Summary
Здесь, мышь кровь была собрана в присутствии анти-коагулянт. Тромбоциты были очищены от iohexol градиент среды с использованием низкой скорости центрифугирования. Тромбоциты были активированы с тромбина для расследования, если они были жизнеспособными. Качество очищенных тромбоцитов анализировалось с помощью потока цитометрии и микроскопии.
Abstract
Тромбоциты очищаются от цельной крови для изучения их функциональных свойств, которые должны быть свободны от красных кровяных телец (РБК), лейкоцитов (WBC), и белков плазмы. Мы описываем здесь очищение тромбоцитов от мыши крови, используя три раза больше iohexol градиент среднего относительно объема крови и центрифугирования в размахивая ведро ротора на 400 x g для 20 мин при температуре 20 °c. Восстановление/выход очищенных тромбоцитов было 18.2-38.5%, а очищенные тромбоциты находились в состоянии покоя, которое не содержало сколь-либо значительного количества РБК и WBC. Очищенные тромбоциты, обработанные тромбином, показали до активации 93%, что указывает на их жизнеспособность. Мы подтвердили, что очищенные тромбоциты являются достаточно чистым использованием потока цитометрической и микроскопической оценки. Эти тромбоциты могут использоваться для экспрессии генов, активации, высвобождения гранул, агрегирования и анализа адгезии. Этот метод может быть использован для очистки тромбоцитов из крови других видов, а также.
Introduction
Тромбоциты являются компонентом крови, который функционирует как инициатор свертывания крови в ответ на повреждение в кровеносный сосуд. Они собирают на месте повреждения для того чтобы заткнуть стену сосуда1. Тромбоциты являются ануклеатными фрагментами цитоплазмы, производными от мегакарыцитов костного мозга под действием тромбоноэтин и попадают в тираж2. Они считаются метаболически активными и способными воспринимать внеклеточную среду путем активации внутриклеточных сигнальных каскадов, которые приводят к распространению тромбоцитов, агрегированию и образованию гемостатической вилки1,3. Помимо гемостаза/тромбоза и заживления ран4, тромбоциты играют важную роль в принимающих воспалительных реакций, ангиогенез, и метагатис3,5,6,7, 8.
Тромбоциты очищают от крови для изучения их биохимических и физиологических свойств, которые должны быть свободны от других компонентов крови. Поскольку эритроциты (РБК) и лейкоциты (WBC) содержат значительно больше РНК и белков, чем тромбоциты9,10, наличие даже небольшого количества этих клеток может мешать транскриптомической и протеомической аналитикам РНК и белков, полученных из тромбоцитов. Мы обнаружили, что очищенные тромбоциты активируются с антителом тромбина антитела, такие как анти-GPIIb/IIIa (Джон/а) и анти-P-selectin более эффективно, чем целые тромбоциты крови.
Так как тромбоциты хрупкие, важно, чтобы обработать образцы как можно более мягко. Если тромбоциты активированы, они выпускают содержимое гранул и в конечном счете деградируют. Поэтому, чтобы сохранить функциональные свойства тромбоцитов нетронутыми, важно поддерживать старение тромбоцитов во время изоляции. Несколько протоколов описали изоляцию тромбоцитов от человека, собаки, крысы, и не-человека приматов различными методами1,10,11,12. Некоторые из методов требуют несколько этапов, таких как сбор обогащенной тромбоцитами плазмы путем центрифугирования, фильтрации путем разделения колонки, отрицательный выбор тромбоцитов с РБК-и WBC-специфические антитела, сопряжения к магнитным бисером, и так далее, которые являются отнимает много времени и может ухудшить тромбоциты и их содержимое.
Форд и его коллеги описали очищение тромбоцитов от человеческой крови с помощью iohexol средних11. Этот метод использует аналогичный объем проб крови и средних во время очистки. В виду того что люди дают более высокий объем крови, оно относительно легки для того чтобы очистить тромбоциты.
