Summary
Måling av hjertefrekvens under en termisk utfordring gir innsikt i fysiologiske responser fra organismer som følge av akutt miljøendring. Ved hjelp av den amerikanske hummeren (Homarus americanus) som modellorganisme beskriver denne protokollen bruken av impedanspnematografi som en relativt ikke-invasiv og ikke-dødelig tilnærming for å måle hjertefrekvensen i sene fase virvelløse dyr.
Abstract
Temperaturene i havene øker raskt som følge av omfattende endringer i verdens klima. Ettersom organismefysiologi er sterkt påvirket av miljøtemperatur, har dette potensial til å endre termisk fysiologisk ytelse i en rekke marine organismer. Ved hjelp av den amerikanske hummeren (Homarus americanus) som modellorganisme beskriver denne protokollen bruken av impedanspnematografi for å forstå hvordan hjerteytelsen i sen fase virvelløse dyr endres under akutt termisk stress. Protokollen presenterer en minimalinvasiv teknikk som gjør det mulig for sanntidsinnsamling av hjertefrekvens under et temperaturrampingseksperiment. Data manipuleres lett for å generere en Arrhenius-tomt som brukes til å beregne Arrhenius break temperature (ABT), temperaturen som hjertefrekvensen begynner å avta med økende temperaturer. Denne teknikken kan brukes i en rekke sene trinnvirvelløse dyr (dvs. krabber, blåskjell eller reker). Selv om protokollen fokuserer utelukkende på virkningen av temperatur på hjerteytelse, kan den endres for å forstå potensialet for ekstra stressfaktorer (f.eks hypoksi eller hyperkapni) for å samhandle med temperatur for å påvirke fysiologisk ytelse. Metoden har dermed potensial for omfattende applikasjoner for å forstå hvordan marine virvelløse dyr reagerer på akutte endringer i miljøet.
Introduction
I de siste tiårene har økt inngang av klimagasser (dvs. karbondioksid, metan og lystgass) inn i atmosfæren resultert i omfattende miljøendringer1. Verdenshavene varmer raskt2,3, en trend som kan ha alvorlige konsekvenser for organismefysiologi. Temperatur påvirker fysiologiske priser, og organismer har et optimalt temperaturområde for ytelse4,5,6. Som sådan, enkeltpersoner kan oppleve vanskeligheter med å opprettholde riktig oksygenlevering til vev som temperaturer bortfra utenfor dette området. Dette har potensial til å føre til nedgang i aerob ytelse i møte med oppvarming havtemperaturer5,7.
I en laboratorieinnstilling er en metode for å forstå de fysiologiske konsekvensene av miljøendringer å undersøke hjerteytelsen i sammenheng med termisk stress. Dette gir innsikt i hvordan eksponering for forventede oppvarmingsforhold kan endre ytelseskurver5,,6 samt potensialet for akklimatiseringsplastisitet8. En rekke metoder er gjennomført for å tidligere måle hjertefrekvensen i marine virvelløse dyr. Imidlertid involverer mange av disse teknikkene kirurgisk fjerning eller større manipulering av eksoskjelettet og langvarig implantasjon av måleenheter9,10,11, som introduserer ekstra stress til testpersonen og øker tiden som trengs for en vellykket gjenoppretting før eksperimentering. Videre kan mindre invasive teknikker (f.eks. visuell observasjon, videografi) være begrenset til tidlige livshistoriestadier når organismer kan være helt ellerhalvgjennomsiktige 12. Videre kan ytterligere utfordringer presenteres for forskere som ikke er godt bevandret i mer teknologisk avanserte metoder (f.eks observasjoner via infrarøde transdusere eller Doppler perfusjon8,11).
Denne protokollen bruker den amerikanske hummeren (Homarus americanus) som en sen fase marine virvelløse modell for å demonstrere bruk av impedanspneumografi for å vurdere endringer i hjertefrekvensen under et temperaturrampingseksperiment. Impedans pneumography innebærer passering av en oscillerende elektrisk strøm (AC) over to elektroder plassert på hver side av perikardiet for å måle endringer i spenning som hjertet kontrakter og slapperav 13,14. Denne teknikken er minimalt invasiv, da den benytter bruk av små elektroder (dvs. 0,10–0,12 mm diameter) som forsiktig implanteres like under eksoskjelettet. Til slutt, det gir sanntidsvurderinger av både hjertefrekvens og vanntemperatur under rampen gjennom bruk av en datalogger.
