Summary
Измерение частоты сердечных приступов во время термической проблемы дает представление о физиологических реакциях организмов в результате острых экологических изменений. Используя американский омар (Homarus americanus) в качестве образцового организма, этот протокол описывает использование пневматической импеданса как относительно неинвазивный и нелетальный подход к измерению частоты сердечных приступов в поздней стадии беспозвоночных.
Abstract
Температура в океанах быстро повышается в результате широкомасштабных изменений мирового климата. Поскольку физиология организма в значительной степени зависит от температуры окружающей среды, это может изменить теплофизиологические показатели в различных морских организмах. Используя американский омар (Homarus americanus) в качестве образцового организма, этот протокол описывает использование пневмоза импеданса, чтобы понять, как сердечная производительность на поздней стадии беспозвоночных меняется при остром тепловом стрессе. Протокол представляет минимально инвазивную технику, которая позволяет в режиме реального времени сбор частоты сердечных приступов во время эксперимента по наращиванию температуры. Данные легко манипулировать для создания arrhenius участок, который используется для расчета Arrhenius перерыв температуры (ABT), температура, при которой частота сердечных сокращений начинает снижаться с повышением температуры. Этот метод может быть использован в различных поздних стадиях беспозвоночных (нат., крабов, мидий или креветок). Хотя протокол фокусируется исключительно на воздействии температуры на сердечную работоспособность, он может быть изменен, чтобы понять потенциал для дополнительных стрессоров (например, гипоксия или гиперкапния) для взаимодействия с температурой, чтобы повлиять на физиологическую производительность. Таким образом, этот метод имеет потенциал для широкого применения для дальнейшего понимания того, как морские беспозвоночные реагируют на острые изменения в окружающей среде.
Introduction
В последние десятилетия увеличение ввода парниковых газов (т.е. двуокиси углерода, метана и закиси азота) в атмосферу привело к широко распространенной модели экологических изменений1. Мировые океаны быстро потепление2,3, тенденция, которая может иметь серьезные последствия для физиологии организма. Температура сильно влияет на физиологические показатели, и организмы имеют оптимальный температурный диапазон для производительности4,,5,,6. Таким образом, люди могут столкнуться с трудностями в поддержании надлежащей доставки кислорода в ткани, как температура бродячих за пределами этого диапазона. Это может привести к снижению аэробных показателей в условиях потепления температуры океана5,7.
В лабораторных условиях, метод, чтобы понять физиологические последствия изменения окружающей среды является изучение сердечной деятельности в контексте теплового стресса. Это дает представление о том, как воздействие прогнозируемых условий потепления может изменить кривые производительности5,6,6 а также потенциал для акклиматизации пластичности8. Успешно внедрены различные методы измерения частоты сердечных приступов у морских беспозвоночных. Тем не менее, многие из этих методов включают хирургическое удаление или крупные манипуляции экзоскелета и длительную имплантацию измерительных приборов99,10,,11, что вводит дополнительную нагрузку на испытительного и увеличивает время, необходимое для успешного восстановления до экспериментов. Кроме того, менее инвазивные методы (например, визуальное наблюдение, видеосъемка) могут быть ограничены ранними стадиями истории жизни, когда организмы могут быть полностью или полупрозрачными12. Кроме того, дополнительные проблемы могут быть представлены исследователям, которые не очень хорошо разбираются в более технологически продвинутых методологиях (например, наблюдения с помощью инфракрасных преобразователей или доплеровской перфузии8,11).
Этот протокол использует американский омаров (Homarus americanus) в качестве модели поздней стадии морских беспозвоночных, чтобы продемонстрировать использование пневмографии импеданса для оценки изменений частоты сердечных приступов во время эксперимента по наращиванию температуры. Импеданс пневможная включает в себя прохождение колеблющегося электрического тока (AC) через два электрода, расположенных по обе стороны от перикарда для измерения изменений в напряжении, как сердце контрактов и расслабляет13,14. Этот метод является минимально инвазивным, так как он использует небольшие электроды (т.е. 0,10-0,12 мм в диаметре), которые мягко имплантируются прямо под экзоскелет. Наконец, он обеспечивает оценку в режиме реального времени как частоты сердечных приступов, так и температуры воды во время рампы с помощью регистратора данных.
Протокол также содержит инструкции по расчету температуры разрыва Arrhenius (ABT), температура, при которой частота сердечных сокращений начинает снижаться с повышением температуры13,15. ABT служит нелетальным индикатором теплового предела емкости в испытуемых, которые могут быть благоприятствования над измерением критического теплового максимума (CTмакс, верхний предел сердечной функции5,6), как смертельные пределы часто экстремальные и редко встречаются в естественной среде5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Установка оборудования
- Оберните ясно, податливые трубки вокруг себя, чтобы создать теплообмена катушки, которая составляет примерно 8-10 см в диаметре и имеет расширения 40-70 см в длину. Защищайте катушки с помощью электрической ленты.