Iohexol является универсальным градиентом плотности инертной среде, которая свободно растворяется в воде и используется в фракционирование нуклеиновых кислот, белков, полисасахадов, и нуклеопротеидов13,14. Он имеет низкую осмолальность и нетоксичен, тем самым делая его идеальной средой для очищения неповрежденными живыми клетками11. Это не-твердых частиц среды; Таким образом, распределение ячеек в градиенте можно определить с помощью хемоцитометер, Flow cytometer, или спектрофотометра. Он не мешает большинству ферментативной или химической реакции клеток или клеточных фрагментов после разбавления.
Мышь служит важной моделью животных для многих заболеваний человека15,16,17,18. Есть несколько опубликованных статей, которые описывают очищение мыши тромбоцитов19,20. Однако, мышь дает относительно меньший объем крови, что затрудняет очищение тромбоцитов. Если используется тот же малый объем градиента средних и образцов крови, то слой тромбоцитов не может быть четко отделен от слоя РБК-WBC после центрифугирования. В этой статье мы описали быстрый и простой метод очистки мыши тромбоцитов с три раза больше iohexol градиент среды относительно объема выборки крови и низкой скорости центрифугирования. Мы также активировали очищенную тромбоциты с тромбин и исследовали их качество с потоком цитометрии и микроскопии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Мышеловки крови должны быть проведены с соответствующими институциональными ухода за животными и использования Комитета одобрения.
Примечание: Протокол очистки тромбоцитов описан в диаграмме потока на рисунке 1.
1. сборник крови
- Добавьте 25 мкл 3,2% цитрата натрия (pH 7,2) в качестве анти-коагулянта и 0,4 мм ГУНО-про-АРГ-про (гпрр) в полипропиленовой трубе.
-
Соберите примерно 200 мкл крови из C57BL/6 мышь с помощью ретро-орбитального кровотечения.
Примечание: кровь может быть собрана из любого типа деформации мыши, независимо от возраста или пола.- Используйте 2 мл изофлуран в любом типе камеры для обезболирования мыши.
Примечание: Глубина анестезии проверяется признаками повышенного дыхания и снижением движения. Мышь не должна реагировать на движение анестезии камеры, или обрабатываются. Если мышь реагирует на движение или обработку, то она требует больше времени, чтобы держать в анестезии камеры. - 1.2.2 Откройте или правое или левое веко мыши и вставьте трубу капилляра 7,5 cm (диаметром 0,12 cm) в сосудистое сплетение глаза.
- Поверните трубу капилляра одной половинной поворот пока прикладывая давление к трубке капилляра для того чтобы сломать сосуды и начать подачу крови. Держите животное вверх дном над собранием флакон, чтобы быть заполнены действием капилляров.
- Как только соответствующий объем крови собирается, удалите трубку капилляра и закройте глаза, применяя мягкое давление в течение 30 лет на веко с марлей. Как только кровотечение остановлено, возвратйте мышь к своей клетке и контролируйте для кровотечения.
- Проверьте глаза на травму через 1-2 дней после ретро-орбитального кровотечения. Удалите мышь из исследования, показывая признаки значительной травмы глаза в результате процедуры и эвтаназии.
Примечание: Мышь не должна подвергаться какому-либо лечению, которое может подавлять тромбоциты, по крайней мере за две недели до сбора крови. Образец крови должен быть использован для очищения тромбоцитов в течение одного часа кровотечения мыши.
- Используйте 2 мл изофлуран в любом типе камеры для обезболирования мыши.
2. Очищение тромбоцитов
Примечание: Очищение от тромбоцитов должно проводиться при комнатной температуре, чтобы предотвратить их деградацию. Убедитесь, что температура реагентов и приборов составляет от 18 до 22 °C. Чтобы предотвратить деградацию тромбоцитов, быстро пипетки и энергичные встряхивания следует избегать во время процедуры.
