测量天然产品生物调节特性的平面运动分析

Summary

与动物在泉水中的运动相比，单是植物运动用于测量天然产品的刺激和提取特性。

Abstract

描述一种直接、可控的方法，利用非寄生植物， 杜格西亚蒂格里纳，一种自由生活水生扁虫，来研究天然产品的兴奋剂和戒断特性。受益于平面生理学独特方面的实验分析已应用于伤口愈合、再生和肿瘤发生的研究。此外，由于平面学家对各种环境刺激表现出敏感性，并且能够学习和开发有条件的反应，因此它们可用于检查学习和记忆的行为研究。平面学家拥有基本的双边对称性和中枢神经系统，该系统使用神经递质系统，可以用于研究神经肌肉生物调节器的作用。因此，开发了监测平面运动和运动的实验系统，以检查物质成瘾和戒断。由于平面运动提供了一个敏感、易于标准化的动能检测系统来监测刺激作用的潜力，因此平面运动速度（pLmV）测试经过调整，通过确定动物与时间交叉的网格线数，来监测平面动物的刺激和戒断行为。在这里，对该技术及其应用进行演示和说明。

Introduction

所述协议使用平面运动提供一种评估自然物质的生物调节作用的手段。它经过专门调整，以确定这些物质是否作为兴奋剂，以及他们是否与可测量的戒断行为^1相关。这种测定，称为平面运动速度（pLmV）测试，首次用于测试已知的药理剂^2,2，3。这种基于平面运动性测定的应用自此越来越受欢迎，并已被对天然产品以外的物质感兴趣的不同实验室^采用,。对于此测定，将平面放在含有泉水的培养皿中，或放入含有溶解生物调节剂的泉水。由于菜本身被放置在图形纸上，因此动物在容器上移动时与时间交叉的网格线数可用于确定每个条件下的移动速率。光/暗测试，也称为条件位置偏好测试（CPP），是监测平面运动性主题的另一个变化，并评估动物的反应和迁移到黑暗的环境^{6，7,的速度}。也可以使用计算机程序和质量（COM）跟踪中心^{（8，9，10，11）,9,分析,}平面^{运动的视频跟踪}。

将平面图用作此类研究的动物模型与其他动物相比具有若干优势，因为实验者可以轻松控制检测环境。具体来说，在实验前使计划学家挨饿可以防止他们接触其他可能混淆结果的营养或药理剂，而所调查的特定生物调节器只需直接添加到培养水中，即可将特定生物调节剂引入规划者，从而标准化接触。由于平面动物有神经系统和神经递质，让人联想到"高阶"动物，这些动物对神经肌肉刺激的生理和实验反应被认为与其他^{,,生物体12、13、14、15、16,13,14有生物学上相关}。¹⁵此外，由于平面学家在实验室中维护成本相对较低，因此为许多研究人员提供了一个可获取的生物模型。

作为一种实验动物，平面动物适合广泛的研究。例如，我们的小组，以及其他研究者使用平面学家来研究肿瘤发生^{17，18，19。,1917,}平面学家还表现出对化学、热、引力、电、照片和磁刺激的一系列反应行为，这些行为构成了其他测定系统的基础。其中一些效应已用于研究这些动物的学习和记忆20，21，22，23，24，25，26，27。^{20,21,22,23,24,25,26,27}目前文献中平面模型的主要用途是平面多能干细胞（称为新细胞）的活动及其在^{再生中的作用28、29、30。,29,30}因此，采用此处描述的模型允许使用其他基于平面的测定进行进一步研究，以提供对天然产品和其他生物调节剂如何影响生物体的更广泛理解。

