Summary
Mätning av hjärtfrekvens under en termisk utmaning ger insikt i organismernas fysiologiska reaktioner som en följd av akut miljöförändring. Med hjälp av den amerikanska hummern (Homarus americanus) som en modell organism, beskriver detta protokoll användningen av impedan pneumografi som en relativt noninvasive och nonlethal strategi för att mäta hjärtfrekvens i sent skede ryggradslösa djur.
Abstract
Temperaturerna i haven ökar snabbt till följd av omfattande förändringar i världens klimat. Eftersom organismfysiologi är starkt påverkad av miljötemperaturen, har detta potential att förändra termisk fysiologisk prestanda i en mängd olika marina organismer. Med hjälp av den amerikanska hummern (Homarus americanus) som en modell organism, beskriver detta protokoll användningen av impedan pneumografi för att förstå hur hjärtprestanda i sent skede ryggradslösa djur förändringar under akut termisk stress. Protokollet presenterar en minimalt invasiv teknik som möjliggör insamling av puls i realtid under ett experiment med temperaturrampning. Data manipuleras lätt för att generera en Arrhenius-tomt som används för att beräkna Arrhenius break temperature (ABT), den temperatur vid vilken hjärtfrekvensen börjar sjunka med ökande temperaturer. Denna teknik kan användas i en mängd sena steg ryggradslösa djur (dvs krabbor, musslor, eller räkor). Även om protokollet fokuserar enbart på temperaturens inverkan på hjärtprestanda, kan det modifieras för att förstå risken för ytterligare stressfaktorer (t.ex. hypoxi eller hyperkapni) att interagera med temperatur för att påverka fysiologiska prestanda. Metoden har således potential för omfattande tillämpningar för att ytterligare förstå hur marina ryggradslösa djur reagerar på akuta förändringar i miljön.
Introduction
Under de senaste decennierna har ökad tillförsel av växthusgaser (dvs. koldioxid, metan och dikväveoxid) i atmosfären lett till omfattande mönster för miljöförändringar1. Världens hav är snabbt uppvärmningen2,3, en trend som kan ha allvarliga effekter på organismfysiologi. Temperaturen påverkar kraftigt fysiologiska priser, och organismer har ett optimalt temperaturområde för prestanda4,,5,,6. Som sådan, individer kan stöta på svårigheter att upprätthålla korrekt syretillförsel till vävnader som temperaturer herrelösa utanför detta intervall. Detta har potential att leda till nedgångar i aerob prestanda inför uppvärmningen havstemperaturer5,7.
I en laboratoriemiljö är en metod för att förstå de fysiologiska effekterna av miljöförändringar att undersöka hjärtprestanda i samband med termisk stress. Detta ger insikt i hur exponering för förväntade uppvärmningsförhållanden kan förändra prestandakurvorna5,,6 samt potentialen för acklimatiseringsplastik8. En mängd olika metoder har framgångsrikt implementerats för att tidigare mäta hjärtfrekvens hos marina ryggradslösa djur. Emellertid, många av dessa tekniker innebär kirurgiskt avlägsnande eller större manipulation av exoskeleton och långvarig implantation av mätenheter9,10,11, som introducerar ytterligare stress till försökspersonen och ökar den tid som behövs för en lyckad återhämtning före experiment. Dessutom kan mindre invasiva tekniker (t.ex. visuell observation, videografi) begränsas till tidiga historiska stadier när organismer kan vara helt eller halvgenomskinliga12. Dessutom kan ytterligare utmaningar presenteras för forskare som inte är väl insatta i mer tekniskt avancerade metoder (t.ex. observationer via infraröda givare eller Doppler perfusion8,11).
Detta protokoll använder den amerikanska hummer (Homarus americanus) som ett sent stadium marina ryggradslösa modell för att visa användningen av impedans pneumografi för att bedöma förändringar i hjärtfrekvens under en temperatur rampning experiment. Impedans pneumografi innebär att en oscillerande elektrisk ström (AC) över två elektroder placeras på vardera sidan av hjärtsäcken för att mäta förändringar i spänning som hjärtat kontrakt och slappnarav 13,14. Denna teknik är minimalt invasiv, eftersom den använder sig av små elektroder (dvs. 0,10-0,12 mm diameter) som försiktigt implanteras strax under exoskelettet. Slutligen ger det realtidsbedömningar av både puls och vattentemperatur under rampen med hjälp av en datalogger.
Protokollet ger också instruktioner för beräkning av Arrhenius rasttemperatur (ABT), den temperatur vid vilken hjärtfrekvensen börjar sjunka med ökande temperaturer13,15. ABT fungerar som en nonlethal indikator på den termiska gränsen för kapacitet hos försökspersoner som kan gynnas framför mätning av den kritiska termiska högsta (CTmax, den övre gränsen för hjärtfunktion5,6), som dödliga gränser är ofta extrema och sällan påträffas i den naturliga miljön5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utrustning setup
- Linda klart, formbara rör runt sig för att skapa en värmeväxande spole som är ca 8–10 cm i diameter och har förlängningar 40–70 cm långa. Säkra spolen med hjälp av eltejp.
