Summary
移植された浸透性ポンプを介したイソプロテレノールの慢性投与は、マウスの高度な心不全を模倣するために広く使用されている。ここでは、3週間にわたる連続イソプロテレノール投与に対する外科的ミニポンプ移植の詳細な方法と、モデル作成に成功するための心エコー評価について説明する。
Abstract
イソプロテレノール(ISO)は、非選択的βアドレナリン作動性アゴニストであり、マウスにおける心臓損傷を誘導するために広く使用されている。急性モデルはストレス誘発性心筋症を模倣するが、浸透性ポンプを介して投与される慢性モデルは、ヒトにおける高度な心不全を模倣する。記載されたプロトコルの目的は、移植されたミニポンプを使用してマウスにおける慢性ISO誘発心不全モデルを作成することである。このプロトコルは、100株以上のヒトマウスの心不全を誘導するために使用されている。外科ポンプ移植に関する技術は詳細に説明され、マウスで心不全モデルを作成することに興味がある人に関連する可能性があります。さらに、各株の心エコーパラメータに基づく毎週の心臓リモデリングの変化と、モデル開発までの予想時間を紹介します。要約すると、この方法はシンプルで再現可能です。3〜4週間にわたって埋め込まれたミニポンプを介して投与される連続ISOは、心臓のリモデリングを誘発するのに十分である。最後に、ISOモデル作成の成功は、肥大、心室拡張、および機能不全を示す連続心エコー検査によって生体内で評価されうる。
Introduction
排出率の低下した心不全(HFrEF)は、心血管恒常性1を維持するために交感神経系の十分に認識された代償応答を伴う。血行力学的ストレスと心臓および循環に対する有害な影響は、慢性的な活性化で観察された。これらは、心不全に対する現代の薬物療法の基礎となり、心不全の進行および神経ホルモン系1の治療的拮抗作用における重要なメカニズムである。
心不全の基本的な調査のためにいくつかのマウスモデルが利用できる。遺伝モデルは、分子療法を探索し、シグナル伝達経路を調べると魅力的です。しかし、これらのモデルは、心不全の一般的な形態に関連しない場合があります。他の一般的なモデルは、左前降下(LAD)動脈結血、経動脈収縮(TAC)、およびイソプロテノール(ISO)を含み、それぞれが異なる病理学的病因2、3、4、5を目指す 、6.LAD動脈ライゲーションは、このように虚血性心筋症に特有のモデルを作成する前壁心筋梗塞を誘発する。TACは急性圧力過負荷を誘発し、心不全の高血圧モデルを作成する。圧力勾配は測定できるが、肥大の層化を可能にするが、高血圧の急性発症は直接的な臨床的関連性4を欠いている。LADおよびTACモデルは両方の実行するために高レベルの外科的専門知識を要求する。心不全の急性ISOモデルは、急性心筋梗塞を模倣する左心室におけるカテコールアミンおよび活性の著しい増加を特徴とする、ストレス誘発性心筋症(タコツボ病とも呼ばれる)を模倣する7、 8.対照的に、心不全の慢性ISOモデルは、高度な心不全の症状特性を示し、カテコールアミン1の慢性的に上昇したレベルを持つ。慢性ISOモデルの利点は、高度な心不全を模倣する慢性アドレナリン刺激を提供し、比較的容易に作成することです。研究者は、関心のある病理を最もよく要約するモデルを選択する必要があります。
この方法の全体的な目標は、心不全患者1で見つかった慢性交感神経活性化を模倣するためにISOを連続的に放出する移植されたミニポンプを使用してマウスの心不全を誘導することです。この方法はシンプルで再現性があります。マウス株間には明らかなばらつきがあるが、30mg/kg/日で3~4週間にわたって投与されたISOは、ほとんどのマウスで心臓リモデリングを誘導するのに十分である。具体的には、ISOは第1週の間に肥大型補償期を導き、その後、壁の間引き、心室拡張および収縮期機能の第2週および第3週2による減少を引き起こす。ISOモデル作成の成功は、肥大、拡張、心室機能不全を示す連続心エコー検査、ならびに心膜内採取心臓組織の組織学的および分子的評価を介して生体内で評価することができる。脂質蓄積、線維症、ERストレス、アポトーシス、および遺伝子発現9、10、11、12.