- Прикрепите теплообменную катушки к внешнему снабжению и верните фитинги охлаждающей/отопительной водяной ванны. Убедитесь, что подключение безопасно с помощью шланговых зажимов.
- Заполните колодец охлаждающей/тепловой циркулирующей водяной бани с помощью воды обратного осмоса (RO) и подключите шнур питания в розетку. Включите водяную ванну и убедитесь, что нет никаких утечек в связи с теплообменной катушки.
- Настройка преобразователя impedance путем подключения черного кабеля BNC к выходу переменного тока на устройстве и подключения его к регистратору данных(Таблица материалов) с помощью порта Channel 1.
- Подключите термопара зонда (температурный рекордер) в T-тип стручка, а затем подключить T-типа стручка в порт канала 2 регистратора данных.
- Подключите шнур питания регистратора данных к блоку питания и подключите регистратор данных к компьютеру с помощью разъема USB-кабеля.
- Заполните акклиматизационную камеру и экспериментальную арену с 7,5 л искусственной морской воды (соленость 35 ppt, рН 8,1, температура й 12 градусов по Цельсию).
ПРИМЕЧАНИЕ: Объем, температура и химия воды, необходимой для акклиматизационной камеры и стартовых условий на экспериментальной арене, зависят от экспериментального проектирования. Важно отметить, что эти контейнеры должны быть достаточно большими, чтобы удобно погрузить объект испытора.
2. Имплантация электродов
- Поместите омаров на пластиковую решетку, которая легко вписывается в экспериментальную арену так, что тело удобно делает Y-формы на одном конце прямоугольника.
- Тщательно закрепите когти и живот омаров к пластиковой решетке с помощью небольших кабельных связей. Кабельные связи должны быть достаточно тесными, чтобы предотвратить движение, но позволяют пространство для хирургических ножниц, чтобы удалить их по завершении эксперимента.
- Высушите панцирь бумажным полотенцем и очистите его ватным тампоном, пропитанным 70% этанола.
- Создайте отверстия для электродов.
- Используя небольшой сверло (например, 1,6 мм), медленно и тщательно ручные сверлить два небольших отверстия (почти) через карапас по обе стороны от перикарда.
- Закончите каждое отверстие, аккуратно вставив стерильную игла.
- Если игла не легко пройти через панцирь, продолжать медленно ручной сверлить, прежде чем пытаться иглу снова.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы свести к минимуму стресс у экспериментальных животных, практикующих эту технику до экспериментов настоятельно рекомендуется. Со временем пользователи могут легко определить, чувствуя, когда сверло бит почти хотя карапас и переключиться на иглу. Ручное бурение подходит для омаров и крабов, особенно если экзоскелет мягкий (т.е. животное недавно линяет). Однако, если испытуемый имеет более толстый экзоскелет или оболочку (т.е. двустворчатый), инструмент Dremel является более подходящим.
- Получить электроды (36-38 G магнитной проволоки, 0,10-0,12 мм диаметр) и соскребать небольшой кусочек изоляции на кончике провода с помощью вскрытия нож омложа. Аккуратно согните кончик каждого провода в небольшой крючок с помощью щипц и вставьте по одному в каждое из недавно просверленных отверстий.
- Закрепите каждый провод свинца с помощью небольшой капли клея цианоакрилат и дайте ему высохнуть в течение 5-10 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно использовать клей экономно, так как добавление слишком много будет reinsulate провода и предотвратить сигнал от записи. - Как только клей высохнет, прикрепите провод ведет к преобразователь импеданса и включите его. Поместите омаров в акклиматизационную камеру и дайте ему акклиматизироваться к имплантированным электродам в течение 15-20 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Быстрые или резкие движения, а также неполновый высушенный клей могут привести к тому, что электроды оторваются от панциря. Если это произойдет, вернитесь к шагу 2.6. - Включите регистратор данных и откройте программное обеспечение LabChart на компьютере. Нажмите Новый эксперимент и оставьте экран просмотра диаграммы открытым.
- В диаграмме View, найти меню функции канала для первого канала из правой части экрана. Выберите усилитель ввода из меню и выберите соединение переменного тока. Входящий сигнал от испытого объекта теперь будет отображаться на экране в режиме реального времени.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чувствительность канала может быть скорректирована, выбрав всплывающее меню Range. Отрегулируйте диапазон до тех пор, пока пики сигнала не будут сопомнены 25%-75% от полной шкалы. Закройте усилитель ввода, нажав OK. - На преобразователе impedance отрегулируйте Gain (размер) и баланс до тех пор, пока не будет наблюдаться сильный сигнал на выходе регистратора данных, стремясь сохранить баланс вблизи нуля.
- На канале 2 выберите стручок T-Type для записи данных о температуре в реальном времени.
- При правильной настройке обоих каналов нажмите кнопку «Пуск», и регистратор данных начнет регистрирование данных.
3. Температура наращивает
- После периода акклиматизации, поместите пластиковую решетку с прикрепленным омаром тщательно в экспериментальной арене и установить теплообмена катушки на верхней части решетки.