Protokollen gir også instruksjoner for beregning av Arrhenius break temperature (ABT), temperaturen der hjertefrekvensen begynner å avta med økende temperaturer13,,15. ABT fungerer som en nonlethal indikator på den termiske grensen for kapasitet i testpersoner som kan favoriseres over å måle den kritiske termiske maksimum (CTmax, den øvre grensen for hjertefunksjon5,6), som dødelige grenser er ofte ekstreme og sjelden oppstått i det naturlige miljøet5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Oppsett av utstyr
- Pakk klar, formbar slange rundt seg selv for å skape en varmeutvekslingsspole som er ca 8–10 cm i diameter og har utvidelser 40–70 cm lange. Fest spolen ved hjelp av elektrisk tape.
- Fest den varmesedkkende spolen til den eksterne tilførselen og returbeslag av et kjølende/ varmesirkulerende vannbad. Kontroller at tilkoblingen er festet ved hjelp av slangeklemmer.
- Fyll brønnen på kjøle-/varmesirkulasjonsvannet med omvendt osmose (RO) vann og koble strømledningen til et uttak. Slå på vannbadet og sørg for at det ikke er noen lekkasjer i forbindelse med varmeutvekslingsspolen.
- Sett opp impedansomformeren ved å koble den svarte BNC-kabelen til AC-utgangen på enheten og koble den til dataloggeren (Materialtabellen) ved hjelp av Kanal 1-porten.
- Koble termoelementsonden (temperaturopptakeren) til T-type-poden, og koble deretter T-type-poden til Kanal 2-porten på dataloggeren.
- Koble strømledningen til dataloggeren til en strømforsyning, og koble dataloggeren til en PC-datamaskin ved hjelp av USB-kabelkontakten.
- Fyll akklimatiseringskammeret og eksperimentell arena med 7,5 l kunstig sjøvann (saltinnalitet = 35 ppt, pH = 8,1, temperatur = ~ 12 °C).
MERK: Volumet, temperaturen og kjemien i vannet som trengs for akklimatiseringskammeret og startforholdene i den eksperimentelle arenaen er avhengig av eksperimentell design. Viktigere, disse beholderne må være store nok til å komfortabelt senke testpersonen.
2. Implantasjon av elektroder
- Plasser hummeren på en plastrist som passer lett inn i den eksperimentelle arenaen, slik at kroppen komfortabelt lager en Y-form i den ene enden av rektangelet.
- Fest forsiktig hummerens klør og mage til plastristen ved hjelp av små strips. Kabelbåndene skal være stramme nok til å forhindre bevegelse, men gi plass til kirurgisk saks for å fjerne dem ved ferdigstillelse av eksperimentet.
- Tørk av karapace med et papirhåndkle og rengjør det med en bomullsdott gjennomvåt i 70% etanol.
- Lag hullene for elektrodene.
- Bruk en liten boreter (f.eks. 1,6 mm), sakte og forsiktig håndbore to små hull (nesten) gjennom karapace på hver side av perikardiet.
- Avslutt hvert hull ved å sette forsiktig inn en steril dissekerende nål.
- Hvis nålen ikke lett går gjennom karapace, fortsett å sakte hånd-drill før du prøver nålen igjen.
MERK: For å minimere stress hos eksperimentelle dyr anbefales det sterkt å praktisere denne teknikken før eksperimentering. Over tid kan brukerne enkelt bestemme ved å føle når borkronen er nesten om karapace og bytte til nålen. Håndboring er egnet for hummer og krabber, spesielt hvis eksoskjelettet er mykt (dvs. dyr har nylig smeltet). Men hvis testpersonen har et tykkere eksoskjelett eller skall (dvs. en bivalve), er et Dremel-verktøy mer hensiktsmessig.
- Få elektrodene (36–38 G magnetisk ledning, 0,10–0,12 mm diameter) og skrap av en liten bit isolasjon på trådens spiss ved hjelp av et dissekerende knivblad. Bøy forsiktig spissen av hver ledning inn i en liten krok ved hjelp av tang og sett den inn i hvert av de nyborede hullene.
- Fest hver ledning ved hjelp av en liten dråpe cyanoakrylatlim og la den tørke i 5–10 min.
MERK: Det er avgjørende å bruke limet sparsomt, da det å legge til for mye vil reisolere ledningen og forhindre at signalet registreres. - Når limet er tørt, fester du ledningene til impedansomformeren og slår den på. Plasser hummeren i akklimatiseringskammeret og la den akklimatisere seg til de implanterte elektrodene i 15–20 min.
MERK: Raske eller rystende bevegelser, samt ufullstendig tørket lim, kan føre til at elektrodene løsner fra karapace. Hvis dette skjer, går du tilbake til trinn 2.6. - Slå på dataloggeren og åpne LabChart-programvaren på datamaskinen. Klikk nytt eksperiment, og la skjermbildet Diagramvisning være åpen.
- Finn kanalfunksjonsmenyen for kanal 1 fra høyre del av skjermen i Diagramvisning. Velg Inngangsforsterker fra menyen, og velg VEKSELKOBLING. Det innkommende signalet fra testpersonen vises nå på skjermen i sanntid.
