Summary
La motilité planaire est utilisée pour évaluer les propriétés stimulantes et de retrait des produits naturels par rapport au mouvement des animaux dans l’eau de source seulement.
Abstract
Un moyen simple et contrôlable d’utiliser le planaire non parasitaire, Dugesia tigrina, un ver plat aquatique vivant libre, pour étudier les propriétés stimulantes et de sevrage des produits naturels est décrit. Des essais expérimentaux bénéficiant d’aspects uniques de la physiologie planaire ont été appliqués aux études sur la cicatrisation des plaies, la régénération et la tumeur. En outre, parce que les planaires présentent une sensibilité à une variété de stimuli environnementaux et sont capables d’apprendre et de développer des réponses conditionnées, ils peuvent être utilisés dans des études comportementales examinant l’apprentissage et la mémoire. Les planaires possèdent une symétrie bilatérale de base et un système nerveux central qui utilise des systèmes de neurotransmetteurs pouvant être utilisés pour étudier les effets des biomodulateurs neuromusculaires. Par conséquent, des systèmes expérimentaux de surveillance des mouvements planaires et de la motilité ont été développés pour examiner la toxicomanie et le sevrage. Parce que la motilité planaire offre le potentiel d’un système sensible et facilement standardisé d’analyse de motilité pour surveiller l’effet des stimuli, le test de vitesse locomotrice planaire (pLmV) a été adapté pour surveiller à la fois les comportements de stimulation et de retrait par les planaires par la détermination du nombre de lignes de grille croisées par les animaux avec le temps. Ici, la technique et son application sont démontrées et expliquées.
Introduction
Le protocole décrit utilise la motilité planaire pour fournir un moyen d’évaluer les effets de biomodulisation des substances naturelles. Il a été spécifiquement adapté pour déterminer si ces substances fonctionnent comme stimulants, et si elles ont ensuite été associées à un comportement de retrait mesurable1. Ce test, connu sous le nom de test de vitesse locomotrice planaire (pLmV), a d’abord été utilisé pour tester les agents pharmacologiques connus2,3. L’application de ce test à base de motilité planaire a depuis gagné en popularité et a été adoptée par différents laboratoires intéressés par des substances autres que les produits naturels4,5. Pour ce test, un planaire est placé dans une boîte de Pétri contenant de l’eau de source ou de l’eau de source contenant un biomodulateur dissous. Étant donné que le plat lui-même est placé sur du papier graphique, le nombre de lignes de grille traversées par l’animal avec le temps pendant qu’il se déplace sur le récipient peut être utilisé pour déterminer le taux de mouvement dans chaque état. Le critère de la lumière/obscurité, autrement appelé le critère de préférence des lieux conditionnés (RPC), est une autre variation sur le thème de la surveillance de la motilité planaire, et évalue la rapidité avec laquelle les animaux réagissent et migrent vers un environnement obscurci6,7. Le suivi vidéo des mouvements planaires peut également être analysé à l’aide de programmes informatiques et de suivi du centre de masse (COM)8,9,10,11.
L’utilisation du planaire comme modèle animal pour de telles études offre plusieurs avantages par rapport aux autres animaux en ce que l’expérimentateur peut facilement contrôler l’environnement d’essai. Plus précisément, la faim des planaires avant l’expérimentation peut empêcher leur exposition à d’autres agents nutritionnels ou pharmacologiques qui pourraient autrement confondre les résultats, et le biomodulateur spécifique à l’étude peut être introduit aux planaires simplement en l’ajoutant directement à l’eau de culture, standardisant ainsi l’exposition. Puisque les planaires ont un système nerveux et des neurotransmetteurs qui rappellent des animaux « d’ordre supérieur », la physiologie et les réponses expérimentales de ces animaux aux stimuli neuromusculaires sont considérés biologiquement pertinents pour d’autres organismes12,13,14,15,16. De plus, comme les planaires sont relativement peu coûteux et faciles à entretenir en laboratoire, ils offrent un modèle biologique accessible à de nombreux chercheurs.
En tant qu’animal expérimental, les planaires conviennent à un large éventail d’études. Par exemple, notre groupe, ainsi que d’autres chercheurs utilisent des planaires pour étudier tumorigenesis17,18,19. Les planaires présentent également une foule de comportements de réponse aux stimuli chimiques, thermiques, gravitationnels, électriques, photographiques et magnétiques qui ont formé la base d’autres systèmes d’essai. Certains de ces effets ont été utilisés pour étudier l’apprentissage et la mémoire chez ces animaux20,21,22,23,24,25,26,27. L’utilisation principale du modèle planaire dans la littérature se concentre actuellement sur l’activité des cellules souches pluripotentes planaires, appelées néoblastes, et leur rôle dans la régénération28,29,30. Ainsi, l’adoption du modèle décrit ici permet d’étudier plus en détail d’autres tests basés sur des planaires afin de fournir une compréhension plus large de la façon dont les produits naturels et autres biomodulateurs affectent l’organisme.
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Protocol
1. Élevage planaire
- Utilisez des planaires achetés auprès d’une société d’approvisionnement biologique ou capturés à l’état sauvage si nécessaire. Les planaires utilisés dans ce protocole sont Dugesia tigrina, comme indiqué dans la liste de fournitures. Cette espèce est également appelée Girardia tigrina31. D’autres espèces planaires aquatiques sont également acceptables2,3.
