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방법 논문

자연 수준이 다른 세 곳을 방문한 후 생물물리학및 심리적 스트레스 수준 측정

8.2K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/59272

⸱

2019년 6월 19일

 ,  ,  , 
1School of Kinesiology and Recreation, Illinois State University, 2Department of Recreation, Park, and Tourism Studies, Indiana University, 3Department pf Environmental and Occupational Health, School of Public Health-Bloomington, Indiana University

이 논문에서

요약

이 백서의 목적은 세 가지 다른 설정을 방문한 후 스트레스 수준의 변화를 식별하고 타액 코티솔, α-아밀라아제 및 심리적 자기 보고의 측정에 기초하여 스트레스 수준을 식별하는 데 사용되는 방법을 설명하는 것입니다. 악기.

초록

자연 환경에 방문 심리적 스트레스 감소에 연결 되었습니다. 대부분의 스트레스 관련 연구는 자기 보고서 형식에 의존했지만, 점점 더 많은 연구가 코티솔과 α-아밀라아제와 같은 생물학적 스트레스 관련 호르몬과 촉매를 통합하여 스트레스 수준을 측정하고 있습니다. 여기에 제시된 프로토콜은 자연의 다른 수준을 가진 3개의 다른 위치에 방문 다음 생물 물리학및 심리적 스트레스의 수준에 대한 효력을 검토하기 위한 프로토콜입니다. 생물물리학 및 자가 보고 심리적 스트레스 수준은 선택한 위치에 들어가자마자 그리고 방문자가 사이트를 떠나기 직전에 측정됩니다. "침" 방법을 사용하여, 생물 물리학 측정은 3개의 연구 장소 의 한에 입력시 연구 주제에 의해 제공된 타액의 1-2 mL 견본으로 이루어져 있습니다. 현존하는 문헌에 의해 규정된 바와 같이, 타액은 방문자가 그 장소에서 약혼한 후 45분 이내에 수집됩니다. 타액 수집 후, 샘플은 표지되고 생물학적 실험실로 이송됩니다. 코티솔은 이 연구에서 관심있는 생물물리학적 변수이며 TECAN 플레이트 리더를 사용하여 ELISA 공정을 사용하여 측정합니다. 자체 보고 된 스트레스를 측정하기 위해 걱정, 긴장, 기쁨 및 인식 된 요구 수준을보고하는 인지 스트레스 설문지 (PSQ). 데이터는 늦은 오후부터 이른 저녁까지 세 사이트에서 모두 수집됩니다. 세 가지 설정 모두에서 비교할 때, 생물학적 마커와 자기 보고서 모두에 의해 측정된 응력 수준은 가장 자연스러운 설정으로 방문한 후 현저히 낮습니다.

서론

높은 스트레스 수준은 오랫동안 심장 질환, 비만 및 심리적 장애와같은 많은 심각한 건강 상태에 연결 되었습니다 1,2,3. 연구의 성장 몸은 공원과 비 개발 풍경과 같은 자연 설정에 가까운 근접 또는 방문이 심리적 웰빙과 스트레스의감소 수준에 놀라운 영향을 미칠 수 있음을 시사 1,4, 5,6,7,8,9,10. 자연 설정 및 스트레스 레벨의 효과에 대한 설명은 다음과 같습니다 : (1) 자연 설정은 신체 활동을위한 장소를 제공합니다8,11 및 (2) 자연 환경에 방문자는 초점을 맞출 수있는 능력을 가지고 더 많은 비 작업 사고 과정에, 따라서 주의 피로 감소로 이어지는12. 스트레스 감소에 대한 자연의 영향을 확인하기 위해, 이 연구는 심리적 스트레스 (PSQ)와 세 가지 다른 레크리에이션 사이트를 방문 한 후, 두 타액 기반의 바이오 마커, 코티솔과 α-아밀라아제의 자기 보고서를 사용합니다. 이러한 위치는 "자연스러움"의 수준에 따라 다르며 황야 형 설정, 시립 공원 및 지역 피트니스 및 레크리에이션 시설을 포함합니다.

