Summary
Planarian motility används för att mäta de stimulerande och tillbakadragande egenskaper naturliga produkter när jämfört med förflyttning av djuren i källvatten ensam.
Abstract
En enkel, kontrollerbar medel för att använda den icke-parasitiska planarian, Dugesia tigrina, en frilevande vattenlevande vattenlevande flatworm, att studera stimulerande och tillbakadragande egenskaper naturliga produkter beskrivs. Experimentella analyser benefitting från unika aspekter av planarian fysiologi har tillämpats på studier om sårläkning, regenerering och tumorigenesis. Dessutom, eftersom planarians uppvisar känslighet för en mängd olika miljö stimuli och är kapabla att lära och utveckla betingade svar, de kan användas i beteendestudier undersöker lärande och minne. Planarianer besitter en grundläggande bilateral symmetri och ett centralt nervsystem som använder signalsubstanssystem mottagliga för studier som undersöker effekterna av neuromuskulära biomodulatorer. Följaktligen har experimentella system övervakning planarisk rörelse och motilitet har utvecklats för att undersöka substansberoende och tillbakadragande. Eftersom planarian motility erbjuder potential för en känslig, lätt standardiserad motility assay system för att övervaka effekten av stimuli, den planarian locomotor hastighet (pLmV) testet anpassades för att övervaka både stimulering och tillbakadragande beteenden av planarianer genom fastställandet av antalet rutnät linjer korsas av djuren med tiden. Här demonstreras och förklaras tekniken och dess tillämpning.
Introduction
Det protokoll som beskrivs använder planarisk motilitet för att tillhandahålla ett sätt att bedöma de biomodulerande effekterna av naturliga ämnen. Det var särskilt anpassat för att avgöra om dessa ämnen fungerar som stimulantia, och om de sedan var förknippade med en mätbar tillbakadragande beteende1. Denna analys, känd som den planarian locomotor hastighet (pLmV) test, användes först för att testa kända farmakologiska medel2,3. Tillämpningen av denna plana järmalhetsbaserade analys har sedan dess vuxit i popularitet och har antagits av olika laboratorier som är intresserade av andra ämnen än naturligaprodukter 4,5. För denna analys placeras en planarian i en petriskål som innehåller källvatten eller källvatten som innehåller en upplöst biomodulator. Eftersom själva skålen placeras på rutpapper, kan antalet rutnätslinjer som korsas av djuret med tiden när den rör sig om behållaren användas för att bestämma rörelsehastigheten i varje villkor. Ljus/mörker-testet, annars kallat CPP (conditioned place preference test), är en annan variant på temat övervakningsplanarisk motilitet, och bedömer hur snabbt djuren svarar och migrerar till en förmörkar miljö6,7. Video spårning av planarisk rörelser kan också analyseras med hjälp av datorprogram och centrum för massa (COM) spårning8,9,10,11.
Att använda planarianen som en djurmodell för sådana studier erbjuder flera fördelar jämfört med andra djur genom att försökssävlaren lätt kan kontrollera analysen miljön. Närmare bestämt svälter planarianerna innan experiment kan förhindra deras exponering för andra näringsmässiga eller farmakologiska medel som annars kan förvirra resultaten, och den specifika biomodulatorn under utredning kan införas till planatörerna helt enkelt genom att lägga till det direkt till kulturvattnet, vilket standardiserar exponeringen. Eftersom planarianer har ett nervsystem och signalsubstanser som påminner om 'högre ordningsdjur' anses dessa djurs fysiologi och experimentella svar på neuromuskulära stimuli vara biologiskt relevanta för andra organismer12,13,14,15,16. Dessutom, eftersom planarianer är relativt billiga och okomplicerade att underhålla i laboratoriet, erbjuder de en tillgänglig biologisk modell för många utredare.
Som försöksdjur är planarianer lämpliga för ett brett spektrum av studier. Till exempel, vår grupp, liksom andra utredare använder planarianer för att studera tumorigenesis17,18,19. Planarianer uppvisar också en mängd svarsbeteenden på kemiska, termiska, gravitationella, elektriska, foto och magnetiska stimuli som har legat till grund för andra analyssystem. Några av dessa effekter har använts för att studera inlärning och minne hosdessa djur 20,21,22,23,24,25,26,27. Den primära användningen av den plana modellen i litteraturen för närvarande fokuserar på verksamheten i planarian pluripotenta stamceller, kallas neoblaster, och deras roll i regenerering28,29,30. Således, anta den modell som beskrivs här möjliggör ytterligare studier med hjälp av andra planarian-baserade analyser för att ge en bredare förståelse för hur naturliga produkter och andra biomodulatorer påverkar organismen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Planarian djurhållning
- Använd planarianer som köpts från ett biologiskt leveransföretag eller vildfångad om det behövs. De planarianer som används i detta protokoll är Dugesia tigrina, som anges i leveranslistan. Denna art kallas även Girardia tigrina31. Även andra vattenplanariska arter ärgodtagbara 2,3.
OBS: Det protokoll som beskrivs är inriktad på djur som köpts från ett biologiskt leveransföretag. Detta analyssystem har inte testats med vildfångade planarianer. Men om vildfångade planarianer används, rekommenderas att de är vana vid det vatten som används i experimenten, liksom laboratoriemiljön i minst 1 vecka före användning. - Vid ankomsten överför planarianer till förvaringskärl för plastmat som innehåller rent källvatten och håller locken på glänt.
- Underhåll planarianer i en förmört miljö.
- Mata nytillde planarianer efter 24–36 h i sin nya miljö.
- Låt planarianer acklimatisera sig till laboratoriet minst 1 vecka före experiment.
- Feed planarians på en vanlig två gånger i veckan schema.
- Låt planarianer att mata ad libitum på hackad ekologisk kokt ägg eller blandade ekologiska nötkött lever för 1–2 h.
- Placera utfodras planarianer i en ren behållare efter utfodring.
- Ta bort det smutsiga vattnet från planarianerna.
