Summary
Termal bir meydan okuma sırasında kalp hızının ölçülmesi, akut çevresel değişimin bir sonucu olarak organizmaların fizyolojik tepkilerine ışık verir. Amerikan ıstakozunu(Homarus americanus)model bir organizma olarak kullanan bu protokol, geç evre omurgasızlarda kalp hızını ölçmek için empedans pnömografisinin nispeten noninvaziv ve öldürücü olmayan bir yaklaşım olarak kullanılmasını tanımlar.
Abstract
Dünya iklimlerinde yaygın değişiklikler sonucunda okyanuslarda sıcaklıklar hızla artmaktadır. Organizma fizyolojisi çevresel sıcaklıktan yoğun olarak etkilendiği için, bu durum çeşitli deniz canlılarında termal fizyolojik performansı değiştirme potansiyeline sahiptir. Amerikan ıstakozunu(Homarus americanus)model bir organizma olarak kullanan bu protokol, geç evre omurgasızlarda kardiyak performansın akut termal stres altında nasıl değiştiğini anlamak için empedans pnömografisinin kullanımını açıklamaktadır. Protokol, bir sıcaklık rampa deneyi sırasında kalp hızının gerçek zamanlı olarak toplanmasına olanak tanıyan minimal invaziv bir teknik sunar. Veriler kolayca Arrhenius kırılma sıcaklığı (ABT), hangi kalp hızı artan sıcaklıklar ile düşmeye başlar sıcaklık hesaplamak için kullanılan bir Arrhenius arsa oluşturmak için manipüle edilir. Bu teknik geç evre omurgasızlar (yani, yengeçler, midye veya karides) çeşitli kullanılabilir. Protokol sadece sıcaklığın kardiyak performans üzerindeki etkisine odaklansa da, fizyolojik performansı etkilemek için sıcaklıkla etkileşime girme potansiyelini anlamak için değiştirilebilir. Bu nedenle, yöntem deniz omurgasızlarının çevredeki akut değişikliklere nasıl tepki verdigini daha iyi anlamak için geniş kapsamlı uygulamalar potansiyeline sahiptir.
Introduction
Son yıllarda, atmosfere sera gazlarının artan girdisi (yani, karbondioksit, metan, ve azot oksit) çevresel değişimyaygındesenler ilerler 1 sonuçlandı. Dünya okyanusları hızla ısınıyor2,,3, organizma fizyolojisi üzerinde ciddi etkileri olabilir bir eğilim. Sıcaklık fizyolojik oranları ağır etkiler ve organizmalar performans için en uygun sıcaklık aralığı na sahip4,5,6. Bu nedenle, sıcaklıklar bu aralığın dışında başıboş olarak bireyler dokulara uygun oksijen dağıtım ını korumakta zorluklar yaşayabilirsiniz. Bu okyanussıcaklıkları5,7ısınma karşısında aerobik performans düşüşlere yol açma potansiyeline sahiptir.
Laboratuvar ortamında, çevresel değişimin fizyolojik etkilerini anlamak için bir yöntem termal stres bağlamında kardiyak performansı incelemektir. Bu, öngörülen ısınma koşullarına maruz kalmanın performans eğrilerini nasıl değiştirebileceği ne kadar içgörü sağlar5,6 yanı sıra iklimlendirme plastisite potansiyelini8. Deniz omurgasızlarında kalp atış hızını ölçmek için çeşitli yöntemler başarıyla uygulanmıştır. Ancak, bu tekniklerin çoğu cerrahi kaldırma veya dış iskelet ve ölçümcihazlarınınuzun süreli implantasyon içerir 9,10,11, hangi test konusuna ek stres tanıttı ve deneme öncesi başarılı bir iyileşme için gerekli süreyi artırır. Ayrıca, daha az invaziv teknikler (örneğin, görsel gözlem, videografi) organizmaların tam veya yarı saydam olabileceği erken yaşam öyküsü aşamaları ile sınırlandırılabilir12. Ayrıca, daha teknolojik olarak gelişmiş metodolojiler (örneğin, kızılötesi transdüserler veya Doppler perfüzyon8yoluyla gözlemler 8,11)iyi bilgili olmayan araştırmacılara ek zorluklar sunulabilir.
Bu protokol, bir sıcaklık rampa deneyi sırasında kalp hızındaki değişiklikleri değerlendirmek için empedans pnömografi kullanımını göstermek için geç aşama deniz omurgasız modeli olarak Amerikan ıstakoz(Homarus americanus)kullanır. Empedans pnömografi kalp sözleşmeler gibi voltaj değişiklikleri ölçmek için perikardın her iki tarafında konumlandırılmış iki elektrotlar arasında bir salınımlı elektrik akımı (AC) geçen içerir ve rahatlatır13,14. Bu teknik minimal invazivdir, çünkü dış iskeletin hemen altına hafifçe yerleştirilen küçük elektrotlar (yani 0.10-0.12 mm çapında) kullanır. Son olarak, bir veri kaydedici kullanımı yoluyla rampa sırasında hem kalp hızı ve su sıcaklığı gerçek zamanlı değerlendirmeler sağlar.
Protokol aynı zamanda Arrhenius kırılma sıcaklığı (ABT), kalp hızı artan sıcaklıklar13,15ile azalmaya başlar sıcaklık hesaplamak için talimatlar sağlar. ABT kritik termal maksimum ölçme üzerinde tercih edilebilir deneklerde kapasitenin termal sınırının öldürücü olmayan bir göstergesi olarak hizmet vermektedir (CTmax, kardiyak fonksiyonun üst sınırı5,6), öldürücü sınırlar genellikle aşırı ve nadiren doğal ortamda karşılaşılan gibi5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Ekipman kurulumu
- Yaklaşık 8-10 cm çapında ve 40-70 cm uzunluğunda uzantıları olan bir ısı alışverişi bobinoluşturmak için kendi etrafında şeffaf, şekillendirilebilir boru sarın. Elektrik bandı kullanarak bobini sabitleyin.
