Summary
Этот протокол описывает производства система 3-мерного органоид мыши внепеченочных желчных протоков. Эти желчных organoids может поддерживаться в культуре для изучения биологии cholangiocyte. Желчных organoids Экспресс маркеры прародителем и желчных клетки и состоят из поляризованные эпителиальных клеток.
Abstract
Cholangiopathies, которые затрагивают внепеченочных желчных протоков (EHBDs), включают в себя Билиарной атрезией, первичный склерозирующий холангит и холангиокарцинома. Они имеют без эффективных терапевтических вариантов. Инструменты для изучения EHBD весьма ограничены. Нашей целью было разработать органоспецифическая, универсальный, взрослых стволовых клеток, доклинические cholangiocyte модели, которые могут быть легко сгенерированы от дикого типа и генетически мышей. Таким образом мы сообщаем о Роман методика разработки системы культуры органоид (EHBDO) EHBD от взрослых мыши EHBDs. Модель является экономически эффективным, могут легко анализироваться, и имеет несколько нисходящие приложения. В частности мы описываем методологии мыши EHBD изоляции и одноклеточного диссоциации, органоид культуры посвящения, распространения и долгосрочного обслуживания и хранения. Этот манускрипт также описывает EHBDO обработки для иммуногистохимии, флуоресцентной микроскопии и мРНК изобилие количественный реального времени Количественная обратная транскрипция полимеразной цепной реакции (qRT ПЦР). Этот протокол имеет значительные преимущества в дополнение к производству EHBD-конкретных organoids. Использование условных среды от клеток L-WRN значительно снижает стоимость этой модели. Использование мыши EHBDs обеспечивает практически неограниченные ткани для формирования культуры, в отличие от человеческих тканей. Сгенерированный мышью EHBDOs содержат чисто населения эпителиальных клеток с маркерами эндодермы прародителя и дифференцированной желчных клетки. Культивированный organoids поддерживать однородные морфология через множественные проходы и могут быть восстановлены после долгосрочного хранения в жидком азоте. Модель позволяет для изучения желчных прародитель пролиферации клеток, можно манипулировать фармакологически и может быть создан из генетически мышей. Будущие исследования необходимы для оптимизации условий культуры с целью повысить эффективность покрытия, оценки функциональных клеток зрелости и прямой клеточная дифференцировка. Желательно также разработка совместного культуры моделей и более биологически нейтральной внеклеточного матрикса.
Introduction
Cholangiopathies являются неизлечимой хронической прогрессивного расстройств, которые влияют на желчных клеток, расположенных в интра - и внепеченочных желчных протоков (EHBDs)1. Некоторые cholangiopathies, как первичный склерозирующий холангит, холангиокарцинома, Билиарной атрезией и Киста холедоха, преимущественно влияет на EHBDs. Разработка терапии для cholangiopathies ограничивается ограниченное наличие доклинических моделей. Кроме того, предыдущие исследования сосредоточены на cholangiopathies, сгруппированных вместе: печень, интра- и EHBDs. Однако внутри - и EHBDs имеют собственный эмбриональное происхождение и, таким образом, следует рассматривать в качестве отдельных молекулярной патологии. Внутрипеченочных желчных протоков развиваются из внутрипеченочных протоковой пластины и черепной частью печеночная дивертикул, весь EHBDs развивать из хвостовой части печени дивертикул2. Они также полагаются на разных прародителя клеточных компартментов для взрослых гомеостаза, включая каналы Геринга внутрипеченочных желчных протоков и peribiliary желез в EHBDs2,3. Использование животных моделей для доклинических исследований ограничивается расходами и должно быть сведено к минимуму, по этическим соображениям. Таким образом упрощенный, воспроизводимость, время и экономически эффективным в пробирке модели являются весьма желательно.