Protocol

1. 平面畜牧业

1. 使用从生物供应公司购买的平面动物或野生捕获者（如果需要）。该协议中使用的平面学家是供应清单中列出的杜格西亚·蒂格里纳。这个物种也被称为吉拉迪亚蒂格里纳^31。其他水生植物物种也是可以接受的^2,2，3。
   注：所述协议适用于从生物供应公司购买的动物。这种检测系统尚未用野生捕获的平面动物进行测试。但是，如果使用野生捕获的平面动物，建议他们习惯在实验中使用的水，以及实验室环境至少1周前使用。
2. 抵达后，将平面食品转移到装有清洁泉水的塑料食品储存容器中，并保持盖子的密封。
3. 在黑暗的环境中维护平面主义者。
4. 在新环境中，24~36小时后给新交付的平面动物喂食。
5. 允许平面学家在实验前至少1周适应实验室。
6. 定期每周两次地给计划员喂食。
   1. 允许平面动物在切碎的有机煮鸡蛋或混合有机牛肉肝上喂食1~2小时。
   2. 喂食后，将喂食的平面动物放入干净的容器中。
      1. 把木板上脏水去掉。
      2. 使用小型平水彩画笔（编号 3+6）将粘在容器上的食品碎屑和粘液从周围的木板转移到纸巾上。
      3. 与新鲜的泉水和温柔的漩涡或搅拌，驱逐木板，并倒入一个干净的容器。
      4. 任何粘在容器上的任何平面器都可以使用圆形水彩画笔（编号 3+6）或具有宽孔的移液器进行转移。
      5. 去处理水。
      6. 用干净的泉水盖住平面。
      7. 24小时后，将木板从任何排出的食物废物中清除，如上文所述（步骤1.6.2.1=1.6.2.6）。
7. 要清洁用于平面饲养的容器和用具，请勿使用肥皂或洗涤剂。用干净的水冲洗好这些物品（自来水是可以接受的），用干净的布或纸巾擦干它们，来清洁它们。

2. 为实验准备平面图

1. 允许新交付的平面学家在实验前至少 1 周适应其环境。
2. 在实验前5~10天饿死计划员。
3. 在饥饿期间，将培养水至少变化1倍。

3. 平面运动速度 （pLmV） 测试：刺激行为

1. 在实验之前，确保饥饿的平面图完全形成，具有完整和色素的头和尾巴。
2. 在开始实验之前，为 pLmV 测试准备一个玻璃杯或塑料 10 厘米培养皿和一个习惯容器。
   1. 将直径为 10 厘米的清洁 Petri 盘放在预定网格纸上（0.5 厘米正方形）上用于 pLmV 测试。
   2. 将 20 mL 的纯正泉水添加到 10 厘米直径的 Petri 盘中，用于 pLmV 测试。
   3. 将相机（例如手机或高分辨率相机）放在准备好的 10 厘米直径 Petri 盘上方，以在实验期间在网格纸上记录平面运动。环架是将摄像机定位在距离内，可以记录 10 厘米 Petri 盘和网格线的整个视图的便捷方式。
   4. 准备一个装有5~10 mL纯正泉水（控制）的习性容器，或含有被测试天然产品适当浓度的泉水。类似于闪烁小瓶或小 5 厘米培养皿的容器是合适的。
3. 使用小、干净、平坦或圆形水彩画笔，将带泉水的库存容器轻轻地转移到含有 5~10 mL 纯纯泉水或含有正在测试天然产品的泉水的固定容器中。
   注：在操作 pLmV 测定的平面分析时，请使用小、干净、平坦或圆形水彩画笔（编号 3~6）。移动平面动物时，应将刷子放在动物下面，轻轻抬起。为确保在使用刷子时，平面动物不会损坏，不应将刷子的刷毛在动物下面被擦掉。如果刷毛夹在刷子的纤维之间，从刷毛中摊开可能会损害平面图。
   注：宽孔转移移液器也可用于将平面转移到清洁干燥的习惯容器中。
   1. 如果使用移液器，则使用移液器从习惯容器中去除与平面体一起移动的多余的水。
   2. 小心地将习惯溶液（即用于控制装置的泉水或含有被测试天然产品浓度的泉水）添加到含有平面的习化容器中。
4. 习惯期将取决于对被测试的自然产品评估的刺激动力学。习惯时间2分钟证明可以接受，以检测刺激的工作^1。
5. 2分钟后习惯期使用水彩画笔轻轻地将平面转移到准备的10厘米培养皿的中心，进行pLmV刺激实验。
6. 启动摄像机以记录平面图的运动。录制 10~11 分钟的视频。
7. 为 pLmV 实验准备习惯容器和 10 厘米培养皿，并针对每个平面图提供新的解决方案。
8. 对正在测试的自然产品的每个实验浓度使用专用移液器、盘子、容器和画笔，以避免在实验过程中无意中使平面图人接触错误的溶液。
9. 由于平面学家表现出学习的行为，每个平面（控制或测试）只应使用一次^{21，22。21,}