- Isı alışverişi bobinini harici beslemeye takın ve bir soğutma/ısıtma sirkülasyonlu su banyosunun geri dönüş bağlantı parçalarına yerleştirin. Hortum kelepçeleri kullanılarak bağlantının güvenli olduğundan emin olun.
- Soğutma/ısıtma sirkülasyonlu su banyosukuyusunu ters ozmoz (RO) suyuyla doldurun ve güç kablosunu bir priz içine takın. Su banyosunu açın ve ısı alışverişi bobinine olan bağlantısında sızıntı olmadığından emin olun.
- Siyah BNC kablosunu ünitedeki AC çıkışına takarak ve Kanal 1 bağlantı noktasını kullanarak veri kaydedicisine(Malzeme Tablosu)bağlayarak empedans dönüştürücüsünü ayarlayın.
- Termokupl probu (sıcaklık kaydedici) T-tipi pod'a takın ve ardından T tipi bölmeyi veri kaydedicinin Kanal 2 bağlantı noktasına takın.
- Veri kaydedicinin güç kablosunu bir güç kaynağına takın ve usb kablo konektörünü kullanarak veri kaydediciyi bir PC bilgisayarına bağlayın.
- Alışma odasını ve deneysel alanı 7,5 L yapay deniz suyu (tuzluluk = 35 ppt, pH = 8,1, sıcaklık = ~12 °C) ile doldurun.
NOT: Uyum odası için gerekli olan suyun hacmi, sıcaklığı ve kimyası ve deneysel arenadaki başlangıç koşulları deneysel tasarıma bağlıdır. Daha da önemlisi, bu kaplar test öznesini rahatça batıracak kadar büyük olmalıdır.
2. Elektrotların implantasyonu
- Istakozu, vücudun dikdörtgenin bir ucunda rahatça Y şeklinde olması için deneysel alana kolayca sığdıran plastik bir ızgaraüzerine yerleştirin.
- Küçük kablo bağları kullanarak ıstakozpençelerini ve karnını plastik ızgaraya dikkatlice sabitleyin. Kablo bağları hareketi önlemek için yeterince sıkı olmalı ama cerrahi makas için oda deney tamamlandıktan sonra bunları kaldırmak için izin.
- Bir kağıt havlu ile carapace kapalı kuru ve% 70 etanol batırılmış bir pamuk topu ile temizleyin.
- Elektrotlar için delikler oluşturun.
- Küçük bir matkap ucu (örn. 1,6 mm), yavaş ve dikkatli bir şekilde perikardın her iki tarafındaki karaayak boyunca iki küçük deliği (yaklaşık) elle delin.
- Steril bir kesme iğnesi yerleştirerek her deliği hafifçe bitirin.
- İğne kolayca karaayak geçmesi değilse, tekrar iğne denemeden önce yavaş yavaş el matkap devam edin.
NOT: Deney hayvanlarında stresi en aza indirmek için, deneme öncesi bu tekniğin kullanılması şiddetle tavsiye edilir. Zamanla, kullanıcılar kolayca matkap ucu neredeyse karaayak ve iğne geçmek rağmen ne zaman duygu belirleyebilirsiniz. El delme ıstakoz ve yengeçler için uygundur, özellikle dış iskelet yumuşaksa (yani, hayvan son zamanlarda erimişse). Ancak, deneğin daha kalın bir dış iskeleti veya kabuğu (yani bir bivalve) varsa, bir Dremel aracı daha uygundur.
- Elektrotları (36-38 G manyetik tel, 0,10-0,12 mm çapında) elde edin ve telin ucundaki küçük bir yalıtım parçasını bir kesme bıçağı kullanarak kazıyın. Her telin ucunu forceps kullanarak küçük bir kancaya dikkatlice bükün ve yeni açılan deliklerin her birine bir tane yerleştirin.
- Her tel kurşunu küçük bir damla siyanoakrilat tutkal kullanarak sabitleyin ve 5-10 dakika kurumasını bekleyin.
NOT: Çok fazla eklemek teli yeniden sulandıracağı ve sinyalin kaydolmasını önleyeceği için tutkalın dikkatli kullanılması çok önemlidir. - Tutkal kuruduktan sonra, tel empedans dönüştürücüye kabloyu takın ve açın. Istakozu alışma odasına yerleştirin ve 15-20 dakika boyunca implante edilmiş elektrotlara alışmasını bekleyin.
NOT: Hızlı veya sarsıcı hareketler ve tamamen kurutulmuş tutkal, elektrotların karaayaktan ayrılmasına neden olabilir. Bu durumda, adım 2.6'ya dönün. - Veri kaydediciyi açın ve bilgisayardaki LabChart yazılımını açın. Yeni Deneme'yi tıklatın ve Grafik Görünümü ekranını açık bırakın.
- GrafikGörünümü'nde, ekranın sağ bölümünden Kanal 1'in Kanal İşlev menüsünü bulun. Menüden Giriş Amplifikatörü'nü seçin ve AC Kaplin'iseçin. Deneğin gelen sinyali artık gerçek zamanlı olarak ekranda görünecektir.
NOT: Kanalın hassasiyeti Aralık açılır menüsü seçilerek ayarlanabilir. Sinyal zirveleri tam ölçeğin %25-75'i olana kadar aralığı ayarlayın. Tamam'ıtıklatarak Giriş Yükselticisini kapatın. - Empedans dönüştürücüde, Denge'yi sıfıra yakın tutmayı amaçlayan veri kaydedici çıkışında güçlü bir sinyal gözlemlenene kadar Kazanç (boyut) ve Denge'yi ayarlayın.