- Fäst värmeväxelspolen på den externa tillförseln och returkopplingarna i ett kyl-/uppvärmningscirkulationsvattenbad. Se till att anslutningen är säker med slangklämmor.
- Fyll brunnen i kyl-/värmecirkulationsvattenbadet med omvänt osmos (RO) vatten och anslut nätsladden till ett uttag. Slå på vattenbadet och se till att det inte finns några läckor i samband med värmeväxelspolen.
- Ställ in impedanskonverteraren genom att ansluta den svarta BNC-kabeln till växelströmsutgången på enheten och ansluta den till dataloggern(Tabell över material)med kanal 1-porten.
- Anslut termoelementsonden (temperaturinspelaren) till podden av T-typ och anslut sedan podden av T-typ till dataloggerns kanal 2-port.
- Anslut nätsladden till dataloggaren i en strömförsörjning och anslut dataloggern till en dator med USB-kabelkontakten.
- Fyll acklimatiseringskammaren och den experimentella arenan med 7,5 L konstgjort havsvatten (salthalt = 35 ppt, pH = 8,1, temperatur = ~12 °C).
OBS: Volymen, temperaturen och kemin hos det vatten som behövs för acklimatiseringskammaren och startförhållandena i den experimentella arenan är beroende av experimentell design. Viktigt, dessa behållare måste vara tillräckligt stor för att bekvämt dränka försökspersonen.
2. Implantation av elektroder
- Placera hummer på ett plastgaller som passar lätt in i den experimentella arenan så att kroppen bekvämt gör en Y-form i ena änden av rektangeln.
- Försiktigt säkra hummer klor och buk till plastgallret med hjälp av små buntband. Buntbanden bör vara tillräckligt snäva för att förhindra rörelse men ge utrymme för kirurgisk sax för att ta bort dem när experimentet är avslutat.
- Torka av ryggskölden med en pappershandduk och rengör den med en bomullstuss indränkt i 70% etanol.
- Skapa hålen för elektroderna.
- Använd en liten borr (t.ex. 1,6 mm) och långsamt för att handborra två små hål (nästan) genom ryggskölden på vardera sidan av hjärtsäcken.
- Avsluta varje hål genom att försiktigt sätta in en steril dissekerande nål.
- Om nålen inte lätt går igenom ryggskölden, fortsätt att långsamt handborra innan du försöker nålen igen.
OBS: För att minimera stress hos försöksdjur rekommenderas denna teknik före försök. Med tiden kan användarna enkelt avgöra genom att känna när borrkronan är nästan om ryggskölden och byta till nålen. Handborrning är lämplig för hummer och krabbor, särskilt om exoskelettet är mjukt (dvs. djuret har nyligen smält). Om försökspersonen har ett tjockare exoskelett eller skal (dvs. ett tvåskaliga) verktyg är dock lämpligare.
- Skaffa elektroderna (36–38 G magnetisk tråd, 0,10–0,12 mm i diameter) och skrapa bort en liten bit isolering på trådens spets med hjälp av ett dissekerande knivblad. Böj försiktigt spetsen på varje tråd i en liten krok med pincett och sätt in en i vart och ett av de nyborrade hålen.
- Säkra varje trådkabel med en liten droppe cyanoakrylatlim och låt den torka i 5–10 minuter.
OBS: Det är viktigt att använda limmet sparsamt, eftersom lägga till för mycket kommer att tömma tråden och förhindra att signalen spelas in. - När limmet är torrt, fäst tråden leder till impedanskonverteraren och slå på den. Placera hummern i acklimatiseringskammaren och låt den acklimatisera sig till de implanterade elektroderna i 15–20 min.
OBS: Snabba eller skärande rörelser, samt ofullständigt torkat lim, kan orsaka att elektroderna lossnar från ryggskölden. Om detta händer, återgå till steg 2.6. - Slå på dataloggern och öppna LabChart-programvaran på datorn. Klicka på Nytt experiment och lämna skärmen Diagramvy öppen.
- Leta reda på menyn Kanalfunktion för kanal 1 i diagramvynfrån den högra delen av skärmen. Välj Ingångsförstärkare på menyn och välj AC-koppling. Den inkommande signalen från försökspersonen visas nu på skärmen i realtid.
Kanalens känslighet kan justeras genom att välja popup-menyn Räckvidd. Justera intervallet tills signaltopparna är 25–75 % av hela skalan. Stäng ingångsförstärkaren genom att klicka på OK. - På impedanskonverteraren justerar du Gain (storlek) och Balans tills en stark signal observeras på dataloggerutgången, i syfte att hålla saldot nära noll.
- På Kanal 2 väljer du Pod för T-typ för att registrera temperaturdata i realtid.
- När båda kanalerna är korrekt konfigurerade klickar du på Start-knappen så börjar dataloggaren logga data.