Большинство предыдущих исследований cholangiopathies использованы нормальные мыши или крысы рака модели или человека холангиокарцинома клеточных линий, полученных от интра - и EHBDs4,5,6,7. Однако эти модели трансформированных клеток и не повторить, нормальный cholangiocyte биологии гомеостаза или в здоровом состоянии. Недавний прогресс в разработке моделей organotypic культуры позволил развитие 3-мерных структур из тканей различных типов, включая гепатобилиарной тканей, хотя не нормальные мыши EHBDs8,9, 10. Эти структуры «орган как» направленные на пародирование основной ткани и выращиваются в искусственной ниши, поддержки самообновления органоспецифическая стволовых/прогениторных клеток11.
«Organoid»-это широкий термин, наиболее часто описывает модели 3-мерной ткани, полученные из стволовых клеток. Organoids могут быть сгенерированы из перенесенной плюрипотентных стволовых клеток представлено эмбриональных стволовых клеток и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. Они также может быть создан из12органоспецифическая взрослых стволовых клеток. Некоторые cholangiocyte органоид модели были предложены в предыдущих исследований. Таким образом organoids, производный от человеческих плюрипотентных стволовых клеток были сообщил7,9,13 и предоставить ценные, время эффективным инструментом, который позволяет для одновременной генерации различных типов клеток. Однако эти плюрипотентных стволовых клеток organoids не в полной мере отражает структуру и функциональность основного взрослого EHBD cholangiocytes.
Organoids производным от взрослых стволовых клеток человека9 и кошачьих10 печени были также предложены. Кошачий модели не широко доступны и имеют ограниченный инструмент взята для целей исследования. Кроме того эти функции печени производные взрослых стволовых клеток, полученных organoids не модель внепеченочных cholangiocytes, но скорее внутрипеченочных cholangiocytes.
EHBD органоид поколения было сообщено от человека нормальный EHBDs14 и мыши EHBD холангиокарцинома15. Однако чрезвычайно ограничен доступ к EHBD ткани человека, и organoids производным от генетических мышиных модель холангиокарцинома15 не представляют здорового cholangiocyte биологии гомеостаза и являются производными от генетически модифицированные клетки.
Для устранения ограничений плюрипотентных стволовых клеток и печени, полученных cholangiocyte органоид моделей и ограниченный доступ к ткани человека, необходимо в доклинических моделях, мы разработали модель мышиных EHBD органоид (рис. 1A). Эта рукопись описывается разработка методики для мыши EHBD-производные organoids от взрослых ткани. Эти EHBD organoids с именем EHBDOs будет важным инструментом в пробирке для изучения механизмов, лежащих в основе EHBDs cholangiocyte гомеостаза и болезней процессов, таких как cholangiopathies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все методы, описанные здесь были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) Мичиганского университета.
1. Подготовка оборудования и материалов для мыши EHBD изоляции
- Подготовить посевной средних и стиральные буфера (Таблица материалов) в 50 мл конические трубы и держать их на 4 ° C или на льду до использования.
- Настройте таблицу хирургические (рис. 1B). Подготовьте стерилизации хирургических инструментов (рис. 1 c).
- Место стерильным 24-ну пластины в инкубатор культуры ткани 37 ° C для предварительного подогрева.
- Место Алиготе подвале матрицы на льду. Подвале матрицу следует используйте только тогда, когда он полностью сжиженный.
2. EHBD изоляции и желчных органоид культура
-
Изоляция и приготовление суспензии одну ячейку мыши EHBD
- Усыпить взрослых (старше 2 месяцев) мыши согласно институциональных руководящих принципов. Поместите указатель мыши в лежачем положении. Откройте брюшной полости, используя подход срединной и убрать печени отдохнуть на диафрагму.
- Определение общего желчного протока, расположенный сразу под печени рубчика, осторожно потянув проксимальной двенадцатиперстную кишку с кровоостанавливающий. Отделите EHBD от окружающих тканей, с использованием лезвием скальпеля. Проведению проксимального конца общего желчного протока с щипцами, вскрыть его дистально чуть выше его этапе с двенадцатиперстную кишку, а затем вскрыть проксимальный конец воздуховода из печени (рис. 1 d). Сразу же место изолированные EHBD (Рисунок 1E) в холодной отмывающего буфера.