- Använd en liten platt akvarellpensel (nummer 3–6) för att överföra matskräp och slem som ansluter sig till containern från runt om i planaärer till en pappershandduk.
- Med färskt källvatten och skonsam virvlande eller agitation, rubba planarianer och häll dem i en ren behållare.
- Alla planarianer som är kvar som följs till behållaren kan överföras med hjälp av en rund akvarellpensel (nummer 3–6) eller överföra pipett med en bred tråkmåns.
- Dekantera överföringsvattnet.
- Täck planarianerna med rent källvatten.
- Efter 24 h, avlägsna planarierna från allt utvisat matavfall genom att överföra dem till en ren behållare enligt ovan (steg 1.6.2.1–1.6.2.6).
- För att rengöra behållare och redskap som används för planarisk djurhållning, använd inte tvål eller rengöringsmedel. Rengör dessa poster genom att skölja dem väl med rent vatten (kranvatten är acceptabelt) och torkning dem med en ren trasa eller pappershandduk.
2. Utarbetande av planarianer för experiment
- Låt nytillkomna planarianer acklimatisera sig till sin omgivning minst 1 vecka före experiment.
- Svälta planarianer i 5–10 dagar före experiment.
- Ändra kulturen vatten minst 1x under svältperioden.
3. Planarian locomotor hastighet (pLmV) test: Stimulerande beteenden
- Före experiment, säkerställa utsvultna planarianer är fullt bildade, med en komplett och pigmenterad huvud och svans.
- Förbered en glas- eller plast 10 cm Petriskål och en tillvänjningsbehållare för pLmV-testet innan försöket påbörjas.
- Placera en ren petriskål med 10 cm diameter som ska användas för pLmV-testet på förlamerat gallerpapper (med 0,5 cm rutor).
- Tillsätt 20 mL oförfalskat källvatten för kontroller, eller källvatten som innehåller lämplig koncentration av den naturliga produkt som testas, till petriskålen med 10 cm diameter som ska användas för pLmV-testet.
- Placera en kamera (t.ex. mobiltelefon eller högupplöst kamera) ovanför den förberedda 10 cm diameter Petri-skålen för att spela in planarisk motilitet över rutnätspapperet under experimentet. Ett ringstativ är ett bekvämt sätt att placera kameran på ett avstånd som kan registrera hela vyn av 10 cm Petriskål och gallerlinjer.
- Bered en habituationsbehållare med 5–10 mL oförfalskat källvatten (kontroller), eller källvatten som innehåller lämplig koncentration av den naturliga produkt som testas. En behållare som liknar en scintillationsflaska eller liten 5 cm Petriskål är lämplig.
- Använd en liten, ren, platt eller rund akvarellpensel för att försiktigt överföra en planarian från lagerbehållaren med källvatten till tillvänjningsbehållaren med 5–10 mL oförfalskat källvatten eller källvatten som innehåller den naturliga produkt som testas.
OBS: När du manipulerar planarianer för pLmV-analysen, använd en liten, ren, platt eller rund akvarellpensel (nummer 3–6). Vid flyttning av planarianer ska borsten placeras under djuret för att lyfta den försiktigt. För att säkerställa planarianer inte skadas när du använder borsten, borsten bör inte splayed ut under djuret. Att sprida sig ut ur borsten kan skada planarian om det fångas mellan fibrer av borsten.
OBS: En bred bore transferpipett kan också användas för överföring av planari i en ren och torr tillvänjningsbehållare.- Om du använder pipetten, avlägsna överflödigt vatten som flyttas med planarian från tillvänjningsbehållaren med hjälp av överföringspipett.
- Tillsätt försiktigt tillvänjningslösningen (dvs. källvatten för kontroller eller källvatten som innehåller den koncentration av naturprodukt som testas) till tillvänjningsbehållaren som innehåller planariet.
- Tillvänjningsperioder kommer att bero på den stimuleringsdynamik som bedöms för den naturliga produkt som testas. En tillvänjningstid på 2 min visade sig vara acceptabel för att upptäcka stimulering i dettaarbete 1.
- Efter 2 min tillvänjningsperioden använda en akvarell pensel för att försiktigt överföra planarian till centrum av den beredda 10 cm Petri skålen för pLmV stimulering experiment.
- Starta kameran för att spela in förflyttning av planarian. Spela in 10–11 min video.
- Förbered tillvänjningsbehållaren och 10 cm Petriskålen för pLmV-experimentet med färska lösningar för varje planarian.
- Använd dedikerade pipetter, disk, behållare och penslar för varje experimentell koncentration av den naturliga produkten som testas för att undvika att oavsiktligt utsätta planarianer för fel lösning under experiment.
- Eftersom planarianer uppvisar inlärda beteenden, varje planarian (kontroll eller test) bör endast användas en gång21,22.
4. Planarian locomotor hastighet (pLmV) test: Tillbakadragande beteenden
- Före experiment, säkerställa utsvultna planarianer är fullt bildade, med en komplett och pigmenterad huvud och svans.
- Förbered en petriskål på 10 cm (glas eller plast) för pLmV-experimentet, en 5 cm petriskål (glas eller plast) för sköljning av planariet efter tillvänjning, och en tillvänjningsbehållare innan experimentet påbörjas.
- Placera en ren petriskål med 10 cm diameter som ska användas för pLmV-experimentet på prelamerat gallerpapper med 0,5 cm rutor).
- Tillsätt 20 mL oförfalskat källvatten till 10 cm diameter Petri-skålen som ska användas för pLmV-experimentet.
- Placera en kamera ovanför den förberedda 10 cm diameter Petriskålen som i steg 3.2.3 för att spela in planarian motility över rutnätet papper under experimentet.
- Förbered den planas sköljbehållaren genom att tillsätta 5 mL enbart källvatten till den 5 cm petriskålen.
- Förbered en tillvänjningsbehållare med 5–10 mL oförfalskat källvatten (kontroller) eller källvatten som innehåller den naturliga produkt som testas. En behållare som liknar en scintillationsflaska eller liten 5 cm Petriskål (glas eller plast) är lämplig.