3. Temperaturrampning
- Efter acklimatiseringsperioden, placera plastgallret med den bifogade hummern försiktigt i den experimentella arenan och ställ in värmeväxande spolen ovanpå gallret.
- Placera termoelementsonden nära hummern och se till att den är helt nedsänkt innan locket placeras på den experimentella arenan för att minska visuell påfrestning till försökspersonen.
- Justera balansen efter behov och kommentera resultatet om att rättegången har påbörjats.
- Utdata kan och bör sparas regelbundet under hela experimentet.
- Klicka på Arkiv och välj Spara som om du först vill spara utdata på datorn.
- När du sparar under experimentet klickar du på Arkiv och väljer Spara.
Även om LabChart-programvaran kan återställa filer i händelse av en oavsiktlig programavstängning (t.ex. ett strömavbrott), rekommenderas att du sparar aktiva filer var 15–20:e minut under experimentet för att förhindra dataförlust.
- Öka vattentemperaturen i den experimentella arenan med en hastighet av ~1,5 °C var 15:e minut för att uppnå en ramp från 12 °C till 30 °C under en 2,5 h-period genom att justera temperaturen på det omgivande vattenbadet.
OBS: Den geografiska fördelningen av den amerikanska hummern spänner över en termisk lutning på 25 °C, och individer kan acklimatisera sig till och överleva vid temperaturer upp till 30 °C16. Som sådan valdes 30 °C som den övre gränsen för denna temperaturramp, eftersom det säkerställer att hummer upplever ett stressigt scenario som inte når den kritiska termiska max13, vilket kan leda till dödlighet. Den specifika uppvärmningsgraden valdes eftersom den ligger inom en rad uppvärmningshastigheter som genomförts i studier med andra arter8,,14 samt tidigare forskning om den amerikanska hummer13,27. Innan detta protokoll genomförs är det viktigt att 1) bestämma lämpligt temperaturintervall för ett givet experiment och 2) genomföra en förundersökningstemperaturramp med en tom experimentell arena, eftersom detta kommer att bidra till att bestämma den nödvändiga temperaturjusteringen av vattenbadet för att uppnå önskad ramp. Detta kan också variera beroende på vattenvolymen i arenan. - Under hela temperaturrampen, registrera när en justering som kan påverka utgången sker.
- Observera att balansen på impedanskonverteraren sannolikt behöver justeras under hela experimentet, och detta kan orsaka en oavsiktlig spik i utdata.
- När temperaturen i den experimentella arenan börjar nå nivåer utanför testmotivets föredragna termiska intervall, kan ofrivilliga muskelsammandragningar resultera i en felaktig "spik" i produktionen. Om detta inträffar, gör en kommentar för att identifiera områden i utdata som ska tas bort under datakonverteringsprocessen.
- När rampen är klar, ta bort hummer från den experimentella arenan och placera den i ett återhämtningsbad (12 °C) i ~ 20 min. Om så önskas, fortsätt att övervaka hummerns puls tills den återgår till basala nivåer.
- Efter 20 min trycker du på stoppknappen på PowerLab-utgången och sparar filen. Ta försiktigt bort elektroderna och skär buntbanden med kirurgisk sax innan testmotivet återförs till sin tank.
OBS: I stället för att placera en hummer direkt i återhämtningsbadet är ett annat alternativ att långsamt återställa den experimentella arenan till starttemperaturen. Detta åstadkoms genom att kyla den experimentella arenan med ~1,5 °C var 15:e minut under loppet av ytterligare 2,5 h.
4. Datakonvertering
- Öppna datablock. Ange kolumn A till tid genom att dubbelklicka på kolumn A och klicka på Markering och aktiv punkt till vänster på menyn Data pad Kolumn A Setup. Välj Tid till höger på menyn och stäng fönstret genom att klicka på OK.
- Ange kolumn B till medeltemperaturen genom att dubbelklicka på kolumn B och välja alternativet Statistik från vänster sida av inställningsmenyn Data pad Kolumn B. Välj Medel från menyns högra sida och Kanal 2 som beräkningskälla längst ned i menyns fönster. Stäng fönstret genom att klicka på OK.
- Konvertera den spänning som registrerats till slag per minut
- Dubbelklicka på kolumn C och välj Markering och aktiv punkt till vänster på menyn. Välj Markeringsvaraktighet till höger på menyn och klicka på OK för att stänga fönstret.
- Dubbelklicka på kolumn D och välj cykliska mått till vänster på menyn. Välj Händelseantal till höger på menyn och Kanal 1 som beräkningskälla. Stäng fönstret genom att klicka på OK. Detta räknar datatopparna för att bestämma pulsen över en vald del av data.