- Удалить EHBD из Отмывающий буфер и фарша 0.5 мм разделов с помощью лезвия стерильным скальпель. Место ткани на стеклянную пластину на льду во время процедуры (рис. 1B).
- Место разделы EHBD в пробирку, содержащую 500 мкл буфера диссоциации. Проинкубируйте втечение 20 мин при температуре 37 ° C. Нейтрализовать диссоциации буфера, добавив 500 мкл ледяной клеток питательной среды.
- Нарезанных суспензию клеток вверх и вниз прогрессирует через 18 G и 20 G иглы, 20 раз каждый. Фильтрации суспензии клеток через стрейнер ячейки 70 мкм и собирать потока через в 50 мл трубки.
Примечание: Предварительное условие ситечко с 500 мкл стерильных фосфат амортизированное saline (PBS) до фильтрации для облегчения прохождения суспензию клеток.
-
Создание EHBD organoids
- Центрифуга потока через от шага 2.1.5 на 300 x g 5 мин при 4 ° C.
- Осторожно удалите супернатант. Ресуспензируйте клеток в 1 мл ледяной стерильные PBS. Перенесите ресуспендирования в новой 1,5 мл трубки. Повторите шаг 2.2.1.
- После центрифугирования тщательно удалите супернатант промывают ячеек, собранные в нижней части трубки. Ресуспензируйте Пелле клеток в 120 мкл сжиженного ледяной подвале матрицы, закупорить вверх и вниз с помощью Р200 советы.
Примечание: Клетки Пелле ресуспендирования в подвале матрица должна быть выполнена на льду баня. - Пластина 40 мкл клетки ресуспендирования в подвале матрицы в центр хорошо в подогретым пластине 24-хорошо.
Примечание: Избегайте отсоса воздуха во время манипулирования подвале матрицы для предотвращения формирования пузыря. - Возвращение пластину с клетками высокомобильна в подвале матрицы в инкубатор культуры ткани 37 ° C 15 минут или пока не затвердевших подвале матрица. Добавьте 600 мкл посева носителя нагревают до 37 ° C для каждой скважины (Таблица материалов). Возвращение пластину в инкубатор культуры ткани 37 ° C.
- Замените средство заполнения 600 мкл свежие органоид питательной среды в 3 дней и каждые 3 дней после этого. Монитор органоид рост с инвертированным микроскопом. Использование organoids течению приложения или Сплит каждые 7 до 9 дней до накопления мусора и органоид распада внутрипросветная наблюдаются (рис. 2A).
3. EHBD органоид прохода и хранения
-
Прохождение EHBD organoids 1:3 до 1:4 каждые 7 до 9 дней
- Удалите носитель из колодца и 400 мкл ледяной PBS. Ресуспензируйте organoids, нежно дозирование смеси вверх и вниз 10 раз в колодец. Передача смеси 1.5 мл.
- Проход смесь через иглу 25 G 4 раза не присоединяться organoids. Центрифуга смеси на 400 x g 4 мин при 4 ° C.
- Тщательно удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки в подвале матрица (1:3 до 1:4) для дальнейшего культивирования (шаг 2.2.4.) или вымыть клетки с лед холодной PBS для дальнейшей обработки.
Примечание: Как правило 250-300 клетки покрыты в пластину 24-хорошо для нисходящие приложения. Покрытие эффективность может оцениваться по микроскопии яркие поля с помощью инвертированного микроскопа на 3-5 день после пассированый путем подсчета количества organoids и расчета их процент от количества первоначальных клеток. мРНК могут быть изолированы от EHBDOs, промывают в PBS, используя стандартный протокол, с помощью Гуанидиновые тиоцианат фенол хлороформ добычи.
-
Длительное хранение EHBD organoids
- Удалите носитель из колодца и мыть organoids с комнатной температуре PBS. Удаление PBS из колодца не нарушая падение матрица подвале.
- 500 мкл ледяной ячейки замораживание среднего колодец. Нежно ресуспензируйте organoids в сжиженный подвале матрицы и замораживание среднего и перенесите смесь в криогенных флаконов.