- Добавить 600 Мкl из градиента iohexol (12% порошка iohexol в 0,85% хлористого натрия, 5 мм Тричин, pH 7,2)11 в трубку 1,5 мл.
- Добавить 200 мкл образца крови медленно вниз по стороне трубки на вершине градиента среды с широким отверстие пипетки наконечник так, что кровь и iohexol среды не смешиваются (рис. 2A).
- Центрифуга образца, содержащего трубки на 400 x g для 20 мин при температуре 20 °c в качающийся ротор ведра с медленным ускорением и замедлением.
- Соберите большую часть обогащенной тромбоцитами слоя и небольшую часть тромбоцитов бедных слоя (всего 300 до 400 мкл), используя широкий наконечник пипетки, не нарушая РБК и WBC слоев (Рисунок 2B). Перенесите образец тромбоцитов в новую трубку.
Примечание: Если количество тромбоцитов меньше в крови или используется меньший объем крови, богатый тромбоцитами слой и слой тромбоцитов-бедных можно рассматривать как один слой. - Добавьте 1 мл PBS в образец тромбоцитов, смешайте инвертирование и центрифугу на 800 x g в течение 10 минут при температуре 20 °c в качающейся роторе ведра. Полностью выбросите раствор и добавьте 200 мкл PBS, чтобы ресуспензируем тромбоциты мягким пипетатом.
Примечание: Этот шаг является необязательным, так как он удаляет градиент средних и плазменных белков и увеличивает чувствительность тромбоцитов к агонистов, таких как тромбин. Так как различные центрифуги имеют различные программы, медленное ускорение/замедление может быть определено путем чтения руководства пользователя центрифуги. - Перенесите 30 мкл этого образца в новую трубку для подсчета тромбоцитов. Оставшиеся тромбоциты могут быть использованы для биохимических и физиологических анализов, таких как активация тромбоцитов, агрегация, релиз гранул и т.д.
- Для извлечения РНК или белка, центрифуга образец тромбоцитов на 800 x g в течение 10 минут, чтобы гранулы тромбоцитов. Выбросьте супернатант полностью, не нарушая гранулят. Добавить требуемый объем РНК или лизиса белка буфер для Lyse тромбоцитов.
3. Подсчет тромбоцитов
- Подсчет всех кровяных клеток без разбавления и очищенных тромбоцитов (разбавляют 2 до 5 раз с PBS) с помощью автоматизированного анализатора клеток. Используйте от 30 до 50 мкл образцов для подсчета.
- Рассчитать общее количество тромбоцитов путем умножения на объем образца.
- Рассчитать процент доходности/восстановления очищенных тромбоцитов.
- Граф РБК и WBC в очищенный образец тромбоцитов (разбавленный 50 до 100 раз с PBS) с хемоцитометер и микроскопом.
4. Активация тромбоцитов
- В трубке, добавить 1 до 2 000 000 очищенных тромбоцитов в до 100 мкл окрашивания буфера (PBS с 2% плода бычьей сыворотки, ФПС).
- Для нескольких образцов, сделать мастер смесь антител с 1 мкл (0,5 мг/мл) из следующих: PE-Cy7 крысы анти-мышь TER 119, PE крысы анти-мышь CD45, FITC крысы анти-мышь CD41, и АКН крысы анти-мышь/человека CD62P (P-selectin) для обнаружения РБК, WBC, тромбоцитов, и активированных тромбоцитов, соответственно. Добавьте Мастер микс в трубы для окрашивания клеток. Не добавляйте тромбин.
- В другой трубе, добавить 1 до 2 000 000 очищенных тромбоцитов в до 100 мкл окрашивания буфера, и 0,4 mM GРРП пептид. Добавить тромбин, чтобы активировать тромбоциты и пятно клеток следующий шаг 4,2.
