Summary
通过植入的渗透泵长期给用异丙酮醇，已被广泛用于模拟小鼠的晚期心力衰竭。在这里，我们描述了手术微型泵植入在持续异丙酮醇给3周内的详细方法，以及成功创建模型的超声心动图评估。
Abstract
Isoproterenol（ISO）是一种非选择性β-肾上腺素激动剂，广泛用于诱导小鼠心脏损伤。虽然急性模型模仿压力引起的心肌病，而通过渗透泵施用的慢性模型模仿人类晚期心力衰竭。所述协议的目的是使用植入的微型泵在小鼠中创建慢性ISO引起的心力衰竭模型。该协议已用于诱导100+系近亲繁殖小鼠的心力衰竭。手术泵植入技术被详细描述，可能与任何有兴趣在小鼠中创建心力衰竭模型的人相关。此外，还介绍了基于每个菌株的超声心动图参数和模型开发的预期时间，每周心脏重塑变化。总之，该方法简单易用。通过植入式微型泵在3至4周内连续施用ISO，足以诱导心脏重塑。最后，通过连续超声心动图显示肥大、心室扩张和功能障碍，可以评估ISO模型创建的成功。
Introduction
心力衰竭与减少弹出分数（HFrEF）伴随着一个公认的补偿反应的同情神经系统，以保持心血管平衡1。慢性活化观察到血液动力学压力和对心脏和循环的有害影响。这些已成为当代心力衰竭药物治疗的基石，是心力衰竭和神经激素系统治疗对抗发展的重要机制1。
有几个小鼠模型可用于心脏衰竭的基本调查。基因模型对探索分子疗法和研究信号通路很有吸引力。然而，这些模型可能与常见的心力衰竭形式无关。其他常见模型包括左前下降 （LAD） 动脉结扎、 横端收缩 （TAC） 和异丙酮醇 （ISO），每个模型针对不同的病理病因2、3、4、5 ，6.LAD动脉结扎诱导前壁心肌梗死，从而创建缺血性心肌病的专用模型。TAC诱导急性压力过载，形成心力衰竭的高血压模型。虽然可以测量压力梯度，允许肥大的分层，但高血压的急性发病缺乏直接的临床相关性4。LAD 和 TAC 型号都需要高水平的外科专业知识才能执行。急性ISO心力衰竭模型模仿应激引起的心肌病，也称为Takotsubo病，其特征是卡他索明的明显增加和左心室的活性，模仿急性心肌梗死7， 8.相比之下，慢性ISO型心力衰竭模型存在晚期心力衰竭的症状特征，慢性高浓度的儿茶酚胺1。慢性 ISO 模型的优点是，它提供模仿晚期心力衰竭的慢性肾上腺素刺激，并且相对容易产生。研究者应该选择一个模型，最好地概括他们感兴趣的病理学。
这种方法的总体目标是诱导小鼠的心力衰竭，使用植入的微型泵，释放 ISO 持续模仿慢感活化发现心力衰竭患者 1 。该方法简单易用。虽然小鼠菌株之间有明显差异，但以30毫克/千克/天在30mg/kg/天下施用3至4周的ISO足以诱导大多数小鼠进行心脏重塑。具体来说，ISO在第1周导致亲肥大补偿阶段，随后在第2周和第32周出现壁变薄、心室扩张和收缩功能下降。ISO模型创建的成功可以通过连续的超声心动图在体内评估，证明肥大、扩张和心室功能障碍，以及通过组织学和分子评估采集的心脏组织进行肌萎缩性功能评估。脂质积累，纤维化，ER压力，凋亡，和基因表达9，10，11，12。
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Protocol
该协议符合加州大学洛杉矶分校的动物护理指南（ARC 协议#2010-075）。建议读者遵守自己的IACUC批准的协议，因为近程序小鼠护理和麻醉管理可能是特定于机构的。
1. 制备异丙酮醇渗透泵
注：此程序已成功应用于9周以上雌性小鼠，体重超过18克，来自100多个近亲繁殖小鼠菌株，以及一个菌株子集的雄性小鼠。此过程没有最大重量限制。始终包括年龄匹配的对照，因为治疗年龄是否影响异丙酮醇对心力衰竭发展的易感性是未知的。
- 称量并记录每只鼠标的体重。
- 计算每只小鼠的异丙酮醇的适当量和浓度（见表1 ;补充文件）。
注：本实验中使用的渗透泵（材料表）的储液罐体积为100 μL，旨在以连续流速输送药物长达28天。为每个泵准备额外的 20 μL 异丙醇溶液，以考虑泵加载期间灌装管的体积损失。 - 使用分析平衡量称出适量的异丙酮醇（表1），并将其溶解在120μL无菌0.9%NaCl溶液中。大力移液或涡旋1分钟，完全溶解异丙酮醇。
注：在实验室生物安全柜中准备渗透泵。泵应用手术手套处理。在整个渗透泵的制备和手术植入过程中，推荐使用无菌技术。 - 称重并记录空渗透泵及其流量调节器，然后拆量调节器。
