Summary
Her beskriver vi en enkel og rimelig metode som gjør det mulig å kvantifisere klebende tumorceller til lymfeknute (LN) kryoseksjoner. LN-tilhenger tumorceller identifiseres lett ved lysmikroskopi og bekreftes av en fluorescensbasert metode, noe som gir en vedhesindeks som avslører tumorcellebindende affinitet til LN parenchyma.
Abstract
Tumordrenerende lymfeknuter (LAN) er ikke bare filtre for tumorprodusert avfall. De er en av de vanligste regionale stedene for midlertidig residens av spredte tumorceller hos pasienter med ulike typer kreft. Påvisning av disse LN-bosatte tumorcellene er en viktig biomarkør forbundet med dårlig prognose og adjuvant terapi beslutninger. Nyere musemodeller har indikert at LN-bosatte tumorceller kan være en betydelig kilde til ondartede celler for fjerne metastaser. Evnen til å kvantifisere adhesivity av tumorceller til LN parenchyma er en kritisk måler i eksperimentell forskning som fokuserer på identifisering av gener eller signalveier som er relevante for lymfatisk / metastatisk formidling. Fordi LN er komplekse 3D-strukturer med en rekke utseender og komposisjoner i vevsseksjoner avhengig av delens plan, er deres matriser vanskelige å gjenskape eksperimentelt in vitro på en fullt kontrollert måte. Her beskriver vi en enkel og rimelig metode som gjør det mulig å kvantifisere klebende tumorceller til LN kryoseksjoner. Ved hjelp av seriedeler av samme LN tilpasser vi den klassiske metoden utviklet av Brodt for å bruke ikke-radioaktive etiketter og teller direkte antall adhering tumorceller per LN overflateareal. LN-tilhenger tumorceller er lett identifisert av lys mikroskopi og bekreftet av en fluorescensbasert metode, noe som gir en vedhesjonsindeks som avslører cellebindende affinitet til LN parenchyma, som er tankevekkende bevis på molekylære endringer i affinitetbindingen av integrins til deres korrelerln-ligands.
Introduction
Kreftmetastase er hovedårsaken til behandlingssvikt og det dominerende livstruende aspektet ved kreft. Som postulert for 130 år siden, den metastatiske spredningen resultater når en elite av spredte tumorceller (DTCs, "frø") skaffe spesifikke biologiske evner som tillater dem å unngå primære steder og etablere ondartet vekst på fjerne steder ("jord")1. Nylig har flere nye konsepter om "frø og jord" relasjoner dukket opp, for eksempel induksjon av premetastatiske nisjer (konseptualisert som en "fruktbar jord" som trengs for "frø" for å trives), selvsåing av primære svulster av DTCer, "frø" dvale i sekundære organer og parallell progresjonsmodell av metastase2.
For de fleste solide maligniteter kan DTCer bo og oppdages i mange mesenchymale organer, som benmarg og lymfeknuter (LAN) hos pasienter med eller uten tegn på klinisk metastase. Fordi tumordrenerende LN-er er den første plasseringen av den regionale spredningen av DTCer, er LN-status en viktig prognoseindikator og er ofte forbundet med adjuvant terapibeslutninger3. For noen tumortyper er korrelasjonen mellom LN-status og verre utfall sterk, inkludert hode og nakke4,5, bryst6, prostata7, lunge8, gastrisk9, kolorektal10,11 og skjoldbruskkjertelkreft12.