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Protocol
このプロトコルは、カリフォルニア大学ロサンゼルス校の動物ケアガイドライン(ARCプロトコル#2010-075)に準拠しています。読者は、手順のマウスケアと鎮鎮薬管理は機関固有である可能性があるため、独自のIACUC承認プロトコルに従うことをお勧めします。
1. イソプロテレノール浸透圧ポンプの調製
注:この手順は、100以上の交配マウス株から18+gの重量を量る9+週齢の雌マウス、ならびに株のサブセットの雄マウスに正常に適用されました。この手順には、体重の上限はありません。治療の年齢が心不全発症に対するイソプロテノール誘発感受性に影響を与えるかどうかは不明であるとして、常に年齢に一致するコントロールを含む。
- 各マウスの体重を計量し、記録します。
- 各マウスのイソプロテレノールの適切な量と濃度を計算します (表 1を参照してください。;補足ファイル)。
注:この実験で使用される浸透圧ポンプ(材料の表)は100 μLの貯留体積を持ち、28日間の連続的な流量で薬物を提供するように設計されている。ポンプのローディング中に充填チューブの体積損失を考慮するために、ポンプあたりのイソプロテレノール溶液の余分な20 μLを準備します。 - 分析バランスを用いて適量のイソプロテレノール(表1)を計量し、無菌0.9%NaCl溶液の120μLに溶解させる。ピペットは、イソプロテレノールを完全に可溶化するために1分間、激しくまたは渦を作る。
注:実験室のバイオセーフティキャビネットに浸透圧ポンプを準備します。ポンプは外科手袋で扱われるべきである。滅菌技術は浸透圧ポンプの調製および外科的注入プロシージャの間に推薦される。 - 空の浸透ポンプをフローモデレータと一緒に計量して記録し、フローモデレータを取り外します。
- 1.0 mLシリンジにイソプロテレノール溶液の120 μLを吸引し、浸透圧ポンプで提供される27ゲージの鈍い先端充填管を取り付けます。
注:注射器と充填チューブに気泡がないことを確認してください。 - ポンプを直立した位置に保持しながら、充填管の先端がポンプ貯蔵所の底部付近に座るまで、上部のポンプ開口部を通して充填管を挿入します。
- イソプロテレノール溶液がポンプ開口部まで満たされるまで、シリンジプランジャーをゆっくりと押して浸透ポンプをロードします。
- 充填チューブを慎重に取り外し、余分な溶液を拭き取ります。
- フローモデレータを挿入してポンプを閉じ、余分な溶液を拭き取ります。
- 浸透ポンプを再計量して、貯水池の体積の90%以上が充填されたことを確認します。
注:制御ポンプは無菌0.9%NaCl溶液でポンプ貯蔵所を満たすことによって同じ方法で調製される。
2. 手術器具の準備
- 光ファイバーOリング光顕微鏡照明器、2つの鉗子、針ホルダー、ホットビーズ滅菌器、ガラスビーズ、およびはさみを含むすべての外科器具をきれいにする(材料の表)。
- 手術前に器具を殺菌するために30分間121°Cのオートクレーブ手術器具。
3. イソプロテノール浸透圧ポンプ外科移植
- 95%O2および5%のCO2で3%のイソファルランを持つ誘導室にマウスを置くことによって麻酔を誘発する。2%のイソファルランで麻酔を維持します。
- 鎮鎮鎮鎮鎮薬のために肩甲骨の間の首の擦り傷に5 mg/kgのカルプロフェンs.c.を投与する。
- 角膜脱水を防ぐために眼の目に眼のチントを置きます。
- 呼吸数、つま先ピンチ反射、粘膜の色をモニタリングして麻酔の深さを確認します。
- 加熱されたパッドの上にマウスを置きます。下腹部から毛髪を取り除き、ベタジンまたはクロルヘキシジンで皮膚を消毒する。
注:術後の感染を最小限に抑えるには、外科用フィールドにインシデントヘアがないことを確認してください。 - 外科用はさみを使用して、長さ1cmの中線皮膚切開を切り取ります。鈍い終わりのはさみを使用して、下の腹膜壁から皮膚を慎重に解剖します。
注:ポンプのサイズを収容するために、経皮内送達が好ましい。 - 鉗子で下の腸から下腸壁を引き離し、細かい外科はさみを使用して根間壁に0.8センチメートルの穴を切ります。
- 浸透圧ポンプをフローモデレータの端部で下垂部器内腔に挿入します。
- 中断された方法で5.0吸収性縫合糸を使用して、口内壁のホールドを閉じます。6.0非吸収性縫合糸を使用して、皮膚切開を中断した方法で閉じます。
- マウスを専用のインキュベーターに入れ、回復時に温めて乾燥させます。正常な呼吸および動きの復帰のために最初の2時間で30分ごとにマウスを監視することによって麻酔からの回復を評価する。