Примечание: ГРП следует добавлять в образец перед добавлением тромбина для предотвращения агрегирования или сгустка через активацию тромбоцитов. Тромбин концентрация должна быть оптимизирована для получения хорошей активации тромбоцитов. После активации тромбоцитов, количество событий уменьшается при приобретении образцов потоком цитометрии. - Как положительный элемент управления, добавить 1 мкл цельной крови в до 100 мкл окрашивания буфера в трубке и 0,4 mM пептид GРРП. Добавьте тромбин, чтобы активировать тромбоциты. Как отрицательный элемент управления, добавьте 1 мкл цельной крови в до 100 мкл окрашивания буфера. Не добавляйте тромбин в отрицательный образец управления. Пятно клеток следующий шаг 4,2.
- Для управления потоком цитометрией изотипа, этикетка 5 труб с незапятнанными, PE-Cy7, PE, FITC, и БТР. Добавьте 100 мкл окрашивания буфера, 1 мкл крови и 1 мкл соответствующего антитела к помеченных трубам, чтобы испачкать клетки.
- Инкубировать образцы, чтобы пятно на 30 мин при комнатной температуре в темноте.
- Вымойте образцы, добавив 1 мл окрашивания буфера для каждой трубки. Центрифуга при комнатной температуре 800 x g в течение 5 минут. Выбросьте окрашивание буфера осторожно, не выбивая гранулы.
- Добавьте 300 мкл окрашивания буфера в каждую трубку, мягко перемешайте и переведите в трубку FACS. Храните окрашенные образцы в темноте, пока не проанализировано с потоком cytometer.
5. поток цитометрии анализы тромбоцитов
-
Создайте новый эксперимент и генерировать журнал вперед рассеивать против журнала стороны разлетаются точечные участки и назначить ворота для Ter119 PE-Cy7 (РБК), CD45 PE (WBC), CD41 FITC (тромбоциты), и CD62P БТР (активированный тромбоцитов) населения в соответствии с стратегией стробирования выбран для эксперимент в программное обеспечение FACS DIVA.
- Откройте иерархию населения, выбрав на вкладке популяции шоу иерархию популяции. Измените иерархию населения, проверив стратегию стробирования и правильно переименовав ворота.
- Открытое представление статистики путем выбора создания просмотра статистики. Редактировать представление статистики в соответствии с пользовательскими предпочтениями вправо, нажав на просмотр статистики и выбрав режим редактирования статистики.
- Выберите цвет для каждого ворот, что повышает визуальный аспект макета с помощью двойного нажатия на поле, соответствующее населению.
- В окне Cytometer щелкните на вкладке параметров и отрегулируйте напряжения для параметров, чтобы визуализировать популяцию процентов на участках.
- Отрегулируйте напряжения для каждого из параметров так, чтобы негативное население можно было отличить от положительной популяции. Перед записью образцов для контроля компенсации проверьте, что одноцветные положительные элементы управления находятся на шкале (убедитесь, что положительные пики видны и не слишком далеко вправо).
Примечание: Если положительные пики не достигают масштаба, напряжение должно корректироваться, чтобы увидеть положительные популяции. - Запишите одноцветные окрашенные ячейки для контроля за компенсацией (незапятнанные, PE-Cy7, PE, FITC и БТР).
- Если положительные контрольные ворота не устанавливаются должным образом, отрегулируйте их, изменяя напряжение.
- Перейти к эксперименту ≫ Настройка компенсации ≫ рассчитать компенсацию. Выберите применять только в результирующее окно.
- Переключитесь на глобальную таблицу, нажав на кнопку переключения в верхней части, слева от окна листа.
- Загрузите положительный образец управления и приобретите достаточное количество ячеек, чтобы скорректировать компенсацию и ворота.
- Загрузите образец снова и проверить, что каждый участок показывает ожидаемые популяции клеток на основе флюфрохром окрашенных антител. Приобретите и запишите 100 000 событий для целых образцов крови и 10 000 событий для очищенных тромбоцитов. Загрузите образцы один за другим до завершения приобретения.