4. 平面运动速度 （pLmV） 测试：退出行为

1. 在实验之前，确保饥饿的平面图完全形成，具有完整和色素的头和尾巴。
2. 为 pLmV 实验准备 10 厘米培养皿（玻璃或塑料），为习惯后冲洗平面菜准备 5 厘米 Petri 盘（玻璃或塑料），并在开始实验前准备一个习惯容器。
   1. 将直径为 10 厘米的清洁 Petri 盘放在 0.5 厘米正方形的预定网格纸上，用于 pLmV 实验。
   2. 将 20 mL 的纯纯泉水加入直径 10 厘米的 Petri 盘中，用于 pLmV 实验。
   3. 将相机放在准备好的 10 厘米直径 Petri 盘上方，如步骤 3.2.3 所示，以在实验期间在网格纸上记录平面运动。
   4. 准备平面冲洗容器，单独添加5 mL的泉水到5厘米培养皿。
   5. 准备一个装有5~10 mL纯正泉水（控制）或含有正在测试天然产品的泉水的习化容器。类似于闪烁小瓶或小 5 厘米培养皿（玻璃或塑料）的容器是合适的。
3. 使用小、干净、平坦或圆形水彩画笔将平面水从泉水转移到准备好的居住容器中，容器中含有 5~10 mL 的纯正泉水（控制）或含有正在测试的天然产品的泉水。轻轻地将动物从库存容器移动到习惯容器。确保平面图没有被刷子损坏。
   注：在操作 pLmV 测定的平面分析时，请使用小、干净、平坦或圆形水彩画笔（编号 3~6）。移动平面动物时，应将刷子放在动物下面，轻轻抬起。为确保在使用刷子时，平面动物不会损坏，不应将刷子的刷毛在动物下面被擦掉。如果刷毛夹在刷子的纤维之间，从刷毛中摊开可能会损害平面图。
   注：宽孔转移移液器也可用于将平面转移到清洁干燥的习惯容器中。
   1. 如果使用移液器，使用移液器应从移液器将与平面体一起移动的多余的水从习惯容器中去除。
   2. 小心地将习惯溶液（即用于控制装置的纯正泉水或含有正在测试的天然产品的泉水）添加到含有平面的习化容器中。
4. 戒断的适应期将取决于对被测试的自然产品进行评估的刺激动力学;2~5分钟已证明足够。
5. 习惯期后，使用水彩画笔轻轻地将平面转移到准备好的 5 厘米培养皿中，其中含有泉水，以冲洗的习惯容器中的任何天然产品。确保平面图没有被刷子损坏。
6. 立即将平面转移到准备好的 10 厘米培养皿的中心，该培养皿包含泉水，用于 pLmV 提取实验。确保平面图没有被刷子损坏。
7. 启动摄像机以记录平面图的运动。录制 10~11 分钟的视频。
8. 为 pLmV 实验准备习惯容器、冲洗容器和 10 厘米 Petri 盘，并针对每个平面图提供新鲜解决方案。
9. 对正在测试的自然产品的每个实验浓度使用专用移液器、盘子、容器和画笔，以避免在实验过程中无意中使平面图人接触错误的溶液。
10. 因为平面学家表现出学习的行为，使用每个平面（控制或测试）只有一次^{26，27。26,}

