Summary
La medición de la frecuencia cardíaca durante un desafío térmico proporciona información sobre las respuestas fisiológicas de los organismos como consecuencia de un cambio ambiental agudo. Utilizando la langosta americana (Homarus americanus) como organismo modelo, este protocolo describe el uso de neumografía de impedancia como un enfoque relativamente no invasivo y no letal para medir la frecuencia cardíaca en invertebrados de etapa tardía.
Abstract
Las temperaturas en los océanos están aumentando rápidamente como consecuencia de los cambios generalizados en los climas mundiales. Como la fisiología del organismo está fuertemente influenciada por la temperatura ambiental, esto tiene el potencial de alterar el rendimiento fisiológico térmico en una variedad de organismos marinos. Usando la langosta americana (Homarus americanus) como organismo modelo, este protocolo describe el uso de neumografía de impedancia para entender cómo el rendimiento cardíaco en invertebrados de etapa tardía cambia bajo estrés térmico agudo. El protocolo presenta una técnica mínimamente invasiva que permite la recolección en tiempo real de la frecuencia cardíaca durante un experimento de rampa de temperatura. Los datos se manipulan fácilmente para generar una gráfica de Arrhenius que se utiliza para calcular la temperatura de rotura de Arrhenius (ABT), la temperatura a la que la frecuencia cardíaca comienza a disminuir con el aumento de las temperaturas. Esta técnica se puede utilizar en una variedad de invertebrados de etapa tardía (es decir, cangrejos, mejillones o camarones). Aunque el protocolo se centra únicamente en el impacto de la temperatura en el rendimiento cardíaco, se puede modificar para comprender el potencial de que los factores de estrés adicionales (por ejemplo, hipoxia o hipercapnia) interactúen con la temperatura para influir en el rendimiento fisiológico. Por lo tanto, el método tiene potencial para aplicaciones de amplio alcance para comprender mejor cómo los invertebrados marinos responden a cambios agudos en el medio ambiente.
Introduction
En las últimas décadas, el aumento de la entrada de gases de efecto invernadero (es decir, dióxido de carbono, metano y óxido nitroso) a la atmósfera ha dado lugar a patrones generalizados de cambio ambiental1. Los océanos del mundo se están calentando rápidamente2,3, una tendencia que puede tener graves impactos en la fisiología del organismo. La temperatura influye en gran medida en las tasas fisiológicas, y los organismos tienen un rango de temperatura óptimo para el rendimiento4,5,6. Como tal, individuos pueden encontrar dificultades para mantener la entrega adecuada de oxígeno a los tejidos como temperaturas se desvían fuera de este rango. Esto tiene el potencial de conducir a la disminución del rendimiento aeróbico frente al calentamiento de las temperaturas del océano5,7.
En un entorno de laboratorio, un método para entender los impactos fisiológicos del cambio ambiental es examinar el rendimiento cardíaco en el contexto del estrés térmico. Esto proporciona una idea de cómo la exposición a las condiciones de calentamiento previstas puede alterar las curvas de rendimiento5,,6, así como el potencial de plasticidad de aclimatación8. Se han implementado con éxito una variedad de métodos para medir previamente la frecuencia cardíaca en los invertebrados marinos. Sin embargo, muchas de estas técnicas implican la extracción quirúrgica o manipulación mayor del exoesqueleto y la implantación prolongada de dispositivos de medición99,10,,11, que introduce estrés adicional al sujeto de prueba y aumenta el tiempo necesario para una recuperación exitosa antes de la experimentación. Además, las técnicas menos invasivas (por ejemplo, observación visual, videografía) pueden limitarse a las primeras etapas de la historia de la vida, cuando los organismos pueden ser totalmente o semitransparentes12. Además, se pueden presentar desafíos adicionales a los investigadores que no están bien versados en metodologías más avanzadas tecnológicamente (por ejemplo, observaciones a través de transductores infrarrojos o perfusión Doppler8,11).
Este protocolo utiliza la langosta americana (Homarus americanus) como un modelo de invertebrado marino en etapa tardía para demostrar el uso de neumografía de impedancia para evaluar los cambios en la frecuencia cardíaca durante un experimento de rampa de temperatura. La neumografía de impedancia implica el paso de una corriente eléctrica oscilante (AC) a través de dos electrodos colocados a ambos lados del pericardio para medir los cambios de voltaje a medida que el corazón se contrae y se relaja13,14. Esta técnica es mínimamente invasiva, ya que emplea el uso de pequeños electrodos (es decir, 0,10–0,12 mm de diámetro) que se implantan suavemente justo debajo del exoesqueleto. Por último, proporciona evaluaciones en tiempo real tanto de la frecuencia cardíaca como de la temperatura del agua durante la rampa mediante el uso de un registrador de datos.