REMARQUE : Le protocole décrit s’adresse aux animaux achetés auprès d’une société d’approvisionnement biologique. Ce système d’essai n’a pas été testé avec des planaires capturés à l’état sauvage. Toutefois, si des planaires capturés à l’état sauvage sont utilisés, il est recommandé qu’ils soient habitués à l’eau utilisée dans les expériences, ainsi qu’à l’environnement de laboratoire pendant au moins une semaine avant l’utilisation. - À l’arrivée, transférer les planaires dans des contenants de stockage d’aliments en plastique contenant de l’eau de source propre et garder les couvercles entrouverts.
- Maintenir les planaires dans un environnement sombre.
- Nourrir les planaires nouvellement livrés après 24-36 h dans leur nouvel environnement.
- Permettre aux planaires de s’acclimater au laboratoire au moins 1 semaine avant l’expérimentation.
- Nourrir les planaires selon un horaire régulier deux fois par semaine.
- Laisser les planaires nourrir l’ad libitum sur les œufs bouillis biologiques hachés ou le foie de bœuf biologique mélangé pendant 1 à 2 h.
- Placer les planaires nourris dans un contenant propre après l’alimentation.
- Retirez l’eau souillée des planaires.
- Utilisez un petit pinceau à aquarelle plat (numéro 3–6) pour transférer les débris alimentaires et la boue adhérant au récipient d’environ planarians à une serviette en papier.
- Avec de l’eau de source fraîche et un léger tourbillon ou agitation, déloger les planaires et les verser dans un récipient propre.
- Tous les planaires restant adhérés au récipient peuvent être transférés à l’aide d’un pinceau à aquarelle ronde (numéro 3–6) ou transférer une pipette avec un large alésage.
- Décanter l’eau de transfert.
- Couvrir les planaires d’eau de source propre.
- Après 24 h, retirez les planaires de tout déchet alimentaire expulsé en les transférant dans un contenant propre tel que décrit ci-dessus (étapes 1.6.2.1–1.6.2.6).
- Pour nettoyer les contenants et les ustensiles utilisés pour l’élevage planaire, n’utilisez pas de savon ou de détergent. Nettoyez ces articles en les rinçant bien avec de l’eau propre (l’eau du robinet est acceptable) et en les séchant avec un chiffon propre ou un essuie-tout.
2. Préparation des planaires pour les expériences
- Permettre aux planaires nouvellement livrés de s’acclimater à leur environnement au moins 1 semaine avant l’expérimentation.
- Starve planarians pendant 5 à 10 jours avant l’expérimentation.
- Changer l’eau de culture au moins 1x pendant la période de famine.
3. Test de vitesse locomoteur planaire (pLmV) : Comportements stimulants
- Avant l’expérimentation, assurez-vous que les planaires affamés sont entièrement formés, avec une tête et une queue complètes et pigmentées.
- Préparer un verre ou un plat petri en verre ou en plastique de 10 cm et un récipient d’accoutumance pour le test pLmV avant de commencer l’expérience.
- Placez une boîte de Pétri propre de 10 cm de diamètre à utiliser pour l’essai pLmV sur du papier de grille prélamé (avec des carrés de 0,5 cm).
- Ajouter 20 mL d’eau de source intacte pour les contrôles, ou de l’eau de source contenant la concentration appropriée du produit naturel testé, à la boîte De Petri de 10 cm de diamètre à utiliser pour l’essai pLmV.
- Placez une caméra (p. ex., téléphone cellulaire ou caméra haute résolution) au-dessus de la boîte Petri préparée de 10 cm de diamètre pour enregistrer la motilité planaire sur le papier de grille pendant l’expérience. Un support d’anneau est un moyen pratique de positionner la caméra à une distance qui peut enregistrer toute la vue de la boîte de 10 cm Petri et les lignes de grille.
- Préparer un récipient d’accoutumance avec 5 à 10 ml d’eau de source (contrôles) nondulés ou d’eau de source contenant la concentration appropriée du produit naturel testé. Un récipient semblable à une fiole de scintillation ou à une petite boîte de Pétri de 5 cm convient.
- Utilisez un petit pinceau à aquarelle propre, plat ou rond pour transférer doucement un planaire du récipient de stock avec de l’eau de source au récipient d’accoutumance ayant 5–10 ml d’eau de source intacte ou d’eau de source contenant le produit naturel testé.
REMARQUE : Lorsque vous manipulez des planaires pour l’essai pLmV, utilisez un petit pinceau à aquarelle propre, plat ou rond (numéro 3–6). Lors du déplacement des planaires, la brosse doit être placée sous l’animal pour la soulever doucement. Pour s’assurer que les planaires ne sont pas endommagés lors de l’utilisation de la brosse, les poils de la brosse ne doivent pas être étalés sous l’animal. L’étalement des poils pourrait nuire au planaire s’il est pris entre les fibres de la brosse.
REMARQUE : Une pipette de transfert de forage large peut également être utilisée pour transférer le planaire dans un récipient d’accoutumance propre et sec.- Si vous utilisez la pipette, retirez l’excès d’eau déplacé avec le planaire du récipient d’accoutumance à l’aide de la pipette de transfert.
- Ajoutez soigneusement la solution d’accoutumance (c.-à-d. l’eau de source pour les contrôles ou l’eau de source contenant la concentration de produit naturel testé) au récipient d’accoutumance contenant le planaire.