- マウスが麻酔から完全に回復したら、それを日常的なハウジングに戻します。毎日3日まで合併症の動物を監視し続け、その後2~3日ごとに実験が終わるまで続ける。
注:動物は、術後の痛みや感染症、体重減少の兆候、運動能力の欠如、異常な姿勢、新郎の失敗、切開部の過度の舐めまたは噛み付きの証拠を監視する必要があります。 - 必要に応じて、24時間ごとに24時間ごとに5mg/kg s.c.を48時間まで投与し、その後投与する。
- 外科部位感染を防ぐために、飲料水中に0.25 mg/mLアモキシシリンを5日間投与する。
- 7~10日後に吸吸収性の縫合糸を取り除きます。
4. 麻酔下の心エコー評価
注:心エコー評価は、数週間にわたって連続的な心臓リモデリングを監視するために繰り返し行うことができます。3週間にわたって毎週の間隔で心エコー測定を行いました。
- イソファルランの1.25%から1.5%で誘導室で麻酔を誘発する。適切に鎮静したら、マウスをテープで心エコー検査プラットフォームに固定し、マウスが鼻コーンを通して麻酔を受け続けられるようにします。
- 過剰老化の負のクロノートロピックおよびイノートロピック効果を最小限に抑えるために、1%の維持投与量にイソファランを減少させる。研究全体を通して呼吸と心拍数に注意し、必要に応じてイソフラン投与量を調整します。.
- 脱毛ローションで胸毛を取り除き、毛のない胸を拭きます。
- 胸に超音波ゲルを配置し、心臓を画像化する超音波プローブを配置します。
- B モードでは、パラスタール長軸ビューで左心室 (LV) をイメージします。心エコー検査プラットフォームを調整して、超音波ビームの平面に大動脈弁とLV頂点を合わせます。
- 心エコー検査プラットフォームを傾けて、LV長軸を超音波ビームに90度、LV最大径を画像の中心に配置します。
- 超音波プローブを90度回してLV短軸を画像化します。
- Mモードでは、LV壁の厚さと内部寸法を測定します。
- マウスをケージに戻します。正常な呼吸および自発的な身体の動きの復帰のためのモニター。
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Representative Results
我々の以前に発表された研究では、我々は105ハイブリッドマウスダイバーシティパネル(HMDP)株2、13を横切る浸透圧ポンプを介して21日間にわたって30 mg/kg/dのISO投与量を投与した。ISO治療のベースライン、第1週、第2週、第3週で行われた心エコー検査を用いて結果を評価した(図1)。著者が23匹のマウス株14の間でイソプロテレノールの影響を研究した以前の研究と同様に、心エコーパラメータ間の顕著な間ひずみ変動を観察した。心エコーパラメータに基づく毎週の変化の概要とモデル開発までの予想時間の概要 (図 2および図 3)2,15.マウス株間で変動が観察されたが、平均して、エンド・ジアストリー(IVSd)および分画短縮(FS)における心室中隔壁の厚さは最初の週に増加するが、後の時点で減少する。末端の心室内径(LVIDd)と左心室質量(LVM)は3週間にわたって増加する(図3)。これらの知見は、イソプロテレノールの第1週の間に、壁の間引き、心室拡張および収縮機能の減少に続く肥大性代償相と一致する。我々の以前に発表された研究はまた、線維性マーカーLgals3および心不全マーカーNppbを含む左心室肥大に関連するいくつかの遺伝子サブセットのアップレギュレーションを第3週2までに実証した。他の差別的に調節された遺伝子には、血管新生に関与するもの、分泌シグナルグ糖タンパク質、多糖結合結合、アクチンサイトスケルトン、ケモカインシグナル伝達経路、タンパク質性細胞外マトリックス、およびコラーゲン2が含まれる。これらの結果は、心エコー学と組織学的所見によって裏付けられます:マウスの心臓は、ISOの下で目に見えて大きな左心室の寸法を実証し、生理食道制御に対するISO治療下でより多くの線維症を示しました(図4)。
図1:ミニポンプによる慢性イソプロテレノール(ISO)-誘発性心不全モデル
この図は、Wang et al.2および Chang et al.15の許可を受けて調整されています。
図2:ハイブリッドマウスダイバーシティパネル(HMDP)マウス株における心臓構造と機能の心エコー測定の変動