El protocolo también proporciona instrucciones para calcular la temperatura de rotura de Arrhenius (ABT), la temperatura a la que la frecuencia cardíaca comienza a disminuir con el aumento de las temperaturas13,15. El ABT sirve como un indicador no letal del límite térmico de la capacidad en sujetos de ensayo que pueden ser favorecidos sobre la medición del máximo térmico crítico (CTmax, el límite superior de la función cardíaca5,6), ya que los límites letales son a menudo extremos y rara vez se encuentran en el entorno natural5.
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Protocol
1. Configuración del equipo
- Envuelva tubos claros y maleables alrededor de sí mismo para crear una bobina de intercambio de calor que tenga aproximadamente 8-10 cm de diámetro y tenga extensiones de 40-70 cm de largo. Fije la bobina con cinta eléctrica.
- Conecte la bobina de intercambio de calor a los accesorios de suministro externo y de retorno de un baño de agua circulante/de refrigeración. Asegúrese de que la conexión esté segura mediante abrazaderas de manguera.
- Llene el pozo del baño de agua circulante/refrigeración con agua de ósmosis inversa (RO) y conecte el cable de alimentación a una toma de corriente. Encienda el baño de agua y asegúrese de que no haya fugas en su conexión con la bobina de intercambio de calor.
- Configure el convertidor de impedancia conectando el cable BNC negro a la salida de CA de la unidad y conectándolo al registrador de datos(Tabla de materiales)utilizando el puerto Channel 1.
- Enchufe la sonda de termopar (grabadora de temperatura) en el pod de tipo T y, a continuación, conecte el pod de tipo T en el puerto Channel 2 del registrador de datos.
- Conecte el cable de alimentación del registrador de datos a una fuente de alimentación y conecte el registrador de datos a un ordenador mediante el conector de cable USB.
- Llenar la cámara de aclimatación y la arena experimental con 7,5 L de agua de mar artificial (salinidad a 35 ppt, pH a 8,1, temperatura a 12 oC).
NOTA: El volumen, la temperatura y la química del agua necesaria para la cámara de aclimatación y las condiciones de arranque en la arena experimental dependen del diseño experimental. Es importante destacar que estos recipientes deben ser lo suficientemente grandes como para sumergir cómodamente el sujeto de prueba.
2. Implantación de electrodos
- Coloque la langosta en una rejilla de plástico que encaje fácilmente en la arena experimental de tal forma que el cuerpo hace cómodamente una forma De en un extremo del rectángulo.
- Asegure cuidadosamente las garras y el abdomen de la langosta a la rejilla de plástico usando pequeños lazos de cable. Los lazos de los cables deben estar lo suficientemente apretados para evitar el movimiento, pero permiten espacio para tijeras quirúrgicas para eliminarlos al finalizar el experimento.
- Seque el caparazón con una toalla de papel y límpielo con una bola de algodón empapada en 70% de etanol.
- Cree los orificios para los electrodos.
- Usando una pequeña broca (por ejemplo, 1,6 mm), perforar lenta mente y cuidadosamente dos pequeños agujeros (casi) a través del caparazón a cada lado del pericardio.
- Termine cada orificio insertando suavemente una aguja de disección estéril.
- Si la aguja no pasa fácilmente a través del caparazón, continúe perforando lentamente a mano antes de volver a probar la aguja.
NOTA: Para minimizar el estrés en animales experimentales, es muy recomendable practicar esta técnica antes de la experimentación. Con el tiempo, los usuarios pueden determinar fácilmente por la sensación de cuando la broca es casi aunque el caparazón y cambiar a la aguja. La perforación manual es apropiada para langostas y cangrejos, especialmente si el exoesqueleto es suave (es decir, el animal se ha fundido recientemente). Sin embargo, si el sujeto de prueba tiene un exoesqueleto o concha más grueso (es decir, una bivalva), una herramienta Dremel es más apropiada.
- Obtenga los electrodos (36–38 G de alambre magnético, 0.10–0.12 mm de diámetro) y raspe un pequeño trozo de aislamiento en la punta del alambre usando una cuchilla de cuchilla disección. Doblar cuidadosamente la punta de cada cable en un pequeño gancho usando fórceps e insertar uno en cada uno de los agujeros recién perforados.