- Les périodes d’accoutumance dépendront de la dynamique de stimulation évaluée pour le produit naturel testé. Un temps d’accoutumance de 2 min s’est avéré acceptable pour détecter la stimulation dans ce travail1.
- Après la période d’accoutumance de 2 min, utilisez un pinceau à aquarelle pour transférer doucement le planaire au centre de la boîte de Pétri préparée de 10 cm pour l’expérience de stimulation pLmV.
- Démarrez la caméra pour enregistrer le mouvement du planaire. Record 10–11 min de vidéo.
- Préparez le récipient d’accoutumance et le plat Petri de 10 cm pour l’expérience pLmV avec des solutions fraîches pour chaque planaire.
- Utilisez des pipettes, des plats, des contenants et des pinceaux dédiés pour chaque concentration expérimentale du produit naturel testé afin d’éviter d’exposer par inadvertance les planaires à la mauvaise solution lors de l’expérimentation.
- Étant donné que les planaires présentent des comportements appris, chaque planaire (contrôle ou test) ne doit être utilisé qu’une fois21,22.
4. Test de vitesse locomotrice planaire (pLmV) : Comportements de retrait
- Avant l’expérimentation, assurez-vous que les planaires affamés sont entièrement formés, avec une tête et une queue complètes et pigmentées.
- Préparez une boîte de Pétri de 10 cm (verre ou plastique) pour l’expérience pLmV, une boîte de Pétri de 5 cm (verre ou plastique) pour rincer le planaire suivant l’accoutumance, et un récipient d’accoutumance avant de commencer l’expérience.
- Placez une boîte de Pétri propre de 10 cm de diamètre à utiliser pour l’expérience pLmV sur du papier de grille prélamé avec des carrés de 0,5 cm).
- Ajouter 20 mL d’eau de source intacte à la boîte de Pétri de 10 cm de diamètre à utiliser pour l’expérience pLmV.
- Placez une caméra au-dessus de la boîte Petri préparée de 10 cm de diamètre comme à l’étape 3.2.3 pour enregistrer la motilité planaire sur le papier de grille pendant l’expérience.
- Préparer le récipient de rinçage planaire en ajoutant 5 ml d’eau de source seul à la boîte de Pétri de 5 cm.
- Préparer un récipient d’accoutumance avec 5 à 10 ml d’eau de source (contrôles) ou d’eau de source contenant le produit naturel testé. Un récipient semblable à une fiole de scintillation ou à une petite boîte de Pétri de 5 cm (verre ou plastique) convient.
- Utilisez un petit pinceau à aquarelle propre, plat ou rond pour transférer un planaire de l’eau de source au récipient d’accoutumance préparé ayant 5–10 ml d’eau de source (contrôles) ou d’eau de source contenant le produit naturel testé. Déplacez doucement l’animal du récipient de stock au récipient d’accoutumance. Assurez-vous que le planaire n’est pas endommagé par la brosse.
REMARQUE : Lorsque vous manipulez des planaires pour l’essai pLmV, utilisez un petit pinceau à aquarelle propre, plat ou rond (numéro 3–6). Lors du déplacement des planaires, la brosse doit être placée sous l’animal pour la soulever doucement. Pour s’assurer que les planaires ne sont pas endommagés lors de l’utilisation de la brosse, les poils de la brosse ne doivent pas être étalés sous l’animal. L’étalement des poils pourrait nuire au planaire s’il est pris entre les fibres de la brosse.
REMARQUE : Une pipette de transfert de forage large peut également être utilisée pour transférer le planaire dans un récipient d’accoutumance propre et sec.- Si vous utilisez la pipette, l’excès d’eau déplacé avec le planaire doit être retiré du récipient d’accoutumance à l’aide de la pipette de transfert.
- Ajoutez soigneusement la solution d’accoutumance (c.-à-d. l’eau de source intacte pour les commandes ou l’eau de source contenant le produit naturel testé) au récipient d’accoutumance contenant le planaire.
- Les périodes d’accoutumance pour le retrait dépendront de la dynamique de stimulation évaluée pour le produit naturel testé; 2–5 min se sont avérés suffisants.
- Après la période d’accoutumance, utilisez un pinceau à aquarelle pour transférer doucement le planaire dans la boîte petri préparée de 5 cm contenant de l’eau de source pour rincer tout produit naturel du récipient d’accoutumance. Assurez-vous que le planaire n’est pas endommagé par la brosse.
- Transférer immédiatement le planaire au centre de la boîte de Pétri préparée de 10 cm contenant de l’eau de source pour l’expérience de retrait pLmV. Assurez-vous que le planaire n’est pas endommagé par la brosse.
- Démarrez la caméra pour enregistrer le mouvement du planaire. Record 10–11 min de vidéo.
- Préparez le récipient d’accoutumance, le récipient de rinçage et la boîte de Pétri de 10 cm pour l’expérience pLmV avec des solutions fraîches pour chaque planaire.
- Utilisez des pipettes, des plats, des contenants et des pinceaux dédiés pour chaque concentration expérimentale du produit naturel testé afin d’éviter d’exposer par inadvertance les planaires à la mauvaise solution lors de l’expérimentation.
- Parce que les planaires présentent des comportements appris, utilisez chaque planaire (contrôle ou test) qu’une fois26,27.