- Храните флаконов на-80 ° C в течение 48 ч. Передача пузырьки азота бак для длительного хранения в паровой фазе.
4. EHBD органоид Pprocessing для встраивания парафин
- Ресуспензируйте EHBDOs в 500 мкл ледяной PBS (4 ° C), закупорить вверх и вниз 5-10 раз. Сбор ресуспензированы EHBDO в матрице сжиженного подвал в 1,5 мл.
Примечание: Чтобы избежать нарушения organoids, отрезать дно 2-3 мм кончика P1000 и очень тщательно удалить супернатант. - Центрифуги EHBD organoids на 350 x g 5 мин тщательно удалить супернатант не нарушая органоид Пелле.
- Добавьте 1 mL ледяной параформальдегида 4% (PFA) organoids и инкубировать organoids в 4%, PFA на ночь при 4° C. Удалите 4% PFA от organoids с помощью кончика P1000 после ночи инкубации.
- Добавить 1000 мкл комнатной температуры PBS в трубку с organoids и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре (RT). Центрифуга трубку с organoids в PBS на 350 x g 5 мин повторить этот процесс еще два раза.
- Удаление PBS и добавьте 1 мл 30% этанола organoids. Инкубируйте 5 мин на RT.
- Центрифуга трубки на 350 x g 5 мин на RT. Remove 30% этанола. Добавить 1 мл 70% этанола и инкубировать в течение 5 мин на RT.
- Центрифугировать на 350 x g для 5 минут удалить 70% этанола. Добавьте 1 mL 100% этанола и инкубировать в течение 5 мин на RT.
Примечание: Organoids может храниться в 100% этанола при комнатной температуре до 48 ч. перед дальнейшей обработкой. - Тепла образец обработки гель в микроволновую печь на 20 s или до тех пор, пока сжиженный. Добавьте 50 мкл образца обработки гель в трубку с organoids. Поместите трубки на льду, до тех пор, пока образец обработки гель затвердевает.
- Удаление капля образца обработки гель с organoids из трубки и место между колодками синий Губка в кассету для дальнейшей обработки в ткани процессора. Использовать 15 минут для каждого шага в парафин embedder во время дальнейшей обработки...
- Раздел organoids парафин врезанных в образец обработки гель на 4 µm. Продолжайте с применением иммуногистохимического окрашивания как описано16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Наш протокол описывает поколения organoids EHBD мыши, ткане- и взрослых стволовых клеток. После искусственного organoids, формирования кистозных структуры могут наблюдаться как 1 день после EHBD изоляции. Загрязнение с фибробластов не наблюдается обычно во время создания культуры. EHBDO покрытие эффективность составляет примерно 2% при изоляции от новорожденных или взрослого (старше 2 месяцев) мышах (рис. 2B). Обшивка эффективность EHBD organoids производным от взрослых мышей увеличивается до 11% в проход 2 и остается стабильной (Рисунок 2Б). Большинство organoids демонстрируют кистозных морфология через все проходы, с редкими «неправильной» organoids (рис. 2 c-E). Organoids достичь пика роста на 5-7 дней, после чего они начинают накапливать внутрипросветная мусора и ухудшаться (рис. 2A). Таким образом для поддержания органоид культуры, они должны разделить каждые 7-10 дней (рис. 2A). После создания и когда надлежащим образом обработаны, organoids может поддерживаться в культуре почти бесконечно (культур были замечены до 14 месяцев). Чтобы избежать культуры загрязнения с дифференцированных клеток, перенесенных с начальной ячейки изоляции, organoids использования, по крайней мере дважды пассированной до их использования в приложении ниже по течению. Для длительного хранения используйте ранее organoids проход (до прохода 7), поскольку они имеют более высокую эффективность покрытия после восстановления от хранения.