- Kanal 2'de, gerçek zamanlı sıcaklık verilerini kaydetmek için T-Type bölmesini seçin.
- Her iki kanal düzgün ayarlandığında, Başlat düğmesini tıklatın ve veri kaydedici veri günlüğe kaydetmeye başlar.
3. Sıcaklık rampası
- Alışma döneminden sonra, plastik ızgarayı ekli ıstakozla dikkatlice deneysel arenaya yerleştirin ve ısı alışverişi bobinini ızgaranın üzerine yerleştirin.
- Istakoz un yanına termokupl probu yerleştirin, test konusuna görsel stresi azaltmak için kapağı deneysel arenaya koymadan önce tamamen batırılmasını sağlar.
- Bakiyeyi gerektiği gibi ayarlayın ve denemenin başladığını belirten çıktıya yorum yapın.
- Çıktı, deneme boyunca periyodik olarak kaydedilebilir ve kaydedilmelidir.
- Çıktıyı bilgisayara kaydetmek için Dosya'yı tıklatın ve Kaydet'i seçin.
- Deneme sırasında kaydederken Dosya'yı tıklatın ve Kaydet'iseçin.
NOT: LabChart yazılımı, yanlışlıkla bir programın kapatılması durumunda dosyaları kurtarabilse de (örn. elektrik kesintisi), veri kaybını önlemek için deneme sırasında her 15-20 dakikada bir etkin dosyaların kaydedilmesi önerilir.
- 12 °C'den 30 °C'ye kadar bir rampa elde etmek için, dolaşımdaki su banyosunun sıcaklığını ayarlayarak 2,5 saat boyunca deneysel arenanın su sıcaklığını ~1,5 °C'de bir artırın.
NOT: Amerikan ıstakozunun coğrafi dağılımı 25 °C'lik termal degradeye sahiptir ve bireyler 30 °C16'yakadar sıcaklıklarda uyum sağlayabilir ve hayatta kalabilirler. Bu nedenle, ıstakozların kritik termal maksimum13'eulaşamayan ve mortaliteye yol açabilecek stresli bir senaryo yaşamasını sağladığından, bu sıcaklık rampası için üst sınır olarak 30 °C seçilmiştir. Isınma belirli oranı,diğer türler8,,14 yanı sıra Amerikan ıstakoz13,27önceki araştırma kullanarak çalışmalarda uygulanan ısınma oranları bir dizi içinde düşüyor çünkü seçildi . Bu protokolü uygulamadan önce, 1) belirli bir deney için uygun sıcaklık aralığını belirlemek ve 2) boş bir deneysel arena ile bir ön deneme sıcaklık rampası yapmak önemlidir, bu istenilen rampa elde etmek için su banyosu gerekli sıcaklık ayarı belirlemek için yardımcı olacaktır. Bu da arenada su hacmine bağlı olarak değişebilir. - Sıcaklık rampası boyunca, çıkışı etkileyebilecek bir ayarlama oluştuğunda kaydedin.
- Empedans dönüştürücüüzerindeki bakiyenin deneme boyunca ayarlanması gerekeceğini ve bunu yapmanın çıktıda kasıtsız bir artışa neden olabileceğini unutmayın.
- Deneysel arenada sıcaklık, deneğin tercih edilen termal aralığının dışında seviyelere ulaşmaya başladığında, istemsiz kas kasılmaları çıkışta hatalı bir "ani artışa" neden olabilir. Bu durumda, veri dönüştürme işlemi sırasında kaldırılması gereken çıktı alanlarını tanımlamak için bir açıklama yapın.
- Rampa tamamlandığında, ıstakozu deneysel arenadan çıkarın ve ~20 dk boyunca bir kurtarma banyosuna (12 °C) yerleştirin. İstenirse, bazal seviyelere dönene kadar ıstakozun kalp atış hızını izlemeye devam edin.
- 20 dakika sonra PowerLab çıkışındaki Durdur düğmesine basın ve dosyayı kaydedin. Elektrotları dikkatlice çıkarın ve testi tutma tankına geri döndürmeden önce kablo bağlarını cerrahi makasla kesin.
NOT: Bir ıstakozu doğrudan iyileşme banyosuna yerleştirmek yerine, başka bir seçenek de deneysel arenayı yavaş yavaş başlangıç sıcaklığına döndürmektir. Bu, deneysel arenanın ilave 2,5 saat boyunca her 15 dakikada ~1,5 °C oranında soğutularak gerçekleştirilir.
4. Veri dönüştürme
- Veri Defteri'niaç. A sütununa çift tıklayarak ve Veri Defteri Sütunu A Kurulum menüsünün sol tarafındaki Seçim ve Etkin Nokta'ya tıklayarak A sütununa zaman ayarlayın. Menünün sağ tarafından Saat'i seçin ve Tamam'ıtıklatarak pencereyi kapatın.
- B Sütunu'na çift tıklayarak ve Column B Veri Defteri Sütunu B Kurulum menüsünün sol tarafından İstatistik seçeneğini seçerek B sütunu ortalama sıcaklığına ayarlayın. Menünün sağ tarafından Ortalama'yı ve menünün penceresinin altındaki Hesaplama kaynağı olarak Kanal 2'yi seçin. Pencereyi kapatmak için Tamam'ı tıklatın.
- Kaydedilen gerilimin dakikada atıma dönüştürülmesi
- C sütununa çift tıklayın ve menünün sol tarafındaki Seçim & Etkin Nokta'yı seçin. Menünün sağ tarafından Seçim Süresi'ni seçin ve pencereyi kapatmak için Tamam'ı tıklatın.