LNer er små ovale organer i lymfesystemet, som er dekket med retikulære celler og vedlagt med lymfatiske kar. Disse organene er helt nødvendige for immunsystemets funksjon13. LNer fungerer som tiltrekkende plattformer for immunsirkulerende celler, og bringer lymfocytter og antigenpresenterende celler sammen14. LNs tiltrekker seg imidlertid også sirkulerende tumorceller. Over flere tiår ble LN-er avbildet som passive transportruter for metastatiske tumorceller. Nyere studier har imidlertid indikert at tumorceller også kan styres mot LN-er ved kjemotaktisk (chemokiner) og/eller haptotaktiske (ekstracellulære matriseelementer) signaler utskilt av lymfeendotelet15. Som eksempler forenkler overuttrykk av CCR7-reseptoren i tumorceller veiledning av metastatiske melanomceller mot tumordrenerendeLN-er 16. I tillegg gir ekstracellulære LN-proteiner et selvklebende stillas for rekruttering og overlevelse av sirkulerende tumorceller17. Faktisk gir tumordrenerende LNer fruktbar jord for såing av DTCer, som kan opprettholdes i proliferative eller sovende tilstander ved spesifikke LN mikromiljøsignaler18. Den endelige skjebnen til disse LN-bosatte DTCs er kontroversiell; noen arbeider tyder på at disse cellene er passive indikatorer på metastatisk progresjon19, mens andre foreslår at de er mer sannsynlig ei grunnleggere av resistens (ved selvsåing primære steder) og / eller fungere som cellulære reservoarer for metastaser (spre "frø" for høyere kreftvekst)20,21. Nylig, ved hjelp av prekliniske modeller, har det blitt vist at en brøkdel av disse LN-bosatte DTCene aktivt invaderte blodkar, gikk inn i blodsirkulasjonen og koloniserte lungene21.
Tatt i betraktning at tilstedeværelsen av kreftceller i LN er en markør for kreft aggressivitet og invasivitet, i denne studien, optimaliserte vi en klassisk metode utviklet av Brodt22 for å kvantitativt måle tumorcellevedheking til LN in vitro. Bruken av en fluorescensbasert analyse tillot oss å utvikle en rimelig, rask, følsom og miljøvennlig (ikke-radioaktiv) protokoll for påvisning av klebende endringer mellom tumorceller og LN kryoseksjoner. Ved hjelp av MCF-7 brystkreftceller som uttrykker ulike nivåer av NDRG4 genuttrykk og rotte LN frosne seksjoner for å eksemplifisere metoden, viste vi at denne protokollen tillot en god sammenheng mellom tumorcellevedheking til LN in vitro og LN metastase observert hos brystkreftpasienter24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
LN-er ble gjenfunnet fra friske skrotter av friske voksne Wistar rotter ofret ved cervical dislokasjon. Vi fulgte NIH-retningslinjene for smerte og nød i laboratoriedyr, og alle prosedyrer ble godkjent av etikkkomiteen og dyreforskningen ved Forsknings- og utdanningsinstituttet ved Sírio-Libanês sykehus (CEUA P 2016-04).
MERK: Alle friske frosne vev anses som biologisk farlige og bør håndteres ved hjelp av egnede forholdsregler for biosikkerhet.
1. Lymphadenectomy og Cryosectioning
- Legg ferske av voksne Wistar rotter (180-220 g) liggende i dorsal recumbency på en ren disseksjon bord ved romtemperatur.
MERK: LN-er må samles opp til 30 min etter eutanasi. - Spray rottekadaveret med 70% isopropylalkohol og bruk steriliserte instrumenter for LN-høsting.
- Løft bukhuden ved hjelp av pinsett og åpne et hulrom med et medial snitt uten å skade det underliggende vevet, og eksponer er abdominal viscera. Trekk ut tarmen og thorax og abdominale LN-er blir synlige (Figur 1).
- Forsiktig avgiftstrekk lNene fra hver rotte ved bruk av stump spiss saks for å unngå å skade den overlegne mesenteric arterien liggende bak.
MERK: Avhengig av plasseringen av den resected lymfeknute, er det nødvendig å rense andre vev festet til det, for eksempel mesenteriske vev. - Høst LNer i 15 ml konisk rør som inneholder 5 ml steril fosfat bufret saltvann (PBS).
- Kast rotteskrottene på riktig måte.
- Fjern friske LAN fra PBS, rull og tørk noden på et tørt filterpapir. Legg den i en liten Petri-tallerken og tilsett innebyggingsløsning for frosne vevsprøver (O.C.T.) i 2 min.