Om det behövs väljer du knappen Alternativ längst ned på menyn och justerar identifieringsinställningarna så att data läss in mer exakt. Sök igenom datafilen och ta reda på om formalternativen "Sinus" eller "Spikey" resulterar i endast de viktigaste topparna i pulsslagsutdata. Dessutom justerar du tröskelvärdet för identifieringsjustering till höger på menyn för att ignorera brus i utdatafilen. - Dubbelklicka på kolumn E och välj cykliska mått till vänster på menyn. Välj Genomsnittlig cyklisk hastighetoch Kanal 1 som beräkningskälla. Justera identifieringsinställningarna och identifieringsjusteringen så att de matchar inställningarna för kolumn D (om den ändras i steg 4.4.2). Stäng fönstret genom att klicka på OK. Detta ger den slutliga uppskattningen av pulsen (som slag per minut) över en vald del av data.
- När kolumnerna har ställts in, gå tillbaka till datafilen och markera de önskade avsnitten i utdata, utelämna områden med felaktiga data som identifieras av kommentarer i avsnitt 3.6.
- Välj Kommandon och Lägg till flera i datablocket.
- Välj Tid på rullgardinsmenyn Sök med hjälp av och hämta data var 30:e sekund genom att markera rutan Varje och ange "30" under Välj-menyn.
- Klicka på alternativet Aktuellt val på menyn Stega och under och klicka på Lägg till.
- Gå tillbaka till skärmen Data Pad och välj Arkiv och Spara som för att spara utdata som en Excel-fil.
OBS: Här rapporteras puls (i slag per minut) var 30:e minut i motsats till varje minut baserat på tidigare forskning8,27. Detta bidrar också till att mer exakt fånga förändringar i realtid insamlade spänningsdata. Det är möjligt att välja data med kortare eller längre tidsintervall baserat på individuella preferenser.
5. Beräkning av Arrhenius rasttemperatur
- Öppna datafilen i Excel och manipulera utdata från LabChart-programvaran.
- Omvandla temperaturen från Celsius till Kelvins ömsesidiga medel med hjälp av följande ekvation: [1000/(temperatur °C + 273,15 K)].
- Få den naturliga hjärteloggen: ln(BPM).
- Generera en Arrhenius-plot genom att rita puls som en funktion av temperaturen, uttryckt som ln(BPM) kontra ömsesidig (K)13,15.
- I SigmaPlot, passa data med en bitvis regression och bestämma skärningspunkten, som är ABT.
- Kopiera och klistra in omformningsdata i en ny arbetsbok. Välj alternativet Statistik på huvudmenyn och guiden Regressions i listrutan.
- Välj bitvis på menyn Ekvationskategori i fönstret Ekvation och 2 segment linjärt under rutan Ekvationsnamn. Klicka på Nästa.
- I fönstret Variabler väljer du de transformerade temperaturdata som ska vara variabeln t och de transformerade pulsdata som ska vara y-variabeln med hjälp av listrutorna på menyn Variabelkolumner. Kontrollera att XY Pair är markerat på menyn Data från innan du klickar på Nästa.
- När du har granskat fönstret Anpassa resultat klickar du på Nästa och markerar kryssrutan för Skapa rapport i fönstret Numeriska utdataalternativ. Klicka på Nästa.
- I fönstret Diagramalternativ kontrollerar du alternativet Skapa nytt diagram under avsnittet Anpassa resultatdiagram och Lägg till ekvation i diagramrubrik under avsnittet Diagramfunktioner. Klicka på Slutför.
- På utdatasidan Resultat hämtar du ekvationerna och parametervärdena för de två regionerna i styckeregressionen, samt den statistiska utdata för regressionen (t.ex. R2, F-statistik och p-värde).
- Med hjälp av parametervärden och ekvationer som genereras ställer du in de två segmenten som är lika med varandra och löser för variabeln "t" för att bestämma ABT. Konvertera detta värde tillbaka till Celsius med hjälp av följande ekvation: °C = (1000/t) - 273,15.
OBS: ABT kan också beräknas i R statistiska datormiljö med hjälp av paketet "segmenterad"17 i programmet SAS18, eller med hjälp av "Segmental linjär regression" rutin i Prism819.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll beskriver användningen av impedans pneumografi för att få realtidsdata för puls (i spänning) och temperatur under en temperatur-rampning experiment. Vid perforering av denna teknik kommer amplituden för de spänningar och temperaturer som registreras att variera beroende på experimentell design och fokala arter. Spänningsutgången som visas i realtid följer dock en generisk sinusdistribution när protokollet implementeras korrekt (bild 1A). När temperaturen i arenan ökar, ändras fördelningen i realtid av spänning för att återspegla en ökad frekvens av spänningstoppar (dvs. hjärtslag; Bild 1B). Eftersom arenatemperaturen fortsätter att öka till nivåer utanför försökspersonens optimala prestandafönster ändras fördelningen för att visa en minskad frekvens av spänningstoppar med en sinusliknande form som avbryts av sporadiska toppar och/eller stunder av "plattfoder" (figur 1C).
