Summary
Het meten van de hartslag tijdens een thermische uitdaging geeft inzicht in fysiologische reacties van organismen als gevolg van acute veranderingen in het milieu. Met behulp van de Amerikaanse kreeft (Homarus americanus) als een model organisme, dit protocol beschrijft het gebruik van impedantie pneumografie als een relatief niet-invasieve en niet-dodelijke aanpak om de hartslag te meten in het laat stadium ongewervelde dieren.
Abstract
De temperatuur in oceanen neemt snel toe als gevolg van wijdverspreide veranderingen in het wereldklimaat. Aangezien de fysiologie van organismen sterk wordt beïnvloed door de omgevingstemperatuur, heeft dit het potentieel om de thermische fysiologische prestaties in een verscheidenheid van mariene organismen te veranderen. Met behulp van de Amerikaanse kreeft (Homarus americanus) als een model organisme, dit protocol beschrijft het gebruik van impedantie pneumografie om te begrijpen hoe cardiale prestaties in de late fase ongewervelde dieren verandert onder acute thermische stress. Het protocol presenteert een minimaal invasieve techniek die het mogelijk maakt voor real-time verzameling van de hartslag tijdens een temperatuur ramping experiment. Gegevens kunnen gemakkelijk worden gemanipuleerd om een Arrhenius-plot te genereren dat wordt gebruikt om de breuktemperatuur van Arrhenius (ABT) te berekenen, de temperatuur waarmee de hartslag begint te dalen met stijgende temperaturen. Deze techniek kan worden gebruikt in een verscheidenheid van late fase ongewervelde dieren (dat wil zeggen, krabben, mosselen, of garnalen). Hoewel het protocol zich uitsluitend richt op de impact van temperatuur op de cardiale prestaties, kan het worden gewijzigd om het potentieel te begrijpen voor extra stressoren (bijvoorbeeld hypoxie of hypercapnie) om te interageren met temperatuur om fysiologische prestaties te beïnvloeden. Zo heeft de methode mogelijkheden voor uitgebreide toepassingen om verder te begrijpen hoe ongewervelde zeedieren reageren op acute veranderingen in de omgeving.
Introduction
In de afgelopen decennia heeft een verhoogde invoer van broeikasgassen (d.w.z. kooldioxide, methaan en lachgas) in de atmosfeer geleid tot wijdverbreide patronen van milieuverandering1. De oceanen van de wereld zijn snel opwarmen2,3, een trend die ernstige gevolgen kan hebben voor de fysiologie van organismen. Temperatuur beïnvloedt de fysiologische tarieven sterk en organismen hebben een optimaal temperatuurbereik voor prestaties4,5,6. Als zodanig kunnen individuen problemen ondervinden bij het handhaven van een goede zuurstoftoevoer naar weefsels, omdat de temperaturen buiten dit bereik afdwalen. Dit heeft het potentieel om te leiden tot dalingen van de aërobe prestaties in het gezicht van de opwarming van de oceaan temperaturen5,7.
In een laboratoriumomgeving is een methode om de fysiologische effecten van milieuverandering te begrijpen het onderzoeken van cardiale prestaties in de context van thermische stress. Dit geeft inzicht in hoe blootstelling aan voorspelde opwarmingscondities prestatiecurven5,6 en het potentieel voor acclimatisatieplasticiteit8kan veranderen. Een verscheidenheid van methoden zijn met succes geïmplementeerd om eerder te meten hartslag in mariene ongewervelde dieren. Echter, veel van deze technieken te betrekken chirurgische verwijdering of grote manipulatie van het exoskelet en langdurige implantatie van meetapparatuur9,10,11, die extra stress introduceert aan de proefpersoon en verhoogt de tijd die nodig is voor een succesvol herstel voorafgaand aan experimenten. Bovendien kunnen minder invasieve technieken (bijvoorbeeld visuele observatie, videografie) worden beperkt tot vroege levensgeschiedenisstadia wanneer organismen volledig of semi-transparant kunnen zijn12. Bovendien kunnen aanvullende uitdagingen worden voorgelegd aan onderzoekers die niet goed thuis zijn in meer technologisch geavanceerde methodologieën (bijvoorbeeld waarnemingen via infraroodtransducers of Doppler perfusie8,11).
Dit protocol maakt gebruik van de Amerikaanse kreeft (Homarus americanus) als een laat stadium mariene ongewervelde model om het gebruik van impedantie pneumografie aan te tonen voor de beoordeling van veranderingen in de hartslag tijdens een temperatuur ramping experiment. Impedantie pneumografie omvat het passeren van een oscillerende elektrische stroom (AC) over twee elektroden geplaatst aan weerszijden van het hartzakje om veranderingen in spanning te meten als het hart contracten en ontspant13,14. Deze techniek is minimaal invasief, omdat het gebruik maakt van kleine elektroden (d.w.z. 0,10-0,12 mm diameter) die voorzichtig worden geïmplanteerd net onder het exoskelet. Ten slotte biedt het real-time beoordelingen van zowel de hartslag als de watertemperatuur tijdens de oprit door het gebruik van een datalogger.
Het protocol bevat ook instructies voor het berekenen van Arrhenius breuktemperatuur (ABT), de temperatuur waarmee de hartslag begint te dalen met stijgende temperaturen13,15. De ABT dient als een niet-dodelijke indicator van de thermische limiet van de capaciteit in proefpersonen die kunnen worden begunstigd boven het meten van de kritische thermische maximum (CTmax, de bovengrens van cardiale functie5,6), zoals dodelijke grenzen zijn vaak extreem en zelden aangetroffen in de natuurlijke omgeving5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Installatie van apparatuur
- Wikkel duidelijke, kneedbare buizen om zich heen om een warmte-uitwisseling spoel die is ongeveer 8-10 cm in diameter en heeft extensies 40-70 cm lang te creëren. Zet de spoel vast met behulp van elektrische tape.