5. Analyse des données
- Préparez une table de collecte de données pour documenter le comportement et la motilité des planaires comme le nombre de lignes de grille croisées pour chaque minute pendant l’exécution pLmV. Le tableau devrait permettre de documenter également le nombre cumulé de lignes par minute franchies par le planaire. Inclure des lignes pour les notes et un tableau de définitions pour compter l’observation des comportements au cours de la période expérimentale, tels que « erre » et « stop » (voir Discussion).
- À l’aide de la vidéo, comptez le nombre de lignes de grille complètes franchies par le planaire par minute pendant 10 min et enregistrez ce nombre sur la table de données. Le comportement planaire typique se compose de la vitesse continue, du mouvement horizontal dirigé vers l’avant, avec des virages périodiques, et sans arrêts.
- Commencez à chronométr l’expérience au point que le planaire a quitté le pinceau utilisé pour le transférer à la boîte de Pétri de 10 cm. Enregistrez cette heure de début.
- Pour déterminer quand l’animal traverse un carré de grille complète, concentrez-vous sur la tête et marquez une ligne lorsque la tête traverse entièrement un carré.
- Pour marquer une grille complète lorsque le ver se déplace autour du bord du plat, visualiser une distance de 0,5 cm en se référant aux lignes comme ils s’étendent à partir des marges du plat. Si le planaire traverse le coin d’une boîte, reportez-vous à la deuxième ligne franchie pour marquer une ligne de grille. Encore une fois, concentrez-vous sur la tête pour prendre ces décisions.
- Arrêtez la vidéo après chaque minute pour enregistrer les données.
- Lors du redémarrage de la vidéo pour compter la minute suivante, si la tête du ver se trouvait entre les lignes de grille lorsque la vidéo a été arrêtée, enregistrez la première ligne franchie comme une boîte complète.
- Marquez le nombre de lignes de grille croisées pendant 10 min.
- Si l’animal cesse de se déplacer pendant un test pLmV et ne traverse plus les lignes de grille pendant le temps d’enregistrement de 10 minutes, documentez le comportement du planaire dans le tableau comportemental (p. ex., « erre » ou « stop »). Les animaux qui cessent leur trajectoire avant pendant l’essai pLmV devraient plutôt être pris en compte et les données présentées comme une fréquence du nombre total d’animaux exposés à cette concentration de réactifs. Le comportement enroulé ou convulsif (connu sous le nom de comportement C) empêchant tout mouvement vers l’avant pendant la période d’accoutumance indique que la concentration du produit naturel n’est pas appropriée pour une utilisation dans un essai pLmV parce que le test pLmV est basé sur la motilité. Les comportements de type C peuvent être analysés à l’aide d’un autre type d’analyse (voir Discussion).
- Si possible, tester plusieurs concentrations expérimentales du produit naturel à l’aide d’au moins 9 à 12 vers à des jours et à des moments différents de la journée si vous déterminez l’effet global du réactif sur la physiologie planaire. Cependant, si les chercheurs s’efforcent de réduire la variabilité induite par le rythme circadien, des expériences peuvent être menées avec un éclairage constant à une heure définie de la journée à l’aide de vers qui sont cultivés avec des cycles chronométrés lumière / obscurité et définir les temps d’alimentation. Avoir au moins deux expérimentateurs impliqués dans le projet pour permettre la possibilité d’avoir une donnée d’enregistrement individuelle, tandis que le second individu compte les lignes de grille « n aveugle » aux conditions utilisées pour la collecte de données. Le fait que différentes personnes participent à la collecte de données, ainsi que des calculs et des analyses statistiques, réduit également les biais possibles.
- Calculer le nombre de lignes de grille pour chaque concentration naturelle de produit chaque jour par rapport au nombre de témoins pour chaque minute afin que les données de différents jours, heures et expérimentateurs puissent être combinées. Ces données peuvent être calculées en moyenne, puis analysées à l’aide des tests T de l’élève. Les valeurs P pour chaque test peuvent être évaluées par minute par rapport au contrôle et entre les concentrations de réactifs. Les évaluations ANOVA à l’aide d’ensembles de données dérivés de différentes concentrations expérimentales fournissent une autre méthode d’analyse.
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Representative Results
Le laboratoire mis en place et la préparation de l’espace de travail pour l’exécution de l’essai pLmV doivent être terminés avant le début de l’expérimentation. Cela comprend la préparation du récipient d’accoutumance, le récipient de rinçage si nécessaire (pour les expériences de retrait), la boîte de Pétri sur le papier de grille laminé, et la caméra correctement placée (Figure 1). Une fois toutes les vidéos prises, il est conseillé d’utiliser une feuille de données commune pour normaliser la collecte et la présentation de données entre les enquêteurs(figure 2 et figure 2 Supplément).