När rådata konverteras med hjälp av Data Pad-komponenten i LabChart-programvaran följer den resulterande fördelningen av pulsen (i slag per minut) under temperaturrampen en parabolisk fördelning om experimentet lyckas (figur 2). I takt med att temperaturen i arenan ökar ökar även testmotivets puls för att möta förhöjda energikrav i samband med varmare temperaturer. Men eftersom temperaturen fortsätter att öka och försökspersonen börjar uppleva måttlig till extrem termisk stress, börjar hjärtfrekvensen att minska eller blir oberäknelig när motivet börjar uppvisa passiv termisk tolerans (t.ex. uppkomsten av anaerob andning, ämnesomsättningsdämpning, och minskad aktivitet5,7). När puls- och temperaturdata omvandlas och ett Arrhenius-område genereras, kan den punkt där pulsen börjar sjunka (ABT) beräknas (figur 3). Arrhenius-handlingen passar sedan med en bitvis regression med hjälp av statistisk programvara där skärningspunkten mellan de två linjerna representerar ABT.
Bild 1: Representativ utdata från LabChart-datalogger. Realtidsförändring i spänning över testmotivets elektroder visas i rött och den återgående realtidseffekten av arenatemperaturen (°C) visas i blått. I början av experimentet under svalare temperaturer (t.ex. 13,1 °C) bör spänningen följa en generisk sinusliknande fördelning (A). När temperaturen ökas (t.ex. 23 °C) bör frekvensen av spänningstoppar öka, men fördelningen bör förbli sinusliknande (B). När försökspersonen skjuts utanför sitt optimala värmeprestandafönster (t.ex. 28,5 °C) bör spänningstopparna bli oregelbundna när frekvensen minskar (C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 2: Förväntad fördelning av pulsen över temperaturrampen. Spänningsdata som samlas in av dataloggern konverteras till puls i slag per minut (BPM) med hjälp av Data Pad-komponenten i programvaran. När rampen utförs på rätt sätt visas en parabolisk fördelning av hjärtfrekvensen över det testade temperaturområdet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Exempel på en Arrhenius-komplott. När data har konverterats i Data Pad och exporteras, omvandlas de för att generera en Arrhenius-plot. I det här exemplet passar data med en bitvis ickelinjär regression i SigmaPlot, vilket genererar ekvationer för vänster- och högersegmenten (region 1 respektive region 2) i regressionslinjen, samt godhet-of-fit-mätvärden. Skärningspunkten mellan de två regressionslinjerna löses som ABT (röd stjärna). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver användningen av impedans pneumografi för att mäta förändringar i hjärtfrekvensen av sent stadium ryggradslösa djur under en temperatur rampning experiment. Den primära fördelen med denna teknik jämfört med andra laboratoriebaserade metoder9,10,11 är att det är minimalt invasiv och inte innebär större kirurgisk manipulation av exoskelettet, vilket minskar mängden återhämtningstid som behövs före experiment. Dessutom är utrustningen lätt att använda, och resulterande data kan helt enkelt manipuleras och tolkas i det föreslagna programmet. Medan den amerikanska hummer används här som en modell ämne, denna teknik har framgångsrikt genomförts i blå musslor(Mytilus spp.14) och kan enkelt ändras för användning i andra sena skede ryggradslösa djur (dvs krabbor, räkor och andra musslor).
En ytterligare fördel med protokollet är att det fokuserar på att beräkna ABT som en nonlethal indikator på termiska gränser. Även om många studier presenterar CTmax som betydande effektmått vid bestämning av termisk fysiologisk prestanda5,,8,,20,,21,22,23, organismer sällan möter temperaturer i detta intervall i den naturliga miljön5. Dessutom, eftersom CTmax är ofta en dödlig temperatur, med hjälp av detta mått som den föredragna endpoint utesluter användning av försökspersoner i ytterligare eller uppföljning experiment post-termisk stress23. När man syftar till att beräkna ABT med hjälp av detta protokoll, är det viktigt att öka temperaturen i den experimentella arenan till den grad att driva testet föremål för dess fysiologiska gräns utan att framkalla dödsfall. Det rekommenderas därför att de potentiella termiska gränserna för fokalarten fastställs genom en pilotstudie (om möjligt) innan hela skalan av den experimentella temperaturrampen fastställs.
Det rekommenderas också att forskare bestämmer och observerar naturliga variationer i basal hjärtfrekvens hos en fokal art när temperaturen i den experimentella arenan hålls på en konstant och icke-stressig nivå före rampexperimentet. Detta är särskilt användbart för fokala arter där vilopulsinformation inte finns tillgänglig i den publicerade litteraturen. Det fungerar också som gott om praxis av elektrodimplantation tekniker. Detta kan också hjälpa forskare att bestämma lämplig acklimatiseringstid som krävs för att säkerställa att inga falska spikar i hjärtfrekvens beror på hantering av stress i början av ett experiment.
Även om protokollet diskuterar användningen av impedans pneumografi i samband med termisk stress ensam, kan det också användas för att utforska de potentiella interaktiva effekterna av andra stressfaktorer på termisk fysiologi. Organismernas prestanda kan minskas i närvaro av miljöfaktorer (dvs. hypoxi, hyperkapni, föroreningar och/eller förändringar i salthalt), vilket också kan komprimera optimala temperaturområden för prestanda7,,24,,25,26. Som sådan kan detta protokoll ändras för att undersöka hur exponering för olika stressfaktorer före temperaturrampning kan påverka prestanda.