- Använd en liten, ren, platt eller rund akvarellpensel för att överföra en planarian från källvatten till den förberedda tillvänjningsbehållaren som har 5–10 mL oförfalskat källvatten (kontroller) eller källvatten som innehåller den naturliga produkt som testas. Flytta försiktigt djuret från lagerbehållaren till tillvänjningsbehållaren. Se till att planarian inte skadas av borsten.
OBS: När du manipulerar planarianer för pLmV-analysen, använd en liten, ren, platt eller rund akvarellpensel (nummer 3–6). Vid flyttning av planarianer ska borsten placeras under djuret för att lyfta den försiktigt. För att säkerställa planarianer inte skadas när du använder borsten, borsten bör inte splayed ut under djuret. Att sprida sig ut ur borsten kan skada planarian om det fångas mellan fibrer av borsten.
OBS: En bred bar överföringspipett kan också användas för att överföra planarian i en ren och torr tillvänjning behållare.- Om du använder pipetten bör överflödigt vatten som flyttas med planariet avlägsnas från tillvänjningsbehållaren med hjälp av överföringspipetten.
- Tillsätt försiktigt tillvänjningslösningen (dvs. oförfalskat källvatten för kontroller eller källvatten som innehåller den naturliga produkt som testas) till tillvänjningsbehållaren som innehåller planariet.
- Tillvänjningsperioder för återkallande kommer att bero på den stimuleringsdynamik som bedöms för den naturliga produkt som testas; 2–5 min har visat sig vara tillräckliga.
- Efter tillvänjningsperioden använd en akvarell pensel för att försiktigt överföra planarian till den beredda 5 cm Petri skålen innehåller källvatten för att skölja bort någon naturlig produkt från tillvänjning behållaren. Se till att planarian inte skadas av borsten.
- Omedelbart överföra planarian till centrum av den beredda 10 cm Petri skålen som innehåller källvatten för pLmV tillbakadragande experiment. Se till att planarian inte skadas av borsten.
- Starta kameran för att spela in förflyttning av planarian. Spela in 10–11 min video.
- Förbered tillvänjningsbehållaren, sköljbehållaren och 10 cm Petriskålen för pLmV-experimentet med färska lösningar för varje planarian.
- Använd dedikerade pipetter, disk, behållare och penslar för varje experimentell koncentration av den naturliga produkten som testas för att undvika att oavsiktligt utsätta planarianer för fel lösning under experiment.
- Eftersom planarianer uppvisar inlärda beteenden, använd varje planarian (kontroll eller test) endast en gång26,27.
5. Dataanalys
- Förbered en datainsamlingstabell för att dokumentera beteendet och motiliteten hos planarianer när antalet rutnätslinjer som korsas för varje minut under pLmV-körningen. Tabellen bör tillåta att det ackumulerade antalet rader per minut som korsas av planarianen ska dokumenteras också. Inkludera rader för anteckningar och en tabell med definitioner för att stämmer observation av beteenden under den experimentella perioden, till exempel 'vandra' och 'stopp' (se Diskussion).
- Med hjälp av videon räknar du antalet fullständiga rutnätslinjer som korsas av planarian per minut i 10 min, och registrerar det numret på datatabellen. Typiskt planariskt beteende består av kontinuerlig hastighet, framåtsyst riktad, horisontell rörelse, med periodiska svängar och utan stopp.
- Börja med att tid experimentet vid den punkt som planarian har flyttat från penseln används för att överföra den till 10 cm Petriskål. Spela in den här starttiden.
- För att avgöra när djuret korsar en hel rutnätsruta, fokusera på huvudet och poäng en linje när huvudet helt korsar en kvadrat.
- För att göra en fullständig rutnät när masken rör sig runt kanten av skålen, visualisera ett avstånd på 0,5 cm genom att hänvisa till linjerna som de sträcker sig ut från marginalerna på skålen. Om planarianen korsar hörnet av en ruta, referera till den andra linjen korsade för att göra mål en rutnätslinje. Återigen, fokusera på huvudet för att göra dessa bestämningar.
- Stoppa videon efter varje minut för att spela in data.
- När du startar om videon för att räkna nästa minut, om chefen för masken var mellan rutnätslinjer när videon stoppades, spela in den första linjen korsade som en full ruta.
- Betyg antalet rutnätslinjer korsade i 10 min.
- Om djuret slutar röra sig under ett pLmV-test och inte längre korsar rutnätslinjer under inspelningstiden på 10 min, dokumenterar du planarianens beteende i beteendediagrammet (t.ex. Djur som upphör med sitt framåtspår under pLmV-analysen bör i stället tas till vara och uppgifterna presenteras som en frekvens av det totala antalet djur som exponeras för den reagenskoncentrationen. Coiling eller krampivt beteende (känd som ett C-beteende) förhindra någon framåt rörelse under tillvänjningsperioden indikerar att koncentrationen av den naturliga produkten inte är lämplig för användning i en pLmV-analys eftersom pLmV-analysen är motility-baserade. C-typ beteenden kan analyseras med hjälp av en annan typ av analys (se Diskussion).
- Testa om möjligt flera experimentella koncentrationer av den naturliga produkten med minst 9–12 maskar på olika dagar och olika tider på dagen om man fastställer reagensens totala effekt på planarisk fysiologi. Men om forskare strävan att minska dygnsrytmen-inducerad variabilitet, experiment kan genomföras med konstant belysning vid en uppsättning tid på dagen med hjälp av maskar som odlas med tidsbestämda ljus / mörker cykler och ställa utfodring gånger. Har minst två experimentörer som deltar i projektet för att möjliggöra möjligheten att ha en enskild postdata, medan den andra individen räknar rutnätslinjerna "blinda" till de villkor som används för datainsamling. Att ha olika individer som är involverade i datainsamling, samt statistiska beräkningar och analyser, minskar också möjliga bias.