- D sütununa çift tıklayın ve menünün sol tarafında Kisikal Ölçümler'i seçin. Menünün sağ tarafından Olay Sayısı'nı ve Hesaplama kaynağıolarak Kanal 1'i seçin. Pencereyi kapatmak için Tamam'ı tıklatın. Bu, verilerin seçili bir bölümünde kalp hızını belirlemek için verilerin doruknoktalarını sayar.
NOT: Gerekirse, menünün altındaki Seçenekler düğmesini seçin ve verileri daha doğru okumak için Algılama Ayarlarını ayarlayın. Veri dosyasını tarayıp tarayıp , "Sine" veya "Spikey" şekil seçeneklerinin yalnızca sinyal çıkışının yalnızca önemli zirvelerinin sayılarına neden olup olmadığını belirleyin. Ayrıca, çıkış dosyasındaki gürültüyü yok saymak için menünün sağ tarafındaki Algılama Ayarlaması eşiğini ayarlayın. - E sütununa çift tıklayın ve menünün sol tarafındaki Döngüsel Ölçümler'i seçin. Hesaplama kaynağıolarak Ortalama Döngüsel Oran'ıve Kanal 1'i seçin. D sütunu ayarlarıyla eşleşecek şekilde Algılama Ayarlarını ve Algılama Ayarını ayarlayın (adım 4.4.2'de manipüle edilirse). Pencereyi kapatmak için Tamam'ı tıklatın. Bu, verilerin seçili bir bölümü üzerinde kalp hızının (dakika başına atım olarak) son tahminini sağlar.
- Sütunlar ayarlandığında, veri dosyasına dönün ve bölüm 3.6'daki açıklamalar tarafından tanımlanan hatalı veri alanlarını atlayarak çıktının istenen bölümlerini vurgulayın.
- Komutları seçin ve Veri Defterine Çoklu Ekle.
- Açılan menüyü kullanarak Bul menüsünden Saat'i seçin ve Her kutuyu işaretleyerek ve Seç menüsünün altına "30" girerek her 30'lu yılda bir veri çekin.
- Menüden Adım'dan Geçerli seçim seçeneğini tıklatın ve Ekle'yitıklatın.
- Çıktıyı Excel dosyası olarak kaydetmek için Veri Defteri ekranına dönün ve Dosya ve Kaydet As'ı seçin.
NOT: Burada, kalp hızı rapor edilir (dakikada atım) her 30 s önceki araştırma8dayalı aksine 8,27. Bu aynı zamanda gerçek zamanlı toplanan voltaj verilerindeki değişiklikleri daha doğru bir şekilde yakalamaya yardımcı olur. Verileri bireysel tercihe göre daha kısa veya daha uzun zaman aralıklarında seçmek mümkündür.
5. Arrhenius mola sıcaklığının hesaplanması
- Excel'deki veri dosyasını açın ve LabChart yazılımından çıktıyı değiştirin.
- Sıcaklığı santigrat'tan Kelvin'in karşılığına dönüştürün: [1000/(sıcaklık °C + 273,15 K)].
- Kalp hızı nın doğal kütüğüne alın: ln(BPM).
- Sıcaklık bir fonksiyonu olarak kalp hızı çizerek bir Arrhenius arsa oluşturun, ln (BPM) vs karşılıklı olarak ifade (K)13,15.
- SigmaPlot'ta, verileri parça parça regresyonla sığdırın ve ABT olan kesişme noktasını belirleyin.
- Dönüştürülen verileri kopyalayıp yeni bir çalışma kitabına yapıştırın. Ana menüden İstatistikler seçeneğini ve açılan listeden Regresyon Sihirbazı'nı seçin.
- Denklem penceresinde, Denklem Kategorisi menüsünden parçalı ve Denklem Adı kutusunun altında 2 segment doğrusal seçin. İleri'yitıklatın.
- Değişkenler penceresinde, Değişken Sütunlar menüsündeki açılır menü seçeneklerini kullanarak, t değişkeni olmak üzere dönüştürülmüş sıcaklık verilerini ve y değişkeni olacak dönüştürülmüş kalp hızı verilerini seçin. İleri'yitıklatmadan önce Veriler menüsünde XY Çiftinin seçildiğinden emin olun.
- Sonuçları Sığdır penceresini inceledikten sonra İleri'yi tıklatın ve Sayısal Çıktı Seçenekleri penceresinde Rapor Oluştur kutusunu işaretleyin. İleri'yitıklatın.
- Grafik Seçenekleri penceresinde, Form Sonuçları Grafiği bölümünün altındaki yeni grafik oluştur seçeneğini işaretleyin ve Grafik Özellikleri Bölümü'nün altındaki grafik başlığına denklem ekleyin. Bitiş'etıklayın.
- Sonuçlar çıktı sayfasında, parça yönündere regresyon iki bölge için denklemler ve parametre değerleri yanı sıra regresyon için istatistiksel çıktı (örneğin, R2, F-istatistik ve p-değer) alın.
- Oluşturulan parametre değerlerini ve denklemlerini kullanarak, iki parçayı birbirine eşit olarak ayarlayın ve ABT'yi belirlemek için "t" değişkenini çözün.