5. 数据分析

1. 准备一个数据收集表，以记录平面线的行为和活动性，因为 pLmV 运行期间每分钟的网格线数。该表还应允许记录平面arian每分钟的累积行数。包括注释行和定义表，用于统计实验期间行为的观察，如"漂移"和"停止"（请参阅"讨论"）。
2. 使用视频，计算平面线每分钟穿过的完全网格线数 10 分钟，并在数据表上记录该数字。典型的平面行为包括连续速度、向前定向、水平运动、周期性转弯和没有停止。
   1. 开始时间实验点，平面已经移动的画笔，用于转移到10厘米的培养皿。记录此开始时间。
   2. 要确定动物何时穿过一个完整的网格方块，请聚焦头部，当头部完全穿过正方形时，请分一行。
   3. 要在蠕虫在菜的边缘移动时获得完整网格，请参照从菜边延伸的线条来可视化 0.5 厘米的距离。如果平面跨越框的角，请参阅第二行交叉以得分一个网格线。再次，专注于头部，作出这些决定。
   4. 每分钟之后停止视频以记录数据。
   5. 重新启动视频以计数下一分钟时，如果蠕虫的头部在视频停止时在网格线之间，请将第一行作为完整框进行录制。
   6. 将网格线数划为 10 分钟。
3. 如果动物在 pLmV 测试期间停止移动，并且在 10 分钟的录制时间中不再跨越网格线，请记录行为图表中平面动物的行为（例如，"流浪"或"停止"）。在 pLmV 检测期间停止其前向轨道的动物应注意，并且数据以接触该试剂浓度的动物总数的频率显示。在习惯期间，线圈或抽搐行为（称为 C 行为）阻止任何向前移动，表明天然产品的浓度不适合用于 pLmV 测定，因为 pLmV 测定是基于运动的。可以使用不同类型的分析来分析 C 型行为（请参阅 讨论）。
4. 如果可能，在确定试剂对平面生理学的总体影响时，在一天的不同天和不同时间使用至少9~12种蠕虫测试天然产品的多个实验浓度。然而，如果研究人员努力减少昼夜节律引起的变异性，那么在一天中设定的时间，可以使用用定时光/暗周期培养的蠕虫进行实验， 并设定喂食时间。至少有两个实验者参与项目，允许选择拥有一个单独的记录数据，而第二个实验者对用于数据收集的条件对网格线进行"盲"计数。让不同的个人参与数据收集以及统计计算和分析，也减少了可能的偏见。
5. 计算每天每个自然产品浓度的网格线计数，作为相对于每分钟的控制计数，以便可以合并不同天、不同的时间以及实验者的数据。这些数据可以进行平均，然后使用学生的 T 测试进行分析。与控制值和试剂浓度之间的测量相比，每分钟可以评估每个测试的 P 值。使用从不同实验浓度得出的数据集进行 ANOVA 评估提供了进一步的分析方法。

Representative Results

在实验开始之前，应完成运行 pLmV 测定的实验室设置和工作空间的准备。这包括准备习惯容器，如果需要冲洗容器（用于提取实验），在层压网格纸上的培养皿，以及正确放置的相机（图1）。拍摄所有视频后，建议使用通用数据表来标准化调查人员之间的数据收集和演示（图 2 和 图 2 补充）。

摄像机设置应允许对平面图和网格纸进行清晰查看，以便准确评估实验期间动物的进度（图3A 和图 3A 补充）。数据收集应包括网格交叉线的数量，以及实验每分钟交叉的累积线数（图3B）。在 pLmV 分析过程中，平面具有连续速度、向前定向水平运动、周期性转弯且不会停止。开始时，第一个全网格框的交叉应作为一个评分，而不是示例视频中确定的第一行。在平面图摆脱用于将其转移到 pLmV 盘的画笔后，记录定向运动的开始时间非常重要，然后随后的每一分钟都坚持。如果平面图是当前时间穿过框的一部分，则重新启动视频后交叉的下一个网格线应计为完整框。 当动物在菜的边缘移动时，参考从菜中伸出的线条，以确定 0.5 厘米的距离。当蠕虫遇到框的角时，请参阅第二行交叉以得分一个网格线。始终专注于头部，做出这些决定。如果平面学家开始覆盖一个密闭的区域，实验者应再次跟随蠕虫的头部来监视整个网格盒的距离。补充视频中包括了此行为的示例（图 3A 补充）。

为了标准化每个试验的结果，应计算和绘制 pLmV 运行，作为相对于匹配控制蠕虫的进度交叉的框数（图 3B）。在开始使用感兴趣的试剂进行测试之前，应培训每个用户执行检测和计数网格线。作为基准，使用实验设置，泉水中的平面学家通常在3分钟内覆盖约24箱（图4A;来自4个用户的数据，平均为24.8±4.8）。应检查一系列测试试剂浓度，以确定要用于每种测试试剂的行为分析类型。对于pLmV分析，研究人员应确定动物在暴露时是否表现出活力（图4B）。其他类型的行为分析对于不同类型的行为可能更有效（请参阅讨论）。相对于泉水控制，兴奋剂数据将显示越来越多的网格线交叉，因为动物通过pLmV容器与所需的浓度测试试剂在泉水，习惯在相同的浓度测试试剂。相比之下，当平面体在使用在泉水中混合的试剂所需浓度后，相对于泉水控制，当平面体通过具有泉水的 pLmV 容器时，提取数据将显示交叉的网格线数量减少（图4C 和4D）。值得注意的是，明显的戒断数据可能导致网格计数低于对控组，如其他组^2、6在药物诱导戒断^{数据中观察到的}。