La caméra mise en place devrait permettre une vue claire du planaire et du document de grille afin de permettre une évaluation précise de l’état d’avancement de l’animal pendant la durée de l’expérience(figure 3A et supplément de la figure 3A). La collecte de données doit comprendre le nombre de lignes de grille franchies, ainsi que le nombre total cumulé de lignes franchies par minute de l’expérience (figure 3B). Au cours de l’analyse pLmV, les planaires ont une vitesse continue, orientée vers l’avant, mouvement horizontal, avec des virages périodiques, et ne s’arrêtent pas. Au début, la première case de grille complète franchie doit être notée comme une seule, et non comme la première ligne telle que déterminée dans la vidéo de l’exemple. Il est important d’enregistrer l’heure de début du mouvement directionnel après que le planaire est libre du pinceau utilisé pour le transférer dans le plat pLmV, puis suivre à travers pour chaque minute par la suite. Si un planaire fait partie d’une boîte à l’heure de la minute, la ligne de grille suivante franchie après le redémarrage de la vidéo doit être comptée comme une zone complète. Lorsque l’animal se déplace autour du bord du plat, se référer aux lignes comme ils s’étendent à partir du plat pour déterminer une distance de 0,5 cm. Lorsque les vers rencontrent le coin d’une boîte, reportez-vous à la deuxième ligne franchie pour marquer une ligne de grille. Concentrez-vous toujours sur la tête pour prendre ces décisions. Si le planaire commence à couvrir une zone serrée, l’expérimentateur doit à nouveau suivre la tête du ver pour surveiller la distance d’une boîte de grille complète. Un exemple de ce comportement est inclus dans la vidéo supplémentaire (figure 3A supplément).
Pour normaliser les résultats de chaque essai, les pistes pLmV doivent être calculées et tracées comme le nombre de boîtes croisées par rapport à la progression du ver de contrôle correspondant (Figure 3B). Chaque utilisateur doit être formé pour effectuer les lignes de grille d’essai et de comptage avant de commencer les tests à l’aide de réactifs d’intérêt. À titre de référence, à l’aide de la configuration expérimentale, les planaires dans l’eau de source couvrent généralement environ 24 boîtes en 3 minutes (Figure 4A; données de 4 utilisateurs, moyenne de 24,8 ± 4,8). Une gamme de concentrations de réactifs d’essai devrait être examinée pour déterminer le type d’analyse comportementale à utiliser pour chacun. Pour l’analyse pLmV, les chercheurs doivent déterminer si les animaux présentent de la motilité lorsqu’ils sont exposés (figure 4B). D’autres types d’analyses comportementales peuvent être plus efficaces pour différents types de comportements (voir discussion). Par rapport au contrôle de l’eau de source, les données stimulantes montrent un nombre croissant de lignes de grille croisées lorsque l’animal se déplace à travers le récipient pLmV avec la concentration souhaitée du réactif d’essai dans l’eau de source, après avoir été habitué dans la même concentration du réactif d’essai. En revanche, les données de retrait montreront une diminution du nombre de lignes de réseau franchies, par rapport au contrôle de l’eau de source, lorsque le planaire se déplace à travers le récipient pLmV ayant l’eau de source seul, après avoir été habitué dans la concentration désirée du réactif mélangé dans l’eau de source (Figure 4C et 4D). Notamment, les données de retrait manifestes peuvent conduire à des comptes de grille inférieurs à ceux des contrôles, comme cela a été observé dans les données de retrait induite par les médicaments par d’autres groupes2,6.
Les planaires de contrôle de l’eau de source se déplaceront sur les lignes du réseau pendant toute la durée de l’expérience. Il est toutefois possible pour les planaires d’essai de cesser de traverser les lignes du réseau pendant l’essai. Si cela se produit, ces données doivent être mises en évidence séparément des données sur les vers qui maintiennent leur progression sur les lignes de grille. La documentation de ces données en pourcentage du nombre total d’animaux exposés à cette concentration particulière de réactifs est un moyen efficace d’illustrer la fréquence relative de ces résultats (figure 5A-C, supplément de la figure 5A et supplément de la figure 5B). Les comportements qui n’empêchent pas les planaires de franchir les lignes du réseau devraient être inclus dans l’analyse pLmV, même si ces mouvements entravent la progression constante des animaux.
Figure 1 : Configuration représentative du test pLmV.
L’espace de laboratoire doit être préparé avant le début de l’essai. Est-ce une configuration typique avec une boîte de Pétri de 10 cm placée sur du papier de grille laminé de 0,5 cm. Une caméra de document est positionnée de telle sorte qu’une vue claire de la boîte de Pétri de 10 cm peut être enregistrée sur un ordinateur lié. Cependant, n’importe quelle caméra peut être utilisée pour enregistrer les progrès des planaires au cours de l’expérience, y compris une caméra de téléphone cellulaire positionnée au-dessus de la boîte de Pétri à l’aide d’un support d’anneau. À l’arrière-plan se trouve une boîte de 5 cm de Petri pour rincer les vers pour les expériences de retrait, ainsi que de petits contenants blancs utilisés pour l’habituation des planaires. En outre, à l’arrière-plan sont étiquetés, dédiés pinceaux à l’aquarelle ronde, pipettes, et petri plats pour chaque concentration de produits. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : fiche de données pLmV.
Une fiche de données préparée pour enregistrer le nombre de lignes de grille croisées, le par rapport correspondant aux données de contrôle, ainsi qu’un moyen de calculer tous les comportements est utile à des fins de collecte de données. Voir figure 2 Supplément pour une version PDF téléchargeable de ce chiffre. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Expérience et fiche de données pLmV représentatives.
(A) Une caméra doit être placée au-dessus de la boîte de Pétri de 10 cm utilisée pour l’essai pLmV de telle sorte que la grille planaire et la grille complète de 0,5 cm sous le plat est clairement visible. L’exécution complète de pLmV doit être enregistrée (Supplément de figure 3A), et (B) le nombre de lignes de grille croisées chaque minute placée dans une table de données préparée. Les lignes de grille totales accumulées croisées doivent être comptées, puis elles doivent être converties en nombre de lignes accumulées croisées par rapport au ver de contrôle de l’eau de source correspondant. Les données figurant sur le tableau de chiffres fourni (B) correspondent aux dénombrements à l’aide de la vidéo supplémentaire (Supplément de la figure 3A). Les nombres de contrôle correspondants ne sont pas affichés. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Graphiques représentatifs des données sur les stimulants et les retraits.