- Asegure cada cable con una pequeña gota de pegamento de cianoacrilato y deje que se seque durante 5-10 min.
NOTA: Es crucial utilizar el pegamento con moderación, ya que añadir demasiado volverá a aislar el cable y evitar que se grabe la señal. - Una vez que el pegamento esté seco, conecte los cables del cable al conversor de impedancia y enciéndalo. Coloque la langosta en la cámara de aclimatación y deje que se aclimate a los electrodos implantados durante 15-20 min.
NOTA: Los movimientos rápidos o agitadores, así como el pegamento secado incompleto, pueden hacer que los electrodos se separen del caparazón. Si esto sucede, vuelva al paso 2.6. - Encienda el registrador de datos y abra el software LabChart en el equipo. Haga clic en Nuevo experimento y deje abierta la pantalla Vista de gráfico.
- En vistade gráfico , busque el menú Función de canal para el canal 1 en la sección derecha de la pantalla. Seleccione Amplificador de entrada en el menú y seleccione Acoplamiento de CA. La señal entrante del sujeto de prueba aparecerá ahora en la pantalla en tiempo real.
NOTA: La sensibilidad del canal se puede ajustar seleccionando el menú emergente Rango. Ajuste el rango hasta que los picos de señal sean del 25%-75% de la escala completa. Cierre el amplificador de entrada haciendo clic en Aceptar. - En el convertidor de impedancia, ajuste la ganancia (tamaño) y el equilibrio hasta que se observe una señal fuerte en la salida del registrador de datos, con el objetivo de mantener el balance cerca de cero.
- En el canal 2, seleccione t-type pod para registrar datos de temperatura en tiempo real.
- Cuando ambos canales se configuran correctamente, haga clic en el botón Inicio y el registrador de datos comenzará a registrar datos.
3. Rampa de temperatura
- Después del período de aclimatación, coloque la rejilla de plástico con la langosta unida cuidadosamente en la arena experimental y coloque la bobina de intercambio de calor en la parte superior de la rejilla.
- Coloque la sonda termopar cerca de la langosta, asegurándose de que esté completamente sumergida antes de colocar la tapa en la arena experimental para reducir el estrés visual al sujeto de prueba.
- Ajuste el balance según sea necesario y coloque un comentario sobre la salida indicando que el ensayo ha comenzado.
- La salida puede y debe guardarse periódicamente a lo largo del experimento.
- Haga clic en Archivo y seleccione Guardar como para guardar inicialmente la salida en el equipo.
- Al guardar durante el experimento, haga clic en Archivo y seleccione Guardar.
NOTA: Aunque el software LabChart puede recuperar archivos en caso de un cierre accidental del programa (por ejemplo, un corte de energía), se recomienda guardar archivos activos cada 15-20 minutos durante el experimento para evitar la pérdida de datos.
- Aumentar la temperatura del agua de la arena experimental a una velocidad de 1,5 oC cada 15 minutos para lograr una rampa de 12 oC a 30 oC durante un período de 2,5 h ajustando la temperatura del baño de agua de recirculación.
NOTA: La distribución geográfica de la langosta americana abarca un gradiente térmico de 25 oC, y los individuos pueden aclimatarse y sobrevivir a temperaturas de hasta 30 oC16. Como tal, se ha elegido 30oC como límite superior para esta rampa de temperatura, ya que asegura que las langostas experimenten un escenario estresante que no alcanza el máximo térmico crítico13,lo que podría conducir a la mortalidad. La tasa específica de calentamiento fue seleccionada porque se encuentra dentro de una gama de tasas de calentamiento implementadas en estudios utilizando otras especies8,,14, así como investigaciones previas sobre la langosta americana13,27. Antes de implementar este protocolo, es importante 1) determinar el rango adecuado de temperaturas para un experimento dado y 2) llevar a cabo una rampa de temperatura previa al ensayo con una arena experimental vacía, ya que esto ayudará a determinar el ajuste de temperatura necesario del baño de agua para lograr la rampa deseada. Esto también puede variar dependiendo del volumen de agua en la arena. - A lo largo de la rampa de temperatura, registre cada vez que se produzca un ajuste que pueda afectar a la salida.
- Tenga en cuenta que es probable que el equilibrio en el conversor de impedancia deba ajustarse a lo largo del experimento, y hacerlo puede provocar un pico no intencional en la salida.
- A medida que la temperatura en la arena experimental comienza a alcanzar niveles fuera del rango térmico preferido del sujeto de prueba, las contracciones musculares involuntarias pueden resultar en un "pico" erróneo en la salida. Si esto ocurre, realice un comentario para identificar las áreas de la salida que se deben quitar durante el proceso de conversión de datos.