- Overfør og orienter LN med forsiden ned i ønsket posisjon i bunnen av en cryomold, med akkurat nok O.C.T til å dekke den. Unngå bobler i nærheten av vevet. Snittoverflaten er bunnen av kryomolden.
- Umiddelbart smekk-fryse cryomold i en Styrofoam kjøler med tørr is. Når det fortsatt er en liten del av ufrosset O.C.T. (~ 20-35 s), overføre prøven til aluminiumsfolie og plassere den i en kjøler med tørris mens du fortsetter å fryse andre prøver. Til slutt lagrer du alle prøvene ved -80 °C til snitting.
- Seksjon LN med en kryostat justering seksjon tykkelse til 5-8 μm. Overfør gråtseksjoner på mikroskop lysbilder.
MERK: Før snitting, fjern de frosne prøvene fra -80 °C-fryseren og la dem likestille til temperaturen i kryostatmikrotomekammeret ved -22 °C i ca. 30 min. LN-holdige lysbilder kan lagres ved -80 °C i opptil en måned.
2. Cellulær merking med fluorescerende fargestoffer
MERK: Fluorescerende fargestoffer er mye brukt i cellebiologi. Vi foretrekker å bruke langkjedede dialkylcarbocyanines merking (DiI (C18),excitation 549 nm, Emission 565 nm) fordi de er lyse, stabile og kan legges direkte til kulturmedier, påvirker ikke cellelevedyktighet eller cellelimegenskaper25,26.
- Dissosierte celler vokser under ideelle forhold (dvs. i fullstendig medium) og resuspenderi serumfritt medium med en tetthet på 106 celler / ml.
- Tilsett 1 ml cellesuspensjon (106 celler) til a15 ml konisk rør og etikett med Dil(C18) (2 μg/ml) i 10 min ved 37 °C.
MERK: Etter 5 min, forsiktig agiterrørene for å unngå cellesedimentering og understaining av sedimenterte celler. Større tettheter krever lengre inkubasjonstider for jevn farging. En optimal inkubasjonstid for cellefarging varierer med cellelinje. Det kan bedre kvantifiseres ved hjelp av den konvensjonelle FL2-strømningscytometrideteksjonskanalen (figur 2A). - Sentrifuge merket suspensjon rør på 300 x g i 4 min.
- Fjern supernatanten og vask to ganger i 10 ml serumfritt medium. Gjenopprett cellene som røde pellets. Resuspender cellene ved 106 celler/ml i serumfritt medium med 0,1 % storfeserumalbumin (BSA).
3. Precoating Retter med Poly-L-lysin Løsning eller BSA som en seeding kontroll (valgfritt)
MERK: Vi brukte cellekulturretter som var forutlagt med PLL som positive lastekontrolloverflater for å sikre at ulike eksperimentelle grupper av tumorceller ble seedet med samme antall, samt BSA-belagte overflater som negative kontroller.
- Under sterile forhold, for å forberede PLL- eller BSA-belagte brønner, tilsett 300 μL PLL (0,1 % w/v i H2O) eller BSA (fortynnet ved 2,5 % m/v i H2O) direkte til 24-brønnplaten og inkuber over natten ved 4 °C.
- Fjern oppløsningen ved aspirasjon, skyll overflaten forsiktig med steril PBS og lufttørk platen ved romtemperatur i vevskulturhetten før cellesåing.
MERK: De endelige volumene av PLL eller BSA må justeres i henhold til området av forskjellige brønnplater.
4. Seeding Fluorescerende merket tumorceller på LN Kryoseksjoner eller PLL/BSA-belagte brønner
MERK: Som eksperimentelle kontroller brukte vi (1) cellekulturretter som er forutskrevet med PLL eller BSA og (2) påfølgende deler av samme LN per eksperiment (se denne detaljen i figur 2D),hvor sistnevnte vil minimere regionale variasjoner i ekstracellulær matrise (ECM) sammensetning av hver LN-seksjon, som igjen kan diktere cellevedhekingsraten. For følgende tumorcelleadhesjonsanalyse, velg høy kvalitet og sekvensielle LN kryoseksjoner.