При анализе с помощью иммунофлуоресцентного, EHBDOs состоят из чистого населения эпителиальных клеток, отмечен E-Кадгерины (Рисунок 3А-C). Органоид клетки демонстрируют маркеры желчных прогениторных клеток (поджелудочной железы и двенадцатиперстной кишки 1 Гомеобокс (PDX1); На рисунке 3A) а также маркеры желчных дифференцировки (Цитокератины 19 (CK19) и секс-определение региона Y-Box 9 (SOX9); Рисунок 3B, C). Важно отметить, что высокий процент органоид клетки обладают первичной ресничку, отмечен ацетилированный α-тубулина (a-AT; 3D рисунок), который является функцией нормального cholangiocytes и предлагает соответствующие органоид клетки поляризации. Выражение меток прародителю (Pdx1) и желчевыводящих дифференцированных клеток [АквапоринCk19, Sox9, 1 (Aqp1), муковисцидозом трансмембранной проводимости регулятор(МВТР)] может быть также подтверждено реальном времени Количественная обратная транскрипция полимеразной цепной реакции (ПЦР qRT) (Таблица 1). Сочетание этих маркеров характерно для cholangiocytes в EHBDs14,17,18.
Таким образом этот протокол описывает поколения модели культуры органоид поляризованные желчных эпителиальных клеток, выражая прародителем и дифференцированной маркеров. Эта система можно поддерживать в культуре длительное время без изменений в морфологии, хранятся долгосрочной и проанализированы с иммуногистохимии и qRT-PCR.
Рисунок 1 : Схема EHBD органоид культуры поколения и хирургический набор макияж (A). схема EHBD органоид поколения. (B). хирургические области был настроен для EHBD изоляции и включал стеклянной пластины (пунктирная линия) хранится на поддон для льда во все времена. (C). стерильные хирургические оборудования включены острыми ножницами, прямо и изогнутых зубчатые пинцет, зажим и скальпеля. (D и E) EHBD изолирован от окружающих тканей соединительной и поджелудочной железы, после тщательного вскрытия проксимально от внутрипеченочных желчных путей и печени (D, стрелка) и дистально от двенадцатиперстной кишки (D, стрелка). Делениям = 1 мм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Культура EHBDO. (A). микроскопических изображений EHBDOs над 12-дневный курс. (B). покрытие эффективность organoids производным от новорожденных (2 мышей за культуру, n = 3 культур) и взрослых (> 2 месяца, 1 мышь на культуру, n = 3 культур) мышей после покрытия 300 ячеек на хорошо в пластине 24-Ну и перечисления organoids на 5 день культуры. (C и D) EHBDO кистозный против нерегулярных морфология был проанализирован микроскопии. (E). процент кистозные и нерегулярные формы organoids были проанализированы в начале (< 10) и поздний (≥10) органоид проходы. Масштаб баров = 500 мкм. количественные данные показали как средство + / Среднеквадратичная ошибка среднего значения (SEM), t-теста. NS = не значительные. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : EHBDOs Экспресс маркеры прародителем и зрелых клеток желчных. (A-C). EHBDOs были проанализированы иммунофлюоресценции, пятнать для маркеры эпителия (A, б. E-Кадгерины, красный), прародитель (A. PDX1, зеленый) и дифференцированные (Б. CK19, зеленый; и C. a-AT, красный) желчных клетки. Масштаб баров = 25 µm. *, люмен. (D). EHBDOs были проанализированы на обилие Pdx1, Ck19, Sox9, Aqp1и МВТР мРНК qRT-ПЦР (средний + / SEM относительно выражение Hprt). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Джин | Присоединение номер | Грунтовка последовательность | Размер продукта | ||
| Hprt | NM_013556 | Вперед 5'-AACTTGCGCTCATCTTAGGCTTTG-3' | 173 bp | ||
| Обратный 5'-AGGACCTCTCGAAGTGTTGGATAC-3' | |||||
| Pdx1 | NM_008814 | Вперед 5'-GAATTCCTTCTCCAGCTCCA-3' | 133 bp | ||
| Обратный 5'-GATGAAATCCACCAAAGCTCA-3' | |||||
| Sox9 | NM_011448 | Вперед 5'-TCCACGAAGGGTCTCTTCTC-3' | 107 bp | ||
| Обратный 5'-AGGAAGCTGGCAGACCAGTA-3' | |||||
| Ck19 | NM_008471 | Вперед 5'-TCTGAAGTCATCTGCAGCCA-3' | 133 bp | ||
| Обратный 5'-ACCCTCCCGAGATTACAACC-3' | |||||