- Una vez completada la rampa, retire la langosta de la arena experimental y colóquela en un baño de recuperación (12 oC) durante 20 minutos. Si lo desea, continúe monitoreando la frecuencia cardíaca de la langosta hasta que vuelva a los niveles basales.
- Después de 20 minutos, pulse el botón Detener en la salida de PowerLab y guarde el archivo. Retire cuidadosamente los electrodos y corte las ataduras de los cables con tijeras quirúrgicas antes de devolver la prueba sujeta a su tanque de retención.
NOTA: En lugar de colocar una langosta directamente en el baño de recuperación, otra opción es devolver lentamente la arena experimental a su temperatura inicial. Esto se logra enfriando la arena experimental en 1,5 oC cada 15 minutos en el transcurso de 2,5 h adicionales.
4. Conversión de datos
- Abra el panel de datos. Establezca la columna A a la hora haciendo doble clic en la columna A y haciendo clic en Selección y punto activo en el lado izquierdo del menú Configuración de la columna A del panel de datos. Seleccione Tiempo en el lado derecho del menú y cierre la ventana haciendo clic en Aceptar.
- Establezca la columna B en la temperatura media haciendo doble clic en la columna B y seleccionando la opción Estadísticas en el lado izquierdo del menú Configuración de la columna B del panel de datos. Seleccione Media en el lado derecho del menú y Canal 2 como fuente de cálculo en la parte inferior de la ventana del menú. Haga clic en Aceptar para cerrar la ventana.
- Conversión de la tensión registrada en latidos por minuto
- Haga doble clic en la columna C y seleccione Selección y punto activo en el lado izquierdo del menú. Seleccione Duración de selección en el lado derecho del menú y haga clic en Aceptar para cerrar la ventana.
- Haga doble clic en la columna D y seleccione Mediciones cíclicas en el lado izquierdo del menú. Seleccione Recuento de eventos en el lado derecho del menú y Canal 1 como origen de cálculo. Haga clic en Aceptar para cerrar la ventana. Esto contará los picos de los datos para determinar la frecuencia cardíaca en una parte seleccionada de los datos.
NOTA: Si es necesario, seleccione el botón Opciones en la parte inferior del menú y ajuste los Ajustes de detección para leer los datos con mayor precisión. Escanee a través del archivo de datos y determine si las opciones de forma "Seno" o "Spikey" dan como resultado recuentos de solo los picos principales de la salida de latidos. Además, ajuste el umbral de ajuste de detección en el lado derecho del menú para ignorar el ruido en el archivo de salida. - Haga doble clic en la columna E y seleccione Mediciones cíclicas en el lado izquierdo del menú. Seleccione Velocidad cíclica mediay Canal 1 como origen de cálculo. Ajuste la configuración de detección y el ajuste de detección para que coincidan con la configuración de la columna D (si se manipula en el paso 4.4.2). Haga clic en Aceptar para cerrar la ventana. Esto proporciona la estimación final de la frecuencia cardíaca (como latidos por minuto) sobre una parte seleccionada de los datos.
- Cuando se configuren las columnas, vuelva al archivo de datos y resalte las secciones deseadas de la salida, omitiendo áreas de datos erróneos identificadas por los comentarios en la sección 3.6.
- Seleccione Comandos y Agregar múltiples al panel de datos.
- Seleccione Tiempo en el menú desplegable Buscar usando y extraiga datos cada 30 s marcando la casilla Cada e ingresando "30" en el menú Seleccionar.
- Haga clic en la opción Selección actual del menú Paso a través y haga clic en Agregar.
- Vuelva a la pantalla Del panel de datos y seleccione Archivo y Guardar como para guardar la salida como un archivo de Excel.
NOTA: Aquí, la frecuencia cardíaca se informa (en latidos por minuto) cada 30 s en comparación con cada minuto basado en la investigación anterior8,27. Esto también ayuda a capturar con mayor precisión los cambios en los datos de voltaje recopilados en tiempo real. Es posible seleccionar datos en intervalos de tiempo más cortos o más largos en función de las preferencias individuales.
5. Cálculo de la temperatura de rotura de Arrhenius
- Abra el archivo de datos en Excel y manipule la salida del software LabChart.
- Convierta la temperatura de Celsius a la recíproca de Kelvin utilizando la siguiente ecuación: [1000/(temperatura s/C + 273.15 K)].
- Obtener el registro natural de la frecuencia cardíaca: ln (BPM).