在实验期间，泉水控制计划者将在电网线路上移动。然而，在测试过程中，测试平面学家有可能停止穿越网格线。如果发生这种情况，应将这些数据与蠕虫的数据分开突出显示，以维护其在网格行上的进度。将这些数据记录为接触该特定试剂浓度的动物总数的百分比是说明这些发现相对频率的有效方法（图 5A-C、图 5A 补编和图 5B 补充）。不阻止平面学家穿越网格线的行为应包含在 pLmV 分析中，即使这些运动妨碍了动物的稳步前进。

图 1：pLmV 测定的代表性设置。
在开始检测之前，应准备实验室空间。显示的是一个典型的设置与10厘米培养皿放置在层压0.5厘米网格纸。文档摄像机的位置使 10 厘米 Petri 盘的清晰视图可以在链接的计算机上记录。但是，任何摄像机都可用于记录实验期间的平面图的进度，包括使用环架放置在 Petri 盘上方的手机摄像头。背景是一个5厘米的培养皿，用于冲洗蠕虫的提取实验，以及用于习惯平面虫的白色小容器。此外，在背景中标有专用圆形水彩画笔、移液器和培养皿，用于每种产品浓度。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2：pLmV 数据手册。
准备好的数据表用于记录交叉的网格线数、与控制数据的相应数据以及计算任何行为的一种方法对于数据收集非常有用。有关 此图的可下载 PDF 版本，请参阅图 2 补充。 请单击此处查看此图的较大版本。

图3：代表性的pLmV实验和数据手册。
（A） 相机应放置在用于 pLmV 的 10 厘米培养皿上方，以便盘下平面和完整的 0.5 厘米网格清晰可见。应记录完整的 pLmV 运行 （图 3A 补充） 和 （B） 每分钟穿过的网格线数，这些网格线放置在准备好的数据表中。应计算交叉的累积网格线，然后将它们转换为相对于相应的泉水控制蠕虫的累积线数。提供的图表上的数据 （B） 与使用补充视频的计数匹配 （图3A 补充） 。不显示相应的控件计数。 请单击此处查看此图的较大版本。

图4：兴奋剂和戒断数据的代表性图表。
研究人员应接受培训，在实验前单独使用泉水对pLmV测定网格线进行评分。通常，平面学家在3分钟内移动大约25条网格线（A））显示来自4个用户的数据，每个用户有10个泉水控制蠕虫。 为了了解试剂对平面运动的影响，使用pLmV测定对一系列浓度进行了调查，并在3分钟内相对于相应的控制计数检查过网格线总数。（B） 控制数据由白条表示。测试数据由黑条表示，浓度在 mM 中。相对于控制数据应绘制以最好地表示收集的数据。（C） 以蓝线/钻石表示的刺激数据将显示交叉网格线的上升，而 （D） 退出数据（也由蓝线/钻石表示）将显示与控制数据相对初始开始值的减小，如两者（C 和 D 中的红线/平方 ）所示。请单击此处查看此图的较大版本。

图5：行为数据的观察和记录。
在pLmV测定中，在实验期间不保持方向运动，但停止与特征行为，不再移动网格的平面应计算。典型行为可能包括显示为"流浪"（A和图 5A 补充）和"停止"（B和图 5B 补充）。B应提供这些行为数据的这些统计，以记录这些行为的频率，与接触该产品浓度 （C） 的所有动物相比。显示的样本数据记录了春季水控制动物 （Ci） 和接触兴奋剂 （Cii） 的动物的百分比，它们有游荡（蓝色）、停止（红色）或无（绿色）行为。请单击此处查看此图的较大版本。

Discussion

介绍了一种简单易用的平面活动测定，以确定天然产品的兴奋剂和戒断作用。作为行为模型，有必要对评分运动有严格的规程，并明确任何行为的定义，以标准化不同实验者之间的观察。提出的想法演示了如何实现这一点。使用该协议的每个实验室应调整所呈现的信息，以适应所测试的特定产品的效果。建议仔细设置工作空间，以确保参与研究的每个调查员在一致条件下进行测试（图1）。可以编译标准化记录表，以帮助精确记录保存和数据收集运动和行为（图2和图3B）。