- Vask forsiktig kryoseksjonene to ganger med PBS og rehydrer med PBS i 15 min ved romtemperatur.
- Blokker uspesifikk vedhev til kryoseksjoner med 2,5 % BSA i 30 min ved 37 °C. Bruk immunhistokjemivaskekamre og laminavugger for å sikre at hele O.C.T ble fjernet under vask og inkubasjoner.
- Tøm overflødig BSA på et tørt papirhåndkle, tørk omrisset av LN-seksjoner med en bomullspinne og omkrans seksjonene ved hjelp av en PAP-penn.
- For tumorcelleadhesjonsanalysen tilsett si 100 μL cellesuspensjon (fra trinn 2,4) til hver omkranset LN-seksjon eller brønn i de 24-brønns PLL-belagte platene og legg den i et fuktet kammerstativ i 1-2 t ved 37 °C i den konvensjonelle cellekulturinkubatoren.
MERK: Det endelige volumet av celleoppheng må justeres i henhold til området av forskjellige omkransede LN-er. - Vask forsiktig av ikke-tilhengerceller fire ganger med PBS. Fest de gjenværende festede fluorescerende cellene med 3,7% formaldehyd i PBS i 15 min ved romtemperatur.
5. Manuell kvantifisering av selvklebende indeks
MERK: Den selvklebende indeksen (dvs. tumorceller/LN mm2)ble oppnådd ved hjelp av et 10X-mål og manuell teller antall tumorceller, lett identifisert av lysmikroskopi og bekreftet av en fluorescensmikroskopi (Figur 2D), per lymfeknuteområder på flere uavhengige felt (oppnådd ved hjelp av National Institute of Health's ImageJ/FIJI-programvare).
- Bruk et fluorescerende mikroskop med 10x-mål for å ta separate TIFF-bilder i to kanaler som tilsvarer de lyse og rødfluorescerende feltene (figur 2D). Navngi og lagre disse bildene systematisk.
- Start ImageJ/FIJI, åpne bildene og angi skalaen. Det er nødvendig å bruke en kalibreringsskala (f.eks. en mikrometrisk linjal 1 mm) (figur 2C).
- Åpne bildet av den mikrometriske linjalen (eller et trinnmikrometer), velg rett linjeverktøy og tegn en rett linje som definerer en kjent avstand.
- Velg Angi skalapå Analyser-menyen. Avstanden i piksler fylles ut basert på lengden (i piksler) på linjen som trekkes i trinn 5.3. Den kjente avstanden vil bli fylt med den virkelige avstanden (i dette tilfellet i millimeter) og lengdens enhet i lengdeenheten (i dette tilfellet i millimeter).
- Klikk på Global (denne kalibreringen gjelder for alle bilder som åpnes i denne ImageJ / FIJI-økten) og trykk OK.
- Lymfeknuteområdekvantifisering: Velg tryllestavverktøyet, og åpne innstillingene for tryllestavverktøy. Sett modus til 8-tilkoblet. Klikk på bildet og angi toleransen til du velger alle lymfeknuter i bildet og trykkOK . Hvis du vil måle området, åpner du Analyser | Mål (CTRL + M). Området uttrykkes i enhetene som er angitt tidligere.
- Tumorcellekvantifisering: Åpne lysmikroskopi/fluorescensbilder i FIJI-programvare. Velg Plugins | Analyser | Celleteller | Celleteller. Klikk på bildet for å bli kvantifisert og trykk Initialiser knappen i celletellervinduet. Velg tellertype (1-8) og klikk på cellene på bildet. Hvis du vil initialisere neste bilde, trykker du på Tilbakestill-knappen i celletellervinduet, åpner det nye bildet og gjentar alle trinnene.