Les chercheurs devraient être formés pour utiliser et marquer les lignes de grille d’essai pLmV en utilisant uniquement l’eau de source avant l’expérimentation. En règle générale, les planaires parcourent environ 25 lignes de grille en 3 min. (A) Les données de quatre utilisateurs sont affichées, chacune avec 10 vers de contrôle de l’eau de source. Pour apprécier l’effet d’un réactif sur la motilité planaire, une série de concentrations sont étudiées à l’aide de l’essai pLmV et le nombre total de lignes de grille franchies sont examinés par rapport au nombre de témoins correspondant à 3 minutes. (B) Les données de contrôle sont représentées par la barre blanche. Les données d’essai sont représentées par les barres noires, avec les concentrations utilisées dans mM. Par rapport aux données de contrôle, il faut tracer pour mieux représenter les données collectées. (C) Les données stimulantes représentées par la ligne bleue/diamants, montreront une augmentation des lignes de grille croisées, par rapport aux données de retrait (D),également représentées par la ligne bleue/diamants, montreront une pente décroissante à partir d’une valeur de départ initiale, par rapport aux données de contrôle, comme le montrent la ligne rouge/carrés dans les deux (C et D). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Observation et documentation des données comportementales.
Les planaires dans l’essai pLmV qui ne maintiennent pas le mouvement directionnel pendant l’expérience, mais s’arrêtent avec des comportements caractéristiques et ne se déplacent plus au-dessus des grilles devraient être comptés. Les comportements typiques peuvent inclure des affichages comme « err » (A et figure 5A Supplément), et « top » (B et figure 5B Supplément). Ces décomptes des données comportementales doivent être présentés pour documenter la fréquence de ces comportements par rapport à tous les animaux exposés à cette concentration de produit (C). Les données d’échantillon documentant les pourcentages d’animaux de contrôle de l’eau de source (Ci) et d’animaux exposés à un stimulant (Cii), ayant une errance (bleu), arrêt (rouge) ou pas (vert) comportement. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Un test de motilité planaire simple et accessible est décrit pour déterminer les effets stimulants et de sevrage des produits naturels. En tant que modèle comportemental, il est nécessaire d’avoir des protocoles rigoureux pour marquer le mouvement et des définitions claires de tout comportement pour normaliser les observations entre les différents expérimentateurs. Les idées présentées offrent une démonstration de la façon dont cela peut être réalisé. Chaque laboratoire utilisant ce protocole doit adapter les informations présentées en fonction des effets du produit particulier testé. Il est recommandé de mettre soigneusement en place l’espace de travail pour s’assurer que les tests peuvent être effectués dans des conditions uniformes par chaque chercheur participant àl’étude( figure 1 ). Des fiches d’enregistrement normalisées peuvent être compilées pour faciliter la tenue des dossiers et la collecte de données sur la motilité et les comportements (figure 2 et figure 3B).
Les tests de motilité doivent être effectués à divers moments de la journée, en utilisant différents lots de planaires si possible, pour tenir compte des activités circadiennes inhérentes divergentes. Bien que ces analyses n’aient pas été effectuées, il est suggéré que les enquêteurs surveillent comment le rythme circadien planaire pourrait affecter la motilité en maintenant les planaires à l’aide d’un cycle clair/foncé standard (p. ex., 12/12), et lors de la réalisation de l’essai pLmV, utilisez des conditions d’éclairage standard et exécutent les tests en même temps que le jour32,33,34. Les chercheurs devraient pratiquer la mécanique de l’essai pLmV et apprendre à compter les lignes de grille pour normaliser à la fois la gestion des planaires et l’évaluation de la motilité planaire (figure 3). Cela doit être fait en utilisant des commandes d’eau de source intactes. En règle générale, après 10 à 20 de ces pratiques, les données deviennent tout à fait standard pour tous les membres du laboratoire. Les comptes après un temps pLmV défini doivent être choisis pour comparer les progrès réalisés dans l’apprentissage de l’essai. Les enquêteurs observent généralement environ 24 lignes de grille franchies par 3 min dans l’essai pLmV dans l’eau de source à la suite d’une accoutumance de 2 minutes dans l’eau de source(figure 4A; données représentatives pour quatre chercheurs avec 10 contrôles aléatoires de l’eau de source chacun; 24,8 ± 4,8 lignes de grille). Le fait d’avoir deux ou trois chercheurs formés effectuant chaque série de tests peut améliorer davantage la fiabilité des résultats, car tous les effets spécifiques à l’utilisateur sur la méthode et les dénombrements peuvent être pris en compte dans l’analyse des erreurs. De cette façon, les tests et les dénombrements peuvent être échangés entre les enquêteurs afin que les comptes puissent être faits « aveugles » aux conditions expérimentales. Pour réduire le risque de biais, différentes personnes pourraient effectuer des tests statistiques sur les données de comptage et effectuer les analyses subséquentes. En dehors de la présence du produit testé, il convient d’éviter les variations environnementales de la qualité de l’eau telles que la température et le pH. Parce que les planaires sont sensibles à la lumière, la configuration de l’expérience devrait s’assurer que l’éclairage de l’espace de travail est égal. Enfin, parce que les planaires peuvent présenter des comportements appris, chaque ver, y compris les contrôles, ne doit être utilisé qu’une fois26,27.