- Поместите термопара зонда рядом с омаром, гарантируя, что он полностью погружен в воду, прежде чем поместить крышку на экспериментальной арене, чтобы уменьшить визуальный стресс для испытного объекта.
- Отрегулируйте баланс по мере необходимости и разместите комментарий к выходу, в котором будет указано, что судебное разбирательство началось.
- Выход можно и нужно периодически сохранять на протяжении всего эксперимента.
- Нажмите файл и выберите Сохранить Как первоначально сохранить выход на компьютер.
- При сохранении во время эксперимента нажмите файл и выберите Сохранить.
ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, что программное обеспечение LabChart может восстановить файлы в случае случайного отключения программы (например, отключения электроэнергии), рекомендуется сохранять активные файлы каждые 15–20 минут во время эксперимента, чтобы предотвратить потерю данных.
- Увеличьте температуру воды на экспериментальной арене со скоростью 1,5 градусов по Цельсию каждые 15 минут, чтобы достичь рампы от 12 до 30 градусов по Цельсию в течение 2,5 ч периода, регулируя температуру рециркулирующей водяной ванны.
ПРИМЕЧАНИЕ: Географическое распределение американских омаров охватывает тепловой градиент 25 градусов по Цельсию, и люди могут акклиматизироваться и выжить при температуре до 30 градусов по Цельсию16. Таким образом, 30 градусов по Цельсию был выбран в качестве верхнего предела для этой температуры пандус, так как он гарантирует, что омары испытывают стрессовый сценарий, который не достигает критического теплового максимума13, что может привести к смертности. Конкретные темпы потепления был выбран, потому что она попадает в диапазон потепления темпы реализации в исследованиях с использованием других видов8,14, а также предыдущие исследования по американским омаров,13,27. Перед реализацией этого протокола важно определить соответствующий диапазон температур для данного эксперимента и 2) провести досудебную температурную рампу с пустой экспериментальной ареной, так как это поможет определить необходимую температурную регулировку водяной ванны для достижения желаемого пандуса. Это также может отличаться в зависимости от объема воды на арене. - На протяжении температурного рампы записывайся всякий раз, когда происходит регулировка, которая может повлиять на выход.
- Обратите внимание, что баланс на преобразователе impedance, скорее всего, необходимо будет корректировать на протяжении всего эксперимента, и это может привести к непреднамеренному скачку вывода.
- По мере того как температура на экспериментальной арене начинает достигать уровней за пределами предпочтительного теплового диапазона испыта, непроизвольные сокращения мышц могут привести к ошибочному «шипу» в выходе. Если это происходит, сделайте замечание, чтобы определить области вывода, которые должны быть удалены в процессе преобразования данных.
- Когда пандус будет завершен, удалите омаров с экспериментальной арены и поместите его в рекуперационную ванну (12 градусов по Цельсию) в течение 20 мин. При желании, продолжать контролировать частоту сердечных приступов омаров, пока он не вернется к базальному уровню.
- После 20 минут нажмите кнопку «Стоп» на выходе PowerLab и сохраните файл. Тщательно удалите электроды и перережьте кабельные связи хирургическими ножницами, прежде чем вернуть испытательный предмет в бак.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вместо того, чтобы размещение омаров непосредственно в ванну восстановления, другой вариант заключается в том, чтобы медленно вернуть экспериментальную арену к его стартовой температуре. Это достигается путем охлаждения экспериментальной арены на 1,5 градусов по Цельсию каждые 15 минут в течение дополнительных 2,5 ч.
4. Преобразование данных
- Открытая панель данных. Установите колонку А к времени, дважды нажав на колонку А и нажав на выбор и активную точку на левой стороне меню настройки Data Pad. Выберите Время из правой стороны меню и закройте окно, нажав OK.
- Установите колонку B на среднюю температуру, дважды нажав на колонку B и выбрав вариант Статистика с левой стороны меню настройки колонки данных. Выберите среднее из правой стороны меню и канала 2 в качестве источника вычислений в нижней части окна меню. Нажмите OK, чтобы закрыть окно.
- Преобразование напряжения, записанного на удары в минуту
- Дважды щелкните по колонке C и выберите выделение и активную точку на левой стороне меню. Выберите Продолжительность выбора из правой стороны меню и нажмите OK, чтобы закрыть окно.
- Дважды щелкните по колонке D и выберите циклические измерения на левой стороне меню. Выберите событие Count из правой стороны меню и Первый канал в качестве источника вычислений. Нажмите OK, чтобы закрыть окно. Это позволит подсчитать пики данных для определения частоты сердечных приступов в выбранной части данных.
ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости выберите кнопку Параметры из нижней части меню и отрегулируйте настройки обнаружения, чтобы более точно считывать данные. Сканирование через файл данных и определить, если "Sine" или "Spikey" параметры формы привести к подсчету только основные пики выхода сердцебиения. Кроме того, отрегулируйте порог корректировки обнаружения на правой стороне меню, чтобы игнорировать шум в выходном файле. - Дважды нажмите на колонку E и выберите циклические измерения на левой стороне меню. Выберите Средний циклический курс,и первый канал в качестве источника расчета. Отрегулируйте настройки обнаружения и обнаружения в соответствии с настройками для колонки D (если манипулировать в шаге 4.4.2). Нажмите OK, чтобы закрыть окно. Это обеспечивает окончательную оценку частоты сердечных приступов (как ударов в минуту) по выбранной части данных.
- Когда столбцы настроены, вернитесь к файлу данных и выделите нужные разделы вывода, опуская области ошибочных данных, определенные комментариями в разделе 3.6.
- Выберите команды и несколько добавить в панель данных.
- Выберите Время из Поиска, используя выпадающее меню и потяните данные каждые 30 с, проверяя каждую коробку и вводя "30" в меню Select.
- Нажмите на текущий вариант выбора из шага через меню и нажмите Добавить.
- Вернитесь на экран Data Pad и выберите файл и сохранить, чтобы сохранить выход в качестве файла Excel.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь, частота сердечных ритмов сообщается (в ударах в минуту) каждые 30 с, в отличие от каждой минуты на основе предыдущих исследований8,27. Это также помогает более точно фиксировать изменения в данных о собранном напряжении в режиме реального времени. Можно выбирать данные с более короткими или более длительными интервалами времени на основе индивидуальных предпочтений.
5. Расчет температуры разрыва Arrhenius
- Откройте файл данных в Excel и манипулируйте выходом из программного обеспечения LabChart.
- Преобразуйте температуру от Цельсия к взаимной кельвине, используя следующее уравнение: «1000/(температура »C » 273.15 K)».
- Получить естественный журнал частоты сердечных приступов: ln (BPM).
- Создайте участок Arrhenius, построив частоту сердечных приступов в зависимости от температуры, выраженную как ln (BPM) против взаимных (K)13,15.
- В SigmaPlot, подходят данные с частями регрессии и определить точку пересечения, которая aBT.
- Копировать и вставить преобразованные данные в новую трудовую книжку. Выберите опцию Статистика из основного меню и Регрессии Мастер из списка выпадающих.
- В окне уравнения выберите по частям из меню категории equation и 2 сегмента линейных под полем Equation Name. Нажмите далее.
- В окне переменных выберите преобразованные данные температуры как переменную т, а преобразованные данные сердечного тарифа — переменную y, используя параметры выпадения в меню переменных столбцов. Убедитесь, что XY Pair выбран в меню Data From, прежде чем нажать кнопку Next.
- После просмотра окна Fit Results нажмите далее и проверьте поле для создания отчета в окне numeric Output Options. Нажмите далее.
- В окне параметры графика проверьте новую опцию графика «Создать» в разделе Fit Results Graph и добавьте уравнение в название графика в разделе Особенности графика. Нажмите Закончить.
- На странице вывода результатов извлеките уравнения и значения параметров для двух областей регрессии по частям, а также статистический вывод для регрессии (например, R2,F-statistic и p-значение).
- Используя сгенерированные значения параметров и уравнения, установите два сегмента, равные друг другу, и решите для переменной "t", чтобы определить ABT. Преобразуйте это значение обратно в Цельсие, используя следующее уравнение: C (1000/t) - 273.15.
ПРИМЕЧАНИЕ: ABT также может быть рассчитана в среде R статистических вычислений с помощью пакета "сегментированных"17 в программе SAS18, или с помощью "Сегментальной линейной регрессии" рутины в Prism819.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот протокол описывает использование пневмографии импеданса для получения данных в режиме реального времени для частоты сердечных приступов (в напряжении) и температуры во время эксперимента по перепаду температуры. При перфорировании этой техники, амплитуда напряжения и температуры, зарегистрированные будет меняться в зависимости от экспериментального дизайна и фокусных видов. Тем не менее, выход напряжения отображается в режиме реального времени следует общего распределения синус, когда протокол реализуется правильно(рисунок 1A). По мере повышения температуры на арене распределение напряжения в режиме реального времени отражает повышенную частоту пиков напряжения (т.е. сердцебиения; Рисунок 1B). По мере того как температура арены продолжается увеличить к уровням вне окна представления испытания оптимальной производительности, изменения распределения для того чтобы отобразить уменьшенную частоту пиков напряжения с sine-like формой прерванной спорадическими пиками и/или моментами «плоской подкладки» (Рисунок 1C).