MERK: LN vedhemsindeks uttrykkes som antall tilhengere tumorceller per LN dekket område (celler / mm2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi illustrerer analysen ved å evaluere LN-limpotensialet til røde fluorescerende MCF-7 brystkreftceller som uttrykker ulike nivåer av NDRG4-genet (referert til som NDRG4-positive og NDRG4-negative celler), en negativ modulator av beta1-integrinklynger på celleoverflaten24, ved å undersøke fraksjonene av rotte LN-tilhenger tumorceller. Eksempler på råbildene av denne protokollen vises i figur 2. Som observert i figur 2Bavrundes morfologien til festede celler i form, og de er heterogent spredt over hele LN. LN-selvklebende indeks er 2 ganger høyere i NDRG4-negative MCF-7-celler (877 ± 124 celler/mm2 av LN) sammenlignet med det i tilsvarende NDRG4-positive MCF-7-celler (412 ± 76 celler/mm2 ln, p = 0,03) (Figur 2D).
Figur 1: Trinnvis prosedyre for isolering av rottemesenteric LN. (A) Ventral midtlinje hudsnitt: euthanized rotter ble plassert i dorsal recumbency posisjon og en 30-50 mm midline snitt ble gjort i huden overliggende midtmagen, utsette abdominal viscera (lever, tynntarm, cecum og blære). (B) Tynntarmen ble forsiktig trukket ut fra bukhulen utsette rotte mesenteric LNer innebygd i visceral fettvev. (C) Grov anatomi i dissekert mage-tarmkanalen etter fjerning. (D) Dissekert mesenteric lymfeknuter fra den koblende fettvev. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Representative resultater av tumorcellevedheft til rottelymfeknuteseksjoner. (A) Illustrerende flow cytometrianalyse som viser intensiteten av DiI (C18) merking (øvre kvadrant) sammenlignet med ikke-merkede celler (nedre kvadrant). (B) Lys (venstre) og fluorescerende (høyre) mikroskopibilder av rødmerkede MCF-7-celler som holder seg til LN-seksjoner etter vasketrinnet. (C) Etter adhesjonsanalyse kvantifiseres vedlagte celler på dekkslepper manuelt ved hjelp av en kalibreringsskala for å estimere lymfeknuteområdet og fluorescerende mikroskopi for å direkte celletelling. (D) NDRG4 knockdown i MCF-7 bryst tumorceller øker lymfeknute adhesjon. Representative bilder av røde fluorescerende MCF-7 celler (NDRG4-positive eller NDRG4-negative DiIC18-merkede celler) 30 min etter seeding på 5 μm rotte lymfeknute seksjoner. LN-klebeindeksen uttrykkes som antall tilhengere tumorceller per LN-dekket område (celler/mm2). Skalabar = 200 μm. * p < 0,05. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Lymfatisk systemformidling av kreftceller krever en rekke komplekse celledrevne hendelser. De initierer med celleavløsning fra primær svulst og ombygging av den ekstracellulære matrisen (ECM) arkitektur, og støttes av vedvarende chemotaxis og aktiv migrasjon gjennom afferent lymfater på vei til sentinel LNer. Hvis kreftceller holder seg og overlever i LN-er, kan de lett spre seg til andre sekundære organer. Her beskriver vi en enkel metode for rask og rimelig funksjonell analyse av spesifikke selvklebende interaksjoner mellom tumorceller og frosne LN-er.
Strukturelt er LN-er diskrete svamplignende masser av tette og omfattende nettverk av ECM-fibre, ofte referert til som "retikulære fibre", som fungerer som baner for cellemigrasjon og som kanaler for rask levering av løselige faktorer (antigener og / eller chemokiner) i LN parenchyma27. De bevarte retikulære fibrene til de frosne LNene i analysen støtter haptotaktiske signaler og gir stillas for tumorcellevedhet in vitro. Disse fibrene består hovedsakelig av strukturelle proteiner, som kollagenne I og III, og av sekundære ECM-elementer, som fibronectin, tenascin, laminin, vitronectin og heparansulfatproteoglykaner28,29. Etter cellevedheft gir de fleste av disse LN-avledede ECM-faktorene molekylære signaler som bestemmer celleoverlevelse (proliferative eller dvaletilstander) eller celledød (anoikis) gjennom integrin-medierte signaler.