MERK: Følsomheten til kanalen kan justeres ved å velge hurtigmenyen Område. Juster rekkevidden til signaltoppene er 25 %–75 % av fullskalaen. Lukk inngangsforsterkeren ved å klikke OK. - På impedansomformeren justerer du Gain (størrelse) og Balanse til et sterkt signal observeres på dataloggerutgangen, med sikte på å holde balansen nær null.
- På kanal 2 velger du T-Type pod for å registrere temperaturdata i sanntid.
- Når begge kanalene er riktig konfigurert, klikker du startknappen, og dataloggeren vil begynne å logge data.
3. Temperaturramping
- Etter akklimatiseringsperioden plasserer du plastristen forsiktig inn i den eksperimentelle arenaen og setter varmeutvekslingsspolen på toppen av risten.
- Plasser termoelementsonden i nærheten av hummeren, og sørg for at den er helt nedsenket før du plasserer lokket på den eksperimentelle arenaen for å redusere visuelt stress til testpersonen.
- Juster balansen etter behov og legg en kommentar til produksjonen som sier at rettssaken har begynt.
- Utgangen kan og bør lagres med jevne mellomrom gjennom hele eksperimentet.
- Klikk fil, og velg Lagre som for å lagre utdataene på datamaskinen i første omgang.
- Når du lagrer under eksperimentet, klikker du fil og velger Lagre.
MERK: Selv om LabChart-programvaren kan gjenopprette filer i tilfelle en utilsiktet programavslutning (f.eks. strømbrudd), anbefales det å lagre aktive filer hver 15-20 min under forsøket for å forhindre tap av data.
- Øk vanntemperaturen på den eksperimentelle arenaen med en hastighet på ~ 1,5 ° C hver 15 min for å oppnå en rampe fra 12 ° C til 30 ° C over en 2,5 t periode ved å justere temperaturen på det resirkulerende vannbadet.
MERK: Den geografiske fordelingen av den amerikanske hummeren strekker seg over en 25 °C termisk gradient, og enkeltpersoner kan akklimatisere seg til og overleve ved temperaturer på opptil 30 °C16. Som sådan ble 30 °C valgt som den øvre grensen for denne temperaturrampen, da det sikrer at hummer opplever et stressende scenario som ikke når den kritiske termiske maksimum13, noe som kan føre til dødelighet. Den spesifikke frekvensen av oppvarming ble valgt fordi den faller innenfor en rekke oppvarmingsrater implementert i studier ved hjelp av andre arter8,14 samt tidligere forskning på den amerikanske hummer13,27. Før du implementerer denne protokollen, er det viktig å 1) bestemme riktig temperaturområde for et gitt eksperiment og 2) gjennomføre en pretrial temperatur rampe med en tom eksperimentell arena, da dette vil bidra til å bestemme den nødvendige temperaturjusteringen av vannbadet for å oppnå ønsket rampe. Dette kan også variere avhengig av volumet av vann i arenaen. - Gjennom hele temperaturrampen registrerer du når en justering som kan påvirke utgangen.
- Vær oppmerksom på at balansen på impedansomformeren sannsynligvis må justeres gjennom hele eksperimentet, og dette kan føre til en utilsiktet økning i produksjonen.
- Som temperaturen i den eksperimentelle arenaen begynner å nå nivåer utenfor det foretrukne termiske området av testfaget, ufrivillige muskelsammentrekninger kan resultere i en feilaktig "pigg" i produksjonen. Hvis dette skjer, må du kommentere for å identifisere områder av utdataene som skal fjernes under datakonverteringsprosessen.
- Når rampen er ferdig, fjern hummeren fra den eksperimentelle arenaen og plasser den i et gjenopprettingsbad (12 °C) i ~ 20 min. Hvis ønskelig, fortsett å overvåke hummerens hjertefrekvens til den går tilbake til basalnivåer.
- Etter 20 minutter, trykk på Stopp-knappen på PowerLab-utgangen og lagre filen. Fjern forsiktig elektrodene og kutt stripsene med kirurgisk saks før du returnerer testen som er underlagt holdetanken.
MERK: I stedet for å plassere en hummer direkte inn i gjenopprettingsbadet, er et annet alternativ å sakte returnere den eksperimentelle arenaen til starttemperaturen. Dette oppnås ved å kjøle den eksperimentelle arenaen med ~ 1,5 ° C hver 15 min i løpet av ytterligere 2,5 timer.
4. Datakonvertering
- Åpne Data Pad. Sett Kolonne A til tid ved å dobbeltklikke på kolonne A og klikke på Markeringog aktivt punkt på venstre side av datablokkkolonne A-oppsettmenyen. Velg Tid fra høyre side av menyen, og lukk vinduet ved å klikke OK.