- Beräkna rutnätslinjeantal för varje naturlig produktkoncentration varje dag som i förhållande till kontrollantal för varje minut så att data från olika dagar, tider och experimenter kan kombineras. Dessa data kan i genomsnitt och sedan analyseras med hjälp av Students T-tester. P-värden för varje test kan bedömas per minut jämfört med kontrollen och mellan reagenskoncentrationer. ANOVA-bedömningar med hjälp av datamängder som härrör från olika experimentella koncentrationer ger ytterligare en analysmetod.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Laboratoriet inrättas och förberedelse av arbetsytan för att köra pLmV analysen bör slutföras innan experiment börjar. Detta inkluderar beredning av tillvänjningsbehållaren, sköljbehållare om det behövs (för utsättningsexperiment), Petriskål över laminerat gallerpapper, och korrekt placerad kamera (Figur 1). När alla videor är tagna, är det lämpligt att använda ett gemensamt datablad för att standardisera datainsamling och presentation mellan utredare (Figur 2 och Bild 2 Tillägg).
Kameran som inrättats bör möjliggöra en klar bild av planarian och nätet papper för att möjliggöra en korrekt bedömning av hur länge djuret under hela försöket (Figur 3A och figur 3A Tillägg). Datainsamlingen bör omfatta antalet korsade rutnätslinjer, samt det ackumulerade totala antalet linjer som korsas per minut av experimentet (Bild 3B). Under pLmV-analys har planarianerna en kontinuerlig hastighet, framåtsträvlig, horisontell rörelse, med periodiska svängar, och stannar inte. När början, den första fullständiga rutnätet rutan korsade bör poängsas som en, inte den första raden som bestäms i exemplet video. Det är viktigt att registrera starttiden för riktningsrörelsen efter att planarian är fri från den pensel som används för att överföra den till pLmV-skålen, och sedan fullfölja för varje minut därefter. Om en planarian är en del av vägen genom en ruta vid minuttid, nästa rutnät linje korsade efter omstart av videon bör räknas som en full ruta. När djuret rör sig runt kanten av skålen, hänvisa till linjerna som de sträcker sig ut från skålen för att bestämma ett avstånd på 0,5 cm. När maskar stöter på hörnet av en ruta, hänvisa till den andra linjen korsade för att göra mål en rutnätslinje. Alltid fokusera på huvudet för att göra dessa bestämningar. Om planarian börjar täcka ett tätt område, bör experimenter igen följa chefen för masken för att övervaka avståndet för en full gallerlåda. Ett exempel på detta beteende ingår i den kompletterande video (Figur 3A tillägg).
För att standardisera resultaten från varje försök bör pLmV-körningarna beräknas och plottas som antalet rutor som korsas i förhållande till förloppet för den matchande kontrollmasken (Bild 3B). Varje användare bör tränas att utföra de assay och räkna grid linjer före början tester med hjälp av reagens av intresse. Som riktmärke, med hjälp av den experimentella inrättas, planarianer i källvatten normalt täcka cirka 24 lådor i 3 minuter (Figur 4A; data från 4 användare, genomsnitt 24,8 ± 4,8). Ett intervall av testreagenskoncentrationer bör undersökas för att bestämma vilken typ av beteendeanalys som ska användas för varje. För pLmV-analys bör forskare avgöra om djuren uppvisar motilitet när de utsätts (Bild 4B). Andra typer av beteendeanalyser kan vara effektivare för olika typer av beteenden (se diskussion). I förhållande till källvattenkontrollen kommer stimulerande data att visa ett ökande antal rutlinjer som korsas när djuret rör sig genom pLmV-behållaren med den önskade koncentrationen av testreagensen i källvatten, efter att ha vants i samma koncentration av testreagensen. Däremot kommer uttagsdata att visa ett minskande antal rutlinjer korsade, i förhållande till källvattenkontrollen, när planarianen rör sig genom pLmV-behållaren som har källvatten ensam, efter att ha vants i den önskade koncentrationen av reagensen blandas i källvatten (Figur 4C och 4D). Noterbart är att data om ett övertagettagetmre kan leda till att näten räknas mindre än kontrollernas, vilket har observerats i droginducerade uttagsdata av andragrupper 2,6.
Spring vattenkontroll planarians kommer att flytta över rutnätslinjer under hela experimentet. Det är dock möjligt för testplanarianer att upphöra att korsa rutnätslinjer under analysen. Om detta inträffar bör dessa data markeras separat från data om maskar som underhåller deras framsteg över rutnätslinjerna. Att dokumentera dessa uppgifter i procent av det totala antalet djur som exponeras för just den reagenskoncentrationen är ett effektivt sätt att illustrera den relativa frekvensen av dessa fynd (figur 5A-C, figur 5A Tillägg och Figur 5B Tillägg). Beteenden som inte hindrar planarianerna från att korsa rutnätslinjer bör ingå i pLmV-analysen, även om dessa rörelser hindrar djurens stadiga framsteg.
Bild 1: Representativt upplägg för pLmV-analysen.
Laboratorieutrymmet bör beredas före början analysen. Visas är en typisk setup med en 10 cm Petriskål placeras över laminerat 0,5 cm gallerpapper. En dokumentkamera är placerad så att en klar bild av 10 cm Petriskålen kan spelas in på en länkad dator. Men kan någon kamera användas för inspelning av utvecklingen av planarianerna under experimentet inklusive en mobiltelefon kamera placerad ovanför Petri-skålen med hjälp av en ring stativ. I bakgrunden är en 5 cm Petriskål att skölja maskar för tillbakadragande experiment, liksom små vita behållare som används för habituating de planarians. Också, i bakgrunden är märkta, dedikerade runda akvarell penslar, pipetter, och Petri rätter för varje produkt koncentration. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 2: pLmV-datablad.
Ett förberett datablad för att registrera antalet rutlinjer som korsas, motsvarande släkting till kontrolldata, samt ett medel för att stämmer några beteenden är användbart för datainsamlingsändamål. Se figur 2 Tillägg för en nedladdningsbar PDF-version av denna figur. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 3: Representativt pLmV-experiment och datablad.