Her demonstrerer vi analysen ved hjelp av xenogene rottelNer og en cellelinje for human brysttumor. Alternativt kan andre kilder til LAN brukes. Sammensetningen av rotte,mus eller menneskelige LNer inkluderer de samme strukturelle og funksjonelle proteiner som er en del av innfødte pattedyr ECM, som alle bevarer lignende bindingssteder som er nødvendige for cellevedheking23. Viktigere er det eneste kritiske trinnet å bruke etterfølgende skiver av samme LN per eksperiment for å minimere regionale variasjoner i ECM-sammensetning av hver LN-seksjon, som igjen kan diktere cellevedhefthastigheten.
En ulempe med analysen er at den ikke rekapitulerer de første trinnene i lymfatisk formidling, noe som bare reflekterer klebende styrke av tumorceller til LNer. For eksempel, seeding mindre aggressive bryst tumorceller på LN seksjoner, som MCF-7 (Figur 2) eller T47D tumor cellelinjer24, føre til en sterk vedheking til LN seksjoner in vitro, på lignende nivåer enn observert for de høye aggressive MDA-MB-231 tumorceller (data ikke vist). Det er imidlertid velkjent at ortopisk MCF-7 xenograft svulster ikke kan nå sentinel LNer, mens MDA-MB-231 svulster spontant metastasere til dem30. Klart, den viktigste flaskehalsen for MCF-7 celler LN-metastase dannelse forekommer i trinn før de når og holder seg til LN, som manglende evne til MCF-7 celler effektivt flykte fra de primære svulster. Så, styrken av analysen beskrevet her er ikke etablere direkte korrelasjoner med LN-metastatisk potensial, men er en enkel metode for å kvantifisere limegenskapene til en tumorcelle i en mer realistisk ECM in vitro. Ved å bruke frosne vev representerer kryoseksjonene den naturlige kompleksiteten til LN-er når det gjelder struktur og sammensetning, noe som ville være umulig å gjenskape ved hjelp av syntetiske teknikker, spesielt de som bruker rensede ECM-proteiner.
Ytterligere begrensninger av metoden er (1) det tillater ikke evaluering av chemotactic potensialet av faktorer utskilt av LN er og at (2) det ikke informere om hvorvidt celle-spesifikk vedhemsing til LN seksjoner er et resultat av fortrinnsrett binding til ECM proteiner, celler eller andre strukturer som finnes i LN seksjoner. Vi følte imidlertid at denne tilnærmingen kunne være relevant og må vurderes seriøst for bestemte applikasjoner, men var utenfor omfanget av dette manuskriptet. For eksempel, i en nylig studie, identifiserte vi N-Myc nedstrømsregulert gen 4 (NDGR4) som en mekanistisk biomarkør av LN metastase i brystsvulster24. Mekanistisk øker tumorceller som mangler NDRG4-uttrykk vedhende til kryoseksjoner av LN-er ved å favorisere montering av β1-integrinreseptorer i forkant av brysttumorceller. Videre, ved hjelp av ekstra kontroller, som retter belagt med renset ECM proteiner, avdekket vi at differensial vedhems behandling til LN seksjoner er et resultat av selektiv tilknytning til vitronectin24.