Il est utile d’avoir une liste de contrôle expérimentale en laboratoire si plusieurs expérimentateurs travaillent avec l’essai, en particulier dans un laboratoire de recherche de premier cycle, pour éviter les pièges communs qui pourraient se produire lors de l’exécution du test pLmV, qui affecterait la valeur statistique des résultats. Toutes les solutions doivent être à température ambiante parce que la motilité planaire est réduite à des températures plus basses. Il faut veiller à ce que les spécimens soient affamés 5 à 10 jours avant leur utilisation et que chaque spécimen soit entièrement formé, avec une tête et une queue entièrement pigmentées. Il est également suggéré que des pinceaux à aquarelle plats ou ronds dédiés (numéro 3–6), des contenants d’accoutumance et des plats Petri soient utilisés pour chaque concentration expérimentale afin de rendre le flux de travail plus fluide pour l’expérimentateur. La technique de transfert des planaires à l’aide de petits pinceaux à aquarelle plat ou rond devrait être pratiquée en profondeur par les enquêteurs afin d’assurer un transfert efficace des vers entre les récipients sans causer de blessures ou de détresse aux animaux (voir la discussion ci-dessus; Figure 4A). L’utilisation de ces pinceaux minimise le transfert de liquides entre les contenants et réduit le stress potentiel sur les planaires. Cependant, les planaires peuvent être endommagés par les poils si les fibres sont propagées ou étalées lorsqu’elles entrent en contact avec l’animal.
Étant donné que l’essai pLmV repose sur des données comportementales, il est essentiel d’utiliser un ensemble de données suffisamment volumineux pour assurer des données robustes malgré la variabilité innée de la réponse du ver au ver. En tant que tel, la plupart des laboratoires utilisent un minimum de neuf à douze planaires pour tester chaque concentration du produit à l’étude, en particulier parce que les produits naturels peuvent ne pas avoir un effet aussi marqué que les produits pharmaceutiques standard1,2,3,45,6,7,13,14,15,16,35,36., Le nombre de lignes de grille traversées chaque minute est calculé par rapport aux données de contrôle de l’eau de source pour chaque jour et heure d’essai. Ces données sont calculées en moyenne pour chaque minute et comparées aux données de contrôle, ainsi qu’à d’autres concentrations assorties à l’heure à l’aide des tests T de l’étudiant et de l’ANOVA.
L’essai pLmV est destiné à des études de réactifs affectant la motilité des planaires pour la durée du temps d’essai. Des études détaillées des mouvements planaires peuvent être effectuées à l’aide d’un certain nombre d’autres évaluations décrites dans la4,35,36,37,38. Par conséquent, il est prudent de mener une série d’expériences d’accoutumance pour prendre note de la façon dont les planaires réagissent au réactif d’essai en utilisant une gamme de concentrations et en comparant les effets avec le comportement des vers dans l’eau de source avant de se lancer dans des tests comportementaux. De cette façon, le test comportemental approprié peut être choisi pour étudier les maniérismes individuels induits par le réactif sur le planaire. Les planaires peuvent être placés dans diverses concentrations du réactif pendant 5-10 min pour déterminer si une concentration leur permet de maintenir leur comportement de natation typique. Les comportements qui ne permettent pas la motilité, tels que ceux qui entraînent un comportement de type C, ou convulsif ou convulsif ou convulsif, ont fait l’objet d’études utilisant des types distincts d’analyses comportementales qui peuvent être appliquées à cette méthode4,39,40. les analyses pLmV peuvent être effectuées à l’aide d’une gamme de concentrations après de courtes périodes d’accoutumance et le nombre total de lignes de grille croisées à 3 min marqués par rapport aux contrôles de l’eau de source avant les analyses de stimulation et de retrait du cours de temps (Figure 4B)1,2,3,4,5. Les chercheurs sont encouragés à échantillonner d’autres fois, comme 15, 30 et 60 min, pour voir si la dynamique de stimulation change avec le temps d’exposition1. Comme cela a été signalé, dans les vers de contrôle de l’eau de source maintenir un mouvement horizontal régulier et dirigé vers l’avant pour le temps d’essai de 10 min1,4. En revanche, les vers traités par le produit peuvent arrêter et cesser leur motilité directionnelle pendant l’essai et ne plus traverser les lignes de grille. L’enquêteur peut décider s’il faut limiter la durée de la course expérimentale de pLmV ou obtenir un moyen d’évaluer ces comportements tels que décrits. Il est important, cependant, d’évaluer la fréquence de ces comportements, car ils fournissent des données supplémentaires affectant la motilité. Les données de motilité et de mouvement sont discutées séparément sur le terrain parce que la combinaison de l’information confond l’évaluation de ces données4,35,36,37,38. À titre d’exemple, deux comportements ont été observés lorsque les vers se sont arrêtés et n’ont plus traversé les lignes de grille pendant l’essai. Ces mouvements sont appelés « erre » (Figure 5A Et Supplément de la figure 5A), et « top » (Figure 5B Et Supplément de la figure 5B). La fréquence de ces comportements est documentée en pourcentages de tous les animaux exposés à la concentration du produit particulière ainsi que les données de contrôle (Figure 5C). Fait important, les comportements aléatoires qui n’empêchent pas le planaire de franchir les lignes du réseau devraient être inclus dans l’analyse pLmV, même si ces mouvements entravent la progression constante des animaux (Figure 4B, barres de 3 mM et 10 mM). Comme mentionné, les chercheurs ont décrit un certain nombre de catégories comportementales qui sont au-delà de la portée de cette discussion du taux pLmV du protocole de motilité4,35,36,37,38.