- 将 120 μL 异丙酮醇溶液吸入 1.0 mL 注射器，并连接渗透泵随附的 27 度钝头填充管。
注：确保注射器和灌装管没有气泡。 - 将泵保持直立位置时，通过顶部的泵开口插入加注管，直到加注管的尖端位于泵储液罐底部附近。
- 缓慢地推动注射器柱塞，直到异丙酮醇溶液充满泵开口，从而加载渗透泵。
- 小心地拆下填充管并擦掉多余的溶液。
- 插入回流调节器以关闭泵并擦去任何多余的溶液。
- 通过重新称重渗透泵，确认超过 90% 的储液罐体积已加满。
注：控制泵的制备方式与向泵储液罐中注入无菌 0.9% NaCl 溶液的方式相同。
2. 手术器械的准备
- 清洁所有手术器械，包括光纤 O 型环光显微镜照明灯、2 钳子、针架、热珠消毒器、玻璃珠和剪刀（材料表）。
- 在121°C下进行高压灭菌手术器械30分钟，在手术前对器械进行消毒。
3. 异丙酮醇渗透泵手术植入
- 将小鼠放入诱导室，在 95% O2 和 5% CO2 中放置 3% 的分氟酶，从而诱导麻醉。通过诺塞酮维持麻醉与2%的异常鲁兰。
- 将5毫克/千克的卡罗芬（Carprofen s.c.）施用至肩部刀片之间的颈部擦伤，以治疗性痛风。
- 将眼部膏放在眼睛上，以防止角膜脱水。
- 通过监测呼吸速率、脚趾捏反射和粘膜的颜色来检查麻醉深度。
- 将鼠标放在加热垫上的上等位置。去除下腹部的头发，用贝他丁或氯西丁对皮肤进行消毒。
注：为尽量减少术后感染，请确保手术场没有事故毛发。 - 使用一把手术剪刀切割一个1厘米长的中线皮肤切口。使用一把钝端剪刀仔细解剖底层壁的皮肤。
注： 最好采用腹内输送来容纳泵的大小。 - 用钳子将围肠壁从下肠道拉开，并用精细的手术剪刀在围肠壁上切开一个0.8厘米的洞。
- 先将渗透泵插入带流量调节器端的围层腔中。
- 以中断的方式使用 5.0 可吸收缝合线关闭围网壁中的保持。使用 6.0 不可吸收缝合线以中断的方式关闭皮肤切口。
- 将鼠标放入专用培养箱中，使其在恢复过程中保持温暖和干燥。通过在头两小时内每30分钟监测一次小鼠，以恢复正常的呼吸和运动，评估麻醉的恢复情况。
- 一旦小鼠从麻醉中完全恢复，将其返回到常规外壳。继续每天监测动物的并发症，最多3天，然后每2至3天，直到实验结束。
注：应监测动物术后疼痛或感染、体重减轻迹象、行动不便、姿势异常、无法梳理以及切口区域过度舔或咬。 - 每24小时施用卡罗芬5mg/kg s.c.，长达48小时，此后根据需要。
- 在饮用水中施用0.25毫克/mL阿莫西林5天，以防止手术部位感染。
- 7 至 10 天后去除不可吸收的缝合线。
4. 麻醉下的超声心动图评估
注：可反复进行超声心动图评估，以监测数周内心脏重塑的连续。我们每周进行一次超声心动图测量，为期 3 周。
- 诱导麻醉在诱导室在1.25%至1.5%的异常鲁兰。一旦适当镇静，用胶带将鼠标固定在回声心形图平台上，让小鼠通过鼻锥继续接受麻醉。
- 将异二苯减为维持剂量为1%，以尽量减少过度镇化的负时间性和不热带作用。在整个研究中注意呼吸和心率，并根据需要调整胶质剂量。
- 去除胸毛与脱毛化妆水和擦拭胸部无毛。
- 将超声波凝胶放在胸部，并放置超声波探头以成像心脏。
- 在 B 模式下，在半轴长轴视图中对左心室 （LV） 进行成像。调整超声心动图平台，使超声束平面中的主动脉瓣和 LV 顶点对齐。
- 倾斜超声心动图平台，将 LV 长轴置于 90 度处，将超声波光束和 LV 最大直径置于图像中心。
- 通过转动超声波探头 90 度，对 LV 短轴进行成像。
- 在 M 模式下测量 LV 壁厚和内部尺寸。
- 将鼠标放回笼子。监测正常呼吸和自发身体运动返回。
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Representative Results