- Bevestig de warmtevervangende spoel aan de externe toevoer- en retourinrichting van een koel/verwarming circulerend waterbad. Zorg ervoor dat de verbinding veilig is met behulp van slangklemmen.
- Vul de put van het koel/verwarmende circulerende waterbad met omgekeerd osmosewater (RO) water en sluit het netsnoer aan op een stopcontact. Zet het waterbad aan en zorg ervoor dat er geen lekken zijn in de verbinding met de warmtewisselspoel.
- Stel de impedantieconvertor in door de zwarte BNC-kabel aan te sluiten op de AC-uitgang op het apparaat en deze aan te sluiten op de datalogger(Table of Materials)via de Kanaal 1-poort.
- Sluit de thermocouplesonde (temperatuurrecorder) aan op de T-type pod en sluit vervolgens de T-type pod aan op de Kanaal 2-poort van de datalogger.
- Sluit het netsnoer van de datalogger aan op een voeding en sluit de datalogger aan op een pc-computer via de USB-kabelconnector.
- Vul de acclimatisatiekamer en experimentele arena met 7,5 L kunstmatig zeewater (zoutgehalte = 35 ppt, pH = 8,1, temperatuur = ~12 °C).
LET OP: Het volume, de temperatuur en de chemie van het water dat nodig is voor de acclimatisatiekamer en de startomstandigheden in de experimentele arena zijn afhankelijk van experimenteel ontwerp. Belangrijk is dat deze containers groot genoeg moeten zijn om de proefpersoon comfortabel onder te dompelen.
2. Implantatie van elektroden
- Plaats de kreeft op een plastic rooster dat gemakkelijk past in de experimentele arena zodanig dat het lichaam comfortabel maakt een Y-vorm aan de ene kant van de rechthoek.
- Zet de klauwen en buik van de kreeft voorzichtig vast aan het plastic rooster met behulp van kleine kabelbinders. De kabelbinders moeten strak genoeg zijn om beweging te voorkomen, maar ruimte voor chirurgische schaar om ze te verwijderen na voltooiing van het experiment.
- Droog de carapace af met een papieren handdoek en maak deze schoon met een katoenen bal gedrenkt in 70% ethanol.
- Maak de gaten voor de elektroden.
- Met behulp van een kleine boorbit (bijvoorbeeld 1,6 mm) boort u langzaam en zorgvuldig twee kleine gaatjes (bijna) door het carapace aan weerszijden van het hartzakje.
- Maak elk gat af door voorzichtig een steriele ontledende naald in te brengen.
- Als de naald niet gemakkelijk door de carapace gaat, blijf langzaam met de hand boren voordat u de naald opnieuw probeert.
OPMERKING: Om stress bij proefdieren te minimaliseren, wordt het oefenen van deze techniek voorafgaand aan het experimenteren ten zeerste aanbevolen. Na verloop van tijd kunnen gebruikers gemakkelijk bepalen door te voelen wanneer de boor bit is bijna al de carapace en overschakelen naar de naald. Handboren is geschikt voor kreeften en krabben, vooral als het exoskelet zacht is (d.w.z. het dier is onlangs vermolmd). Als de proefpersoon echter een dikker exoskelet of omhulsel heeft (d.w.z. een tweekleppige), is een Dremel-gereedschap geschikter.
- Verkrijg de elektroden (36-38 G magnetische draad, 0,10-0,12 mm diameter) en schraap een klein beetje isolatie af aan de punt van de draad met behulp van een mes. Buig voorzichtig de punt van elke draad in een kleine haak met behulp van tangen en steek een in elk van de nieuw geboorde gaten.
- Zet elke draadlood vast met een kleine druppel cyanoacrylaatlijm en laat het 5-10 min drogen.
OPMERKING: Het is van cruciaal belang om de lijm spaarzaam te gebruiken, omdat het toevoegen van teveel de draad opnieuw zal isoleren en voorkomt dat het signaal wordt opgenomen. - Zodra de lijm droog is, bevestig de draad leidt tot de impedantie convertor en zet het aan. Plaats de kreeft in de acclimatisatiekamer en laat deze gedurende 15-20 min wennen aan de geïmplanteerde elektroden.
LET OP: Snelle of schokkende bewegingen, evenals onvolledig gedroogde lijm, kunnen ervoor zorgen dat de elektroden losraken van het carapace. Als dit gebeurt, gaat u terug naar stap 2.6. - Schakel de datalogger in en open de LabChart-software op de computer. Klik op Nieuw experiment en laat het scherm Grafiekweergave open.
- Zoek in grafiekweergavehet menu Kanaalfunctie voor Kanaal 1 in het rechtergedeelte van het scherm. Kies Invoerversterker in het menu en selecteer AC Koppeling. Het binnenkomende signaal van de proefpersoon verschijnt nu in real-time op het scherm.
OPMERKING: De gevoeligheid van het kanaal kan worden aangepast door het pop-upmenu Bereik te selecteren. Pas het bereik aan totdat de signaalpieken 25%-75% van de volledige schaal zijn. Sluit de invoerversterker door op OKte klikken. - Op de impedantie convertor, pas de Gain (grootte) en Balans totdat een sterk signaal wordt waargenomen op de datalogger output, gericht op de balans te houden in de buurt van nul.