L’essai pLmV repose sur la solubilité de l’eau du produit à l’étude. Beaucoup de ces substances, cependant, ne sont pas entièrement solubles dans l’eau et, en tant que telles, seules les parties solubles dans l’eau peuvent être testées par ce test tandis que le reste doit être filtré de la solution comme cela a été fait dans les travaux précédents1. Si les essais pLmV sont exécutés à l’aide de réactifs solubilisés à l’aide de solvants autres que l’eau, ceux-ci nécessitent un contrôle équivalent en volume en plus de la commande de l’eau de source. Bien que cette méthode n’ait pas été utilisée avec de telles substances, ces contrôles vectoriels devraient probablement être traités comme un test, et la motilité notée par rapport aux témoins comme n’importe quelle autre substance d’essai. Un autre moyen possible de tester des substances non solubles serait de les nourrir aux planaires en les mélangeant en gels alimentaires. Cette technique est utilisée pour introduire siRNA aux planaires dans les expériences génique knock-down/RNAi41. Toutefois, l’alimentation des planaires des produits biologiques et du siRNA présente des complications à cet essai en ce que les planaires ne seraient pas affamés et ne peuvent pas être transférés dans le contenant d’analyse de motilité dans un délai normalisé qui assure une exposition égale ou la prise du produit à l’étude par les animaux expérimentaux avant l’essai.
Une fois que la dynamique des stimulants et des retraits est établie à l’aide de l’essai pLmV, d’autres expérimentations peuvent impliquer des comodulateurs, l’introduction de l’ARN, ainsi que des modificateurs de voies biologiques ou des médicaments pour tester l’augmentation ou l’inhibition des effets de motilité observés par rapport aux résultats initiaux recueillis lorsqu’ils n’utilisent pas ces biomodulateurs1,3. Par exemple, la réduction de l’expression d’un gène ou l’ajout d’inhibiteurs de la voie pourrait diminuer le taux de mouvement, tandis que d’autres peuvent modifier la dynamique du sevrage. Grâce à l’observation des résultats modifiés de pLmV, ces expériences supplémentaires peuvent fournir un aperçu de la physiologie sous-jacente affectée par un produit naturel ou d’autres réactifs d’essai5,42,43,44.
La procédure décrite est accessible à tout laboratoire intéressé à déterminer les effets stimulants et de sevrage d’une variété de biomodulateurs, y compris de nombreux produits naturels. Les avantages de l’application de l’essai de pLmV planaire comprennent la façon dont peu coûteux et facile à entretenir ces animaux sont, et qu’ils peuvent également être des sujets pour d’autres tests basés sur planarian pour fournir une compréhension large des effets physiologiques du produit à l’étude.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à révéler.
Acknowledgments
Les auteurs souhaitent reconnaître le bureau de l’avancement institutionnel et la Morrisville College Foundation pour une subvention de publication à l’appui de ce travail, ainsi que le SUNY Morrisville Collegiate Science and Technology Entry Program (CSTEP) pour leur aide continue et leur soutien à la recherche de premier cycle à SUNY Morrisville. Nous tenons également à remercier Sophia Hutchens pour leurs commentaires utiles sur la technique décrite.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bottled Water - 1 Gal. | Poland Spring | N/A | Spring water for planarian culture and to prepare solutions |
| Brown Planaria (Dugesia tigrina) | Carolina Biological Supply Company | 132954 | Brown planaria living (other species are acceptable) |
| Flat Paintbrush | Royal Crafter's Choice | 9159 | Flat watercolor paintbrushes for cleaning planarian culture containers |
| Glass Petri Dish - 10 cm | Kimax | N/A | 10 cm diameter (glass) Petri dishes for pLmV assay |
| Glass Petri Dish - 5 cm | Kimax | N/A | 5 cm and Petri dishes for rinsing planarians during withdrawal experiments and for stimulant habituation |
| Grid Paper | Any | N/A | Standard 0.5 cm grid paper for pLmV assay |
| iPEVO Visualizer (software) | iPEVO | https://www.ipevo.com/software/visualizer | Document camera software for video capture and recording |
| Metalware Set with Support Stand and Retort Ring | Any | N/A | Standard chemistry lab ring stand to hold a cell phone camera if used |
| Organic Egg | Any | N/A | Organic egg or beef liver for feeding planarains |
| Polycarbonate Bottle w/ Screw-on Cap - 10 mL | Beckman | N/A | Plastic vials to hold 5 to 10 mL volumes for stimulant habituation |
| Round Storage Container - 10 cm | Ziploc | N/A | 10 cm Round food storage containers for approximately 90 planarians or fewer |
| Round Water Paint Brush | LOEW-Cornell | N/A | Small round watercolor paint brushes (numbers 3 to 6) - soft |
| Transfer Pipette | Any | N/A | Wide bore (5 mL) plastic transfer pipettes to move planarians |
| USB Document Camera | iPEVO | CDVU-06IP | Document camera (or other camera or cell phone camera) |
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