- Generar una gráfica de Arrhenius trazando la frecuencia cardíaca en función de la temperatura, expresada como ln(BPM) frente a recíproca (K)13,15.
- En SigmaPlot, ajuste los datos con una regresión por parte y determine el punto de intersección, que es el ABT.
- Copie y pegue los datos transformados en un nuevo libro de trabajo. Seleccione la opción Estadísticas en el menú principal y asistente de regresión en la lista desplegable.
- En la ventana Ecuación, seleccione por pieza en el menú Categoría de ecuación y 2 segmentos lineales en el cuadro Nombre de ecuación. Haga clic en Siguiente.
- En la ventana Variables, seleccione los datos de temperatura transformados para que sean la variable t y los datos de frecuencia cardíaca transformados para que sean la variable y, utilizando las opciones desplegables del menú Columnas variables. Asegúrese de que Par XY está seleccionado en el menú Datos de antes de hacer clic en Siguiente.
- Después de revisar la ventana Ajustar resultados, haga clic en Siguiente y active la casilla Crear informe en la ventana Opciones de salida numérica. Haga clic en Siguiente.
- En la ventana Opciones de gráfico, compruebe la opción Crear nuevo gráfico en la sección Ajustar gráfico de resultados y Agregar ecuación al título del gráfico en la sección Características del gráfico. Graph Features Haga clic en Finalizar.
- En la página Resultados, recupere las ecuaciones y los valores de parámetro para las dos regiones de la regresión por parte, así como la salida estadística para la regresión (por ejemplo, R2,F-estadística y valor p).
- Usando los valores de parámetro y las ecuaciones generadas, establezca los dos segmentos iguales entre sí y resuelva para la variable "t" para determinar el ABT. Convierta este valor de nuevo a Celsius usando la siguiente ecuación: .
NOTA: El ABT también se puede calcular en el entorno informático estadístico R utilizando el paquete "segmentado"17 en el programa SAS18,o utilizando la rutina de "regresión lineal segmentaria" en Prism819.
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Representative Results
Este protocolo describe el uso de neumografía de impedancia para obtener datos en tiempo real de la frecuencia cardíaca (en voltaje) y la temperatura durante un experimento de aumento de temperatura. Al perforizar esta técnica, la amplitud de los voltajes y temperaturas registradas variará en función del diseño experimental y las especies focales. Sin embargo, la salida de tensión mostrada en tiempo real sigue una distribución genérica del seno cuando el protocolo se implementa correctamente(Figura 1A). A medida que aumenta la temperatura en la arena, la distribución en tiempo real de la tensión cambia para reflejar una mayor frecuencia de picos de voltaje (es decir, latidos del corazón; Figura 1B). A medida que la temperatura de la arena continúa aumentando a niveles fuera de la ventana de rendimiento óptimo del sujeto de prueba, la distribución cambia para representar una frecuencia reducida de picos de voltaje con una forma similar a la forma sinusoidainterrumpda por picos esporádicos y / o momentos de "plano"(Figura 1C).
Una vez que los datos sin procesar se convierten utilizando el componente Data Pad del software LabChart, la distribución resultante de la frecuencia cardíaca (en latidos por minuto) en el transcurso de la rampa de temperatura sigue una distribución parabólica si el experimento es exitoso(Figura 2). A medida que aumenta la temperatura en la arena, la frecuencia cardíaca del sujeto de prueba también aumenta para satisfacer las elevadas demandas energéticas asociadas con las temperaturas más cálidas. Sin embargo, a medida que la temperatura sigue aumentando y el sujeto de prueba comienza a experimentar estrés térmico moderado a extremo, la frecuencia cardíaca comienza a disminuir o se vuelve errática a medida que el sujeto comienza a mostrar tolerancia térmica pasiva (por ejemplo, inicio de respiración anaeróbica, supresión de la frecuencia metabólica y reducción de la actividad5,7). Cuando se transforman los datos de frecuencia cardíaca y temperatura y se genera una gráfica de Arrhenius, se puede calcular el punto en el que la frecuencia cardíaca comienza a disminuir (ABT)(Figura 3). La gráfica de Arrhenius se ajusta entonces con una regresión por parte del uso de software estadístico en el que la intersección de las dos líneas representa el ABT.