- Selecteer op Kanaal 2 de t-type pod om realtime temperatuurgegevens op te nemen.
- Wanneer beide kanalen goed zijn ingesteld, klikt u op de knop Start en begint de datalogger met het registreren van gegevens.
3. Temperatuuroplaten
- Plaats na de acclimatisatieperiode het plastic rooster met de bijgevoegde kreeft voorzichtig in de experimentele arena en plaats de warmte-uitwisselingspoel bovenop het rooster.
- Plaats de thermocouplesonde in de buurt van de kreeft, zodat deze volledig onder water staat voordat u het deksel op de experimentele arena plaatst om visuele stress voor de proefpersoon te verminderen.
- Pas het saldo zo nodig aan en plaats een opmerking over de uitvoer waarin staat dat de proef is begonnen.
- De uitvoer kan en moet periodiek worden opgeslagen gedurende het hele experiment.
- Klik op Bestand en selecteer Opslaan als om de uitvoer in eerste instantie op de computer op te slaan.
- Klik tijdens het experiment op Bestand en selecteer Opslaan.
OPMERKING: Hoewel de LabChart-software bestanden kan herstellen in het geval van een onbedoelde onderbreking van het programma (bijvoorbeeld een stroomstoring), wordt aanbevolen om tijdens het experiment elke 15-20 min actieve bestanden op te slaan om gegevensverlies te voorkomen.
- Verhoog de watertemperatuur van de experimentele arena met een snelheid van ~1,5 °C om de 15 min om een helling te bereiken van 12 °C tot 30 °C over een periode van 2,5 uur door de temperatuur van het recirculatiewaterbad aan te passen.
OPMERKING: De geografische verspreiding van de Amerikaanse kreeft beslaat een thermische gradiënt van 25 °C en individuen kunnen acclimatiseren aan en overleven bij temperaturen tot 30 °C16. Als zodanig werd 30 °C gekozen als bovengrens voor deze temperatuurhelling, omdat het ervoor zorgt dat kreeften een stressvol scenario ervaren dat niet het kritische thermische maximum13bereikt, wat tot sterfte zou kunnen leiden. Het specifieke tempo van de opwarming werd geselecteerd omdat het valt binnen een reeks van opwarmingspercentages die worden toegepast in studies met andere soorten8,14 en eerder onderzoek naar de Amerikaanse kreeft13,27. Voorafgaand aan de implementatie van dit protocol, is het belangrijk om 1) het bepalen van de juiste temperatuurbereik voor een bepaald experiment en 2) een pretrialtemperatuur helling met een lege experimentele arena uit te voeren, omdat dit zal helpen om de noodzakelijke temperatuuraanpassing van het waterbad te bepalen om de gewenste helling te bereiken. Dit kan ook verschillen afhankelijk van het volume van het water in de arena. - Tijdens de temperatuurhelling, registreren wanneer een aanpassing die van invloed kan zijn op de output optreedt.
- Houd er rekening mee dat het saldo op de impedantieconvertor waarschijnlijk gedurende het hele experiment moet worden aangepast en dat dit een onbedoelde piek in de uitvoer kan veroorzaken.
- Als de temperatuur in de experimentele arena begint te bereiken niveaus buiten de gewenste thermische bereik van de proefpersoon, onwillekeurige spiercontracties kan resulteren in een verkeerde "piek" in de output. Als dit gebeurt, maakt u een opmerking om gebieden van de uitvoer te identificeren die tijdens het gegevensconversieproces moeten worden verwijderd.
- Wanneer de helling is voltooid, verwijdert u de kreeft uit de experimentele arena en plaatst u deze in een herstelbad (12 °C) voor ~ 20 min. Indien gewenst, blijven de hartslag van de kreeft te controleren totdat het terugkeert naar basale niveaus.
- Na 20 min druk je op de stopknop op de PowerLab-uitgang en sla je het bestand op. Verwijder voorzichtig de elektroden en snijd de kabelbanden door met een chirurgische schaar voordat u de proefpersoon terugvoert naar de houdtank.
LET OP: In plaats van het plaatsen van een kreeft direct in het herstelbad, een andere optie is om langzaam terug de experimentele arena naar de starttemperatuur. Dit wordt bereikt door de experimentele arena te koelen met ~1,5 °C om de 15 min in de loop van een extra 2,5 uur.
4. Gegevensconversie
- Gegevenspad openen. Stel Kolom A in op tijd door te dubbelklikken op Kolom A en te klikken op Selectie en actief punt aan de linkerkant van het menu Kolom Een setup van het gegevenspad. Selecteer Tijd aan de rechterkant van het menu en sluit het venster door op OKte klikken.
- Stel Kolom B in op de gemiddelde temperatuur door dubbel te klikken op kolom B en de optie Statistieken te selecteren aan de linkerkant van het menu Kolom B-installatie van gegevenspad. Selecteer Gemiddelde aan de rechterkant van het menu en Kanaal 2 als berekeningsbron onder in het venster van het menu. Klik op OK om het venster te sluiten.
- De opgenomen spanning omzetten in beats per minuut
- Dubbelklik op Kolom C en selecteer Selectie en actief punt aan de linkerkant van het menu. Selecteer Selectieduur in de rechterkant van het menu en klik op OK om het venster te sluiten.
- Dubbelklik op Kolom D en selecteer Cyclische metingen aan de linkerkant van het menu. Selecteer Gebeurtenisaantal aan de rechterkant van het menu en Kanaal 1 als berekeningsbron. Klik op OK om het venster te sluiten. Dit telt de pieken van de gegevens om de hartslag te bepalen over een geselecteerd deel van de gegevens.