- Проанализируйте данные о потоке цитометрии с программным обеспечением с соответствующими участками и воротами (рис. 3)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Сводка по очистке тромбоцитов описывается в схеме потока (рис.1). Шаги включают в себя сбор крови из мыши с помощью ретро-орбитального кровотечения в присутствии антикоагулянта, Добавление образца крови на iohexol градиент среды, центрифугирования в размахивая ведро ротора на 400 x g для 20 мин при температуре 20 °c. Качество очищенных тромбоцитов оценивалось с помощью микроскопии и потока цитометрии после окрашивания с антителами для выявления любых загрязняющих клеток и активированных тромбоцитов.
Средний градиент iohexol и образец крови сформировали 2 отдельных слоя в трубке если кровь медленно была добавлена на средство (рисунок 2A). Однако, если есть задержка в этом шаге, большая часть образца крови может диффундировать в среду, и это может быть трудно очистить тромбоциты. Широкие пипетки-наконечники не обеспечивали физического напряжения тромбоцитов, что важно для поддержания целостности тромбоцитов и предотвращения их деградации. Во время центрифугирования медленное ускорение помогло предотвратить случайное смешивание образца крови с помощью iohexol среднего и медленного замедления, которое помогло сохранить градиент после центрифугации. Верхний (соломенный) слой содержал плазму и не содержал ни одного типа клеток крови, второй слой (беловатый) сверху содержал большинство тромбоцитов, собранных с помощью ширококровной пипетки, третий слой (прозрачный) был тромбоцитов бедных, которые были частично собраны тщательно, чтобы избежать стремления нижнего слоя (красный) РБК и WBC (Рисунок 2B). Богатый тромбоцитами слой и уровень тромбоцитов бедных не может рассматриваться отдельно, если тромбоцитов были низкими в образце крови. Слой РБК и WBC не мог рассматриваться как отдельные слои, так как объем крови был небольшим. Тем не менее, WBC образует белый слой, называемый Баффи пальто между слоем тромбоцитов бедных и РБК слоя, если больший объем крови используется для очистки10, 11. Важно провести всю процедуру в 18 – 22 °C. И более высокая температура и охлаждение образцов дали более низкие количества тромбоцитов из-за деградации.
Мы обнаружили, 18,2 до 38,5% (27,1 ± 6,5%, n = 12) восстановление/урожайность очищенных тромбоцитов. Для исследования их жизнеспособности, очищенных образцов тромбоцитов были активированы с тромбина. Flow цитометрический анализ образцов тромбоцитов было сделано после окрашивания с маркерами для тромбоцитов, активированных тромбоцитов, РБК и WBC. Вся кровь показала различные популяции РБК, WBC, и тромбоцитов на логарифмической вперед разброс против боковой разброс точечный участок (Рисунок 3A), в то время как очищенные тромбоциты показали различные популяции с незначительным числом РБК и WBC (Рисунок 3a ). Вся кровь показала РБК и WBC после окрашивания их с анти-мышь Ter119 и анти-мышь CD45 антитела (рис. 3C), тогда как очищенные тромбоциты показали незначительное количество РБК и WBC (рис. 3c). Мы оценивали очищенный образец тромбоцитов с микроскопом и не видели сколько-нибудь значительного количества неповрежденной РБК и WBC. Таким образом, РБК и WBC события, которые были показаны на рисунке 3D могут быть фрагменты РБК и WBC, содержащие TER119 и CD45, соответственно. Очищенные тромбоциты, которые не лечились с помощью тромбина, не показали почти никакой активации, указывающей их состояние покоя (Рисунок 3E), тогда как очищенные тромбоциты, обработанные тромбоном, показали 71% активацию (до 93% активации наблюдалось в некоторых образцах) ( Рисунок 3F) с указанием их жизнеспособности. Мы также выполняли микроскопическую оценку очищенных образцов тромбоцитов, не получавших тромбин, который не показывал агрегацию тромбоцитов (рис. 4A), однако очищенные тромбоциты сформировали агрегаты после лечения тромбом (рис. 4A), которые далее указывают на их жизнеспособность. Основываясь на потоке цитометрических и микроскопических исследований, мы подтвердили, что наши очищенные тромбоциты были хорошего качества.
