 측면을 부드럽게 두드려 시약을 섞습니다.
   9. 플레이트 씰러로 덮고 20-25°C의 실온(RT)에서 1시간 동안 흔듭니다.
   10. 웰 내용물을 제거하고 세척 버퍼(300μl)로 각 웰을 4번 헹굽니다. 세탁 사이에 흡수성 수건을 말리려면 접시를 두드리십시오.
   11. TMB 기질을 각 웰(100μL)에 추가합니다.
   12. 20-25 °C에서 흔들지 않고 30 분 동안 플레이트를 배양합니다.
   13. 각 웰에 정지 용액을 추가합니다(50μL).
   14. 450 nm에서 마이크로플레이트의 각 웰에 있는 광학 밀도를 판독합니다.
   15. 각 표준물질에 대한 광학 밀도의 평균을 구한 다음 NSB 웰에 대한 평균 광학 밀도를 샘플링하고 뺍니다.
   16. 최대 결합력(B0) 컨트롤을 사용하여 모든 샘플에 대한 % 한계(B/B0)를 계산합니다.
   17. %B/B0 곡선에서 계산된 4개 매개변수 로지스틱 회귀 곡선 피팅이 가능한 소프트웨어를 사용하여 표준 곡선을 생성합니다.
   18. 결과에 희석 계수(10)를 곱하여 pg/mL 단위의 코티솔 값을 구합니다.
   19. 광학 밀도가 가장 높은 표준을 초과하는 샘플은 분석 버퍼로 추가로 희석하고 다시 분석한 다음 결과에 추가 희석 계수를 곱해야 합니다.

그림 1: 예시 플레이트 레이아웃. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

7. 심리적 측정 (인지된 스트레스 설문지)

1. Fliege et al.^{13에서 발표한 PSQ를 사용하여 피험자의 심리적 수준을 측정}하며, 여기에는 4가지 요소(걱정, 긴장, 긴장, 기쁨)가 포함되어 있으며 20개 항목을 활용합니다.
2. 피험자에게 레크리에이션 경험 직전과 경험이 끝난 직후에 PSQ를 작성하도록 요청합니다.
3. 설문지에 각 피험자의 생체생리학적 스트레스 수준과 동일한 3자리 ID 번호를 태그합니다.

샘플 설명
이 연구는 할당량 표본추출 기법을 활용하여 3개 사이트 각각에서 35명의 방문자를 모집했습니다. 이 연구에서는 남성 63명과 여성 42명을 포함하여 총 105명의 피험자를 모집했습니다. 3개의 다른 사이트에서 모집된 방문자의 평균 연령은 25.9세(사이트 A), 37.2세(사이트 B) 및 28.8세(사이트 C)였습니다. 선택된 3개 장소에 대한 피험자의 방문 빈도도 기록되었습니다. 사이트 A와 사이트 C의 경우, 대다수의 피험자가 일주일에 1-3번 이 사이트를 방문했다. B 시험기관에서 피험자의 방문 빈도는 일주일에 1회에서 3회, 그리고 일주일에 3회 이상으로 균등하게 나뉘었다.

생물물리학적, 심리적 스트레스 지표. 생리적 스트레스 수준의 변화를 확인하기 위해 코르티솔 및 α-아밀라아제 수치의 생물물리학적 측정이 활용되었습니다. 심리적 스트레스의 변화는 PSQ 도구를 통해 확인되었습니다.

코티솔 수치 및 α-아밀라아제 수치에 대한 레크리에이션 사이트 방문의 영향
첫 번째 연구 질문은 부위 유형(예: 자연 수준)에 따라 코르티솔과 α-아밀라아제의 수치에 차이가 있는지 물었습니다. 쌍을 이룬 샘플 t-테스트에서는 사이트 A(자연 환경)를 방문한 후 타액 코르티솔이 유의하게 감소했습니다[t31 = 3.26, p < .01, 그림 2 참조]. 부위 B와 C에서 코르티솔 수치의 유의미한 변화는 관찰되지 않았다. 세 부위 모두에서 피험자의 코르티솔 수치 변화를 비교했을 때, 분산 분석 테스트 결과는 서로 다른 부위(자연 수준)가 작은 효과 크기(0.01-0.04)에서 피험자의 코르티솔 수치 변화[F(2,95) = 1.86, p = 0.16]에 전반적으로 유의한 영향을 미치지 않는 것으로 나타났습니다.