После того, как необработанные данные преобразуются с использованием компонента Data Pad программного обеспечения LabChart, в результате распределения частоты сердечных приступов (в ударах в минуту) в течение температуры рампы следует параболического распределения, если эксперимент является успешным (Рисунок 2). По мере повышения температуры на арене частота сердечных приступов испытательного объекта также увеличивается для удовлетворения повышенных энергетических требований, связанных с повышением температуры. Однако, по мере того как температура продолжает увеличивать и испытитель начинает испытывать от умеренного до крайнего теплового стресса, частота сердечных сокращений начинает снижаться или становится неустойчивой, поскольку субъект начинает проявлять пассивную термическую толерантность (например, начало анаэробного дыхания, подавление скорости обмена веществ и снижение активности5,7). Когда частота сердечных сокращений и температуры данные преобразуются и arrhenius сюжет генерируется, точка, в которой частота сердечных сокращений начинает снижаться (ABT) может быть рассчитана(рисунок 3). Участок Arrhenius затем вписывается в частичный регрессии с использованием статистического программного обеспечения, в котором пересечение двух линий представляет ABT.
Рисунок 1: Вывод представителя из регистратора данных LabChart. Изменение напряжения в режиме реального времени по электродам испытуемого отображается красным цветом, а сопутствующий выход арены в реальном времени отображается синим цветом. В начале эксперимента при более низких температурах (например, 13,1 градуса по Цельсию) напряжение должно следовать родовому синусотому распределению(A). По мере повышения температуры (например, 23 градусов по Цельсию) частота пиков напряжения должна увеличиваться, но распределение должно оставаться синусовым(B). Наконец, по мере того, как испытуемый выталкивается за пределы оптимального теплового окна (например, 28,5 градусов по Цельсию), пики напряжения должны стать неустойчивыми по мере уменьшения частоты(C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Ожидаемое распределение частоты сердечных приступов по курсу температурного рампы. Данные о напряжении, собранные регистратором данных, преобразуются в частоту сердечных приступов в минуту (BPM) с использованием компонента Data Pad программного обеспечения. Когда пандус проводится правильно, отображается параболическое распределение частоты сердечных приступов по перечне температурного диапазона. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Пример сюжета Аррениуса. После того, как данные были преобразованы в Data Pad и экспортируются, они преобразуются для создания участка Arrhenius. В этом примере данные подходят с нелинейным регрессией в SigmaPlot, генерируя уравнения для левого и правого сегментов (регион 1 и область 2 соответственно) регрессионной линии, а также метрик доброго соответствия. Пересечение двух регрессионных линий решается как ABT (красная звезда). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол описывает использование пневмографии импеданса для измерения изменений частоты сердечных приступов беспозвоночных поздней стадии во время эксперимента по наращиванию температуры. Основное преимущество этого метода по сравнению с другими лабораторными подходами99,10,,11 является то, что он является минимально инвазивным и не предполагает крупных хирургических манипуляций с экзоскелетом, тем самым уменьшая время восстановления, необходимое до экспериментов. Кроме того, оборудование простое в использовании, а полученные данные можно просто манипулировать и интерпретировать в предложенной программе. В то время как американский омар используется здесь в качестве модели предмета, этот метод был успешно реализован в синих мидий (Mytilus spp.14) и может быть легко изменен для использования в других поздних беспозвоночных (например, крабы, креветки, и другие двустворчатые).
Дополнительным преимуществом протокола является то, что он фокусируется на расчете ABT как нелетального индикатора тепловых пределов. Хотя многочисленные исследования представляют КТмакс в качестве значительной конечной точки при определении тепловой физиологической работы5,8,20,21,22,23, организмы редко сталкиваются температуры в этом диапазоне в естественной среде5. Кроме того, как КТмакс часто смертельной температуры, используя эту метрику в качестве предпочтительной конечной точки исключает использование испытуемых в дополнительных или последующих экспериментов пост-термического стресса23. При цели вычислить ABT с помощью этого протокола, важно увеличить температуру в экспериментальной арене до точки нажатия испытать его физиологический предел без индуцирования смерти. Поэтому рекомендуется определить потенциальные тепловые пределы координационных видов с помощью экспериментального исследования (по возможности) до определения полного диапазона экспериментального температурного пандуса.
Также рекомендуется, чтобы исследователи определяли и наблюдали естественные изменения в базальном частоте сердечных приступов фокусного вида, когда температура на экспериментальной арене поддерживается на постоянном и нестрессовом уровне до начала эксперимента. Это особенно полезно для координационных видов, в которых информация о частоте сердечных приступов отсутствует в опубликованной литературе. Он также служит в качестве достаточной практики методов имплантации электродов. Это также может помочь исследователям определить подходящее время акклиматизации, необходимое для обеспечения того, чтобы никакие ложные всплески частоты сердечных приступов не были вызваны стрессом в начале эксперимента.
Хотя в протоколе обсуждается использование пневматической импедации в контексте только теплового стресса, он также может быть использован для изучения потенциальных интерактивных эффектов других стрессоров на термическую физиологию. Производительность организмов может быть снижена при наличии экологических стрессоров (т.е. гипоксии, гиперкапния, загрязняющих веществ и/или изменений в сослюне), которые также могут сжимать оптимальные температурные диапазоны для производительности7,,24,,25,26. Таким образом, этот протокол может быть изменен, чтобы изучить, как воздействие различных стрессоров до повышения температуры может повлиять на производительность.