Til slutt er det verdt å merke seg at denne metoden ikke er begrenset til LNs seksjoner og kan settes opp for å vurdere cellevedheking til forskjellige levende organer, som kryoseksjoner av milt eller lunger. Metastatiske celler viser organofisme og målinger av klebemiddelstyrke i frosne deler av forskjellige organer in vitro, kan være et nyttig middel for å forutsi organspesifikk kreftformidling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Rosana De Lima Pagano og Ana Carolina Pinheiro Campos for teknisk hjelp. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra: FAPESP - São Paulo Research Foundation (2016/07463-4) og Ludwig Institute for Cancer Research (LICR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conical Tubes | Corning | 352096 | |
| 2-propanol | Merck | 109634 | |
| Benchtop Laminar Flow | Esco Cell Culture | ||
| Bin for Disc | Leica | 14020139126 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647-100 | |
| Cell culture flask T-25 cm2 | Corning | 430372 | |
| Cryostat | Leica | CM1860 UV | |
| Cryostat-Brush with magnet | Leica | 14018340426 | |
| DiIC18 Cell Traker Dye | Molecular Probes | V-22885 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 12657-029 | |
| Fluorescence microscope | Nikon Eclipse 80 | ||
| Forma Series II CO2 incubator | Thermo Scientific | ||
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| High Profile Disposable Razor | Leica | 14035838926 | |
| Incubation Cube (IHC) | KASVI | K560030 | |
| Inverted microscope | Olympus | CKX31 | |
| Isofluran 100 mL | Cristália | ||
| Liquid Bloquer Super Pap Pen | Abcam, Life Science Reagents | ab2601 | |
| Optimal Cutting Temperature "OCT" compound | Sakura | 4583 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 70011-044 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| RPMI | Gibco | 31800-022 | |
| Serological Pipettes 1 mL | Jet Biofil | GSP010001 | |
| Serological Pipettes 10 mL | Jet Biofil | GSP010010 | |
| Serological Pipettes 2 mL | Jet Biofil | GSP010002 | |
| Serological Pipettes 5 mL | Jet Biofil | GSP010005 | |
| Serological Pipettes 50 mL | Jet Biofil | GSP010050 | |
| Serological Pipettor Easypet 3 | Eppendorf | ||
| Tissue-Tek cryomold | Sakura | 4557 | |
| Trypan Blue 0.4% | Invitrogen | T10282 | |
| Trypsin | Instituto Adolfo Lutz | ATV |
References
- Paget, S. The distribution of secondary growths in cancer of the breast. Cancer and Metastasis Reviews. 8 (2), 98-101 (1989).
- Liu, Q., Zhang, H., Jiang, X., Qian, C., Liu, Z., Zuo, D. Factors involved in cancer metastasis: a better understanding to seed and soil hypothesis. Molecular Cancer. 16 (1), 176 (2017).
- Padera, T. P., Meijer, E. F., Munn, L. L. The Lymphatic System in Disease Processes and Cancer Progression. Annual Review of Biomedical Engineering. 18, 125-158 (2016).
- Leemans, C. R., Tiwari, R., Nauta, J. J., van der Waal, I., Snow, G. B. Regional lymph node involvement and its significance in the development of distant metastases in head and neck carcinoma. Cancer. 71 (2), 452-456 (1993).
- Kowalski, L. P., et al. Prognostic significance of the distribution of neck node metastasis from oral carcinoma. Head & Neck. 22 (3), 207-214 (2000).
- McGuire, W. L. Prognostic factors for recurrence and survival in human breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment. 10 (1), 5-9 (1987).
- Gervasi, L. A., et al. Prognostic significance of lymph nodal metastases in prostate cancer. The Journal of Urology. 142 (2 Pt 1), 332-336 (1989).
- Naruke, T., Suemasu, K., Ishikawa, S. Lymph node mapping and curability at various levels of metastasis in resected lung cancer. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 76 (6), 832-839 (1978).
- Sasako, M., et al. D2 lymphadenectomy alone or with para-aortic nodal dissection for gastric cancer. The New England Journal of Medicine. 359 (5), 453-462 (2008).
- Chang, G. J., Rodriguez-Bigas, M. A., Skibber, J. M., Moyer, V. A. Lymph node evaluation and survival after curative resection of colon cancer: systematic review. Journal of the National Cancer Institute. 99 (6), 433-441 (2007).
- Watanabe, T., et al. Extended lymphadenectomy and preoperative radiotherapy for lower rectal cancers. Surgery. 132 (1), 27-33 (2002).