黒いバーは、ベースライン条件下の測定値をランク付けされた順序で表します。白い棒は連続的なISO注入の3週間後の測定値を表す。IVSd = 心室中隔壁の厚さ;LVIDd = 末端拡張期の左心室内径;LVM = 左心室質量;FS = 小数短。誤差余数は、平均値 (SEM) の標準誤差を表します。この図は、Wang et al.2および Chang et al.15の許可を受けて調整されています。
図3:各古典的な生まれつき株の各ISO時点におけるベースラインと比較した心エコー測定の平均変化。
この図は、Wang et al.2および Chang et al.15の許可を受けて調整されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:慢性イソプロテレノール注入後の心エコー学および細胞学的変化
(A)イソプロテレノールのベースラインおよび第3週における2匹のマウスからの代表的なMモード心エコー図画像が示されている。両方のマウスにおける左心室内寸法の拡大とマウス#2における心内線維症(赤い矢印)の発症に注意する。(B)短軸の左心室のマッソンのトリクロム染色は、イソプロテレノール処理(スケールバー:2mm)による広範な線維化を示す。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 体重 (g) | 毎日の投与量 (μg/日) | 流量(μL/日) | 濃度(μL/日) | イソプロテレノール (mg/120 μl) |
| 20 | 600 | 2.64 | 227 | 27.3 |
| 21 | 630 | 2.64 | 239 | 28.6 |
| 22 | 660 | 2.64 | 250 | 30 |
| 23 | 690 | 2.64 | 261 | 31.4 |
| 24 | 720 | 2.64 | 273 | 32.7 |
| 25 | 750 | 2.64 | 284 | 34.1 |
| 26 | 780 | 2.64 | 295 | 35.4 |
| 27 | 810 | 2.64 | 307 | 36.8 |
| 28 | 840 | 2.64 | 318 | 38.2 |
| 29 | 870 | 2.64 | 330 | 39.5 |
| 30 | 900 | 2.64 | 341 | 40.9 |
表1:イソプロテレノール濃度および30mg/kg/dの浸透圧率での代表的な体重の準備。このテーブルは、Wang et al.2および Chang et al.15の許可を受けて調整されています。
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Discussion
我々は、慢性βアドレナリン刺激2、13に起因する心臓の結果を評価するために、100以上のヒトマウスの100以上の株にこの方法を適用しました。イソプロテレノールに対する感受性の有意な差は、マウス株の間に存在することが知られており、必要に応じて関心の株にカスタマイズされてもよい16。これは、マウス株17間のβアドレナリン受容体機能の変動、自律神経系活性16における株依存性の相違、β-アドレナリン受容体(β-AR)密度および/または結合17に起因する可能性がある。株間の他の遺伝的違い。生体内の連続心エコー検査と、ISOの有無にかかわらず、細胞プロセス、細胞外マトリックスから炎症に至る慢性イソプロテレノール治療は顕著な違いを誘発した。応答2,13.以下の考慮事項は、この心不全モデルの適用に関連する可能性があります。
イソプロテレノール浸透圧を移植したマウスの30%近くが実験プロトコル2、13の終了前に死亡した。このうち、ポンプ移植後48時間以内に90%以上が死亡した。死亡者数は、BXA-12/PgnJ、BXD-34/TyJ、BTBRT<+>tf/J、NZW/LacJ、BXD40/TyJ、BALB/cJが最も影響を受けやすい株である。さらに、体重<20gのマウスは、術後の早期死亡率(48時間以内の死亡)が高いことを観察した。マウスが少なくとも9~10週齢または>20gまで成熟することを可能にすることは、術後の早期死亡率を最小限に抑える可能性がある。したがって、実験を計画する際には、ひずみ特異的な違いと早期の術後死亡率を考慮することが重要な場合があります。死因を調べる解剖は行わなかった。したがって、浸透圧ポンプの故障率を判断することはできません。犠牲になったマウスのうち、視覚欠陥は検出されなかった。