Например, Харрингтон и Хэмлин27 подвергали несовершеннолетних H. americanus текущим или прогнозируемым условиям рН конца века (8,0 и 7,6, соответственно) в течение 2 месяцев до оценки сердечной производительности во время температурного рампы. Омары предварительно экспонированных более кислой среде продемонстрировали значительное сокращение среднего ABT по сравнению с теми, которые проводятся в нынешних условиях рН. Это говорит о том, что среда с низким рН снижает тепловую производительность и может увеличить риск повреждения клеток из-за теплового стресса при более низких температурах27. Будущие усилия могли бы расширить представленный здесь метод, включав в него предварительное воздействие на любое сочетание экологических стрессоров до соблюдения этого протокола. Кроме того, этот протокол может быть изменен для измерения изменений в сердечной деятельности во время воздействия биотических стрессоров, а также как тепловые пределы могут меняться в соответствии с онтогенеза4,5.
Основным ограничением этого протокола является то, что оборудование, как описано, ограничено для использования в лабораторных условиях, потенциально ограничивая его применимость для полевых экспериментов, которые требуют более специализированного оборудования8. Этот метод также требует ограничения высокоподвижного испытуемых (например, омаров и крабов) для сокращения производства ложных точек данных в результате несердечных движений мышц. Хотя это может ограничить естественное поведение во время температуры пандус, воздействие ограничений последовательно во всех испытуемых. Самое главное, есть потенциал для повреждения тканей или смерти у испытуемых, если агрессивное или неосторожное бурение во время имплантации электрода осуществляется. Это резко контрастирует с инфракрасной фотоплетисмографии, поистине неинвазивной техникой, которая использует внешний инфракрасный преобразующий, чтобы передать свет через перикард и запись функции сердца путем преобразования отраженной световой энергии в напряжение8,28.
Хотя инфракрасная фотоплетисмография снижает риск обработки стресса по сравнению с пневмозам импедацией, правильное имплантация электродов с помощью описанного метода приводит к минимальной травме, позволяет быстро ещрую акклиматику и приводит к быстрому выздоровлению без индуцирования смертности у испытуемых после эксперимента27. Поскольку нет существенной разницы в сердечном выходе, зафиксированном обоими методами28,делается вывод, что пневмография импеданса является надежным и минимально инвазивным методом оценки сердечной работоспособности. Наконец, многочисленные преимущества и гибкость протокола могут выяснить, как различные экологические факторы взаимодействуют с температурой, чтобы повлиять на физиологические показатели в поздней стадии ракообразных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы благодарят Пола Роусона за лабораторную помощь и награду Национального научного фонда IIA-1355457 мэнскому EPSCoR в Университете штата Мэн за средства на приобретение оборудования. Этот проект был поддержан Национальным институтом продовольствия и сельского хозяйства Министерства сельского хозяйства США, номером проекта Hatch MEO-21811 через сельскохозяйственную и лесную экспериментовую станцию мэн, а также Национальной службой морского рыболовства NOAA Солтонсталл Кеннеди Грант #18GAR039-136. Авторы также благодарят трех анонимных рецензентов за их комментарии к предыдущей версии этой рукописи. Мэн сельскохозяйственных и лесных экспериментов станции Публикация Номер 3733.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.6 mm (1/16 in) drill bit | Milwaukee Tool at Home Depot | 1001294900 | This is for a 1.6 mm (1/16 in) diameter drill bit. This item can be found at most home-improvement stores. |
| 38 AWG Copper Magnet Wire | TEMCo | MW0093 | This wire is used to make the wire electrode leads that are implanted into the test subjects. This listing is for a 4 oz coil of 38-gauge magnetic wire. TemCo also has 36-gauge magnetic wire that is also suitable for use in constructing wire electrodes. |
| Cyanoacrylate glue | Loctite | 852882 | This item includes a brush tip, which makes it easier to control the amount of glue used to secure electrodes to the carapace. |
| Ethanol, 70% Solution, Molecular Biology Grade | Fisher BioReagents | BP82931GAL | This reagent is used in combination with the sterile cotton balls to disinfect the carapace prior to electrode implantation. |
| Excel | Microsoft | N/A | This program is used in the protocol for organizing, manipulating, and analyzing data. It is compatible with both PC and Mac operating systems. |
| Fisherbrand 8-Piece Dissection Kit | Fisher Scientific | 08-855 | This kit includes the forceps, scissors, dissecting knife (and blades), and dissecting needle needed to accomplish the electrode implantation steps in the protocol. |
| Fisherbrand Isotemp Refrigerated/Heated Bath Circulators: 5.4-6.5L, 115V/60Hz | Fisher Scientific | 13-874-180 | This is a complete system that consists of an immersion circulator and a bath. It can be used as a temperature controlled bath or to circulate fluid externally to an application. Temperature range of this water bath is -20 to +100 °C, and the unit heats/cools rapidly and is easy to drain upon conclusion of use. |