NOT: ABT ayrıca R istatistiksel hesaplama ortamında SAS18programındaki "segmentli"17 paketi kullanılarak veya Prism819'daki"Segmental lineer regresyon" rutini kullanılarak hesaplanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokol, sıcaklık arttırıcı bir deney sırasında kalp hızı (voltaj) ve sıcaklık için gerçek zamanlı veri elde etmek için empedans pnömografisinin kullanımını açıklar. Bu tekniğin perforing zaman, gerilim ve sıcaklık genliği deneysel tasarım ve odak türlerine göre değişir. Ancak, gerçek zamanlı olarak görüntülenen gerilim çıkışı, protokol doğru uygulandığında genel bir sinüs dağılımını izler (Şekil 1A). Arenadaki sıcaklık arttıkça, voltajın gerçek zamanlı dağılımı gerilim zirvelerinin (yani kalp atışlarının) artan frekansını yansıtacak şekilde değişir. Şekil 1B). Arena sıcaklığı deneğin en iyi performans penceresinin dışındaki seviyelere artmaya devam ettikçe, dağılım, düzensiz zirveler ve/veya "düz astar" anları tarafından kesilen sinüs benzeri bir şekle sahip gerilim zirvelerinin daha az frekansını göstermek için değişir (Şekil 1C).
Ham veriler LabChart yazılımının Veri Defteri bileşeni kullanılarak dönüştürüldükten sonra, sıcaklık rampası boyunca kalp hızının (dakika başına atım) dağılımı, deneme başarılı olursa parabolik bir dağılım izler(Şekil 2). Arenada sıcaklık arttıkça, test konusunun kalp hızı da daha sıcak sıcaklıklarile ilişkili yüksek enerjik talepleri karşılamak için artar. Ancak, sıcaklık artmaya devam ettikçe ve denek aşırı termal stres orta yaşamaya başlar, kalp hızı azalmaya başlar veya konu pasif termal tolerans sergilemeye başlar gibi düzensiz hale gelir (örneğin, anaerobik solunum başlangıcı, metabolik hız bastırma, ve azaltılmış aktivite5,7). Kalp hızı ve sıcaklık verileri dönüştürüldüğünde ve bir Arrhenius çizimi oluşturulduğunda, kalp hızının düşmeye başladığı nokta (ABT) hesaplanabilir(Şekil 3). Arrhenius çizimi daha sonra iki satırın kesiştiği ABT'yi temsil eden istatistiksel yazılım kullanılarak parça parça yönlü bir gerileme ile uyum sağlar.
Şekil 1: LabChart veri kaydedicisinden temsili çıktı. Deneğin elektrotları arasındaki voltajdaki gerçek zamanlı değişim kırmızı renkte, arena sıcaklığının (°C) eşlik eden gerçek zamanlı çıkışı mavi renkte görüntülenir. Denemenin başında daha soğuk sıcaklıklarda (örn. 13.1 °C) gerilim, genel bir sinüs benzeri dağılım(A)izlemelidir. Sıcaklık arttıkça (örneğin, 23 °C), gerilim zirvelerinin sıklığı artmalıdır, ancak dağılım sinüs benzeri kalmalıdır (B). Son olarak, denek optimum termal performans penceresinin dışına itildikçe (örneğin, 28,5 °C), frekans azaldıkça gerilim zirveleri düzensiz hale gelmelidir(C). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Sıcaklık rampası seyri üzerinde kalp hızı beklenen dağılımı. Veri kaydedici tarafından toplanan voltaj verileri, yazılımın Veri Defteri bileşeni kullanılarak dakika başına (BPM) atışlarda kalp hızına dönüştürülür. Rampa doğru yapıldığında, test edilen sıcaklık aralığı üzerinde kalp hızı parabolik dağılımı görüntülenir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Bir Arrhenius arsa örneği. Veriler Veri Defteri'ne dönüştürüldükten ve dışa aktarıldıktan sonra, bir Arrhenius çizimi oluşturmak için dönüştürülürler. Bu örnekte, veriler SigmaPlot'ta parça yönünde olmayan doğrusal olmayan bir regresyonla, regresyon çizgisinin sol ve sağ kesimleri (sırasıyla bölge 1 ve bölge 2) için denklemler ve uygunluk iyiliği ölçümleri ile uyumludur. İki regresyon çizgisinin kesişimi ABT (kırmızı yıldız) olarak çözülür. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, bir sıcaklık rampa deneyi sırasında geç evre omurgasızların kalp hızındaki değişiklikleri ölçmek için empedans pnömografisinin kullanımını açıklar. Bu tekniğin diğer laboratuvar tabanlı yaklaşımlar99,10,11 ile karşılaştırıldığında birincil yararı minimal invaziv olması ve dış iskeletin büyük cerrahi manipülasyon içermemesidir, böylece deneme öncesinde gerekli iyileşme süresini azaltır. Ayrıca, ekipman Kullanımı kolaydır ve ortaya çıkan veriler sadece manipüle edilebilir ve önerilen yazılım programında yorumlanabilir. Amerikan ıstakoz burada bir model konu olarak kullanılırken, bu teknik başarıyla mavi midye uygulanmıştır(Mytilus spp.14) ve kolayca diğer geç evre omurgasızlar (yani, yengeçler, karides, ve diğer bivalves) kullanılmak üzere değiştirilebilir.
Protokolün bir diğer yararı da ABT'nin termal limitlerin öldürücü olmayan bir göstergesi olarak hesaplanmasına odaklanmasıdır. Termal fizyolojik performansı belirlerken çok sayıda çalışma CTmax önemli bitiş noktası olarak mevcut olmasına rağmen5,8,20,21,22,23, organizmalar nadiren doğal ortamda bu aralıkta sıcaklıkkarşılaşmak5. Ayrıca, CTmax genellikle öldürücü bir sıcaklık olduğu gibi, tercih edilen bitiş noktası olarak bu metrik kullanarak ek veya takip deney termal stres23test deneklerin kullanımını engellemez . Bu protokolü kullanarak ABT'yi hesaplamayı hedeflerken, deney alanında ki sıcaklığı, deneyi ölüme neden olmadan fizyolojik sınırına itecek noktaya kadar artırmak çok önemlidir. Bu nedenle, deneysel sıcaklık rampasının tüm aralığını belirlemeden önce bir pilot çalışma (mümkünse) ile odak türünün potansiyel termal limitlerinin belirlenmesi önerilir.