Till exempel, Harrington och Hamlin27 utsatt juvenil H. americanus till nuvarande eller förutspådde slutet-talet pH villkor (8,0 och 7,6, respektive) i 2 månader före bedömningen av hjärtprestanda under en temperatur ramp. Hummer som exponerades för surare miljöer uppvisade en signifikant minskning av medelvärdet ABT jämfört med dem som innehas under nuvarande pH-förhållanden. Detta tyder på att en låg pH-miljö minskar värmeprestanda och kan öka risken för cellulära skador på grund av värmestr stress vid lägre temperaturer27. Framtida insatser skulle kunna utveckla den metod som presenteras här för att inkludera förhandsexponering för varje kombination av miljöfaktorer innan de följer detta protokoll. Dessutom kan detta protokoll ändras för att mäta förändringar i hjärtprestanda under exponering för biotiska stressfaktorer samt hur termiska gränser kan ändras enligt ontogeny4,5.
En viktig begränsning av detta protokoll är att utrustningen enligt beskrivningen är begränsad för användning i laboratoriemiljö, vilket kan begränsa dess tillämplighet för fältbaserade experiment som kräver mer specialiserad utrustning8. Denna teknik kräver också återhållsamhet av mycket rörliga försökspersoner (t.ex. hummer och krabbor) för att minska produktionen av falska datapunkter till följd av icke-hjärtmuskelrörelser. Även om detta kan begränsa naturliga beteenden under en temperaturramp, är effekterna av begränsningar konsekventa i alla försökspersoner. Viktigast av allt finns det potential för vävnadsskada eller dödsfall hos försökspersoner om aggressiv eller vårdslös borrning under elektrodimplantation genomförs. Detta kontrasterar skarpt med infraröd fotoplethysmography, en verkligt noninvasive teknik som använder en extern infraröd givare för att passera ljus genom hjärtsäcken och registrera hjärtfunktionen genom att konvertera reflekterad ljusenergi till spänning8,28.
Även infraröd fotoplethysmography minskar risken för hantering av stress jämfört med impedans pneumografi, korrekt implantering elektroder med den beskrivna metoden resulterar i minimal trauma, möjliggör en snabb acklimatiseringstid, och leder till snabb återhämtning utan att förmå dödligheten hos försökspersoner efter rampning experiment27. Eftersom det inte finns någon signifikant skillnad i hjärtminutvolymen som registrerats av båda metoderna28, dras slutsatsen att impedans pneumografi är en tillförlitlig och minimalt invasiv teknik för att bedöma hjärtprestanda. Slutligen har protokollets många fördelar och flexibilitet potential att klargöra hur olika miljöfaktorer interagerar med temperaturen för att påverka fysiologiska prestanda i sena kräftdjur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar Paul Rawson för laboratoriestöd och National Science Foundation tilldelning IIA-1355457 till Maine EPSCoR vid University of Maine för medel för att köpa utrustning. Detta projekt stöddes av USDA National Institute of Food and Agriculture, Hatch projektnummer MEO-21811 genom Maine Agricultural and Forest Experiment Station, samt NOAA National Marine Fisheries Service Saltonstall Kennedy Grant #18GAR039-136. Författarna tackar också tre anonyma recensenter för deras kommentarer om en tidigare version av detta manuskript. Maine jordbruks- och skogexperiment posterar publikationen numrerar 3733.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.6 mm (1/16 in) drill bit | Milwaukee Tool at Home Depot | 1001294900 | This is for a 1.6 mm (1/16 in) diameter drill bit. This item can be found at most home-improvement stores. |
| 38 AWG Copper Magnet Wire | TEMCo | MW0093 | This wire is used to make the wire electrode leads that are implanted into the test subjects. This listing is for a 4 oz coil of 38-gauge magnetic wire. TemCo also has 36-gauge magnetic wire that is also suitable for use in constructing wire electrodes. |
| Cyanoacrylate glue | Loctite | 852882 | This item includes a brush tip, which makes it easier to control the amount of glue used to secure electrodes to the carapace. |
| Ethanol, 70% Solution, Molecular Biology Grade | Fisher BioReagents | BP82931GAL | This reagent is used in combination with the sterile cotton balls to disinfect the carapace prior to electrode implantation. |
| Excel | Microsoft | N/A | This program is used in the protocol for organizing, manipulating, and analyzing data. It is compatible with both PC and Mac operating systems. |
| Fisherbrand 8-Piece Dissection Kit | Fisher Scientific | 08-855 | This kit includes the forceps, scissors, dissecting knife (and blades), and dissecting needle needed to accomplish the electrode implantation steps in the protocol. |
| Fisherbrand Isotemp Refrigerated/Heated Bath Circulators: 5.4-6.5L, 115V/60Hz | Fisher Scientific | 13-874-180 | This is a complete system that consists of an immersion circulator and a bath. It can be used as a temperature controlled bath or to circulate fluid externally to an application. Temperature range of this water bath is -20 to +100 °C, and the unit heats/cools rapidly and is easy to drain upon conclusion of use. |
| Fisherbrand Sterile Cotton Balls | Fisher Scientific | 22-456-885 | These swabs should be soaked in 70% ethanol before being used to disinfect the carapace prior to electrode implantation. |