이 연구는 다음과 같은 연구 질문을 해결하는것을 목표로 : (RQ 1) 타액 코티솔과 α-아밀라아제에 의해 측정 된 생물 물리학 적 스트레스의 수준에 차이가 있는 경우 모든 세 사이트에 걸쳐 비교 (즉, 자연, 반 자연, 내장)? (RQ2) PSQ에 의해 측정 된 심리적 스트레스의 수준에 차이가 있습니까 (네 가지 구조에 의해 명시: 요구, 걱정, 긴장, 기쁨) 세 사이트 모두에 걸쳐 비교 할 때 (즉, 자연, 반 자연, 내장)?

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프로토콜

이 연구는 인디애나 대학 기관 검토 위원회의 인간 연구 보호 프로그램의 정책과 지침을 따릅니다.

1. 위치 선택

  1. 다양한 특성에 따라 사이트 수(n)를 선택합니다.
    참고 : 우리는 우리의 작품에 대한 세 가지 사이트를 선택했다. 사이트 A는 "자연스러움"의 수준에 따라 연속체를 사용하여 가장 자연스러우며 호수와 인접한 약 1,200 에이커의 나무가 우거진 능선으로 구성되어 있으며 낙엽 숲 내에 자리 잡혀 있습니다. 가장 일반적인 활동으로는 걷기와 야생 동물 관찰이 있습니다. 사이트 B는 산책로, 모임 장소, 놀이터 및 인과 적 레크리에이션 활동을위한 열린 필드 공간을 갖춘 33 에이커의 시립 공원이었습니다. 사이트 C는 자연스러움이 가장 낮은 도시, 실내 운동 시설이었습니다. 세 곳 모두 미국 중서부의 중형 도시(인구 46,000명)와 비교적 가깝습니다.

2. 참가자 선발 및 준비

  1. 피험자가 레크리에이션 경험에 참여하기 전에 참가자 모집을 완료하십시오.
    참고: 사이트 A와 B의 경우 공원 입구 주차장에 있는 연구원이 피사체에 접근했습니다. 사이트 C의 경우 실내 운동 시설의 프론트 데스크에서 피사체에 접근했습니다. 활동 유형의 차이를 제어하기 위해 사이트 A와 B 모두에 대해 모집된 과목은 주로 하이킹을 하고 있었고, 사이트 C의 경우 주요 활동이 실내 트랙에서 실행되거나 걷고 있었습니다.
  2. 모집 하는 동안, 타 액 코 티 솔 샘플 수집에 관련 된 지침을 준수 하는 주제를 생각 나게. 그들은 타액 샘플을 제공하기 전에 10 분 동안 먹거나 마시지 않아야합니다.
    참고 : 이 경우 타액 샘플이 부피 또는 희석 (농도)에 대해 정규화되지 않았음을 주목해야합니다 - 즉 참가자가 샘플 수집 사이에 적절하게 수화 및 / 또는 수화 변화를 수행했는지 여부.
  3. 각 참가자에게 빨간 완장(또는 이와 동등한 눈에 띄는 의류)을 제공하여 약혼이 끝날 때 쉽게 식별할 수 있도록 합니다.
  4. 세 사이트의 모든 피사체가 각 사이트에서 비슷한 시간을 보낼 수 있도록 30-40분의 시간 할당을 할당합니다. 나머지 샘플보다 훨씬 더 많거나 적은 시간을 소비하는 피험자는 제외합니다.
  5. 참여도유형을 일관되게 유지합니다.
    참고 : 이 경우 "중간"활동은 걷거나 하이킹을했습니다. 걷기 나 하이킹과 는 상당히 다른 활동에 종사하는 피험자는 샘플에서 제외되었습니다. 예를 들어, 낚시, 피크닉 또는 역도 대상자는 각 샘플에 포함되지 않았습니다.