| Aqp1 | NM_007472 | Вперед 5'-CAGTACCAGCTGCAGAGTGC-3' | 112 bp | ||
| Обратный 5'-CATCACCTCCTCCCTAGTCG-3' | |||||
Таблица 1: грунтовки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Эта работа описывает поколение 3-мерной модели мыши EHBD cholangiocytes organotypic. Важные шаги в EHBDO культуры поколения включают в себя тщательное EHBD рассечение во избежание заражения клеток поджелудочной железы, поддержание стерильных условий для предотвращения бактериального и грибкового заражения и тщательной обработки после центрифугирования, чтобы избежать Потеря клеточного материала. Требуется закрыть соблюдение описанных температурных условий. Существуют некоторые ограничения на метод. EHBDs взрослых мышей небольшие (около 1 мм в диаметре; Рисунок 1E), которые требуют утонченность для изоляции. Микроскопом диссекции может использоваться для оказания помощи с рассечение.
Матрица подвал, используемые в настоящем Протоколе является биологическим матрицу, содержащую известные и неизвестные факторы роста19, концентрация которого может варьироваться от много много. Мы рекомендуем, что для технического реплицирует, же много и/или Алиготе подвале матрицы во избежание использовать изменчивости. Мы также рекомендуем регулярно культуры клеток L-WRN загрязнение микоплазмы и кондиционером среду для WNT деятельности11. Лаборатории для данного исследования использовались, соответственно, микоплазмы обнаружения комплект и WNT деятельности пробирного. В частности EHBDOs носитель содержит низкое количество плода бычьим сывороточным (0,5%; Таблица материалов).
Представленные протокол описывает 3-мерной эпителиальных клеток культуры, содержащие клетки с прародителем и дифференцированных клеток маркеры, характерные для cholangiocytes и сформированных в присутствии WNT3a, R-spondin1 и льют факторы роста и определены добавки (Таблица материалов). Это органоспецифическая, поскольку он является производным от взрослой мыши EHBDs. Скорее всего, он является производным от взрослых клеток со свойствами стволовых клеток, подтверждается самоорганизации клеток в 3-мерной структуры и способности поддерживать и расширять долгосрочные. Organoids основном кистозных в структуре с минимальными «бутонизации,», которая могла бы указывать более стволовых клеток как органоид фенотип. Вполне возможно, что дополнительные стволовых клеток нишу факторов может привести к более высокой эффективности покрытия organoids, а также более высокой степенью дифференциации.
Наша техника производит 3-мерной органоид культуры, которые могут быть сгенерированы в времени и экономически эффективным образом, что сводит к минимуму использование животных, высокую воспроизводимость и допускает несколько нисходящие приложения. Этот новый инструмент имеет важное значение для EHBD исследований, поскольку инструменты для изучения взрослых EHBDs весьма ограничены. Было бы специальных пособий для лабораторий, которые не имеют доступа к ткани человека или хотят воспользоваться генетически модифицированные мыши моделей.
Ткани мыши, в отличие от тканей человека, является весьма доступным. Существует несколько реагентов, включая иммуногистохимия антитела изучать мыши тканей. Стоимость реагентов для культуры ткани взрослых organoids значительно уменьшилось, поскольку этот метод был первоначально представлен. Кроме того новые материалы стали доступны, в том числе среднего кондиционером клеток L-предупреждение, используемые в настоящем Протоколе, который еще больше снижает стоимость органоид культуры. EHBDOs легко распространять, хранить и процесс для анализа. Иммуногистохимическая, микроскопические и qRT ПЦР анализа представлены в качестве примеров в этой рукописи. Кроме того наша группа недавно описал, генерации и использования EHBDOs от генетически мышей и количественный пролиферации EHBDO клеток, используя 5-ethynyl-2´ дезоксиуридина (EdU)16.