OPMERKING: Selecteer indien nodig de knop Opties onder in het menu en pas de detectie-instellingen aan om de gegevens nauwkeuriger te kunnen lezen. Scan door het gegevensbestand en bepaal of de vormopties 'Sine' of 'Spikey' resulteren in tellingen van alleen de belangrijkste pieken van de hartslagoutput. Pas bovendien de drempel detectieaanpassing aan de rechterkant van het menu aan om ruis in het uitvoerbestand te negeren. - Dubbelklik op Kolom E en selecteer Cyclische metingen aan de linkerkant van het menu. Selecteer Gemiddelde cyclische snelheiden kanaal 1 als berekeningsbron. Pas de detectie-instellingen en detectieaanpassing aan op de instellingen voor kolom D (indien gemanipuleerd in stap 4.4.2). Klik op OK om het venster te sluiten. Dit geeft de uiteindelijke schatting van de hartslag (als slagen per minuut) over een geselecteerd gedeelte van gegevens.
- Wanneer de kolommen zijn ingesteld, gaat u terug naar het gegevensbestand en markeert u de gewenste secties van de uitvoer, waarbij gebieden met foutieve gegevens worden weggegeven die zijn geïdentificeerd door opmerkingen in punt 3.6.
- Selecteer Opdrachten en Meerdere toevoegen aan gegevenspad.
- Selecteer Tijd in het vervolgkeuzemenu Zoeken met behulp van en haal om de 30 s gegevens op door het vakAl te controleren en '30' in te voeren onder het menu Selecteren.
- Klik op de optie Huidige selectie in het menu Doorzetten en klik op Toevoegen.
- Ga terug naar het scherm Gegevenspad en selecteer Bestand en Opslaan als om de uitvoer op te slaan als een Excel-bestand.
OPMERKING: Hier wordt hartslag gerapporteerd (in slagen per minuut) elke 30 s in tegenstelling tot elke minuut op basis van eerder onderzoek8,27. Dit helpt ook om veranderingen in de real-time verzamelde spanningsgegevens nauwkeuriger vast te leggen. Het is mogelijk om gegevens te selecteren met kortere of langere tijdsintervallen op basis van individuele voorkeur.
5. Berekening van arrhenius breuktemperatuur
- Open het gegevensbestand in Excel en manipuleer de uitvoer van de LabChart-software.
- Zet de temperatuur van Celsius om in het wederkerige van Kelvin met behulp van de volgende vergelijking: [1000/(temperatuur °C + 273,15 K)].
- Verkrijg het natuurlijke logboek van de hartslag: ln (BPM).
- Genereer een Arrhenius-plot door de hartslag in kaart te brengen als functie van temperatuur, uitgedrukt in ln(BPM) versus wederkerig (K)13,15.
- In SigmaPlot, passen de gegevens met een stuksgewijze regressie en bepalen van de snijpunt, dat is de ABT.
- Kopieer en plak de getransformeerde gegevens in een nieuwe werkmap. Selecteer de optie Statistieken in het hoofdmenu en de wizard Regressie in de vervolgkeuzelijst.
- Selecteer in het venster Vergelijking stukwijs in het menu Vergelijkingscategorie en 2 segmentlineair onder het vak Vergelijkingsnaam. Klik op Volgende.
- Selecteer in het venster Variabelen de getransformeerde temperatuurgegevens als de t-variabele en de getransformeerde hartslaggegevens als de y-variabele, met behulp van de vervolgkeuzeopties in het menu Variabele kolommen. Controleer of XY Pair is geselecteerd in het menu Gegevens uit voordat u op Volgendeklikt.
- Nadat u het venster Resultaten aanpassen hebt bekeken, klikt u op Volgende en schakelt u het selectievakje Rapport maken in het venster Numerieke uitvoeropties in. Klik op Volgende.
- Schakel in het venster Grafiekopties de optie Nieuwe grafiek maken in de sectie Grafiek van resultaten aanpassen en Vergelijking toevoegen aan grafiektitel onder de sectie Grafiekfuncties. Klik op Voltooien.
- Haal op de pagina Resultatenuitvoer de vergelijkingen en parameterwaarden op voor de twee regio's van de stuksgewijze regressie, evenals de statistische uitvoer voor de regressie (bijvoorbeeld R2,F-statistiek en p-waarde).
- Met behulp van de gegenereerde parameterwaarden en vergelijkingen stelt u de twee segmenten gelijk aan elkaar in en los u op dat de variabele "t" de ABT bepaalt. Zet deze waarde terug naar Celsius met behulp van de volgende vergelijking: °C = (1000/t) - 273,15.
OPMERKING: De ABT kan ook worden berekend in de R statistische computeromgeving met behulp van het pakket "gesegmenteerd"17 in het programma SAS18, of met behulp van de "Segmental linear regression" routine in Prism819.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit protocol beschrijft het gebruik van impedantiepneumografie om real-time gegevens te verkrijgen voor hartslag (in spanning) en temperatuur tijdens een temperatuur-ramping experiment. Bij het perforeren van deze techniek zal de amplitude van de opgenomen spanningen en temperaturen variëren op basis van experimenteel ontwerp en focale soorten. De spanningsoutput die in real-time wordt weergegeven, volgt echter een generieke sinusverdeling wanneer het protocol correct wordt geïmplementeerd (figuur 1A). Naarmate de temperatuur in de arena wordt verhoogd, verandert de real-time verdeling van spanningsveranderingen om een verhoogde frequentie van spanningspieken weer te geven (d.w.z. hartslagen; Figuur 1B). Naarmate de temperatuur in de arena blijft stijgen tot niveaus buiten het optimale prestatievenster van de proefpersoon, verandert de verdeling om een verminderde frequentie van spanningspieken met een sinine-achtige vorm weer te geven die wordt onderbroken door sporadische pieken en/of momenten van "vlakke lijn" (figuur 1C).