(A) En kamera bör placeras ovanför 10 cm Petri-skålen som används för pLmV-analysen så att planarian och hela 0,5 cm rutnät under skålen syns tydligt. Den fullständiga pLmV-körningen ska registreras (Bild 3A-tillägg), och (B) antalet rutnätslinjer som varje minut har placerats i en förberedd datatabell. De ackumulerade totala rutlinjerna som korsas bör räknas samman, och sedan bör dessa konverteras till antalet ackumulerade linjer som korsas i förhållande till motsvarande källvattenkontrollmask. Uppgifterna på den figurtabell som tillhandahålls (B) matchar de räknas med hjälp av den kompletterande video (Figur 3A Tillägg). Motsvarande kontrollantal visas inte. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 4: Representativa grafer över uppgifter om stimulantia och återkallelse.
Forskare bör utbildas för att använda och poäng pLmV analys rutnät linjer med hjälp av källvatten ensam före experiment. Typiskt, planarianer resa cirka 25 rutnät linjer i 3 min. (A) Data från fyra användare visas, var och en med 10 källvatten kontroll maskar. För att uppskatta effekten av ett reagens på planarisk motilitet, undersöks en serie koncentrationer med hjälp av pLmV-analysen och det totala antalet rutlinjer som korsas undersöks i förhållande till motsvarande kontrollantal vid 3 minuter. (B) Kontrolldata representeras av den vita stapeln. Testdata representeras av de svarta fälten, med de koncentrationer som används i mM. I förhållande till kontrolldata bör ritas för att bäst representera de data som samlas in. (C) Stimulerande data som representeras av den blå linjen / diamanter, kommer att visa en ökning av rutnätslinjer korsade, kontra (D) uppgifter om tillbakadragande, också representeras av den blå linjen / diamanter, kommer att visa en minskande lutning från en inledande start värde, i förhållande till kontrolldata, som framgår av den röda linjen / rutor i både (C och D). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 5: Observation och dokumentation av beteendedata.
Planarianer i pLmV-analysen som inte upprätthåller riktningsrörelsen under experimentet, men sluta med karakteristiska beteenden och inte längre röra sig över gallren bör stäms. Typiska beteenden kan omfatta displayer som 'vandra' (A och figur 5A Supplement), och 'stop' (B och Figur 5B Supplement). Dessa stämmer av beteendemässiga data bör presenteras för att dokumentera frekvensen av dessa beteenden jämfört med alla de djur som utsätts för att produktkoncentration (C). Visas är provdata som dokumenterar procentsatserna för källvattenkontrolldjur (Ci), och djur som utsätts för en stimulerande (Cii), som har en vandring (blå), stoppa (röd) eller ingen (grön) beteende. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En okomplicerad och tillgänglig planarian motility assay beskrivs för att bestämma stimulerande och abstinenseffekter av naturliga produkter. Som beteendemodell är det nödvändigt att ha stränga protokoll för poängsättning rörelse och tydliga definitioner av eventuella beteenden för att standardisera observationer mellan olika experimentörer. De framlagda idéerna erbjuder en demonstration av hur detta kan uppnås. Varje laboratorium som använder detta protokoll bör anpassa den presenterade informationen så att den passar effekterna av den särskilda produkt som testas. Det rekommenderas att noggrant ställa in arbetsytan för att säkerställa tester kan göras under konsekventa förhållanden av varje utredare som deltar i studien (Figur 1). Standardiserade inspelningsark kan sammanställas för att bistå med exakt registerhållning och datainsamling om motilitet och beteenden (figur 2 och figur 3B).
Motility tester bör göras vid olika tidpunkter på dagen, med hjälp av olika partier av planarianer om möjligt, för att ta hänsyn till divergerande inneboende dygnsrytm verksamhet. Även om dessa analyser inte har genomförts, föreslås det att utredarna övervaka hur den planarian dygnsrytmen kan påverka motiliteten genom att upprätthålla planarianer med hjälp av en vanlig ljus / mörk cykel (t.ex. 12/12), och när du utför pLmV-analysen, använda standard ljusförhållanden och köra testerna vid samma tidpunktpå dagen 32,33,34. Forskare bör öva mekaniken i pLmV-analysen och lära sig att räkna rutnätslinjer för att standardisera både hanteringen av planarianerna och bedömningen av planarisk motilitet (Figur 3). Detta bör göras med hjälp av oförfalskad källvatten kontroller. Typiskt, efter 10–20 sådana övningskörningar, blir data ganska standard för alla laboratoriemedlemmar. Räknas efter en inställd pLmV tid bör väljas för att jämföra framsteg i att lära analysen. Utredare observerar vanligtvis cirka 24 rutnätslinjer korsade med 3 min i pLmV-analysen i källvatten efter en 2 min tillvänjning i källvatten (Figur 4A; representativa data för fyra utredare med 10 slumpmässiga källvattenkontroller vardera; 24,8 ± 4,8 rutnätslinjer). Med två eller tre utbildade utredare som utför varje uppsättning tester kan ytterligare förbättra tillförlitligheten i resultaten eftersom alla användarspecifika effekter på metoden och räknas kan beaktas i felanalysen. På detta sätt kan tester och räkningar bytas mellan utredare så att räkningar kan göras "blinda" för experimentella förhållanden. För att minska risken för partiskhet, olika individer kunde genomföra statistiska tester på räkna data och utföra de efterföljande analyserna. Utanför förekomsten av den produkt som testas bör miljövariationer i vattenkvalitet såsom temperatur och pH undvikas. Eftersom planarianer är ljuskänsliga bör inställningen av experimentet se till att belysningen av arbetsytan är jämn. Slutligen, eftersom planarians kan uppvisar inlärda beteenden, varje mask, inklusive kontroller, bör endast användas en gång26,27.