3. 조건 및 실험 설계

  1. 준실험 사전 테스트/사후 테스트 설계를 사용합니다.
  2. 피험자와 참여에 동의한 후, 각 피험자에게 연구의 자발적성격, 목적 및 절차를 설명하는 IRB 양식에 서명하도록 요청합니다.
  3. 이 과정을 따라, 피험자에게 미래의 식별을 위해 의류 (예 : 빨간 완장)를 주고 스트레스 수준 (즉, PSQ, 침또는 시험관에 침을 뱉은 타액의 1-2 mL)의 생리적, 심리적 측정을 얻습니다. 늦은 오후부터 이른 저녁까지 샘플을 수집합니다.
    참고 : 이러한 데이터는 피험자가 사이트에 들어가기 직전에 1) 및 2) 사이트 방문이 끝나자마자 연구원에 의해 수집되었습니다.

4. 타액 샘플

  1. 시료 희석을 피하려면 타액 샘플을 제공하기 전에 10분 동안 음식을 먹거나 마시거나 헹구지 않도록 피험자에게 요청하십시오.
  2. 피험자에게 레크리에이션 경험 직전과 경험의 결론 직후에 1-2 mL 타액 샘플 (거품 제외)을 제공하도록 요청하십시오.
  3. 수동 침 방법을 사용하여 타액 샘플을 수집합니다.
    1. 2 mL 극저온에 침을 흘리도록 플라스틱 마시는 빨대에 2를 피실험자에게 제공합니다 (재료 표참조).
    2. 피험자에게 타액이 입에 풀을 넣을 수 있도록 지시한 다음 지푸라기를 흘리며 극저온으로 침을 흘립니다. 타액 수집 및 취급 조언 (2011)에 따르면, 1 mL (거품 제외)은 대부분의 테스트에 적합합니다.
    3. 데이터 수집 의 타이밍을 나타내는 할당 된 3 자리 ID 번호 (즉, 001) 및 문자가할당 된 라벨 샘플 (즉, A는 사전 테스트를 나타내고, B는 사후 테스트를 나타냅니다. 001A는 참가자 001에서 제공하는 타액 샘플을 나타내는 경우 레크리에이션 경험).
    4. 샘플을 수집하고 라벨을 붙인 후, 2 시간 이하의 드라이 아이스로 가득 찬 스테로이드 폼 상자에 일시적으로 냉동 보관해야합니다.
    5. 표시된 샘플을 실험실로 이송하고 분석될 때까지 -80°C에서 보관합니다.

5. α-아밀라아제 정량화

참고 : 이 분석에서 α-아밀라아제 는 2-클로로-p-니트로페닐-α-D-말토트리오사이드를 2-클로로-니트로페놀로 분해하고 포도당, 2-클로로-p-니트로페닐-α-D-말토사이드, 말토트리오스 및 포도당을 형성한다. 반응은 405 nm의 흡광도에서 모니터링되며, 이는 샘플에서 α-아밀라아제 활성에 해당한다. 이 분석은 0과 2000 U/L 사이의 선형성을 보여줍니다.