α-아밀라아제 수치를 사용하여 스트레스 수준(방문 전/후)의 변화를 측정한 결과, 3개의 연구 위치에서 엇갈린 결과가 나왔습니다. 사용 후 쌍체 샘플 t-테스트는 사이트 C를 방문한 후 α-아밀라아제 수치의 유의한 증가를 나타냅니다[t34 = 2.79, p < .01. 사이트 A 또는 사이트 B를 방문한 후에는 통계적 차이가 관찰되지 않았습니다(그림 3). ANOVA 기법을 사용한 분석에서는 위치가 다른 주효과가 피험자의 α-아밀라아제 수치 변화에 유의한 영향을 미치는 것으로 나타났습니다[F(2,101)= 3.36, p < 0.05]. Scheffe 사후 분석을 사용하여 α-amylase 수치는 사이트 B와 비교할 때 사이트 C를 방문한 후 훨씬 더 높았습니다. 사이트 A와 사이트 B 또는 사이트 A와 사이트 C의 방문자를 비교할 때 α-아밀라아제 수준에는 유의한 차이가 없었으며, 효과 크기(0.03-0.01)가 발견되었으며 작은 것으로 확인되었습니다.

레크리에이션 사이트 방문이 심리적 스트레스 수준에 미치는 영향
쌍을 이룬 표본 t-검정을 적용하여 세 부위의 심리적 스트레스 수준에 대한 방문 전과 후를 각각 비교했습니다. 그림 4와 5에서 볼 수 있듯이, 세 곳을 방문한 후 요구와 걱정 요인(p < 0.01)이 현저히 감소하는 것이 관찰되었습니다. 세 위치 중 어느 곳에서도 인자인 장력의 유의미한 변화는 관찰되지 않았습니다. (그림 6 참조). 사이트 A와 사이트 B에서 요인인 기쁨에 대해 상당한 증가가 보고되었습니다. 사이트 C 방문자에게는 중요한 변화가 관찰되지 않았습니다(그림 7).

3개 사이트 중 어느 곳이 피험자의 심리적 스트레스 수준을 낮추는 데 더 효과적인지 여부를 결정하기 위해, 분산 분석 결과, 쉐프 기법을 사용한 사후 분석에서 3개 사이트(p < 0.01) 간에 유의미한 차이가 있음을 보여주었으며, 사이트 A를 방문한 후 사이트 B와 사이트를 방문한 방문자에 비해 기쁨 수준이 유의하게 증가했다고 보고했습니다. 요구 수준의 변화에서는 차이가 발견되지 않았습니다., 걱정 및 긴장(p = 0.27)이 세 위치에 걸쳐 있습니다.

요약하면, 사이트 A(가장 자연스러운)의 방문자들은 코르티솔 수치가 현저히 감소했다고 보고했으며, 이는 생물학적 스트레스 수치의 감소를 시사합니다. 또한, PSQ에 의해 측정된 바와 같이, 사이트 A를 방문한 방문자들에게서 요구와 걱정의 심리적 요인이 현저히 감소하고 기쁨 수준이 크게 증가한 것이 관찰되었다. 사이트 B(반자연적) 방문자들은 요구와 걱정의 수준이 감소하고 기쁨의 수준이 증가했다고 보고했다. C(건축 환경) 수요와 걱정 수준이 두 가지 감소한 것으로 보고되었습니다. 흥미롭게도, α-아밀라아제의 수치는 사이트 C를 방문한 후 크게 증가했습니다. 특정 활동이나 사회적 환경과 같은 잠재적 요인, 특히 촉매인 α-아밀라아제에 미치는 영향을 조사하기 위해서는 추가 연구가 필요합니다.

그림 2: 3개의 다른 사이트를 방문한 후 코르티솔 수치의 변화. 이 그림은 서로 다른 수준의 자연을 대표하는 세 곳의 장소, 즉 A, B, C를 방문하기 전과 후에 측정된 피험자의 코르티솔 수치를 보여줍니다. 데이터는 자연 로그 척도에서 평균 ± SD로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 3개의 다른 부위를 방문한 후 아밀라아제 수치의 변화. 이 그림은 사이트 A, B 및 C를 방문하기 전과 후에 측정된 피험자의 아밀라아제 수치를 보여줍니다. 데이터는 자연 로그 척도에서 평균 ± SD로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 3개의 다른 사이트를 방문한 후 인지된 요구 수준의 변화. 이 그림은 사이트 A, B, C를 방문한 후 피험자의 요구 수준이 감소했음을 보여줍니다. 데이터는 평균 ± SD로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 세 개의 다른 사이트를 방문한 후 인지된 걱정 수준의 변화. 이 그림은 사이트 A, B, C를 방문한 후 피험자의 걱정 수준이 감소했음을 보여줍니다. 데이터는 평균적인 ± SD로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6: 세 개의 다른 사이트를 방문한 후 인지된 긴장 수준의 변화. 이 그림은 사이트 A, B, C를 방문한 후 피험자의 긴장 수준이 감소했음을 보여줍니다. 데이터는 평균 ± SD로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7: 세 개의 다른 사이트를 방문한 후 인지된 기쁨 수준의 변화. 이 그림은 사이트 A, B, C를 방문한 후 피험자의 기쁨 수준이 증가했음을 보여줍니다. 데이터는 평균 SD± 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.