| Fork Terminal, Red Vinyl, Butted Seam, 22 to 16 AWG, 100 PK | Grainger | 5WHE6 | Terminals are soldered to the magnetic wire to construct the wire electrodes. These can be purchased from a variety of home-improvement vendors. |
| Impedance converter | UFI | Model 2991 | Measures impedance changes correlated with very small voltage changes, ranging from 0.2 ohm to over 5 ohms. This model can convert impedance changes that stem from resistance, capacitance, or inductance variations, as well as a combination of all three. |
| LabChart software | ADInstruments | N/A | Purchase of the PowerLab datalogger includes the LabChart software, but a license for the software can also be directly downloaded online. LabChart allows the user to record data, open and read LabChart files, analyze data, as well as save and export files. There is a free version of the software, LabChart Reader, but users can only open and read LabChart files and analyze them (i.e., it cannot be used to record, save, or export data files). One also has the option of selecting LabChart Pro, which includes LabChart teaching modules that can be used for educational purposes. |
| LED Soldering Iron | Grainger | 28EA35 | This is a generic soldering iron that can be used to solder the magnetic wire to the fork terminals to create the wire electrodes. |
| PowerLab datalogger | ADInstruments | ML826 | There are a variety of models of the PowerLab. This catalog number is for the 2/26 model that is a 2 channel, 16 bit resolution recorder with two analog input channels, independently selectable input sensitivities, two independent analog outputs for stimulation or pulse generation and a trigger input. The PowerLab features a wide range of low-pass filters, AC or DC coupling and adaptive mains filter. This unit has a USB interface for connection to Windows or Mac OS computers and a sampling rate of 100,000 samples/s per channel. |
| Prism8 | GraphPad | N/A | This program provides an additional option for calculating the Arrhenius Break Temperature through its “Segmental linear regression” data analysis option. This program does not require any programming and is compatible with both Mac and Windows operating systems. |
| R | R Project | N/A | This is free software for statistical computing that is compatible with UNIX platforms, as well as Windows and Mac operating systems. This program can also be used to calculate the Arrhenius Break Temperature using the “segmented” package. There are a number of tutorials and user guides available online through the r-project.org website. |
| Rosin Core Solder | Grainger | 331856 | This product has a diameter of 0.031 in (0.76 mm) and is ideal for use in soldering speaker wire (similar gauge as magnetic wire used for electrodes). |
| SAS | SAS Institute | N/A | This program provides an additional option for calculating the Arrhenius Break Temperature. However, it does require programming and is not compatible with Mac operating systems. |
| SigmaPlot | Systat Software, Inc. | N/A | This is the authors’ preferred program for statistical determination of the Arrhenius Break Temperature. The “Regression Wizard” is easy to use and does not require any programming. One can obtain a free 30-day trial license before purchase. However, it is compatible only with PC computers. |
| T-type Pod | ADInstruments | ML312 | Suitable for measurement of temperatures from 0-50 °C using T-type thermocouples. |
| T-type Thermocouple Probe | ADInstruments | MLT1401 | Compatible with the T-type Pod for connection. Measures temperature up to 150 °C, and is suitable for immersion in various solutions, semi-solids, and tissue (includes a needle for implantation). This product is a 0.6 mm diameter isolated probe that is sheathed in chemical-resistant Teflon and a lead length of 1.0 m. |
| UV Cable Tie, Black | Home Depot | 295813 | This is for a 100-pack of 8-inch (20.32 cm), black cable ties. However, based on the size of test subjects, smaller or larger cable ties may be needed. This item, and others like it, can be purchased at any home-improvement store. |
References
- Stocker, T. F., et al. Climate Change 2013: The Physical Basis. Contribution of Working Group I to the Fifth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change. , Cambridge University Press. Cambridge, UK, and New York, NY, USA. (2013).
- Pershing, A. J., et al. Slow adaptation in the face of rapid warming leads to collapse of the Gulf of Maine cod fishery. Science. 350 (6262), 809-812 (2015).
- Smale, D. A., et al. Marine heat waves threaten global biodiversity and the provision of ecosystem services. Nature Climate Change. 9 (4), 306-316 (2019).
- Pörtner, H. O., Farrell, A. P.
- Pörtner, H. O., Bock, C., Mark, F. C. Oxygen- and capacity-limited thermal tolerance: bridging ecology and physiology. Journal of Experimental Biology. 220 (15), 2685-2696 (2017).
- Somero, G. N., Lockwood, B. L., Tomanek, L. Biochemical adaptation: response to environmental challenges, from life's origins to the Anthropocene. , Sinauer Associates, Incorporated Publishers. Sunderland, MA, USA. (2017).