Zodra ruwe gegevens worden geconverteerd met behulp van de Data Pad-component van de LabChart-software, volgt de resulterende verdeling van de hartslag (in slagen per minuut) in de loop van de temperatuurhelling een parabolische verdeling als het experiment succesvol is (figuur 2). Als de temperatuur in de arena wordt verhoogd, de hartslag van de proefpersoon stijgt ook om te voldoen aan verhoogde energetische eisen in verband met warmere temperaturen. Echter, als de temperatuur blijft stijgen en de proefpersoon begint te ervaren matige tot extreme thermische stress, hartslag begint te dalen of wordt grillig als het onderwerp begint te vertonen passieve thermische tolerantie (bijvoorbeeld, het begin van anaërobe ademhaling, metabole onderdrukking van de stofwisseling, en verminderde activiteit5,7). Wanneer hartslag- en temperatuurgegevens worden getransformeerd en een Arrhenius-plot wordt gegenereerd, kan het punt waarop de hartslag begint te dalen (ABT) worden berekend (figuur 3). Het Arrhenius-plot past dan met een stuksgewijze regressie met behulp van statistische software waarin het snijpunt van de twee lijnen de ABT vertegenwoordigt.
Figuur 1: Representatieve uitvoer van LabChart datalogger. Real-time spanningsverandering over elektroden van de proefpersoon wordt in het rood weergegeven en de gelijktijdige real-time output van de arenatemperatuur (°C) wordt in blauw weergegeven. In het begin van het experiment onder koelere temperaturen (bijvoorbeeld 13,1 °C) moet de spanning een generieke sine-achtige verdeling volgen (A). Naarmate de temperatuur wordt verhoogd (bijvoorbeeld 23 °C), moet de frequentie van spanningspieken toenemen, maar de verdeling moet sine-achtig blijven (B). Ten slotte moeten de spanningspieken onregelmatig worden naarmate de frequentie afneemt(C). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Verwachte verdeling van de hartslag over de temperatuurhellingcursus. Spanningsgegevens die door de datalogger worden verzameld, worden omgezet in hartslag in slagen per minuut (BPM) met behulp van de Data Pad-component van de software. Wanneer de helling correct wordt uitgevoerd, wordt een parabolische verdeling van de hartslag over het geteste temperatuurbereik weergegeven. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Voorbeeld van een Arrhenius-complot. Zodra gegevens zijn omgezet in de Data Pad en geëxporteerd, worden ze getransformeerd om een Arrhenius-plot te genereren. In dit voorbeeld zijn gegevens geschikt voor een stuksgewijze niet-lineaire regressie in SigmaPlot, waardoor vergelijkingen worden genereren voor de linker- en rechtersegmenten (respectievelijk regio 1 en regio 2) van de regressielijn, evenals goodness-of-fit-metrics. Het snijpunt van de twee regressielijnen wordt opgelost als de ABT (rode ster). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol beschrijft het gebruik van impedantiepneumografie om veranderingen in de hartslag van late fase ongewervelde dieren te meten tijdens een temperatuur ramping experiment. Het belangrijkste voordeel van deze techniek in vergelijking met andere laboratoriumgebaseerde benaderingen9,10,11 is dat het minimaal invasief is en geen grote chirurgische manipulatie van het exoskelet inhoudt, waardoor de hoeveelheid hersteltijd die nodig is voor experimenten wordt verminderd. Bovendien is de apparatuur gemakkelijk te gebruiken, en de resulterende gegevens kunnen eenvoudig worden gemanipuleerd en geïnterpreteerd in het voorgestelde softwareprogramma. Terwijl de Amerikaanse kreeft hier als modelonderwerp wordt gebruikt, is deze techniek met succes uitgevoerd in blauwe mosselen(Mytilus spp.14)en kan gemakkelijk worden gewijzigd voor gebruik in andere late fase ongewervelde dieren (d.w.z. krabben, garnalen en andere tweekleppigen).
Een bijkomend voordeel van het protocol is dat het zich richt op het berekenen van de ABT als een niet-dodelijke indicator van thermische grenzen. Hoewel talrijke studies deCT-max presenteren als het significante eindpunt bij het bepalen van de thermische fysiologische prestaties5,8,20,21,22,23, ondervinden organismen zelden temperaturen in dit bereik in de natuurlijke omgeving5. Bovendien, als de CTmax is vaak een dodelijke temperatuur, met behulp van deze metrische als het gewenste eindpunt sluit het gebruik van proefpersonen in extra of follow-on experimenten post-thermische stress23. Bij het berekenen van de ABT met behulp van dit protocol, is het van cruciaal belang om de temperatuur in de experimentele arena te verhogen tot het punt van het duwen van de proefpersoon tot zijn fysiologische limiet zonder de dood te induceren. Daarom wordt aanbevolen om de potentiële thermische grenzen van de focale soorten te bepalen via een proefstudie (indien mogelijk) alvorens het volledige bereik van de experimentele temperatuurhelling te bepalen.