  1. 자료
    1. 액상 아밀라아제 시약 세트(재료 표참조)를 사용하여 타액 샘플에서 α-아밀라아제를 정량화했습니다. 모든 시약은 즉시 사용할 수 있는 액체로 제공되며 0-4°C에 보관됩니다.
    2. 분석 기간 동안 37°C로 제어되는 온도로 405 nm에서 광학 밀도를 판독할 수 있는 다중 모드 리더(재료 표참조)를 사용한다.
  2. 분석
    1. 분석 전에 얼음에 샘플을 해동.
    2. 1x PBS로 1:10 샘플을 희석합니다(타액 10 μL + PBS 90 μL).
    3. 중복으로 각 샘플을 분석합니다.
    4. 아밀라아제 시약을 20-25°C로 적어도 30분 동안 평형화한다.
    5. 각 시료에 대해 96개의 웰 마이크로플레이트에 아밀라아제 시약 0.1 mL를 추가합니다.
    6. 마이크로플레이트를 37°C에서 최소 5분 동안 미리 배양한다.
    7. 아밀라아제 시약에 시료 의 2.5 μL을 추가합니다.
    8. 60 초 후에 초기 독서를하십시오.
    9. 추가 2 분 동안 모든 60 s를 계속.
    10. 분당 평균 흡광도차이(ΔAbs/min)를계산합니다.
  3. 계산
    1. 아밀라아제 활성을 계산하려면 다음 수식을 사용하십시오.
      figure-protocol-1
      ΔAbs/min = 분당 흡광도 차이의 변화; TV = 총 분석 볼륨 (0.1025 mL); *1000 = U/mL에서 U/L로 변환; MMA = 2-클로로-p-니트로페놀의 밀리몰 흡수성 = 12.9; SV = 샘플 볼륨 (0.0025 mL); 및 LP = 라이트 패스(1cm)를 표시합니다. 대체는 다음과 같은 것을 제공합니다.
      figure-protocol-2
      따라서, U/L에서 아밀라아제를 얻기 위해 희석 계수(10)를 3178배 곱하여 ΔAbs/min을 곱합니다.
    2. 2000 U/L(분석 선형성) 이상의 시료의 경우 추가희석(PBS를 사용하여 최소 2배) 희석하고 재분석한 다음 α-아밀라아제 결과를 추가 희석 인자에 곱합니다.

6. 코티솔 정량화

참고 :이 분석에서, 무료 코티솔은 코티솔 표준 곡선을 사용하여 타액에서 정량화됩니다. 표준 및 희석 된 샘플은 항체로 미리 코팅된 마이크로 티터 플레이트에 첨가됩니다. 코티솔 - 퍼옥시다아제 컨쥬게이트가 웰에 추가되고 코티솔에 단일 클론 항체가 추가됩니다. 샘플에서 코티솔의 농도가 증가함에 따라 코티솔 / 과산화수지 결합의 양이 감소합니다.

  1. 자료
    1. 코티솔 효소 면역 분석 키트(재료 표참조)를 사용하여 타액 샘플에서 코티솔을 정량화하십시오. 이 분석기를 수행하는 데 필요한 모든 시약이 키트에 포함되어 있습니다. 키트의 모든 구성 요소는 만료 날짜에 도달하기 전에 0-4 °C에 저장됩니다.
    2. 450nm에서 광학 밀도(OD)를 판독할 수 있는 분광광도계(재료 표참조)와 플레이트 리더의 OD 기록을 사용하여 4파라미터 로지스틱 커브(4 PLC) 피팅을 수행할 수 있는 소프트웨어를 사용합니다.
  2. 시약 준비
    1. 모든 시약이 최소 30분 동안 20-25°C까지 평형화되도록 하십시오.
    2. 탈이온수를 사용하여 코티솔 분석 버퍼 1:5를 희석한다.
    3. 탈이온수를 사용하여 세척 완충액 1:20을 희석합니다.
      참고: 분석 및 세척 버퍼는 0-4°C에서 보관할 때 3개월 동안 안정적입니다.
  3. 샘플 준비
    1. 분석 전에 얼음에 샘플을 해동.
    2. 코티솔 분석 버퍼 (타액 20 μL + 완충액 180 μL)로 샘플을 1 :10 희석하고 준비 2 시간 이내에 사용하십시오.
  4. 표준 준비
    1. 라벨 유리 테스트 튜브 #1 #7.
    2. 튜브 #1 및 튜브 #2 #7 버퍼의 125 μL의 분석 버퍼의 파이펫 225 μL.
    3. 튜브 #1 와류에 코티솔 스톡 솔루션 25 μL을 추가합니다.
    4. 튜브 #1 버퍼 125 μL을 제거하고 튜브 #2 추가 한 다음 소용돌이.
    5. 튜브 #3 #7 대한 직렬 희석을 반복합니다.
      참고 : 각 표준의 최종 코티솔 농도는 표1에 나와 있습니다.
    6. 표준은 준비 후 2시간 이내에 사용해야 합니다.
표준#1#2#3#4#5#6#7
분석 버퍼 볼륨 (μL)225125125125125125125
또한스톡 세인트#1#2#3#4#5#6
부피 추가(μL)25개125125125125125125
최종 농도(pg/mL)32001600년800400개200개100개50개