Потенциальные нисходящие приложения EHBDOs включают, но не ограничиваются культивирования почти неограниченное количество cholangiocytes изучить механизмы гомеостаза cholangiocyte EHBD. В будущем этот протокол может быть применен к изучению болезней государств; чтобы проверить organoids cholangiocyte, включая анализ регенеративной медицины (intrabiliary имплантация), генетические и фармакологические манипуляции, наркотиков испытания16; и изучение воздействия инфекционных агентов12,20. Ячейке взаимодействия могут быть изучены с помощью совместного культуры EHBD organoids с другие типы клеток21.
Мышь производные organoids может быть использовано для экспериментальных исследований до создания человеческого EHBDOs, поскольку человеческий материал ценный и ограниченный. Будущие исследования фокусировались на обнаружение факторов, способствующих повышению эффективности покрытия и дифференцировки клеток органоид желательны для изучения человеческого organoids. Текущие исследования, которые ищут более биологически нейтральной внеклеточного матрикса органоид культуры, также имеют отношение к EHBDOs культуре уточнения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они имеют не конкурирующие интересы.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана американской ассоциации исследование печени заболевания Pinnacle премии (чтобы н.р.) и национальных институтов здравоохранения, национального института диабета и пищеварения и заболевания почек (награды Р30 DK34933 н.р., P01 DK062041 до J.L.M.). Мы благодарим д -р Рамон Ocadiz-Руис (Мичиганский университет) за его помощь в разработке этой методологии.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-WRN cell culture medium | |||
| Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634-010 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | 1% | Life Technologies | 10437-028 |
| Penicillin-Streptomycin | 100 U/mL | Life Technologies | 15140-122 |
| Washing buffer | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | 50 mL | Life Technologies | 10010-023 |
| Penicillin-Streptomycin | 125 U/mL | Life Technologies | 15140-122 |
| Amphotericin B | 6.25 µg/mL | Life Technologies | 15290-018 |
| Organoid culture medium | |||
| L-WRN Conditioned medium | 1:1 | ATCC | CRL-3276 |
| Advanced DMEM/F12 | 1:1 | Life Technologies | 12634-010 |
| Penicillin-Streptomycin | 100 U/mL | Life Technologies | 15140-122 |
| N-Glutamine | 10 µl/mL | Life Technologies | 35050-061 |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid, HEPES | 10 mM | Life Technologies | 15630-080 |
| B27 | 10 µl/mL | Gibco | 17504-044 |
| N2 | 10 µl/mL | Gibco | 17502-048 |
| Organoid seeding medium | |||
| Organoid culture medium | |||
| Epidermal growth factor (EGF) | 50 ng/mL | Invitrogen | PMG8041 |
| Fibroblast growth factor-10 (FGF10) | 100 ng/mL | PeproTech | 100-26 |
| Primary antibodies | |||
| Anti-Cytokeratin 19 (CK19) antibody, Rabbit | 1:250 | Abcam | ab53119 |
| Sex-Determining Region Y-Box 9 (SOX9) antibody, Rabbit | 1:200 | Santa Cruz | sc-20095 |
| Pancreatic Duodenal Homeobox 1 (PDX1) antibody, Rabbit | 1:2000 | DSRB | F109-D12 |
| E-cadherin antibody, Goat | 1:500 | Santa Cruz | sc-31020 |
| Acetylated α-tubulin antibody, Mouse | 1:500 | Sigma-Aldrich | T6793 |
| Secondary antibodies | |||
| 488 labeled anti-rabbit, Donkey IgG | 1:1000 | Invitrogen | A-21206 |
| 594 labeled anti-goat, Donkey IgG | 1:1000 | Invitrogen | A-11058 |
| 568 labeled anti-mouse, Goat IgG2b | 1:500 | Invitrogen | A-21144 |
| TopFlash Wnt reporter assay | |||
| TopFlash HEK293 cell line | ATCC | CRL-1573 | |
| Luciferase Assay Kit | Biotium | 30003-2 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| 0.4% Trypan Blue Solution | Life Technologies | 15250061 | |
| Additional materials and reagents | |||
| Basement matrix, phenol free Matrigel | CORNING | 356237 | |
| Dissociation buffer, Accutase | Gibco | A1110501 | |
| Cell culture freezing medium, Recovery | Life Technologies | 12648010 | |
| Cell strainer (70 µm, steriled) | Fisherbrand | 22363548 | |
| Guanidinium thiocyanate-phenol RNA extraction, TRIzol | Invitrogen | 15596026 | |
| Specimen processing gel, HistoGel | Thermo Fisher Scientific | HG-4000-012 | |
| Universal mycoplasma detection kit | ATCC | 30-1012K | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Fisherbrand | 05-408-129 | |
| 24 well plate | USA Scientific | CC7682-7524 | |
| 50 mL conical centrifuge tube | Fisher scientific | 14-432-22 | |
| Fluorescence microscope | Nikon | Eclipse E800 | |
| Inverted microscope | Biotium | 30003-2 | |
| Necropsy tray | Fisherbrand | 13-814-61 |
References
- Lazaridis, K. N., LaRusso, N. F.