Det är bra att ha en experimentell checklista i labbet om flera experimentörer arbetar med analysen, särskilt i en grundutbildning forskningslaboratorium, för att undvika vanliga fallgropar som kan uppstå när du kör pLmV testet, vilket skulle påverka det statistiska värdet av resultaten. Alla lösningar bör vara i rumstemperatur eftersom planarian motilitet reduceras vid lägre temperaturer. Man bör se till att exemplaren är utsvultna 5–10 dagar före deras användning och att varje exemplar är fullt format, med ett helt pigmenterat huvud och svans. Det föreslås också att dedikerade platta eller runda akvarellpenslar (nummer 3–6), tillvänjningsbehållare och Petri-rätter ska användas för varje experimentell koncentration för att göra arbetsflödet smidigare för experimentören. Tekniken att överföra planarianerna med hjälp av små platta eller runda akvarellpenslar bör utövas i stor utsträckning av utredarna för att säkerställa effektiv överföring av maskarna mellan behållare utan att orsaka skada eller ångest för djuren (se diskussionen ovan; Bild 4A). Användningen av dessa penslar minimerar överföringen av vätskor mellan behållarna och minskar potentiell stress på planarianerna. Men planarianer kan skadas av borst om fibrerna sprids eller utspelas när de kontaktar djuret.
Eftersom pLmV-analysen bygger på beteendedata är det viktigt att använda en tillräckligt stor datauppsättning för att säkerställa robusta data trots medfödd mask-till-mask svar variabilitet. Som sådan använder de flesta laboratorier minst nio till tolv planarianer för att testa varje koncentration av den produkt som undersöks, särskilt eftersom naturliga produkter kanske inte har lika markerad effekt som standard läkemedel1,2,3,4,5,6,7,13,14,15,16,35,36. Antalet rutnätslinjer som korsas varje minut beräknas i förhållande till källvattenkontrolldata för varje testdag och tid. Dessa data är i genomsnitt för varje testkoncentration för varje minut och jämfört med kontrolldata, samt med andra tidsmatchade koncentrationer med hjälp av både Students T-tester och ANOVA.
PLmV-analysen är inriktad på studier av reagenser som påverkar motiliteten hos planarianerna under den tid som analysen tiden. Detaljerade studier av planarisk förflyttningar kan genomföras med hjälp av ett antal andra bedömningar som beskrivs i litteraturen4,35,36,37,38. Därför är det klokt att genomföra en serie tillvänjningsexperiment för att ta del av hur planarianerna reagerar på testreagensen med hjälp av en rad koncentrationer och jämföra eventuella effekter med maskarnas beteende i källvatten innan de påbörjar beteendetester. På så sätt kan lämpligt beteendetest väljas för att studera de individuella manér som reagensen framkallat på planarian. Planarianerna kan placeras i olika koncentrationer av reagenset under 5–10 min för att avgöra om en koncentration tillåter dem att behålla sitt typiska simbeteende. Beteenden som inte tillåter motilitet, såsom de som resulterar i en C-typ, eller konvulsiv eller beslag-liknande beteende, har varit i fokus för studier med hjälp av separata typer av beteendeanalyser som kan tillämpas på denna metod4,39,40. pLmV-analyser kan genomföras med hjälp av en rad koncentrationer efter korta tillvänjningstider och antalet totala rutnätslinjer som korsas vid 3 min som fick poäng i förhållande till källvattenkontroller före tidskursstimulering och abstinensanalyser (Bild 4B)1,2,3,4,5. Utredare uppmanas att prova andra gånger, till exempel 15, 30 och 60 min, för att se om stimuleringsdynamiken förändras med exponeringstid1. Som har rapporterats, i källvatten kontroll maskar upprätthålla en stadig, framåt-riktad horisontell rörelse för 10 min analys tid1,4. Däremot kan produktbehandlade maskar stoppa och upphöra med sin riktningsmotilitet under analysen och inte längre korsa gallerlinjer. Prövaren kan göra en bedömning om att begränsa längden på den experimentella pLmV springa eller härleda ett sätt att bedöma dessa beteenden som beskrivs. Det är dock viktigt att bedöma frekvensen av dessa beteenden, eftersom de ger ytterligare data som påverkar motilitet. Motilitets- och förflyttningsdata diskuteras separat inom området eftersom en kombination av informationen förvirrar bedömningen av sådana uppgifter4,35,36,37,38. Som ett exempel observerades två beteenden när maskarna stannade och inte längre korsade rutnätslinjer under analysen. Dessa rörelser benämns "vandra" (Bild 5A Och Figur 5A-tillägg), och "stopp" (Bild 5B Och Bild 5B Tillägg). Frekvensen av dessa beteenden dokumenteras som procentandelar av alla de djur som exponeras för den särskilda produktkoncentrationen tillsammans med kontrolldata (Bild 5C). Viktigt är att slumpmässiga beteenden som inte hindrar planarian från att korsa rutnätslinjer bör ingå i pLmV-analysen, även om dessa rörelser hindrar djurens stadiga framsteg (Bild 4B, 3 mM och 10 mM barer). Som nämnts har utredarna beskrivit ett antal beteendemässiga kategorier som är utanför ramen för denna diskussion om pLmV graden av motility protokoll4,35,36,37,38.
PLmV-analysen är beroende av vattenlösligheten hos den produkt som är under utredning. Många av dessa ämnen är dock inte helt lösliga i vatten och som sådan kan endast de vattenlösliga portionerna testas genom denna analys medan resten måste filtreras från lösningen som har gjorts i tidigare arbete1. Om pLmV-analyser körs med hjälp av reagenser som solubiliserats med hjälp av andra lösningsmedel än vatten, kräver dessa en volymekvivalent kontroll utöver kontrollen av källvatten. Medan denna metod inte har använts med sådana ämnen, bör sådana vektorkontroller sannolikt behandlas som ett test, och motiliteten fick i förhållande till kontroller, vilket skulle vara något annat testämne. Ett annat möjligt sätt att testa icke-lösliga ämnen skulle vara att mata dem till planarianerna genom att blanda dem i livsmedelsgeler. Denna teknik används för att införa siRNA till planarianer i gen knock-down/RNAi experiment41. Utfodring planarians biologiska produkter och siRNA, dock presenterar komplikationer till denna analys i att de planarianer inte skulle svälta och kan inte överföras till behållaren motility assay inom en standardiserad tid som säkerställer lika exponering eller intag av produkten under utredning av försöksdjuren före testning.