- Sokolova, I. M., Frederich, M., Bagwe, R., Lanning, G., Sukhotin, A. A. Energy homeostasis as an integrative tool for assessing limits of environmental stress tolerance in aquatic invertebrates. Marine Environmental Research. 79, 1-15 (2012).
- Tepolt, C. K., Somero, G. N. Master of all trades: thermal acclimation and adaptation of cardiac function in a broadly distributed marine invasive species, the European green crab, Carcinus maenas. Journal of Experimental Biology. 217 (7), 1129-1138 (2014).
- Frederich, M., Pörtner, H. O. Oxygen limitation of thermal tolerance defined by cardiac and ventilatory performance in spider crab, Maja squinado. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 279 (5), 1531-1538 (2000).
- Metzger, R., Sartoris, F. J., Langenbuch, M., Pörtner, H. O. Influence of elevated CO2 concentrations on thermal tolerance of the edible crab Cancer pagurus. Journal of Thermal Biology. 32, 144-151 (2007).
- Walther, K., Sartoris, F. J., Bock, C., Pörtner, H. O. Impact of anthropogenic ocean acidification on thermal tolerance of the spider crab Hyas araneus. Biogeosciences. 6 (10), 2207-2215 (2009).
- Styf, H. K., Sköld, H. N., Eriksson, S. P. Embryonic response to long-term exposure of the marine crustacean Nephrops norvegicus to ocean acidification. Ecology and Evolution. 3 (15), 5055-5065 (2013).
- Camacho, J., Qadri, S. A., Wang, H., Worden, M. K. Temperature acclimation alters cardiac performance in the lobster Homarus americanus. Journal of Comparative Physiology A. 192 (12), 1327-1334 (2006).
- Braby, C., Somero, G. N. Ecological gradients and relative abundance of native (Mytilus trossulus) and invasive (Mytilus galloprovincialis) blue mussels in the California hybrid zone. Marine Biology. 148 (6), 1249-1262 (2006).
- Stenseng, E., Braby, C. E., Somero, G. N. Evolutionary and acclimation-induced variation in the thermal limits of heart function in congeneric marine snails (Genus Tegula): implications for vertical zonation. Biological Bulletin. 208 (2), 138-144 (2005).
- Factor, J. Biology of the Lobster: Homarus americanus. , Academic Press. Boston, MA, USA. (1995).
- Muggeo, V. M. Segmented: an R package to fit regression models with broken-lin relationships. R News. 8 (1), 20-25 (2008).
- Ryan, S. E., Porth, L. S. A tutorial on the piecewise regression approach applied to bedload transport data. General Technical Report RMS-GTR-189. , US Department of Agriculture, Forest Service, . Rocky Mountain Research Station, Fort Collins, CO, USA. (2007).
- Prism8 Statistics Guide. , GraphPad Software, Inc. San Diego, California, USA. www.graphpad.com (2020).
- Cuculescu, M., Hyde, D., Bowler, K. Thermal tolerance of two species of marine crab, Cancer pagurus and Carcinus maenas. Journal of Thermal Biology. 23 (2), 107-110 (1998).
- Stillman, J. H. A comparative analysis of plasticity of thermal limits in porcelain crabs across latitudinal and intertidal zone clines. International Congress Series. 1275, 267-274 (2004).
- Maderia, D., et al. cellular and biochemical thermal stress response of intertidal shrimps with different vertical distributions: Palaemon elegans and Palaemon serratus. Comparative Biochemistry and Physiology, Part A. 183, 107-115 (2015).
- Padilla-Ramirez, S., et al. The effects of thermal acclimation on the behavior, thermal tolerance, and respiratory metabolism in a crab inhabiting a wide range of thermal habitats (Cancer antennarius Stimpson, 1856, the red shore crab). Marine and Freshwater Behaviour and Physiology. 48 (2), 89-101 (2017).
- Pörtner, H. O. Ecosystem effects of ocean acidification in times of ocean warming: a physiologist's view. Marine Ecology Progress Series. 373, 203-217 (2008).
- Pörtner, H. O. Oxygen- and capacity-limitation of thermal tolerance: a matrix for integrating climate-related stressor effects in marine ecosystems. Journal of Experimental Biology. 213 (6), 881-893 (2010).
- Zittier, Z. M. C., Hirse, T., Pörtner, H. O. The synergistic effects of increasing temperature and CO2 levels on activity capacity and acid-base balance in the spider crab, Hyas araneus. Marine Biology. 160 (8), 2049-2062 (2013).
- Harrington, A. M., Hamlin, H. J. Ocean acidification alters thermal cardiac performance, hemocyte abundance, and hemolymph chemistry in subadult American lobsters Homarus americanus H. Milne Edwards, 1837 (Decapoda: Malcostraca: Nephropidae). Journal of Crustacean Biology. 39 (4), 468-476 (2019).
- Depledge, M. H. Photoplethysmography - a non-invasive technique for monitoring heart beat and ventilation rate in decapod crustaceans. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Physiology. 77 (2), 369-371 (1984).