Ayrıca araştırmacıların, deneysel arenadaki sıcaklık rampa deneyi öncesinde sabit ve stresli olmayan bir düzeyde korunduğunda fokal bir türün bazal kalp hızındaki doğal değişimleri belirlemeleri ve gözlemlemeleri önerilir. Bu özellikle istirahat kalp hızı bilgileri yayınlanan literatürde mevcut değildir odak türleri için yararlıdır. Ayrıca elektrot implantasyon teknikleri bol uygulama olarak hizmet vermektedir. Bu aynı zamanda araştırmacıların, bir deneyin başında ki stresi taşımadan kaynaklanmadığından kalp hızında ki yanlış ani artışların olmamasını sağlamak için gereken uygun alışma süresini belirlemelerine de yardımcı olabilir.
Protokolde empedans pnömografisinin sadece termal stres bağlamında kullanımı tartışılsa da, diğer stresörlerin termal fizyoloji üzerindeki potansiyel interaktif etkilerini araştırmak için de kullanılabilir. Organizma performansı çevresel stres (yani, hipoksi, hiperkapni, kirleticiler ve / veya tuzluluk değişiklikleri) varlığında azaltılabilir, aynı zamanda performansiçinoptimum sıcaklık aralıkları sıkıştırabilir 7,24,25,26. Bu nedenle, bu protokol, sıcaklık rampası öncesinde çeşitli stres lere maruz kalmanın performansı nasıl etkileyebileceğini keşfetmek için değiştirilebilir.
Örneğin, Harrington ve Hamlin27, bir sıcaklık rampası sırasında kardiyak performansı değerlendirmeden önce 2 ay boyunca, genç H. americanus'u mevcut veya öngörülen yüzyıl sonu pH koşullarına (sırasıyla 8.0 ve 7.6) maruz bıraktılar. Daha asidik ortamlara önceden maruz kalan ıstakozlar, mevcut pH koşullarında tutulanlara göre ortalama ABT'de önemli bir azalma sergilemiştir. Bu düşük pH ortamı termal performansı azaltır ve düşük sıcaklıklarda ısı stresi nedeniyle hücresel hasar riskini artırabilir düşündürmektedir27. Gelecekteki çabalar, bu protokolü takip eden önce çevresel stresörlerin herhangi bir kombinasyonuna ön maruziyeti içerecek şekilde burada sunulan yöntemi genişletebilir. Ayrıca, bu protokol biyotik strese maruz kalma sırasında kardiyak performans değişiklikleri ölçmek için değiştirilebilir yanı sıra nasıl termal sınırları ontogeny göre değiştirebilirsiniz4,5.
Bu protokolün önemli bir sınırlama sıcağa tanımlanan ekipman bir laboratuvar ortamında kullanılmak üzere sınırlı olmasıdır, potansiyel olarak daha özel ekipman gerektiren alan tabanlı deneyler için uygulanabilirliğini sınırlayan8. Bu teknik aynı zamanda kardiyak olmayan kas hareketlerinden kaynaklanan yanlış veri noktalarının üretimini azaltmak için son derece hareketli deneklerin (örneğin, ıstakoz lar ve yengeçler) dizginletilmesi gerekir. Bu, bir sıcaklık rampası sırasında doğal davranışları kısıtlayabilir, ancak kısıtlamaların etkisi tüm denekler arasında tutarlıdır. En önemlisi, elektrot implantasyonu sırasında agresif veya dikkatsiz sondaj uygulandığında deneklerde doku hasarı veya ölüm potansiyeli vardır. Bu kızılötesi fotoplethysmografi ile keskin kontrastlar, perikard ışık geçmek ve kayıt kalp fonksiyonu için bir dış kızılötesi transdücer kullanan bir gerçekten noninvaziv teknik gerilim yansıyan ışık enerjisi dönüştürerek8,28.
Kızılötesi fotopletimografi empedans pnömografisine göre stresle başa çıkma riskini azaltsa da, açıklanan yöntemle elektrotların doğru şekilde implante edilmesi minimal travmaya yol açar, hızlı bir alışma süresi sağlar ve rampa deneyi27'densonra deneklerde mortaliteye neden olmadan hızlı iyileşmeye yol açar. Her iki yöntemde de kardiyak debi de anlamlı bir farkbulunmadığından,empedans pnömografisinin kardiyak performansı değerlendirmek için güvenilir ve minimal invaziv bir teknik olduğu sonucuna varılmaktadır. Son olarak, protokolün sayısız yararları ve esnekliği, çeşitli çevresel faktörlerin geç evre kabuklularda fizyolojik performansı etkilemek için sıcaklıkla nasıl etkileştiğini açıklama potansiyeline sahiptir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Yazarlar paul Rawson laboratuvar yardımı ve Ulusal Bilim Vakfı ödülü IIA-1355457 Maine EPSCoR Maine Üniversitesi'nde fon ekipman satın almak için teşekkür ederiz. Bu proje USDA Ulusal Gıda ve Tarım Enstitüsü, Hatch proje numarası MEO-21811 Maine Tarım ve Orman Deney İstasyonu yanı sıra NOAA Ulusal Deniz Balıkçılık Servisi Saltonstall Kennedy Grant #18GAR039-136 tarafından desteklendi. Yazarlar ayrıca bu makalenin önceki bir sürümü hakkındaki yorumları için üç anonim yorumcuya teşekkür eder. Maine Tarım ve Orman Deney İstasyonu Yayın No 3733.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.6 mm (1/16 in) drill bit | Milwaukee Tool at Home Depot | 1001294900 | This is for a 1.6 mm (1/16 in) diameter drill bit. This item can be found at most home-improvement stores. |
| 38 AWG Copper Magnet Wire | TEMCo | MW0093 | This wire is used to make the wire electrode leads that are implanted into the test subjects. This listing is for a 4 oz coil of 38-gauge magnetic wire. TemCo also has 36-gauge magnetic wire that is also suitable for use in constructing wire electrodes. |
| Cyanoacrylate glue | Loctite | 852882 | This item includes a brush tip, which makes it easier to control the amount of glue used to secure electrodes to the carapace. |
| Ethanol, 70% Solution, Molecular Biology Grade | Fisher BioReagents | BP82931GAL | This reagent is used in combination with the sterile cotton balls to disinfect the carapace prior to electrode implantation. |
| Excel | Microsoft | N/A | This program is used in the protocol for organizing, manipulating, and analyzing data. It is compatible with both PC and Mac operating systems. |