표 1: 표준 곡선 준비 표.

  1. 분석
    1. 마이크로 플레이트를 설정하는 가이드로 그림 1의 아래 플레이트 레이아웃을 사용합니다.
    2. 시약을 추가하기 위해 멀티 채널 파이펫을 사용하는 것이 좋습니다.
    3. 50 μL의 샘플 또는 표준을 플레이트의 적절한 수의 웰에 넣습니다. 샘플 및 표준은 중복으로 실행되어야 합니다.
    4. 비특이적 결합(NSB) 웰에 분석 버퍼(75 μL)를 추가합니다.
    5. 분석 버퍼(50 μL)를 최대 결합(B0) 웰과 제로 표준(블랭크) 웰에 추가합니다.
    6. 각 우물에 코티솔 컨쥬게이트 25 μL을 추가합니다.
    7. NSB 웰을 제외한 각 우물에 코티솔 항체25 μL을 추가합니다.
    8. 플레이트 의 측면을 부드럽게 두드려 시약을 섞습니다.
    9. 플레이트 실러로 덮고 실온(RT)에서 20-25°C에서 1시간 동안 흔들어 줍니다.
    10. 웰 내용물 제거 및 세척 버퍼 (300 Μl)로 각 우물 4 배 씻어. 접시를 두드려 서열 사이에 흡수성 수건으로 말리십시오.
    11. TMB 기판을 각 웰(100 μL)에 추가합니다.
    12. 플레이트를 20-25°C에서 30분 동안 흔들지 않고 배양합니다.
    13. 각 웰(50 μL)에 스톱 솔루션을 추가합니다.
    14. 450 nm에서 마이크로 플레이트의 각 웰에서 광학 밀도를 판독합니다.
    15. 각 표준에 대한 광학 밀도를 평균화한 다음 NSB 웰의 평균 광학 밀도를 샘플링하고 뺍니다.
    16. 최대 바인딩(B0) 컨트롤을 사용하여 모든 샘플에 대해 %바운드(B/B0)를 계산합니다.
    17. %B/B0 곡선에서 계산된 4개의 매개변수 로지스틱 회귀 곡선 피팅이 가능한 소프트웨어를 사용하여 표준 곡선을 작성합니다.
    18. 그 결과를 희석 인자(10)에 곱하여 pg/mL에서 코티솔 값을 얻습니다.
    19. 광학 밀도가 가장 높은 표준 이상으로 떨어지는 샘플은 분석 버퍼로 더 희석하고 다시 분석해야 하며, 그 결과는 추가 희석 계수를 곱하여야 합니다.

figure-protocol-3
그림 1 : 예제 플레이트 레이아웃. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

7. 심리적 측정 (인식 스트레스 설문지)

  1. Fliege 등13에의해 출판 된 PSQ를 사용하여 피험자의 심리적 수준을 측정, 네 가지 요인을 포함 (걱정, 긴장, 긴장, 기쁨) 및 활용 20 항목.
  2. 피사체에 레크리에이션 경험 직전에 PSQ를 작성하고 경험의 결론을 바로 따르도록 요청하십시오.
  3. 각 피험자의 생리생리적 스트레스 수준과 동일한 3자리 ID 번호로 설문지에 태그를 붙입니다.