Het wordt ook aanbevolen dat onderzoekers natuurlijke variaties in basale hartslag van een brandpuntssoort bepalen en observeren wanneer de temperatuur in de experimentele arena op een constant en niet-stressvol niveau wordt gehandhaafd voorafgaand aan het ramping-experiment. Dit is vooral nuttig voor focale soorten waarbij in de gepubliceerde literatuur geen hartslaginformatie beschikbaar is. Het dient ook als ruime praktijk van elektrode implantatie technieken. Dit kan ook helpen onderzoekers bepalen van de juiste acclimatisatie tijd die nodig is om ervoor te zorgen dat er geen valse pieken in de hartslag zijn te wijten aan de behandeling van stress aan het begin van een experiment.
Hoewel het protocol bespreekt het gebruik van impedantie pneumografie in de context van thermische stress alleen, het kan ook worden gebruikt om de potentiële interactieve effecten van andere stressoren op de thermische fysiologie te verkennen. De prestaties van organismen kunnen worden verminderd in aanwezigheid van milieustressoren (d.w.z. hypoxie, hypercapnie, verontreinigende stoffen en/of veranderingen in zoutgehalte), die ook optimale temperatuurbereiken kunnen comprimeren voor prestaties7,24,25,26. Als zodanig kan dit protocol worden gewijzigd om te onderzoeken hoe blootstelling aan verschillende stressoren voorafgaand aan temperatuurhelling de prestaties kan beïnvloeden.
Bijvoorbeeld, Harrington en Hamlin27 blootgesteld jeugdige H. americanus aan de huidige of voorspelde eind-eeuw pH voorwaarden (8.0 en 7.6, respectievelijk) voor 2 maanden voorafgaand aan de beoordeling van de cardiale prestaties tijdens een temperatuur helling. Kreeften die vooraf werden blootgesteld aan meer zure omgevingen vertoonden een aanzienlijke vermindering van het gemiddelde ABT in vergelijking met die onder de huidige pH-omstandigheden. Dit suggereert dat een lage pH-omgeving de thermische prestaties vermindert en het risico op cellulaire schade als gevolg van hittestress bij lagere temperaturen kan verhogen27. Toekomstige inspanningen kunnen worden uitgebreid op de methode die hier wordt gepresenteerd om pre-blootstelling aan een combinatie van milieustressoren voorafgaand aan het volgen van dit protocol op te nemen. Bovendien kan dit protocol worden aangepast om veranderingen in de cardiale prestaties te meten tijdens blootstelling aan biotische stressoren en hoe thermische grenswaarden kunnen veranderen naar gelang van ontogeny4,5.
Een belangrijke beperking van dit protocol is dat de apparatuur zoals beschreven is beperkt voor gebruik in een laboratorium omgeving, potentieel beperken van de toepasbaarheid voor veld-gebaseerde experimenten die meer gespecialiseerdeapparatuur8 vereisen . Deze techniek vereist ook de terughoudendheid van zeer motile proefpersonen (bijvoorbeeld kreeften en krabben) om de productie van valse gegevens punten als gevolg van niet-cardiale spierbewegingen te verminderen. Hoewel dit natuurlijk gedrag tijdens een temperatuurhelling kan beperken, is de impact van beperkingen consistent voor alle proefpersonen. Het belangrijkste is dat er kans is op weefselschade of overlijden bij proefpersonen als agressief of onzorgvuldig boren tijdens elektrodeimplantatie wordt uitgevoerd. Dit contrasteert scherp met infrarood fotoplethysmografie, een echt niet-invasieve techniek die gebruik maakt van een externe infrarood transducer om licht door het hartzakje te passeren en hartfunctie te registreren door gereflecteerde lichtenergie om te zetten in spanning8,28.
Hoewel infrarood fotoplethysmografie vermindert het risico van het hanteren van stress in vergelijking met impedantie pneumografie, correct implanteren van elektroden met behulp van de beschreven methode resulteert in een minimale acclimatisatie tijd, en leidt tot een snelle acclimatisatie tijd, en leidt tot een snelle herstel zonder inducerende sterfte bij proefpersonen na de ramping experiment27. Aangezien er geen significant verschil is in de cardiale output die door beide methoden28wordt geregistreerd, wordt geconcludeerd dat impedantiepneumografie een betrouwbare en minimaal invasieve techniek is voor het beoordelen van de cardiale prestaties. Ten slotte hebben de talrijke voordelen en flexibiliteit van het protocol het potentieel om te verduidelijken hoe verschillende omgevingsfactoren interageren met temperatuur om fysiologische prestaties in late fase schaaldieren te beïnvloeden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs bedanken Paul Rawson voor laboratoriumbijstand en de National Science Foundation award IIA-1355457 aan Maine EPSCoR aan de Universiteit van Maine voor fondsen om apparatuur te kopen. Dit project werd ondersteund door het USDA National Institute of Food and Agriculture, Hatch projectnummer MEO-21811 via het Maine Agricultural and Forest Experiment Station, evenals NOAA National Marine Fisheries Service Saltonstall Kennedy Grant #18GAR039-136. De auteurs bedanken ook drie anonieme recensenten voor hun opmerkingen over een eerdere versie van dit manuscript. Maine Landbouw en Forest Experiment Station Publicatie Nummer 3733.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.6 mm (1/16 in) drill bit | Milwaukee Tool at Home Depot | 1001294900 | This is for a 1.6 mm (1/16 in) diameter drill bit. This item can be found at most home-improvement stores. |
| 38 AWG Copper Magnet Wire | TEMCo | MW0093 | This wire is used to make the wire electrode leads that are implanted into the test subjects. This listing is for a 4 oz coil of 38-gauge magnetic wire. TemCo also has 36-gauge magnetic wire that is also suitable for use in constructing wire electrodes. |
| Cyanoacrylate glue | Loctite | 852882 | This item includes a brush tip, which makes it easier to control the amount of glue used to secure electrodes to the carapace. |