| Fisherbrand 8-Piece Dissection Kit | Fisher Scientific | 08-855 | This kit includes the forceps, scissors, dissecting knife (and blades), and dissecting needle needed to accomplish the electrode implantation steps in the protocol. |
| Fisherbrand Isotemp Refrigerated/Heated Bath Circulators: 5.4-6.5L, 115V/60Hz | Fisher Scientific | 13-874-180 | This is a complete system that consists of an immersion circulator and a bath. It can be used as a temperature controlled bath or to circulate fluid externally to an application. Temperature range of this water bath is -20 to +100 °C, and the unit heats/cools rapidly and is easy to drain upon conclusion of use. |
| Fisherbrand Sterile Cotton Balls | Fisher Scientific | 22-456-885 | These swabs should be soaked in 70% ethanol before being used to disinfect the carapace prior to electrode implantation. |
| Fork Terminal, Red Vinyl, Butted Seam, 22 to 16 AWG, 100 PK | Grainger | 5WHE6 | Terminals are soldered to the magnetic wire to construct the wire electrodes. These can be purchased from a variety of home-improvement vendors. |
| Impedance converter | UFI | Model 2991 | Measures impedance changes correlated with very small voltage changes, ranging from 0.2 ohm to over 5 ohms. This model can convert impedance changes that stem from resistance, capacitance, or inductance variations, as well as a combination of all three. |
| LabChart software | ADInstruments | N/A | Purchase of the PowerLab datalogger includes the LabChart software, but a license for the software can also be directly downloaded online. LabChart allows the user to record data, open and read LabChart files, analyze data, as well as save and export files. There is a free version of the software, LabChart Reader, but users can only open and read LabChart files and analyze them (i.e., it cannot be used to record, save, or export data files). One also has the option of selecting LabChart Pro, which includes LabChart teaching modules that can be used for educational purposes. |
| LED Soldering Iron | Grainger | 28EA35 | This is a generic soldering iron that can be used to solder the magnetic wire to the fork terminals to create the wire electrodes. |
| PowerLab datalogger | ADInstruments | ML826 | There are a variety of models of the PowerLab. This catalog number is for the 2/26 model that is a 2 channel, 16 bit resolution recorder with two analog input channels, independently selectable input sensitivities, two independent analog outputs for stimulation or pulse generation and a trigger input. The PowerLab features a wide range of low-pass filters, AC or DC coupling and adaptive mains filter. This unit has a USB interface for connection to Windows or Mac OS computers and a sampling rate of 100,000 samples/s per channel. |
| Prism8 | GraphPad | N/A | This program provides an additional option for calculating the Arrhenius Break Temperature through its “Segmental linear regression” data analysis option. This program does not require any programming and is compatible with both Mac and Windows operating systems. |
| R | R Project | N/A | This is free software for statistical computing that is compatible with UNIX platforms, as well as Windows and Mac operating systems. This program can also be used to calculate the Arrhenius Break Temperature using the “segmented” package. There are a number of tutorials and user guides available online through the r-project.org website. |
| Rosin Core Solder | Grainger | 331856 | This product has a diameter of 0.031 in (0.76 mm) and is ideal for use in soldering speaker wire (similar gauge as magnetic wire used for electrodes). |
| SAS | SAS Institute | N/A | This program provides an additional option for calculating the Arrhenius Break Temperature. However, it does require programming and is not compatible with Mac operating systems. |
| SigmaPlot | Systat Software, Inc. | N/A | This is the authors’ preferred program for statistical determination of the Arrhenius Break Temperature. The “Regression Wizard” is easy to use and does not require any programming. One can obtain a free 30-day trial license before purchase. However, it is compatible only with PC computers. |
| T-type Pod | ADInstruments | ML312 | Suitable for measurement of temperatures from 0-50 °C using T-type thermocouples. |
| T-type Thermocouple Probe | ADInstruments | MLT1401 | Compatible with the T-type Pod for connection. Measures temperature up to 150 °C, and is suitable for immersion in various solutions, semi-solids, and tissue (includes a needle for implantation). This product is a 0.6 mm diameter isolated probe that is sheathed in chemical-resistant Teflon and a lead length of 1.0 m. |
| UV Cable Tie, Black | Home Depot | 295813 | This is for a 100-pack of 8-inch (20.32 cm), black cable ties. However, based on the size of test subjects, smaller or larger cable ties may be needed. This item, and others like it, can be purchased at any home-improvement store. |
References
- Stocker, T. F., et al. Climate Change 2013: The Physical Basis. Contribution of Working Group I to the Fifth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change. , Cambridge University Press. Cambridge, UK, and New York, NY, USA. (2013).
- Pershing, A. J., et al. Slow adaptation in the face of rapid warming leads to collapse of the Gulf of Maine cod fishery. Science. 350 (6262), 809-812 (2015).