イソファランは陰性クロトロピックおよびイノートロピックであることが知られている。心エコー測定に対するイソフランの座り込みと影響を最小限に抑えるために注意が必要です。胸骨が骨の影を落とし、画像の質を低下させる場合は、マウスの位置を変更して、異なる肋間空間を通して心臓をイメージします。右心室壁の存在によって心室壁間の厚さの測定が複雑な場合は、異なる肋間空間を通して再画像化し、十分に描かれなかった境界線を最小限に抑えます。正確な測定は、下流の比較分析に不可欠です。
ラット18、19における浸透性ミニポンプの使用を文書化した文献が存在する。読者は、このプロトコルはマウスでのみ使用されており、他の文献は他の種との実験のために参照されるべきであることに注意する必要があります。
過去の文献は、イソプロテレノールの毎日の注射と浸透性ポンプを介した連続投与が体重20に対して同様の心室重量を引き起こすことを示唆している。しかし、ヘモダイナミクスには違いがあります。毎日の注射は、即時の低血圧と頻脈を引き起こし、数時間以内にリバウンド高血圧が続きます。連続投与は、ポンプ移植の日に即時低血圧を引き起こし、続いて2日目20日までに軽度の高血圧に血圧を正常化する。全体的なヘモダイナミクスの傾向は、心不全患者の慢性的に活性化された交感神経ホルモンをより密接に模倣する。
イソプロテレノールの第1週目では、収縮性が増加または超常現象であった。第2週と第3週までに、収縮性はほとんどの株で正常に戻り、いくつかの株のために減少しました。進行中のイソプロテレノールの背景には、分数短縮(FS)および吐出分率(EF)によって測定される正常な収縮性は、実際には、収縮準備金の損なわれた状態を表してもよい。研究者がより深い程度の心臓障害を誘発することを望むなら、ISO投与量を増加させたり、ISO治療期間を4週間に延長したり、術後死亡率の増加のリスクを計量する。最後に、我々が提示したデータは、雌マウスのみに基づいていました。雌マウスは、雄マウス21と比較して虚血再灌流傷害モデルにおいて、虚血後収縮機能が高く、ATP欠損が小さいことを実証した。さらに、慢性ISOモデルでは、雄マウスは、女性22と比較して、心から体重比に上昇し、耳下腺および下顎腺の全ノルエピネフリンレベルを減少させた。ユーザーは、女性と男性にこのアプローチを適用する際に観察された結果の性別ベースの違いを考慮する必要があります。.
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
著者らは、資金援助のためのNIH K08 HL133491を認めます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro-Osmotic Pump System with Flow Moderator in Place | Alzet | Model 1004 | Includes filling tube, flow moderator and pump body |
| (-)-Isoproterenol hydrochloride | Sigma-Aldrich | 16504-1G | (-)-Isoproterenol hydrochloride is a powder that needs to be stored at -20°C. |
| 1 ml sterile syringe | VWR | BD309602 | |
| 30 W LED Fiber optic O-ring light microscope illuminator | AmScope | SKU: LED-30WR | |
| 5-0 COATED VICRYL (polyglactin 910) Suture | Ethicon | J303H | 5-0, absorbable |
| Fine Scissors - Sharp | FST | 14060-09 | |
| Glass beads | FST | 18000-46 | |
| Hot bead sterilizers | FST | 18000-50 | |
| Iris forceps | WPI | 15915 | |
| Look Sharpoint 6-0, 18" Black Nylon Monofilament Suture | LOOK | AA-2176 | 6-0, non-absorbable |
| Needle holder | WPI | 15926 | |
| Normal Saline, 0.9% NaCl | Fisher | 89167-772 |
References
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