| Fisherbrand Sterile Cotton Balls | Fisher Scientific | 22-456-885 | These swabs should be soaked in 70% ethanol before being used to disinfect the carapace prior to electrode implantation. |
| Fork Terminal, Red Vinyl, Butted Seam, 22 to 16 AWG, 100 PK | Grainger | 5WHE6 | Terminals are soldered to the magnetic wire to construct the wire electrodes. These can be purchased from a variety of home-improvement vendors. |
| Impedance converter | UFI | Model 2991 | Measures impedance changes correlated with very small voltage changes, ranging from 0.2 ohm to over 5 ohms. This model can convert impedance changes that stem from resistance, capacitance, or inductance variations, as well as a combination of all three. |
| LabChart software | ADInstruments | N/A | Purchase of the PowerLab datalogger includes the LabChart software, but a license for the software can also be directly downloaded online. LabChart allows the user to record data, open and read LabChart files, analyze data, as well as save and export files. There is a free version of the software, LabChart Reader, but users can only open and read LabChart files and analyze them (i.e., it cannot be used to record, save, or export data files). One also has the option of selecting LabChart Pro, which includes LabChart teaching modules that can be used for educational purposes. |
| LED Soldering Iron | Grainger | 28EA35 | This is a generic soldering iron that can be used to solder the magnetic wire to the fork terminals to create the wire electrodes. |
| PowerLab datalogger | ADInstruments | ML826 | There are a variety of models of the PowerLab. This catalog number is for the 2/26 model that is a 2 channel, 16 bit resolution recorder with two analog input channels, independently selectable input sensitivities, two independent analog outputs for stimulation or pulse generation and a trigger input. The PowerLab features a wide range of low-pass filters, AC or DC coupling and adaptive mains filter. This unit has a USB interface for connection to Windows or Mac OS computers and a sampling rate of 100,000 samples/s per channel. |
| Prism8 | GraphPad | N/A | This program provides an additional option for calculating the Arrhenius Break Temperature through its “Segmental linear regression” data analysis option. This program does not require any programming and is compatible with both Mac and Windows operating systems. |
| R | R Project | N/A | This is free software for statistical computing that is compatible with UNIX platforms, as well as Windows and Mac operating systems. This program can also be used to calculate the Arrhenius Break Temperature using the “segmented” package. There are a number of tutorials and user guides available online through the r-project.org website. |
| Rosin Core Solder | Grainger | 331856 | This product has a diameter of 0.031 in (0.76 mm) and is ideal for use in soldering speaker wire (similar gauge as magnetic wire used for electrodes). |
| SAS | SAS Institute | N/A | This program provides an additional option for calculating the Arrhenius Break Temperature. However, it does require programming and is not compatible with Mac operating systems. |
| SigmaPlot | Systat Software, Inc. | N/A | This is the authors’ preferred program for statistical determination of the Arrhenius Break Temperature. The “Regression Wizard” is easy to use and does not require any programming. One can obtain a free 30-day trial license before purchase. However, it is compatible only with PC computers. |
| T-type Pod | ADInstruments | ML312 | Suitable for measurement of temperatures from 0-50 °C using T-type thermocouples. |
| T-type Thermocouple Probe | ADInstruments | MLT1401 | Compatible with the T-type Pod for connection. Measures temperature up to 150 °C, and is suitable for immersion in various solutions, semi-solids, and tissue (includes a needle for implantation). This product is a 0.6 mm diameter isolated probe that is sheathed in chemical-resistant Teflon and a lead length of 1.0 m. |
| UV Cable Tie, Black | Home Depot | 295813 | This is for a 100-pack of 8-inch (20.32 cm), black cable ties. However, based on the size of test subjects, smaller or larger cable ties may be needed. This item, and others like it, can be purchased at any home-improvement store. |
References
- Stocker, T. F., et al. Climate Change 2013: The Physical Basis. Contribution of Working Group I to the Fifth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change. , Cambridge University Press. Cambridge, UK, and New York, NY, USA. (2013).
- Pershing, A. J., et al. Slow adaptation in the face of rapid warming leads to collapse of the Gulf of Maine cod fishery. Science. 350 (6262), 809-812 (2015).
- Smale, D. A., et al. Marine heat waves threaten global biodiversity and the provision of ecosystem services. Nature Climate Change. 9 (4), 306-316 (2019).
- Pörtner, H. O., Farrell, A. P.
- Pörtner, H. O., Bock, C., Mark, F. C. Oxygen- and capacity-limited thermal tolerance: bridging ecology and physiology. Journal of Experimental Biology. 220 (15), 2685-2696 (2017).
- Somero, G. N., Lockwood, B. L., Tomanek, L. Biochemical adaptation: response to environmental challenges, from life's origins to the Anthropocene. , Sinauer Associates, Incorporated Publishers. Sunderland, MA, USA. (2017).