Figura 1: Salida representativa del registrador de datos LabChart. El cambio de tensión en tiempo real en los electrodos del sujeto de prueba se muestra en rojo, y la salida en tiempo real concomitante de la temperatura de la arena (C) se muestra en azul. Al comienzo del experimento bajo temperaturas más frías (por ejemplo, 13,1 oC), el voltaje debe seguir una distribución genérica similar a la sinusozca (A). A medida que aumenta la temperatura (por ejemplo, 23 oC), la frecuencia de los picos de tensión debe aumentar, pero la distribución debe permanecer similar a la del seno (B). Por último, a medida que el sujeto de prueba se empuja fuera de su ventana de rendimiento térmico óptimo (por ejemplo, 28,5 oC), los picos de tensión deben volverse erráticos a medida que disminuye la frecuencia (C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Distribución esperada de la frecuencia cardíaca en el curso de rampa de temperatura. Los datos de voltaje recopilados por el registrador de datos se convierten en frecuencia cardíaca en latidos por minuto (BPM) utilizando el componente Data Pad del software. Cuando la rampa se lleva a cabo correctamente, se muestra una distribución parabólica de la frecuencia cardíaca sobre el rango de temperatura probado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Ejemplo de una gráfica de Arrhenius. Una vez que los datos se han convertido en el Panel de datos y se han exportado, se transforman para generar una gráfica de Arrhenius. En este ejemplo, los datos se ajustan a una regresión no lineal por parte en SigmaPlot, generando ecuaciones para los segmentos izquierdo y derecho (región 1 y región 2, respectivamente) de la línea de regresión, así como métricas de bondad de ajuste. La intersección de las dos líneas de regresión se resuelve como la ABT (estrella roja). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este protocolo describe el uso de neumografía de impedancia para medir los cambios en la frecuencia cardíaca de los invertebrados en etapa tardía durante un experimento de rampa de temperatura. El principal beneficio de esta técnica en comparación con otros enfoques basados en laboratorio9,,10,11 es que es mínimamente invasivo y no implica una manipulación quirúrgica importante del exoesqueleto, reduciendo así la cantidad de tiempo de recuperación necesario antes de la experimentación. Además, el equipo es fácil de usar, y los datos resultantes pueden ser simplemente manipulados e interpretados en el programa de software sugerido. Mientras que la langosta americana se utiliza aquí como un tema modelo, esta técnica se ha implementado con éxito en mejillones azules (Mytilus spp.14) y se puede modificar fácilmente para su uso en otros invertebrados de etapa tardía (es decir, cangrejos, camarones y otros bivalvos).
Un beneficio adicional del protocolo es que se centra en el cálculo del ABT como un indicador no letal de los límites térmicos. Aunque numerosos estudios presentan la TCmax como el punto final significativo a la hora de determinar el rendimiento fisiológico térmico5,8,20,21,22,23, los organismos rara vez encuentran temperaturas en este rango en el entorno natural5. Además, como el CTmax es a menudo una temperatura letal, el uso de esta métrica como punto final preferido impide el uso de sujetos de prueba en la experimentación adicional o posterior de la experimentación post-térmica23. Cuando se pretende calcular el ABT utilizando este protocolo, es crucial aumentar la temperatura en el ámbito experimental hasta el punto de empujar el sujeto de prueba a su límite fisiológico sin inducir la muerte. Por lo tanto, se recomienda determinar los límites térmicos potenciales de las especies focales a través de un estudio piloto (cuando sea posible) antes de determinar el rango completo de la rampa de temperatura experimental.
También se recomienda que los investigadores determinen y observen variaciones naturales en la frecuencia cardíaca basal de una especie focal cuando la temperatura en la arena experimental se mantiene en un nivel constante y no estresante antes del experimento de rampa. Esto es particularmente útil para las especies focales en las que la información sobre la frecuencia cardíaca en reposo no está disponible en la literatura publicada. También sirve como amplia práctica de técnicas de implantación de electrodos. Esto también puede ayudar a los investigadores a determinar el tiempo de aclimatación adecuado necesario para asegurarse de que no hay picos falsos en la frecuencia cardíaca se deben al manejo del estrés al comienzo de un experimento.
Aunque el protocolo analiza el uso de la neumografía de impedancia en el contexto del estrés térmico por sí solo, también se puede utilizar para explorar los posibles efectos interactivos de otros factores de estrés en la fisiología térmica. El rendimiento del organismo puede reducirse en presencia de factores de estrés ambientales (es decir, hipoxia, hipercapnia, contaminantes y/o cambios en la salinidad), que también pueden comprimir rangos óptimos de temperatura para el rendimiento7,24,25,26. Como tal, este protocolo se puede modificar para explorar cómo la exposición a varios factores de estrés antes de la rampa de temperatura puede afectar el rendimiento.