Рисунок 1: схематическая схема для очищения тромбоцитов мыши. Образец крови из мыши собирается в присутствии антикоагулянта. Образец крови медленно добавляется в средний градиент Iohexol и центрифугируется при температуре 400 x g в течение 20 минут при температуре 20 °c. Слой тромбоцитов переносится на новую трубку. Качество очищенных тромбоцитов проверяется с помощью микроскопии и потока цитометрии. Тромбоциты могут быть использованы немедленно или храниться при температуре-80 ° c. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Рисунок 2:. Мышь крови до и после центрифугирования с Iohexol градиент среды. (A) iohexol и кровь образуют два отдельных слоя перед центрифугирования, если образец крови добавляется осторожно. Левая панель показывает схематичный график и правая панель показывает фактическое изображение. (B) четыре отдельных слоя видны после центрифугирования цельной крови с градиентом среды. Левая панель показывает схематичный график слоев и правая панель показывает фактическое изображение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Рисунок 3: ток цитометрический анализ очищенных тромбоцитов. (A) вся кровь показывает ЭРИТРОЦИТЫ, WBC, и тромбоцитов населения. (B) очищенные тромбоциты показывают незначительное количество событий РБК и WBC. (C) вся кровь показывает, РБК и WBC после окрашивания с анти-мышь Ter119 и анти-мышь CD45. (D) очищенные тромбоциты показывают незначительное число РБК и WBC событий после окрашивания с анти-мышь Ter119 и анти-мышь CD45. (E) очищенных тромбоцитов окрашенных с анти-мышь CD41 и анти-мышь/человека P-selectin Показать почти нет активации тромбоцитов. (F) очищенные тромбоциты обрабатывают тромбин и окрашивали с анти-мышь CD41 и анти-мышь/человека P-selectin Показать активации тромбоцитов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Рисунок 4: микроскопическая Оценка очищенных тромбоцитов. (A) очищенные тромбоциты не показывают каких-либо агрегирования. (B) очищенных тромбоцитов, получавших тромбин Показать агрегацию. Обе цифры 200x увеличение, глазной линзы 10x и объектив 20x объективен. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Обычно тромбоциты изолированы низкоскоростным центрифугирования, которая дает богатую тромбоцитами плазму, которая содержит значительное количество клеток крови, клеточного мусора и белков плазмы, которые могут вмешиваться в биохимические и физиологические анализы и потребности дальнейшее очищение21. Поэтому, важно использовать быстрый и простой метод, который может дать чистые тромбоциты без основных загрязняющих веществ. Представленный здесь протокол описывает очищение тромбоцитов от крови мышей с помощью градиента с низкой скоростью центрифугирования. Параметры, используемые в данном протоколе, максимизируют урожайность и минимизируют деградацию тромбоцитов. Средние и плазменные белки градиента могут быть удалены, включая этап стирки после сбора тромбоцитов, который может увеличить чувствительность тромбоцитов к агонистом или антителу. Самое главное, что очищенные тромбоциты находятся в состоянии покоя, но они могут быть активированы в присутствии агониста, например, тромбина. Мы обнаружили, что тромбин активность варьируется от одного источника к другому. Таким образом, концентрация тромбин должна быть оптимизирована эмпирически, чтобы получить хорошую активацию тромбоцитов.
Из-за небольшого объема мышиной крови, это неудобно для очистки тромбоцитов, поскольку тромбоциты могут быть смешаны с РБК и WBC во время аспирации. Мы решили этот вопрос путем оптимизации соотношения образца крови и градиента среды. Мы обнаружили, что в три раза больше градиента среднего по отношению к объему крови может четко отделить слой тромбоцитов из сыворотки и РБК-WBC слои, что облегчает легкую коллекцию чистых тромбоцитов.