- Sokolova, I. M., Frederich, M., Bagwe, R., Lanning, G., Sukhotin, A. A. Energy homeostasis as an integrative tool for assessing limits of environmental stress tolerance in aquatic invertebrates. Marine Environmental Research. 79, 1-15 (2012).
- Tepolt, C. K., Somero, G. N. Master of all trades: thermal acclimation and adaptation of cardiac function in a broadly distributed marine invasive species, the European green crab, Carcinus maenas. Journal of Experimental Biology. 217 (7), 1129-1138 (2014).
- Frederich, M., Pörtner, H. O. Oxygen limitation of thermal tolerance defined by cardiac and ventilatory performance in spider crab, Maja squinado. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 279 (5), 1531-1538 (2000).
- Metzger, R., Sartoris, F. J., Langenbuch, M., Pörtner, H. O. Influence of elevated CO2 concentrations on thermal tolerance of the edible crab Cancer pagurus. Journal of Thermal Biology. 32, 144-151 (2007).
- Walther, K., Sartoris, F. J., Bock, C., Pörtner, H. O. Impact of anthropogenic ocean acidification on thermal tolerance of the spider crab Hyas araneus. Biogeosciences. 6 (10), 2207-2215 (2009).
- Styf, H. K., Sköld, H. N., Eriksson, S. P. Embryonic response to long-term exposure of the marine crustacean Nephrops norvegicus to ocean acidification. Ecology and Evolution. 3 (15), 5055-5065 (2013).
- Camacho, J., Qadri, S. A., Wang, H., Worden, M. K. Temperature acclimation alters cardiac performance in the lobster Homarus americanus. Journal of Comparative Physiology A. 192 (12), 1327-1334 (2006).
- Braby, C., Somero, G. N. Ecological gradients and relative abundance of native (Mytilus trossulus) and invasive (Mytilus galloprovincialis) blue mussels in the California hybrid zone. Marine Biology. 148 (6), 1249-1262 (2006).
- Stenseng, E., Braby, C. E., Somero, G. N. Evolutionary and acclimation-induced variation in the thermal limits of heart function in congeneric marine snails (Genus Tegula): implications for vertical zonation. Biological Bulletin. 208 (2), 138-144 (2005).
- Factor, J. Biology of the Lobster: Homarus americanus. , Academic Press. Boston, MA, USA. (1995).
- Muggeo, V. M. Segmented: an R package to fit regression models with broken-lin relationships. R News. 8 (1), 20-25 (2008).
- Ryan, S. E., Porth, L. S. A tutorial on the piecewise regression approach applied to bedload transport data. General Technical Report RMS-GTR-189. , US Department of Agriculture, Forest Service, . Rocky Mountain Research Station, Fort Collins, CO, USA. (2007).
- Prism8 Statistics Guide. , GraphPad Software, Inc. San Diego, California, USA. www.graphpad.com (2020).
- Cuculescu, M., Hyde, D., Bowler, K. Thermal tolerance of two species of marine crab, Cancer pagurus and Carcinus maenas. Journal of Thermal Biology. 23 (2), 107-110 (1998).
- Stillman, J. H. A comparative analysis of plasticity of thermal limits in porcelain crabs across latitudinal and intertidal zone clines. International Congress Series. 1275, 267-274 (2004).
- Maderia, D., et al. cellular and biochemical thermal stress response of intertidal shrimps with different vertical distributions: Palaemon elegans and Palaemon serratus. Comparative Biochemistry and Physiology, Part A. 183, 107-115 (2015).
- Padilla-Ramirez, S., et al. The effects of thermal acclimation on the behavior, thermal tolerance, and respiratory metabolism in a crab inhabiting a wide range of thermal habitats (Cancer antennarius Stimpson, 1856, the red shore crab). Marine and Freshwater Behaviour and Physiology. 48 (2), 89-101 (2017).
- Pörtner, H. O. Ecosystem effects of ocean acidification in times of ocean warming: a physiologist's view. Marine Ecology Progress Series. 373, 203-217 (2008).
- Pörtner, H. O. Oxygen- and capacity-limitation of thermal tolerance: a matrix for integrating climate-related stressor effects in marine ecosystems. Journal of Experimental Biology. 213 (6), 881-893 (2010).
- Zittier, Z. M. C., Hirse, T., Pörtner, H. O. The synergistic effects of increasing temperature and CO2 levels on activity capacity and acid-base balance in the spider crab, Hyas araneus. Marine Biology. 160 (8), 2049-2062 (2013).
- Harrington, A. M., Hamlin, H. J. Ocean acidification alters thermal cardiac performance, hemocyte abundance, and hemolymph chemistry in subadult American lobsters Homarus americanus H. Milne Edwards, 1837 (Decapoda: Malcostraca: Nephropidae). Journal of Crustacean Biology. 39 (4), 468-476 (2019).
- Depledge, M. H. Photoplethysmography - a non-invasive technique for monitoring heart beat and ventilation rate in decapod crustaceans. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Physiology. 77 (2), 369-371 (1984).