- Carpino, G., et al. Stem/Progenitor Cell Niches Involved in Hepatic and Biliary Regeneration. Stem Cells International. 2016, 3658013 (2016).
- DiPaola, F., et al. Identification of intramural epithelial networks linked to peribiliary glands that express progenitor cell markers and proliferate after injury in mice. Hepatology. 58 (4), 1486-1496 (2013).
- Venter, J., et al. Development and functional characterization of extrahepatic cholangiocyte lines from normal rats. Digestive And Liver Disease. 47 (11), 964-972 (2015).
- Glaser, S. S., et al. Morphological and functional heterogeneity of the mouse intrahepatic biliary epithelium. Laboratry Investigation. 89 (4), 456-469 (2009).
- Cardinale, V., et al. Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes, cholangiocytes, and pancreatic islets. Hepatology. 54 (6), 2159-2172 (2011).
- De Assuncao, T. M., et al. Development and characterization of human-induced pluripotent stem cell-derived cholangiocytes. Laboratry Investigation. 95 (6), 684-696 (2015).
- Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).
- Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
- Kruitwagen, H. S., et al. Long-Term Adult Feline Liver Organoid Cultures for Disease Modeling of Hepatic Steatosis. Stem Cell Reports. 8 (4), 822-830 (2017).
- Spence, J. R. Taming the Wild West of Organoids, Enteroids, and Mini-Guts. Cellular And Molecular Gastroenterology And Hepatology. 5 (2), 159-160 (2018).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems. Trends In Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
- Sampaziotis, F.
- Sampaziotis, F., et al. Reconstruction of the mouse extrahepatic biliary tree using primary human extrahepatic cholangiocyte organoids. Nature Medicine. 23 (8), 954-963 (2017).
- Nakagawa, H., et al. Biliary epithelial injury-induced regenerative response by IL-33 promotes cholangiocarcinogenesis from peribiliary glands. Proceedings Of The Natural Academy Of Science Of The United States Of America. 114 (19), E3806-E3815 (2017).
- Razumilava, N. Hedgehog signaling modulates IL-33-dependent extrahepatic bile duct cell proliferation in mice. Hepatology Communications. , (2018).
- Boyer, J. L.
- Carpino, G., et al. Biliary tree stem/progenitor cells in glands of extrahepatic and intraheptic bile ducts: an anatomical in situ study yielding evidence of maturational lineages. Journal Of Anatomy. 220 (2), 186-199 (2012).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Williamson, I. A., et al. A High-Throughput Organoid Microinjection Platform to Study Gastrointestinal Microbiota and Luminal Physiology. Cellular And Molecular Gastroenterology And Hepatology. 6 (3), 301-319 (2018).
- Wan, A. C. A. Recapitulating Cell-Cell Interactions for Organoid Construction - Are Biomaterials Dispensable? Trends In Biotechnology. 34 (9), 711-721 (2016).