Очищение от тромбоцитов должно проводиться при комнатной температуре от 18 до 22 °C, чтобы предотвратить их деградацию. Сообщалось, что тромбоциты деградируют при хранении в холодильнике или температурах выше 27 °C11. Быстрый пипетки и энергичные встряхивания следует избегать, чтобы предотвратить деградацию тромбоцитов во время очистки. Так как различные центрифуги имеют различные программы, ускорение/замедление должно определяться эмпирически для поддержания градиента.
Если несколько проб крови мыши использованы в очищении, то кровотечение должно быть сделано в меньш чем 1 h и очищение должно быть завершено затем в пределах 1 h. Если пробы крови оставлены на более чем 2 ч, тромбоциты не могут быть очищены из-за их деградации. Если больше тромбоцитов необходимы для любого исследования, мышь кровь может быть собрана с помощью терминальных процедур, таких как сердечный прокол или Нижняя полая вена кровотечение, которые дают 800 до 1 000 мкл крови, и очищение от тромбоцитов должно осуществляться в нескольких труб и совмещено после очищения.
В заключение, мы описали простой и быстрый протокол для очищения тромбоцитов от небольшого объема крови мыши. Этот метод также может быть использован для очищения тромбоцитов от других видов, а также. Очищенные тромбоциты могут быть использованы для экспрессии генов, активации и высвобождения гранул, агрегирования и адгезионной пробы при стимуляции различными агонистами.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не заявляют о конфликте интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана запуска финансирования детского исследовательского фонда Цинциннати и Университета Цинциннати пилот поступательный Грант на М.Н. Мы хотели бы поблагодарить детский госпиталь Цинциннати исследовательский поток Цитометрическая Core за их услуги.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APC rat anti-mouse/human CD62P (P-selectin) | Thermoscientific | 17-0626-82 | Platelets activation marker |
| Eppendorf tube | Fisher Scientific | 14-222-166 | Tube for centifuge |
| FACS DIVA software | BD Biosciences | Non-catalog item | Analysis of platelets and whole blood |
| FACS tube | Fisher Scientific | 352008 | Tubes for flow cytomtery |
| Fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 26140079 | Ingredient for staining buffer |
| FITC rat anti-mouse CD41 | BD Biosciences | 553848 | Platelets marker |
| Flow cytometer | BD Biosciences | Non-catalog item | Analysis of platelets and whole blood |
| FlowJo software | FlowJo, Inc. | Non-catalog item | Analysis of platelets and whole blood |
| Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP) | EMD Millipore | 03-34-0001 | Prevent platelet clot formation |
| Hematocrit Capillary tube | Fisher Scientific | 22-362566 | Blood collection capillary tube |
| Hemavet | Drew Scientific | Non-catalog item | Blood cell analyzer |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | Cell counting chamber |
| Isoflurane | Baxter | 1001936040 | Use to Anesthetize mouse |
| Microscope (Olympus CKX41) | Olympus | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
| Nycodenz (Histodenz) | Sigma-Aldrich | D2158 | Gradient medium |
| PE rat anti-mouse CD45 | BD Biosciences | 561087 | WBC marker |
| PE-Cy7 rat anti-mouse TER 119 | BD Biosciences | 557853 | RBC marker |
| Pipet tips 200 µL, wide-bore | ThermoFisher Scientific | 21-236-1A | Transferring blood and platelet samples |
| Pipet tips 1000 µL, wide-bore | ThermoFisher Scientific | 21-236-2C | Transferring blood and platelet samples |
| Phosphate buffured saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14040-117 | Buffer for washing and dilution |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | Physiological saline |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | 02-688-26 | Anti-coagulant |
| Staining buffer | In-house | Non-catalog item | Wash and dilution buffer |
| Steile water | In-house | Non-catalog item | Solvent |
| Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | Swinging bucket rotor centrifuge |
| Thrombin | Enzyme Research Laboratoty | HT 1002a | Platelet activation agonist |
| Tricine | Sigma-Aldrich | T0377 | Buffer for Nycodenz medium |
References
- de Witt, S. M., Verdoold, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Insights into platelet-based control of coagulation. Thrombosis Research. 133, S139-S148 (2014).