运动性测试应在一天的不同时间进行，如果可能，使用不同批次的平面，以解释固有的昼夜活动不同。虽然这些分析尚未进行，但建议调查人员通过使用标准光/暗循环（例如，12/12）维持平面节律，以及在进行pLmV测定时，使用标准照明条件，^{,并在第32天、第33}天、^第34天的同一时间运行测试^，从而监测平面昼夜节^{律如何影响运动。}研究人员应实践pLmV测定的力学，并学会计算网格线，以标准化平面学家的处理和平面运动的评估（图3）。这应该使用纯正的泉水控制装置完成。通常，在 10~20 次此类练习运行后，数据将成为所有实验室成员的标准数据。应选择在设置 pLmV 时间后计数，以比较学习分析的进度。调查人员通常在泉水中观察24条网格线，在泉水中经过2分钟的习惯后，在pLmV测定中交叉约3分钟（图4A;4名调查人员的代表数据，每个4个调查员有10个随机泉水控制;24.8±4.8个网格线）。让两个或三个训练有素的调查员进行每组测试可以进一步提高结果的可靠性，因为在错误分析中可以考虑任何用户特定对方法和计数的影响。这样，测试和计数可以在调查人员之间交换，以便计数可以"盲目"地对实验条件进行。为了减少偏见的机会，不同的个人可以对计数数据进行统计测试，并执行后续分析。在测试产品存在的情况下，应避免在水质（如温度和 pH 值）方面出现环境变化。由于平面图对光敏感，因此实验的设置应确保工作空间的照明均匀。最后，由于平面学家可以表现出学习的行为，每个蠕虫，包括控件，只应使用一次^{2626，27。27}

如果多个实验者正在实验室中进行检测（尤其是在本科研究实验室中），以避免运行 pLmV 测试时可能发生的常见陷阱，从而避免影响结果的统计值，则在实验室中安装实验检查表是很有用的。所有解决方案都应在室温下使用，因为平面运动在低温下会降低。应注意确保标本在使用前 5-10 天被饿死，并且每个标本都完全形成，头部和尾部完全有色素。还建议将专用的平或圆形水彩画笔（编号3~6）、习惯容器和培养皿用于每个实验浓度，使实验者工作流程更顺畅。调查人员应广泛采用使用小型平底或圆形水彩画笔转移平面动物的技术，以确保在容器之间有效转移蠕虫，而不会对动物造成伤害或痛苦（见上文讨论; 图4A）。使用这些画笔可最大限度地减少容器之间液体的转移，并减轻对平面主义者的潜在压力。然而，如果纤维在接触动物时被扩散或传播，植物人可能会被刷毛损坏。

由于 pLmV 检测依赖于行为数据，因此必须使用足够大的数据集来确保健壮的数据，尽管与生俱来的蠕虫到蠕虫响应变异性。因此，大多数实验室使用至少9至12^,个平面分析仪来测试被检查产品的每一个浓度，特别是因为天然产品可能不像标准药物^,,,,,,1,1、2、3、4、5、6、7、13、14、15、16、35、36^{35,那样具有显著效果}。^{,1513,14537,24616}相对于每个测试天和时间的泉水控制数据，计算每分钟交叉的网格线数。这些数据是每分钟每个测试浓度的平均值，并与控制数据进行比较，以及使用学生 T 测试和 ANOVA 的其他时间匹配浓度。

pLmV 测定适用于在测定时间期间影响平面学家活力的试剂的研究。详细的研究，平面运动可以使用文献中描述的一些其他评估^{4,35,36,37,38}.因此，在开始行为测试之前，谨慎的做法是进行一系列习惯实验，以注意到平面学家使用一系列浓度对测试试剂的反应，并将任何影响与泉水中蠕虫的行为进行比较。这样，就可以选择适当的行为测试来研究试剂对平面上引起的个体举止。平面可以放置在各种浓度的试剂5-10分钟，以确定浓度是否允许他们保持他们典型的游泳行为。不允许活动的行为，如导致C型，或抽搐或癫痫发作样的行为，一直是研究的重点，使用不同类型的行为分析，可以应用于此方法^4,39,40.pLmV 分析可以在短习惯时间后使用一系列浓度进行，与时间过程刺激和排空分析之前的泉水控制相比，在 3 分钟内交叉的总网格线数（图 4B)^1,2,3,4,5.鼓励调查人员在其他时间（如 15、30 和 60 分钟）取样，看看刺激动力学是否随着暴露时间而变化¹.据报道，在春季水控制蠕虫保持一个稳定的，向前方向的水平运动10分钟的时间^1,4.相比之下，产品处理的蠕虫在检测过程中可能会停止并停止其定向活动，不再跨越网格线。研究者可以判断是限制实验 pLmV 运行的长度，还是得出一种评估上述行为的手段。但是，评估这些行为的频率非常重要，因为它们提供了影响活动性的其他数据。运动性和运动数据在实地单独讨论，因为合并信息混淆了对这些数据的评估^{4,35,36,37,38}.例如，当蠕虫停止并且在检测过程中不再越过网格线时，观察到两种行为。这些运动被称为"流浪"（图5A 和 图 5A 补充、和"停止"（图 5B 和 图 5B 补充).这些行为的频率记录为接触特定产品浓度的所有动物的百分比以及控制数据（图 5C).重要的是，不阻止平面线穿越网格线的随机行为应该包括在pLmV分析中，即使这些运动妨碍了动物的稳步前进（图 4B，3 mM 和 10 mM 酒吧）。如前所述，调查人员描述了一些超出本讨论活动协议的 pLmV 速率范围的行为类别^{4,35,36,37,38}.