- Machens, A., Dralle, H. Correlation between the number of lymph node metastases and lung metastasis in papillary thyroid cancer. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 97 (12), 4375-4382 (2012).
- Dijkstra, C. D., Kamperdijk, E. W. A., Veerman, A. J. P. Normal Anatomy, Histology, Immunohistology, and Ultrastructure, Lymph Node, Rat. Hemopoietic System. Jones, T. C., Ward, J. M., Mohr, U., Hunt, R. D. , 129-136 (1990).
- Gretz, J. E., Anderson, A. O., Shaw, S. Cords, channels, corridors and conduits: critical architectural elements facilitating cell interactions in the lymph node cortex. Immunological Reviews. 156, 11-24 (1997).
- Podgrabinska, S., Skobe, M. Role of lymphatic vasculature in regional and distant metastases. Microvascular Research. 95, 46-52 (2014).
- Wiley, H. E., Gonzales, E. B., Maki, W., Wu, M. T., Hwang, S. T. Expression of CC chemokine receptor-7 and regional lymph node metastasis of B16 murine melanoma. Journal of the National Cancer Institute. 93 (21), 1638-1643 (2001).
- Chen, J., Alexander, J. S., Orr, A. W. Integrins and their extracellular matrix ligands in lymphangiogenesis and lymph node metastasis. International Journal of Cell Biology. 2012, 853703 (2012).
- Müller, M., Gounari, F., Prifti, S., Hacker, H. J., Schirrmacher, V., Khazaie, K. EblacZ tumor dormancy in bone marrow and lymph nodes: active control of proliferating tumor cells by CD8+ immune T cells. Cancer Research. 58 (23), 5439-5446 (1998).
- Cady, B. Regional lymph node metastases; a singular manifestation of the process of clinical metastases in cancer: contemporary animal research and clinical reports suggest unifying concepts. Annals of Surgical Oncology. 14 (6), 1790-1800 (2007).
- Klein, C. A. The systemic progression of human cancer: a focus on the individual disseminated cancer cell-the unit of selection. Advances in Cancer Research. 89, 35-67 (2003).
- Pereira, E. R., et al. Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice. Science. 359 (6382), 1403-1407 (2018).
- Brodt, P. Tumor cell adhesion to frozen lymph node sections-an in vitro correlate of lymphatic metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. 7 (3), 343-352 (1989).
- Badylak, S. F. Xenogeneic extracellular matrix as a scaffold for tissue reconstruction. Transplant Immunology. 12 (3-4), 367-377 (2004).
- Jandrey, E. H. F., et al. NDRG4 promoter hypermethylation is a mechanistic biomarker associated with metastatic progression in breast cancer patients. NPJ Breast Cancer. 5, 11 (2019).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends in Neurosciences. 12 (9), 333 (1989).
- Costa, E. T., et al. Intratumoral heterogeneity of ADAM23 promotes tumor growth and metastasis through LGI4 and nitric oxide signals. Oncogene. 34 (10), 1270-1279 (2015).
- Song, J., et al. Extracellular matrix of secondary lymphoid organs impacts on B-cell fate and survival. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), E2915-E2924 (2013).
- Kramer, R. H., Rosen, S. D., McDonald, K. A. Basement-membrane components associated with the extracellular matrix of the lymph node. Cell and Tissue Research. 252 (2), 367-375 (1988).
- Sobocinski, G. P., Toy, K., Bobrowski, W. F., Shaw, S., Anderson, A. O., Kaldjian, E. P. Ultrastructural localization of extracellular matrix proteins of the lymph node cortex: evidence supporting the reticular network as a pathway for lymphocyte migration. BMC Immunology. 11, 42 (2010).
- Pathak, A. P., Artemov, D., Neeman, M., Bhujwalla, Z. M. Lymph Node Metastasis in Breast Cancer Xenografts Is Associated with Increased Regions of Extravascular Drain, Lymphatic Vessel Area, and Invasive Phenotype. Cancer Research. 66 (10), 5151-5158 (2006).