- Machlus, K. R., Thon, J. N., Italiano, J. E. Interpreting the developmental dance of the megakaryocyte: a review of the cellular and molecular processes mediating platelet formation. British Journal of Haematology. 165 (2), 227-236 (2014).
- Weyrich, A. S., Zimmerman, G. A. Platelets: signaling cells in the immune continuum. Trends in Immunology. 25 (9), 489-495 (2004).
- Nami, N., et al. Crosstalk between platelets and PBMC: New evidence in wound healing. Platelets. 27 (2), 143-148 (2016).
- Mancuso, M. E., Santagostino, E. Platelets: much more than bricks in a breached wall. British Journal of Haematology. 178 (2), 209-219 (2017).
- Hampton, T. Platelets' Role in Adaptive Immunity May Contribute to Sepsis and Shock. Journals of the American Medical Association. 319 (13), 1311-1312 (2018).
- Sabrkhany, S., Griffioen, A. W., Oude Egbrink, M. G. The role of blood platelets in tumor angiogenesis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer. 1815 (2), 189-196 (2011).
- Menter, D. G., et al. Platelet "first responders" in wound response, cancer, and metastasis. Cancer and Metastasis Reviews. 36 (2), 199-213 (2017).
- Fink, L., et al. Characterization of platelet-specific mRNA by real-time PCR after laser-assisted microdissection. Thrombosis and Haemostasis. 90 (4), 749-756 (2003).
- Trichler, S. A., Bulla, S. C., Thomason, J., Lunsford, K. V., Bulla, C. Ultra-pure platelet isolation from canine whole blood. BioMed Central Veterinary Research. 9, 144 (2013).
- Ford, T. C., Graham, J., Rickwood, D. A new, rapid, one-step method for the isolation of platelets from human blood. Clinica Chimica Acta. 192 (2), 115-119 (1990).
- Noisakran, S., et al. Infection of bone marrow cells by dengue virus in vivo. Experimental Hematolology. 40 (3), 250-259 (2012).
- Rickwood, D., Ford, T., Graham, J. Nycodenz: a new nonionic iodinated gradient medium. Analytical Biochemistry. 123 (1), 23-31 (1982).
- Graham, J. M., Ford, T., Rickwood, D. Isolation of the major subcellular organelles from mouse liver using Nycodenz gradients without the use of an ultracentrifuge. Analytical Biochemistry. 187 (2), 318-323 (1990).
- Milligan, G. N., et al. A lethal model of disseminated dengue virus type 1 infection in AG129 mice. Journal of General Virology. 98 (10), 2507-2519 (2017).
- Strassel, C., et al. Lentiviral gene rescue of a Bernard-Soulier mouse model to study platelet glycoprotein Ibbeta function. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (7), 1470-1479 (2016).
- Bergmeier, W., Boulaftali, Y. Adoptive transfer method to study platelet function in mouse models of disease. Thrombosis Research. 133, S3-S5 (2014).
- Bakchoul, T., et al. Recommendations for the use of the non-obese diabetic/severe combined immunodeficiency mouse model in autoimmune and drug-induced thrombocytopenia: communication from the SSC of the ISTH. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 13 (5), 872-875 (2015).
- Aurbach, K., Spindler, M., Haining, E. J., Bender, M., Pleines, I. Blood collection, platelet isolation and measurement of platelet count and size in mice-a practical guide. Platelets. , 1-10 (2018).
- Jirouskova, M., Shet, A. S., Johnson, G. J. A guide to murine platelet structure, function, assays, and genetic alterations. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 5 (4), 661-669 (2007).
- Birschmann, I., et al. Use of functional highly purified human platelets for the identification of new proteins of the IPP signaling pathway. Thrombosis Research. 122 (1), 59-68 (2008).