在我们之前发表的研究中，我们通过渗透泵在105种混合小鼠多样性面板（HMDP）菌株2、13中施用ISO剂量为30mg/kg/d。我们使用在ISO治疗的基线第1、2和3周进行的超声心动图评估结果（图1）。与先前的研究类似，作者研究了异丙酮醇在23个小鼠菌株14中的影响，我们观察到超声心动图参数之间惊人的菌株间变异。根据超声心动图参数和模型开发的预期时间，提出了每周变化的摘要（图2和图3）2，15。 虽然在小鼠菌株中观察到变化，但平均而言，在端膜（IVSd）和分数缩短（FS）处的间间隔膜厚度在第一周增加，但后期减少;左心室内径在末端直径（LVIDd）和左心室质量（LVM）在3周内增加（图3）。这些发现与异丙酮醇第1周中亲肥大补偿阶段一致，随后是壁变薄、心室扩张和收缩功能下降。我们先前发表的研究也显示，与左心室肥大相关的几个基因子集，包括纤维化标记Lgals3和心力衰竭标记Nppb在第32周上升。其他差异调节的基因包括那些参与血管生成，分泌信号糖蛋白，多糖结合，活性细胞骨架，化学信号通路，蛋白质细胞外基质，和胶原蛋白2。这些结果得到超声心动图和组织学结果的证实：在ISO下，小鼠心脏的左心室尺寸明显较大，ISO治疗下的纤维化量相对于盐碱对照（图4）
图1：慢性异丙酮醇（ISO）-诱发心力衰竭模型通过微型泵。
这个数字已经适应了王等人2和张等人15年请点击这里查看这个数字的较大版本。
图2：混合小鼠多样性小组（HMDP）小鼠菌株中心脏结构和功能超声心动测量的变化。
黑条按排名顺序表示基线条件下的测量值。白条表示连续 3 周 ISO 输注后的测量值。IVSd = 中间的隔膜壁厚;LVIDd = 左心室内径在末端直径;LVM = 左心室质量;FS = 分数缩短。误差条表示等值 （SEM） 的标准误差。这个数字已经根据王等人2和张等人15号的许可进行了修改。
图3：每个经典近亲繁殖菌株的超声心动测量与每个ISO时间点的基线相比的平均变化。
这个数字已经根据王等人2和张等人15号的许可进行了修改。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：慢性异丙酮输注后超心动图和组织学变化。
（A） 显示来自基线和第3周的2只小鼠的代表性M模式超声心动图图像。注意小鼠左心室内尺寸的扩大以及小鼠#2内膜纤维化（红箭）的发展。（B） 马森在短轴左心室的三色染色，通过异丙酮治疗（刻度棒：2毫米）表现出广泛的纤维化。请点击此处查看此图的较大版本。
| 体重（克） | 每日剂量（μg/天） | 流量（μL/天） | 浓度（μL/天） | 异丙酮醇（毫克/120μl） |
| 20 | 600 | 2.64 | 227 | 27.3 |
| 21 | 630 | 2.64 | 239 | 28.6 |
| 22 | 660 | 2.64 | 250 | 30 |
| 23 | 690 | 2.64 | 261 | 31.4 |
| 24 | 720 | 2.64 | 273 | 32.7 |
| 25 | 750 | 2.64 | 284 | 34.1 |
| 26 | 780 | 2.64 | 295 | 35.4 |
| 27 | 810 | 2.64 | 307 | 36.8 |
| 28 | 840 | 2.64 | 318 | 38.2 |
| 29 | 870 | 2.64 | 330 | 39.5 |
| 30 | 900 | 2.64 | 341 | 40.9 |
表1：异丙酮醇浓度和在渗透泵速率为30mg/kg/d的代表性体重的制备。这张桌子已经适应了王等人2和张等人15号的许可。
补充文件。请点击此处下载此文件。
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Discussion
我们已经将这种方法应用于超过100多种近亲小鼠，以评估慢性β-肾上腺素刺激引起的心脏结果2，13。已知在小鼠菌株中存在异丙酮醇的易感性显著差异，可根据所需兴趣菌株进行定制16。这可能是由于小鼠菌株17之间β-肾上腺素受体功能的变化，自主神经系统活性16的菌株依赖性差异，β-肾上腺素受体（β-AR）密度和/或耦合17菌株之间的其他遗传差异。基于体内连续回声心电图以及带 ISO 的外体心脏组织组织和基因表达，慢性异丙酮治疗诱发了从细胞过程、细胞外基质到炎症的惊人差异响应2，13.以下注意事项可能与此心力衰竭模型的应用相关。
近30%的老鼠植入异丙丙醇渗透泵死亡之前，实验协议2，13。其中，超过90%在泵植入后48小时内死亡。死亡似乎带有特异性，BXA-12/PgnJ、BXD-34/TyJ、BTBRT<>tf/J、NZW/LacJ、BXD40/TyJ和BALB/cJ是最易感染的菌株。此外，我们观察到体重<20g的小鼠术后早期死亡率较高（死亡在48小时以内）。允许小鼠成熟至至少9至10周或>20克可降低术后早期死亡率。因此，在计划实验时，考虑菌株特异性差异和术后早期死亡率可能很重要。我们没有进行验尸以确定死因。因此，我们无法确定渗透泵的故障率。在牺牲的老鼠中，我们没有发现视觉缺陷。