| Ethanol, 70% Solution, Molecular Biology Grade | Fisher BioReagents | BP82931GAL | This reagent is used in combination with the sterile cotton balls to disinfect the carapace prior to electrode implantation. |
| Excel | Microsoft | N/A | This program is used in the protocol for organizing, manipulating, and analyzing data. It is compatible with both PC and Mac operating systems. |
| Fisherbrand 8-Piece Dissection Kit | Fisher Scientific | 08-855 | This kit includes the forceps, scissors, dissecting knife (and blades), and dissecting needle needed to accomplish the electrode implantation steps in the protocol. |
| Fisherbrand Isotemp Refrigerated/Heated Bath Circulators: 5.4-6.5L, 115V/60Hz | Fisher Scientific | 13-874-180 | This is a complete system that consists of an immersion circulator and a bath. It can be used as a temperature controlled bath or to circulate fluid externally to an application. Temperature range of this water bath is -20 to +100 °C, and the unit heats/cools rapidly and is easy to drain upon conclusion of use. |
| Fisherbrand Sterile Cotton Balls | Fisher Scientific | 22-456-885 | These swabs should be soaked in 70% ethanol before being used to disinfect the carapace prior to electrode implantation. |
| Fork Terminal, Red Vinyl, Butted Seam, 22 to 16 AWG, 100 PK | Grainger | 5WHE6 | Terminals are soldered to the magnetic wire to construct the wire electrodes. These can be purchased from a variety of home-improvement vendors. |
| Impedance converter | UFI | Model 2991 | Measures impedance changes correlated with very small voltage changes, ranging from 0.2 ohm to over 5 ohms. This model can convert impedance changes that stem from resistance, capacitance, or inductance variations, as well as a combination of all three. |
| LabChart software | ADInstruments | N/A | Purchase of the PowerLab datalogger includes the LabChart software, but a license for the software can also be directly downloaded online. LabChart allows the user to record data, open and read LabChart files, analyze data, as well as save and export files. There is a free version of the software, LabChart Reader, but users can only open and read LabChart files and analyze them (i.e., it cannot be used to record, save, or export data files). One also has the option of selecting LabChart Pro, which includes LabChart teaching modules that can be used for educational purposes. |
| LED Soldering Iron | Grainger | 28EA35 | This is a generic soldering iron that can be used to solder the magnetic wire to the fork terminals to create the wire electrodes. |
| PowerLab datalogger | ADInstruments | ML826 | There are a variety of models of the PowerLab. This catalog number is for the 2/26 model that is a 2 channel, 16 bit resolution recorder with two analog input channels, independently selectable input sensitivities, two independent analog outputs for stimulation or pulse generation and a trigger input. The PowerLab features a wide range of low-pass filters, AC or DC coupling and adaptive mains filter. This unit has a USB interface for connection to Windows or Mac OS computers and a sampling rate of 100,000 samples/s per channel. |
| Prism8 | GraphPad | N/A | This program provides an additional option for calculating the Arrhenius Break Temperature through its “Segmental linear regression” data analysis option. This program does not require any programming and is compatible with both Mac and Windows operating systems. |
| R | R Project | N/A | This is free software for statistical computing that is compatible with UNIX platforms, as well as Windows and Mac operating systems. This program can also be used to calculate the Arrhenius Break Temperature using the “segmented” package. There are a number of tutorials and user guides available online through the r-project.org website. |
| Rosin Core Solder | Grainger | 331856 | This product has a diameter of 0.031 in (0.76 mm) and is ideal for use in soldering speaker wire (similar gauge as magnetic wire used for electrodes). |
| SAS | SAS Institute | N/A | This program provides an additional option for calculating the Arrhenius Break Temperature. However, it does require programming and is not compatible with Mac operating systems. |
| SigmaPlot | Systat Software, Inc. | N/A | This is the authors’ preferred program for statistical determination of the Arrhenius Break Temperature. The “Regression Wizard” is easy to use and does not require any programming. One can obtain a free 30-day trial license before purchase. However, it is compatible only with PC computers. |
| T-type Pod | ADInstruments | ML312 | Suitable for measurement of temperatures from 0-50 °C using T-type thermocouples. |
| T-type Thermocouple Probe | ADInstruments | MLT1401 | Compatible with the T-type Pod for connection. Measures temperature up to 150 °C, and is suitable for immersion in various solutions, semi-solids, and tissue (includes a needle for implantation). This product is a 0.6 mm diameter isolated probe that is sheathed in chemical-resistant Teflon and a lead length of 1.0 m. |
| UV Cable Tie, Black | Home Depot | 295813 | This is for a 100-pack of 8-inch (20.32 cm), black cable ties. However, based on the size of test subjects, smaller or larger cable ties may be needed. This item, and others like it, can be purchased at any home-improvement store. |
References
- Stocker, T. F., et al. Climate Change 2013: The Physical Basis. Contribution of Working Group I to the Fifth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change. , Cambridge University Press. Cambridge, UK, and New York, NY, USA. (2013).
- Pershing, A. J., et al. Slow adaptation in the face of rapid warming leads to collapse of the Gulf of Maine cod fishery. Science. 350 (6262), 809-812 (2015).
- Smale, D. A., et al. Marine heat waves threaten global biodiversity and the provision of ecosystem services. Nature Climate Change. 9 (4), 306-316 (2019).