När stimulerande och tillbakadragande dynamik upprättas med hjälp av pLmV-analysen, ytterligare experiment kan innebära comodulators, införandet av siRNA, samt biologiska vägmodifierare eller läkemedel för att testa för augmentation eller hämning av de observerade motility effekter jämfört med de första resultaten samlas in när inte använder dessa biomodulatorer1,3. Till exempel, downregulating uttrycket av en gen eller lägga utbildningsavsnitt hämmare kan minska rörelsehastigheten, medan andra kan ändra dynamiken i tillbakadragande. Genom observation av ändrade pLmV-resultat kan dessa ytterligare experiment ge insikt i den underliggande fysiologi som påverkas av en naturlig produkt eller annan testreagens5,42,43,44.
Det förfarande som beskrivs är mottagliga för alla laboratorium som är intresserade av att bestämma stimulerande och abstinenseffekter av en mängd olika biomodulatorer, inklusive många naturliga produkter. Fördelar med tillämpningen av den planiska pLmV-analysen är bland annat hur billiga och lätta att underhålla dessa djur är, och att de också kan vara ämnen för andra planarianbaserade analyser för att ge en bred förståelse för de fysiologiska effekterna av den produkt som är föremål för undersökning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill erkänna kontoret för institutionella Advancement, och Morrisville College Foundation för en publikation bidrag för att stödja detta arbete, liksom SUNY Morrisville Collegiate Science and Technology Entry Program (CSTEP) för deras pågående stöd och stöd till grundutbildningen forskning vid SUNY Morrisville. Vi vill också tacka Sophia Hutchens för hjälpsamma kommentarer om den teknik som beskrivs.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bottled Water - 1 Gal. | Poland Spring | N/A | Spring water for planarian culture and to prepare solutions |
| Brown Planaria (Dugesia tigrina) | Carolina Biological Supply Company | 132954 | Brown planaria living (other species are acceptable) |
| Flat Paintbrush | Royal Crafter's Choice | 9159 | Flat watercolor paintbrushes for cleaning planarian culture containers |
| Glass Petri Dish - 10 cm | Kimax | N/A | 10 cm diameter (glass) Petri dishes for pLmV assay |
| Glass Petri Dish - 5 cm | Kimax | N/A | 5 cm and Petri dishes for rinsing planarians during withdrawal experiments and for stimulant habituation |
| Grid Paper | Any | N/A | Standard 0.5 cm grid paper for pLmV assay |
| iPEVO Visualizer (software) | iPEVO | https://www.ipevo.com/software/visualizer | Document camera software for video capture and recording |
| Metalware Set with Support Stand and Retort Ring | Any | N/A | Standard chemistry lab ring stand to hold a cell phone camera if used |
| Organic Egg | Any | N/A | Organic egg or beef liver for feeding planarains |
| Polycarbonate Bottle w/ Screw-on Cap - 10 mL | Beckman | N/A | Plastic vials to hold 5 to 10 mL volumes for stimulant habituation |
| Round Storage Container - 10 cm | Ziploc | N/A | 10 cm Round food storage containers for approximately 90 planarians or fewer |
| Round Water Paint Brush | LOEW-Cornell | N/A | Small round watercolor paint brushes (numbers 3 to 6) - soft |
| Transfer Pipette | Any | N/A | Wide bore (5 mL) plastic transfer pipettes to move planarians |
| USB Document Camera | iPEVO | CDVU-06IP | Document camera (or other camera or cell phone camera) |
References
- Moustakas, D. Guarana provides additional stimulation over caffeine alone in the planarian model. PloS One. 10 (4), 0123310 (2015).
- Raffa, R. B., Valdez, J. M.
- Raffa, R. B., Holland, L. J., Schulingkamp, R. J. Quantitative assessment of dopamine D2 antagonist activity using invertebrate (Planaria) locomotion as a functional endpoint. Journal of Pharmacology and Toxicological Methods. 45 (3), 223-226 (2001).
- Thumé, I. S., Frizzo, M. E. Sertraline induces toxicity and behavioral alternations in planarians. Biomedical Research International. 2017, 5792621 (2017).
- Aggarwal, S., et al. Identification of a novel allosteric modulator of the human dopamine transporter. ACS Chemical Neuroscience. 10 (8), 3718-3730 (2019).
- Zhang, C., Tallarida, C. S., Raffa, R. B., Rawls, S. M. Sucrose produces withdrawal and dompamine-sensitive reinforcing effects in planarians. Physiology & Behavior. 0, 8-13 (2013).
- Zewde, A. M., et al. PLDT (planarian light/dark test): an invertebrate assay to quantify defensive responding and study anxiety-like effects. Journal of Neuroscience Methods. 293, 284-288 (2018).
- Risse, B., Otto, N., Berh, D., Jiang, X., Klämbt, C. FIM Imaging and FIMtrack: two new tools allowing high-throughput and cost effective locomotion analysis. Journal of Visualized Experiments. (94), e52207 (2014).
- Inoue, T., Hoshino, H., Yamashita, T., Shimoyama, S., Agata, K. Planarian shows decision-making behavior in response to multiple stimuli by integrative brain function. Zoological Letters. 1, 7 (2015).
- Hastrom, D., Cochet-Escartin, O., Zhang, S., Khuu, C., Collins, E. M. S. Freshwater planarians as an alternative animal model for neurotoxicology. Toxicological Sciences. 147 (1), 270-285 (2015).