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결과

샘플 설명
이 연구는 할당량 샘플링 기법을 활용하여 3개 사이트에서 35명의 방문자를 모집했습니다. 총, 105 과목이이 연구에서 모집 되었다, 포함 하 여 63 남성 과 42 여성. 세 곳의 다른 사이트에서 모집된 방문자의 평균 연령은 25.9년(사이트 A), 37.2년(사이트 B), 28.8년(사이트 C)이었습니다. 선정된 3개 장소에 대한 피험자의 방문 빈도도 기록되었다. 사이트 A와 사이트 C의 경우 대부분의 피험자가 일주일에 1~3회 이 사이트를 방문했습니다. 사이트 B의 피험자의 경우 방문 빈도가 주당 1~3회, 주당 3회 이상 동등하게 분할되었습니다.

생물 물리학 및 심리적 스트레스 지표. 코티솔과 α의 생물물리학적 척도-아밀라아제 수준은 생리적 스트레스 수준의 변화를 확인하기 위해 이용되었습니다. 심리적 스트레스의 변화는 PSQ 기기를 통해 확인되었습니다.

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토론

이 연구의 목적은 자연의 다른 수준으로 세 가지 다른 설정에 레크리에이션 방문 다음 생물 물리학 및 심리적 악기를 사용하여 스트레스의 잠재적 인 변화를 식별하는 것입니다. 코티솔과 α-아밀라아제는 심리적 스트레스 수준을 신뢰할 수 있는 지표로 나타났습니다. 본 연구에 기술된 아밀라아제 분석 절차는 96웰 포맷으로 조정되었다. 타액의 아밀라아제 수치가 높을 때, 흡광도 변화는 급속히 발생합니다. 따라서 한 번에 분석할 수 있는 샘플의 수가 각 웰에 얼마나 빨리 2.5 μL까지 첨가될 수 있는지에 따라 한 번에 분석되는 샘플 수를 제한하는 것이 중요합니다. 이 연구에서, 아밀라아제 수준은 주어진 시간에 하나의 컬럼(8개의 반응)에서 측정되었다. 시상 하부 - 뇌하수체 - 부신 피질 축 (HPA) 및 동정 -부신 세포 시스템 (SAM)을 포함하여 두 가지 주요 시스템은 스트레스 응답에 관여한다. Kirschbaum과 Hellhammer14 타액 코 티 솔 측정 밀접 하 게 혈 청 코 티 솔 ...

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공개 사항

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

감사의 글

이 연구는 인디애나 대학, 블루밍턴, IN에서 공중 보건의 학교를 통해 후원 교수 연구 보조금 프로그램 (FRGP)를 통해 부분적으로 투자되었다. 저자는 앨리슨 보이트 박사와 멜리사 페이지의 편집 지원과 건설적인 의견에 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
코티솔 효소 면역분석 키트DetectXK003-H1코티솔 효소 면역분석 키트는 건조 대변 추출물, 타액, 소변, 혈청, 혈장 및 배양 배지 샘플에 존재하는 코티솔을 정량적으로 측정하도록 설계되었습니다.
극저온 보관을 위한 극저온 라벨Fisherbrand5-910-A극한의 온도를 견디는 독특한 접착제
액체 아밀라아제(CNPG3) 시약 세트Pointe ScientificA7564인간 혈청에서 α-amylase 활성의 정량적 동역학 측정을 위해.
외부 나사산 캡이 있는 둥근 바닥 2mL 폴리프로필렌 튜브Greiner Bio-One07-000-2572.0ml U-BTM Cryo.s 자체 스탠딩 폴리프로필렌 멸균
Synergy 다중 모드 마이크로플레이트 리더BioTek이중 광학 설계를 사용하여 마이크로플레이트 형식의 샘플 측정을 수행하는 단일 채널 흡광도, 형광 및 발광 마이크로플레이트 리더입니다.

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