- Pörtner, H. O., Farrell, A. P.
- Pörtner, H. O., Bock, C., Mark, F. C. Oxygen- and capacity-limited thermal tolerance: bridging ecology and physiology. Journal of Experimental Biology. 220 (15), 2685-2696 (2017).
- Somero, G. N., Lockwood, B. L., Tomanek, L. Biochemical adaptation: response to environmental challenges, from life's origins to the Anthropocene. , Sinauer Associates, Incorporated Publishers. Sunderland, MA, USA. (2017).
- Sokolova, I. M., Frederich, M., Bagwe, R., Lanning, G., Sukhotin, A. A. Energy homeostasis as an integrative tool for assessing limits of environmental stress tolerance in aquatic invertebrates. Marine Environmental Research. 79, 1-15 (2012).
- Tepolt, C. K., Somero, G. N. Master of all trades: thermal acclimation and adaptation of cardiac function in a broadly distributed marine invasive species, the European green crab, Carcinus maenas. Journal of Experimental Biology. 217 (7), 1129-1138 (2014).
- Frederich, M., Pörtner, H. O. Oxygen limitation of thermal tolerance defined by cardiac and ventilatory performance in spider crab, Maja squinado. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 279 (5), 1531-1538 (2000).
- Metzger, R., Sartoris, F. J., Langenbuch, M., Pörtner, H. O. Influence of elevated CO2 concentrations on thermal tolerance of the edible crab Cancer pagurus. Journal of Thermal Biology. 32, 144-151 (2007).
- Walther, K., Sartoris, F. J., Bock, C., Pörtner, H. O. Impact of anthropogenic ocean acidification on thermal tolerance of the spider crab Hyas araneus. Biogeosciences. 6 (10), 2207-2215 (2009).
- Styf, H. K., Sköld, H. N., Eriksson, S. P. Embryonic response to long-term exposure of the marine crustacean Nephrops norvegicus to ocean acidification. Ecology and Evolution. 3 (15), 5055-5065 (2013).
- Camacho, J., Qadri, S. A., Wang, H., Worden, M. K. Temperature acclimation alters cardiac performance in the lobster Homarus americanus. Journal of Comparative Physiology A. 192 (12), 1327-1334 (2006).
- Braby, C., Somero, G. N. Ecological gradients and relative abundance of native (Mytilus trossulus) and invasive (Mytilus galloprovincialis) blue mussels in the California hybrid zone. Marine Biology. 148 (6), 1249-1262 (2006).
- Stenseng, E., Braby, C. E., Somero, G. N. Evolutionary and acclimation-induced variation in the thermal limits of heart function in congeneric marine snails (Genus Tegula): implications for vertical zonation. Biological Bulletin. 208 (2), 138-144 (2005).
- Factor, J. Biology of the Lobster: Homarus americanus. , Academic Press. Boston, MA, USA. (1995).
- Muggeo, V. M. Segmented: an R package to fit regression models with broken-lin relationships. R News. 8 (1), 20-25 (2008).
- Ryan, S. E., Porth, L. S. A tutorial on the piecewise regression approach applied to bedload transport data. General Technical Report RMS-GTR-189. , US Department of Agriculture, Forest Service, . Rocky Mountain Research Station, Fort Collins, CO, USA. (2007).
- Prism8 Statistics Guide. , GraphPad Software, Inc. San Diego, California, USA. www.graphpad.com (2020).
- Cuculescu, M., Hyde, D., Bowler, K. Thermal tolerance of two species of marine crab, Cancer pagurus and Carcinus maenas. Journal of Thermal Biology. 23 (2), 107-110 (1998).
- Stillman, J. H. A comparative analysis of plasticity of thermal limits in porcelain crabs across latitudinal and intertidal zone clines. International Congress Series. 1275, 267-274 (2004).
- Maderia, D., et al. cellular and biochemical thermal stress response of intertidal shrimps with different vertical distributions: Palaemon elegans and Palaemon serratus. Comparative Biochemistry and Physiology, Part A. 183, 107-115 (2015).
- Padilla-Ramirez, S., et al. The effects of thermal acclimation on the behavior, thermal tolerance, and respiratory metabolism in a crab inhabiting a wide range of thermal habitats (Cancer antennarius Stimpson, 1856, the red shore crab). Marine and Freshwater Behaviour and Physiology. 48 (2), 89-101 (2017).
- Pörtner, H. O. Ecosystem effects of ocean acidification in times of ocean warming: a physiologist's view. Marine Ecology Progress Series. 373, 203-217 (2008).
- Pörtner, H. O. Oxygen- and capacity-limitation of thermal tolerance: a matrix for integrating climate-related stressor effects in marine ecosystems. Journal of Experimental Biology. 213 (6), 881-893 (2010).
- Zittier, Z. M. C., Hirse, T., Pörtner, H. O. The synergistic effects of increasing temperature and CO2 levels on activity capacity and acid-base balance in the spider crab, Hyas araneus. Marine Biology. 160 (8), 2049-2062 (2013).
- Harrington, A. M., Hamlin, H. J. Ocean acidification alters thermal cardiac performance, hemocyte abundance, and hemolymph chemistry in subadult American lobsters Homarus americanus H. Milne Edwards, 1837 (Decapoda: Malcostraca: Nephropidae). Journal of Crustacean Biology. 39 (4), 468-476 (2019).
- Depledge, M. H. Photoplethysmography - a non-invasive technique for monitoring heart beat and ventilation rate in decapod crustaceans. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Physiology. 77 (2), 369-371 (1984).