- Smale, D. A., et al. Marine heat waves threaten global biodiversity and the provision of ecosystem services. Nature Climate Change. 9 (4), 306-316 (2019).
- Pörtner, H. O., Farrell, A. P.
- Pörtner, H. O., Bock, C., Mark, F. C. Oxygen- and capacity-limited thermal tolerance: bridging ecology and physiology. Journal of Experimental Biology. 220 (15), 2685-2696 (2017).
- Somero, G. N., Lockwood, B. L., Tomanek, L. Biochemical adaptation: response to environmental challenges, from life's origins to the Anthropocene. , Sinauer Associates, Incorporated Publishers. Sunderland, MA, USA. (2017).
- Sokolova, I. M., Frederich, M., Bagwe, R., Lanning, G., Sukhotin, A. A. Energy homeostasis as an integrative tool for assessing limits of environmental stress tolerance in aquatic invertebrates. Marine Environmental Research. 79, 1-15 (2012).
- Tepolt, C. K., Somero, G. N. Master of all trades: thermal acclimation and adaptation of cardiac function in a broadly distributed marine invasive species, the European green crab, Carcinus maenas. Journal of Experimental Biology. 217 (7), 1129-1138 (2014).
- Frederich, M., Pörtner, H. O. Oxygen limitation of thermal tolerance defined by cardiac and ventilatory performance in spider crab, Maja squinado. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 279 (5), 1531-1538 (2000).
- Metzger, R., Sartoris, F. J., Langenbuch, M., Pörtner, H. O. Influence of elevated CO2 concentrations on thermal tolerance of the edible crab Cancer pagurus. Journal of Thermal Biology. 32, 144-151 (2007).
- Walther, K., Sartoris, F. J., Bock, C., Pörtner, H. O. Impact of anthropogenic ocean acidification on thermal tolerance of the spider crab Hyas araneus. Biogeosciences. 6 (10), 2207-2215 (2009).
- Styf, H. K., Sköld, H. N., Eriksson, S. P. Embryonic response to long-term exposure of the marine crustacean Nephrops norvegicus to ocean acidification. Ecology and Evolution. 3 (15), 5055-5065 (2013).
- Camacho, J., Qadri, S. A., Wang, H., Worden, M. K. Temperature acclimation alters cardiac performance in the lobster Homarus americanus. Journal of Comparative Physiology A. 192 (12), 1327-1334 (2006).
- Braby, C., Somero, G. N. Ecological gradients and relative abundance of native (Mytilus trossulus) and invasive (Mytilus galloprovincialis) blue mussels in the California hybrid zone. Marine Biology. 148 (6), 1249-1262 (2006).
- Stenseng, E., Braby, C. E., Somero, G. N. Evolutionary and acclimation-induced variation in the thermal limits of heart function in congeneric marine snails (Genus Tegula): implications for vertical zonation. Biological Bulletin. 208 (2), 138-144 (2005).
- Factor, J. Biology of the Lobster: Homarus americanus. , Academic Press. Boston, MA, USA. (1995).
- Muggeo, V. M. Segmented: an R package to fit regression models with broken-lin relationships. R News. 8 (1), 20-25 (2008).
- Ryan, S. E., Porth, L. S. A tutorial on the piecewise regression approach applied to bedload transport data. General Technical Report RMS-GTR-189. , US Department of Agriculture, Forest Service, . Rocky Mountain Research Station, Fort Collins, CO, USA. (2007).
- Prism8 Statistics Guide. , GraphPad Software, Inc. San Diego, California, USA. www.graphpad.com (2020).
- Cuculescu, M., Hyde, D., Bowler, K. Thermal tolerance of two species of marine crab, Cancer pagurus and Carcinus maenas. Journal of Thermal Biology. 23 (2), 107-110 (1998).
- Stillman, J. H. A comparative analysis of plasticity of thermal limits in porcelain crabs across latitudinal and intertidal zone clines. International Congress Series. 1275, 267-274 (2004).
- Maderia, D., et al. cellular and biochemical thermal stress response of intertidal shrimps with different vertical distributions: Palaemon elegans and Palaemon serratus. Comparative Biochemistry and Physiology, Part A. 183, 107-115 (2015).
- Padilla-Ramirez, S., et al. The effects of thermal acclimation on the behavior, thermal tolerance, and respiratory metabolism in a crab inhabiting a wide range of thermal habitats (Cancer antennarius Stimpson, 1856, the red shore crab). Marine and Freshwater Behaviour and Physiology. 48 (2), 89-101 (2017).
- Pörtner, H. O. Ecosystem effects of ocean acidification in times of ocean warming: a physiologist's view. Marine Ecology Progress Series. 373, 203-217 (2008).
- Pörtner, H. O. Oxygen- and capacity-limitation of thermal tolerance: a matrix for integrating climate-related stressor effects in marine ecosystems. Journal of Experimental Biology. 213 (6), 881-893 (2010).
- Zittier, Z. M. C., Hirse, T., Pörtner, H. O. The synergistic effects of increasing temperature and CO2 levels on activity capacity and acid-base balance in the spider crab, Hyas araneus. Marine Biology. 160 (8), 2049-2062 (2013).
- Harrington, A. M., Hamlin, H. J. Ocean acidification alters thermal cardiac performance, hemocyte abundance, and hemolymph chemistry in subadult American lobsters Homarus americanus H. Milne Edwards, 1837 (Decapoda: Malcostraca: Nephropidae). Journal of Crustacean Biology. 39 (4), 468-476 (2019).
- Depledge, M. H. Photoplethysmography - a non-invasive technique for monitoring heart beat and ventilation rate in decapod crustaceans. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Physiology. 77 (2), 369-371 (1984).