异曲兰已知是负性时间不分明的。应注意尽量减少镇定和视点电对超声心动图测量的影响。如果胸骨投射出骨影并降低图像质量，请重新定位鼠标，通过不同的内部空间对心脏进行成像。如果间间壁厚度测量因右心室壁的存在而变得复杂，则通过不同的成本间空间重新成像，以尽量减少划定不良的边框。精确的测量对于下游的比较分析至关重要。
有文献记载了在大鼠18，19中使用渗透微型泵。读者应该注意到，这个协议只用于小鼠，其他文献应该被参考用于其他物种的实验。
过去的文献表明，每天注射异丙酮醇和通过渗透泵持续给给会导致与体重20相似的心室重量。然而，在流体动力学上存在差异。每日注射可立即导致低血压和心动过速，随后在几个小时内出现反弹性高血压。持续给药在泵植入当天立即导致低血压，随后在220日将血压正常化至轻度高血压。整体血液动力学趋势更密切地模仿心力衰竭患者慢性激活的交感激素。
在异丙酮醇第1周，收缩性增加或超常。到第2周和第3周，大多数菌株的收缩能力恢复正常，一些菌株的收缩率下降。在持续异丙酮醇的背景下，通过分数缩短 （FS） 和弹出分数 （EF） 测量的正常收缩性实际上可能代表受损的收缩保留。如果调查员希望引起更深刻的心脏损伤，可能会增加ISO剂量或延长ISO治疗期至4周，同时权衡术后死亡率增加的风险。最后，我们提供的数据仅基于雌性小鼠。与雄性小鼠21相比，雌性小鼠在缺血再灌注损伤模型中表现出较高的缺血后收缩功能和较少的ATP消耗。此外，在慢性ISO模型中，雄性小鼠表现出心脏与体重比升高，与雌性22相比，在单体和亚颌腺中，肾上腺素总水平降低。在将这种方法应用于女性和男性时，用户可能需要考虑观察到的结果中基于性别的差异。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者承认NIH K08 HL133491的资金支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro-Osmotic Pump System with Flow Moderator in Place | Alzet | Model 1004 | Includes filling tube, flow moderator and pump body |
| (-)-Isoproterenol hydrochloride | Sigma-Aldrich | 16504-1G | (-)-Isoproterenol hydrochloride is a powder that needs to be stored at -20°C. |
| 1 ml sterile syringe | VWR | BD309602 | |
| 30 W LED Fiber optic O-ring light microscope illuminator | AmScope | SKU: LED-30WR | |
| 5-0 COATED VICRYL (polyglactin 910) Suture | Ethicon | J303H | 5-0, absorbable |
| Fine Scissors - Sharp | FST | 14060-09 | |
| Glass beads | FST | 18000-46 | |
| Hot bead sterilizers | FST | 18000-50 | |
| Iris forceps | WPI | 15915 | |
| Look Sharpoint 6-0, 18" Black Nylon Monofilament Suture | LOOK | AA-2176 | 6-0, non-absorbable |
| Needle holder | WPI | 15926 | |
| Normal Saline, 0.9% NaCl | Fisher | 89167-772 |
References
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