- Risse, B., Berh, D., Otto, N., Klämbt, C., Jiang, X. FIMtrack: an open source tracking and locomotion analysis software for small animals. PLoS One Computational Biology. 13 (5), 100553 (2017).
- Pagán, O. R. Planaria: an animal model that integrates development, regeneration and pharmacology. International Journal of Developmental Biology. 61, 519-529 (2017).
- Palladini, G. A pharmacological study of cocaine activity in planaria. Comparative Biochemistry and Physiology. 115 (1), 41-45 (1996).
- Buttarelli, F. R., Pellicano, C., Pontieri, F. E. Neuropharmacology and behavior in planarians: translation to mammals. Comparative Biochemistry and Physiology Part C. Toxicology & Pharmacology. 147 (4), 399-408 (2008).
- Nishimura, K., et al. Identification of glutamic acid decarboxylase gene and distribution of GABAergeric nervous system in the planarian Dugesia japonica. Neuroscience. 153 (4), 1103-1114 (2008).
- Raffa, R. B., Rawls, S. M. A model for drug action and abuse. , Landes Bioscience. Austin, TX. (2008).
- Hall, F., Morita, M., Best, J. B. neoplastic transformation in the planarian: I cocarcinogenesis and histopathology. The Journal of Experimental Zoology. 240 (2), 211-227 (1986).
- Voura, E. B., et al. Planarians as models of cadmium-induced neoplasia provide measurable benchmarks for mechanistic studies. Ecotoxicology and Environmental Safety. 142, 544-554 (2017).
- Van Roten, A., et al. A carcinogenic trigger to study the function of tumor suppressor genes in Schmedtea mediterranea. Disease Models and Mechanisms. 11 (9), 032573 (2018).
- Mason, P. R.
- Van Huizen, A. V., et al. Weak magnetic fields alter stem cell-mediated growth. Science Advances. 5 (1), 7201 (2019).
- Brown, H. M., Ogden, T. E. The electrical response of the planarian ocellus. Journal of General Physiology. 51 (2), 255-260 (1968).
- Inoue, T., Yamashita, T., Agata, K. Thermosensory signaling by TRPM is processed by brain serotonergic neurons to produce planarian thermotaxis. The Journal of Neuroscience. 34 (47), 15701-15714 (2014).
- Byrne, T. Effects of ethanol on negative phototaxis and motility in brown planarians (Dugesia tigrina). Neuroscience Letters. 685, 102-108 (2018).
- de Sousa, N., et al. Transcriptomic analysis of planarians under simulated microgravity or 8g demonstrates that alteration of gravity induces genomic and cellular alterations that could facilitate tumoral transformation. International Journal of Molecular Sciences. 20 (3), 720 (2019).
- Best, J. B., Rubinstein, I. Maze learning and associated behavior in planaria. Journal of Comparative and Physiological Psychology. 55, 560-566 (1962).
- Shomrat, T., Levin, M. An automated training paradigm reveals long-term memory in planarians and its persistence through head regeneration. The Journal Experimental Biology. 216, Pt 20 3799-3810 (2013).
- Robarts-Galbraith, R. H., Newmark, P. A. On the organ trail: insights into organ regeneration in the planarian. Current Opinion in Genetics & Development. 32, 37-46 (2015).
- Ivancovic, M., et al. Model systems for regeneration: planarians. Development. 146 (17), 167684 (2019).
- Herath, S., Lobo, D. Cross-inhibition of Turing patterns explains the self-organized regulatory mechanism of planarian fission. Journal of Theoretical Biology. 485, 110042 (2019).
- Animal Diversity. , Available from: http://animaldiversity.ummz.umich.edu/accounts/Dugesia_tigrina/ (2019).
- Itoh, M. T., Shinozawa, T., Sumi, Y. Circadian rhythms of melatonin-synthesizing enzyme activities and melatonin levels in planarians. Brain Research. 830 (1), 165-173 (1999).
- Itoh, M. T., Igarashi, J.
- Hinrichsen, R. D., et al. Photosensitivity and motility in planarian Schmedtea mediterranea vary diurnally. Chronobiology International. 36 (12), 1789-1793 (2019).
- Raffa, R. B., Desai, P. Description and quantification of cocaine withdrawal signs in planaria. Brain Research. 1032 (1-2), 200-202 (2005).
- Pagán, O. R., et al. A cembranoid from tobacco prevents the expression of induced withdrawal behavior in planarian worms. European Journal of Pharmacology. 615 (1-3), 118-124 (2009).
- Rawls, S. M., Patil, T., Yuvasheva, E., Raffa, R. B. First evidence that drugs of abuse produce behavioral sensitization and cross-sensitization in planarians. Behavioural Pharmacology. 21 (4), 301-313 (2010).
- Venturini, G., et al. A pharmacological study of dopaminergic receptors in planaria. Neuropharmacology. 28 (12), 1377-1382 (1989).
- Ouyang, K., et al. Behavioral effects of Spenda, Equal and sucrose: Clues from planarians on sweeteners. Neuroscience Letters. 636, 213-217 (2017).
- Pagán, O. R., Montgomery, E., Deats, S., Bach, D., Baker, D. Evidence of nicotine-induced, curare-sensitive, behavior in planarians. Neurochemical Research. 40 (10), 2087-2090 (2015).
- Shibata, N., Agata, K. RNA interference in planarians: feeding and injection of synthetic dsRNA. Methods in Molecular Biology. 1774, 455-466 (2018).
- Pagán, O. R., et al. Reversal of cocaine-induced planarian behavior by parthenolide and related sesquiterpene lactones. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 89 (2), 160-170 (2008).
- Vouga, A., et al. Stereochemistry and neuropharmacology of a 'bath salt' cathinone: S-enantiomer of mephedrone reduces cocaine-induced reward and withdrawal in invertebrates. Neuropharmacology. 91, 109-116 (2015).
- Chan, J. D., Marchant, J. S. Pharmacological and functional genetic assays to manipulate regeneration of the planarian Dugesia japonica. Journal of Visualized Experiments. (54), e3058 (2011).