Por ejemplo, Harrington y Hamlin27 expusieron al juvenil H. americanus a las condiciones actuales o previstas del pH de finales de siglo (8,0 y 7,6, respectivamente) durante 2 meses antes de evaluar el rendimiento cardíaco durante una rampa de temperatura. Las langostas preexpuestas a ambientes más ácidos mostraron una reducción significativa de la ABT media en comparación con las mantenidas bajo las condiciones actuales de pH. Esto sugiere que un entorno de pH bajo reduce el rendimiento térmico y puede aumentar el riesgo de daño celular debido al estrés por calor a temperaturas más bajas27. Los esfuerzos futuros podrían ampliar el método presentado aquí para incluir la exposición previa a cualquier combinación de factores estresantes ambientales antes de seguir este protocolo. Además, este protocolo se puede modificar para medir los cambios en el rendimiento cardíaco durante la exposición a los estresores bióticos, así como cómo los límites térmicos pueden cambiar de acuerdo con la ontogeny4,5.
Una limitación importante de este protocolo es que el equipo descrito está restringido para su uso en un entorno de laboratorio, lo que potencialmente limita su aplicabilidad para experimentos sobre el terreno que requieren equipos más especializados8. Esta técnica también requiere la restricción de sujetos de prueba altamente móviles (por ejemplo, langostas y cangrejos) para reducir la producción de falsos puntos de datos resultantes de movimientos musculares no cardíacos. Aunque esto puede restringir los comportamientos naturales durante una rampa de temperatura, el impacto de las restricciones es constante en todos los sujetos de prueba. Lo más importante es que existe la posibilidad de daño tisular o muerte en sujetos de prueba si se implementa una perforación agresiva o descuidada durante la implantación de electrodos. Esto contrasta fuertemente con la fotopletimografía infrarroja, una técnica verdaderamente no invasiva que utiliza un transductor infrarrojo externo para pasar la luz a través del pericardio y registrar la función cardíaca mediante la conversión de la energía de la luz reflejada a voltaje8,,28.
Aunque la fotopletismografía infrarroja reduce el riesgo de manejar el estrés en comparación con la neumografía de impedancia, implantar correctamente los electrodos utilizando el método descrito da como resultado un trauma mínimo, permite un tiempo de aclimatación rápido y conduce a una rápida recuperación sin inducir la mortalidad en sujetos de prueba después del experimento de rampa27. Dado que no hay ninguna diferencia significativa en la salida cardíaca registrada por ambos métodos28,se concluye que la neumografía de impedancia es una técnica fiable y mínimamente invasiva para evaluar el rendimiento cardíaco. Por último, los numerosos beneficios y flexibilidad del protocolo tienen el potencial de dilucidar cómo diversos factores ambientales interactúan con la temperatura para impactar el rendimiento fisiológico en los crustáceos de etapa tardía.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen a Paul Rawson por la asistencia de laboratorio y el premio IIA-1355457 de la National Science Foundation a Maine EPSCoR en la Universidad de Maine por fondos para comprar equipos. Este proyecto fue apoyado por el Instituto Nacional de Alimentación y Agricultura del USDA, el número de proyecto Hatch MEO-21811 a través de la Estación Experimental Agrícola y Forestal de Maine, así como el Servicio Nacional de Pesca Marina de la NOAA Saltonstall Kennedy Grant #18GAR039-136. Los autores también agradecen a tres revisores anónimos por sus comentarios sobre una versión anterior de este manuscrito. Maine Estación Experimental Agrícola y Forestal Publicación Número 3733.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.6 mm (1/16 in) drill bit | Milwaukee Tool at Home Depot | 1001294900 | This is for a 1.6 mm (1/16 in) diameter drill bit. This item can be found at most home-improvement stores. |
| 38 AWG Copper Magnet Wire | TEMCo | MW0093 | This wire is used to make the wire electrode leads that are implanted into the test subjects. This listing is for a 4 oz coil of 38-gauge magnetic wire. TemCo also has 36-gauge magnetic wire that is also suitable for use in constructing wire electrodes. |
| Cyanoacrylate glue | Loctite | 852882 | This item includes a brush tip, which makes it easier to control the amount of glue used to secure electrodes to the carapace. |
| Ethanol, 70% Solution, Molecular Biology Grade | Fisher BioReagents | BP82931GAL | This reagent is used in combination with the sterile cotton balls to disinfect the carapace prior to electrode implantation. |
| Excel | Microsoft | N/A | This program is used in the protocol for organizing, manipulating, and analyzing data. It is compatible with both PC and Mac operating systems. |