pLmV测定依赖于所调查产品的水溶性。然而，这些物质中有许多不是完全溶于水，因此，只有水溶性部分可以通过这种测定进行测试，而其余的必须像以前^的工作1那样从溶液中过滤。如果使用使用水以外的溶剂溶解的试剂进行 pLmV 测定，则除了泉水控制外，还需要体积等效控制。虽然这种方法尚未用于此类物质，但此类病媒控制可能应被视为一种测试，并且与任何其他测试物质一样，相对于对等控制，其活性得分。测试非可溶性物质的另一种可能方法就是将它们混合到食物凝胶中，将它们喂给平面动物。该技术用于在基因击倒/RNAi实验中将siRNA引入平面学家^41。然而，给平面动物提供生物制品和siRNA，给这种检测带来了并发症，因为平面动物不会挨饿，不能在标准化时间内转移到运动性测定容器，以确保在测试前与实验动物所调查的产品进行平等接触或摄入。

一旦使用pLmV测定确定兴奋剂和戒断动力学，进一步的实验可以涉及共生剂，引入siRNA，以及生物通路改性剂或药物，以测试对观察到的活性效应的增强或抑制，与不使用这些生物调节器^1，3时收集的初始结果^相比。例如，降低基因的表达或添加通路抑制剂可以降低运动速度，而其他可能改变戒断的动态。通过观察变化的pLmV结果，这些额外的实验可以提供了解受天然产品或其他测试试剂^{5，42，43，44,43}影响^{5,的基础生理学}。

所述程序适用于任何有兴趣确定各种生物调节剂（包括许多天然产品）的兴奋剂和戒断作用的实验室。平面 pLmV 分析的应用优势包括这些动物的廉价和易于维护，并且它们也可以成为其他基于平面分析的受试者，以便对所调查产品的生理影响有广泛的了解。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bottled Water - 1 Gal.	Poland Spring	N/A	Spring water for planarian culture and to prepare solutions
Brown Planaria (Dugesia tigrina)	Carolina Biological Supply Company	132954	Brown planaria living (other species are acceptable)
Flat Paintbrush	Royal Crafter's Choice	9159	Flat watercolor paintbrushes for cleaning planarian culture containers
Glass Petri Dish - 10 cm	Kimax	N/A	10 cm diameter (glass) Petri dishes for pLmV assay
Glass Petri Dish - 5 cm	Kimax	N/A	5 cm and Petri dishes for rinsing planarians during withdrawal experiments and for stimulant habituation
Grid Paper	Any	N/A	Standard 0.5 cm grid paper for pLmV assay
iPEVO Visualizer (software)	iPEVO	https://www.ipevo.com/software/visualizer	Document camera software for video capture and recording
Metalware Set with Support Stand and Retort Ring	Any	N/A	Standard chemistry lab ring stand to hold a cell phone camera if used
Organic Egg	Any	N/A	Organic egg or beef liver for feeding planarains
Polycarbonate Bottle w/ Screw-on Cap - 10 mL	Beckman	N/A	Plastic vials to hold 5 to 10 mL volumes for stimulant habituation
Round Storage Container - 10 cm	Ziploc	N/A	10 cm Round food storage containers for approximately 90 planarians or fewer
Round Water Paint Brush	LOEW-Cornell	N/A	Small round watercolor paint brushes (numbers 3 to 6) - soft
Transfer Pipette	Any	N/A	Wide bore (5 mL) plastic transfer pipettes to move planarians
USB Document Camera	iPEVO	CDVU-06IP	Document camera (or other camera or cell phone camera)