| Fisherbrand 8-Piece Dissection Kit | Fisher Scientific | 08-855 | This kit includes the forceps, scissors, dissecting knife (and blades), and dissecting needle needed to accomplish the electrode implantation steps in the protocol. |
| Fisherbrand Isotemp Refrigerated/Heated Bath Circulators: 5.4-6.5L, 115V/60Hz | Fisher Scientific | 13-874-180 | This is a complete system that consists of an immersion circulator and a bath. It can be used as a temperature controlled bath or to circulate fluid externally to an application. Temperature range of this water bath is -20 to +100 °C, and the unit heats/cools rapidly and is easy to drain upon conclusion of use. |
| Fisherbrand Sterile Cotton Balls | Fisher Scientific | 22-456-885 | These swabs should be soaked in 70% ethanol before being used to disinfect the carapace prior to electrode implantation. |
| Fork Terminal, Red Vinyl, Butted Seam, 22 to 16 AWG, 100 PK | Grainger | 5WHE6 | Terminals are soldered to the magnetic wire to construct the wire electrodes. These can be purchased from a variety of home-improvement vendors. |
| Impedance converter | UFI | Model 2991 | Measures impedance changes correlated with very small voltage changes, ranging from 0.2 ohm to over 5 ohms. This model can convert impedance changes that stem from resistance, capacitance, or inductance variations, as well as a combination of all three. |
| LabChart software | ADInstruments | N/A | Purchase of the PowerLab datalogger includes the LabChart software, but a license for the software can also be directly downloaded online. LabChart allows the user to record data, open and read LabChart files, analyze data, as well as save and export files. There is a free version of the software, LabChart Reader, but users can only open and read LabChart files and analyze them (i.e., it cannot be used to record, save, or export data files). One also has the option of selecting LabChart Pro, which includes LabChart teaching modules that can be used for educational purposes. |
| LED Soldering Iron | Grainger | 28EA35 | This is a generic soldering iron that can be used to solder the magnetic wire to the fork terminals to create the wire electrodes. |
| PowerLab datalogger | ADInstruments | ML826 | There are a variety of models of the PowerLab. This catalog number is for the 2/26 model that is a 2 channel, 16 bit resolution recorder with two analog input channels, independently selectable input sensitivities, two independent analog outputs for stimulation or pulse generation and a trigger input. The PowerLab features a wide range of low-pass filters, AC or DC coupling and adaptive mains filter. This unit has a USB interface for connection to Windows or Mac OS computers and a sampling rate of 100,000 samples/s per channel. |
| Prism8 | GraphPad | N/A | This program provides an additional option for calculating the Arrhenius Break Temperature through its “Segmental linear regression” data analysis option. This program does not require any programming and is compatible with both Mac and Windows operating systems. |
| R | R Project | N/A | This is free software for statistical computing that is compatible with UNIX platforms, as well as Windows and Mac operating systems. This program can also be used to calculate the Arrhenius Break Temperature using the “segmented” package. There are a number of tutorials and user guides available online through the r-project.org website. |
| Rosin Core Solder | Grainger | 331856 | This product has a diameter of 0.031 in (0.76 mm) and is ideal for use in soldering speaker wire (similar gauge as magnetic wire used for electrodes). |
| SAS | SAS Institute | N/A | This program provides an additional option for calculating the Arrhenius Break Temperature. However, it does require programming and is not compatible with Mac operating systems. |
| SigmaPlot | Systat Software, Inc. | N/A | This is the authors’ preferred program for statistical determination of the Arrhenius Break Temperature. The “Regression Wizard” is easy to use and does not require any programming. One can obtain a free 30-day trial license before purchase. However, it is compatible only with PC computers. |
| T-type Pod | ADInstruments | ML312 | Suitable for measurement of temperatures from 0-50 °C using T-type thermocouples. |
| T-type Thermocouple Probe | ADInstruments | MLT1401 | Compatible with the T-type Pod for connection. Measures temperature up to 150 °C, and is suitable for immersion in various solutions, semi-solids, and tissue (includes a needle for implantation). This product is a 0.6 mm diameter isolated probe that is sheathed in chemical-resistant Teflon and a lead length of 1.0 m. |
| UV Cable Tie, Black | Home Depot | 295813 | This is for a 100-pack of 8-inch (20.32 cm), black cable ties. However, based on the size of test subjects, smaller or larger cable ties may be needed. This item, and others like it, can be purchased at any home-improvement store. |
References
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