- Sett kolonne B til gjennomsnittstemperaturen ved å dobbeltklikke på kolonne B og velge Statistikk-alternativet fra venstre side av datablokkkolonne B-oppsettmenyen. Velg Mean fra høyre side av menyen og Kanal 2 som beregningskilde nederst i vinduet på menyen. Klikk OK for å lukke vinduet.
- Konvertere spenningen som er registrert til slag per minutt
- Dobbeltklikk på kolonne C og velg Valg og aktivt punkt på venstre side av menyen. Velg Valgvarighet fra høyre side av menyen, og klikk OK for å lukke vinduet.
- Dobbeltklikk på kolonne D og velg Sykliske målinger på venstre side av menyen. Velg Hendelsesantall fra høyre side av menyen, og Kanal 1 som beregningskilde. Klikk OK for å lukke vinduet. Dette teller toppene av dataene for å bestemme hjertefrekvensen på tvers av en valgt del av dataene.
MERK: Velg eventuelt Alternativer-knappen nederst på menyen og juster registreringsinnstillingene for å lese dataene mer nøyaktig. Skann gjennom datafilen og finn ut om "Sine" eller "Spikey" formalternativer resulterer i tellinger av bare de store toppene i hjerteslagutdataene. I tillegg justerer du terskelen for gjenkjenningsjustering på høyre side av menyen for å ignorere støy i utdatafilen. - Dobbeltklikk på Kolonne E og velg Sykliske målinger på venstre side av menyen. Velg Gjennomsnittlig syklisk satsog Kanal 1 som beregningskilde. Juster registreringsinnstillingene og registreringsjusteringen slik at de samsvarer med innstillingene for kolonne D (hvis den manipuleres i trinn 4.4.2). Klikk OK for å lukke vinduet. Dette gir den endelige estimeringen av hjertefrekvensen (som slag per minutt) over en valgt del av dataene.
- Når kolonnene er konfigurert, går du tilbake til datafilen og uthevede de ønskede delene av utdataene, og utelater områder med feilaktige data som identifiseres av kommentarer i del 3.6.
- Velg Kommandoer og flere legg til i datablokk.
- Velg Tid fra rullegardinmenyen Søk ved hjelp av, og hent data hver 30-tall ved å merke av for Hver boks og skriv inn "30" under Velg-menyen.
- Klikk alternativet Gjeldende valg fra Gå gjennom-menyen, og klikk Legg til.
- Gå tilbake til datablokkskjermen, og velg Fil og Lagre som for å lagre utdataene som en Excel-fil.
MERK: Her rapporteres hjertefrekvensen (i slag per minutt) hver 30 s i motsetning til hvert minutt basert på tidligere forskning8,27. Dette bidrar også til å fange opp endringer i sanntidsinnsamlede spenningsdata mer nøyaktig. Det er mulig å velge data med kortere eller lengre tidsintervaller basert på individuelle preferanser.
5. Beregning av Arrhenius pausetemperatur
- Åpne datafilen i Excel og manipulere utdataene fra LabChart-programvaren.
- Konverter temperaturen fra Celsius til gjensidig kelvin ved hjelp av følgende ligning: [1000/(temperatur °C + 273,15 K)].
- Få den naturlige loggen av hjertefrekvens: ln (BPM).
- Generer en Arrhenius-tomt ved å plotte hjertefrekvenssom en funksjon av temperatur, uttrykt som ln(BPM) vs. gjensidig (K)13,15.
- I SigmaPlot, passer dataene med en stykkevis regresjon og bestemme skjæringspunktet, som er ABT.
- Kopier og lim inn de transformerte dataene i en ny arbeidsbok. Velg alternativet Statistikk fra hovedmenyen og regresjonsveiviseren fra rullegardinlisten.
- I Formel-vinduet velger du delmessig på Formelkategori-menyen og 2 segment lineærunder Formelnavn-boksen. Klikk Neste.
- I vinduet Variabler velger du de transformerte temperaturdataene som t-variabelen, og de transformerte pulsdataene som t y-variabelen, ved hjelp av rullegardinalternativene i Variabelkolonner-menyen. Kontroller at XY Pair er valgt i Data fra-menyen før du klikker Neste.
- Når du har gjennomgått vinduet Tilpass resultater, klikker du Neste og merker av for Opprett rapport i vinduet Numeriske utdataalternativer. Klikk Neste.
- I vinduet Diagramalternativer merker du av for Opprett nytt diagram under Fit Results Graph-delen, og Legg til formel i diagramtittel under inndelingen Graph-funksjoner. Klikk Fullfør.
- Hent Results ligninger og parameterverdier for de to regionene i den stykkevis regresjonen på resultatutdata-siden, samt statistisk utdata for regresjonen (f.eks. R2,F-statistikk og p-verdi).
- Ved hjelp av parameterverdiene og ligningene som genereres, angir du de to segmentene som er lik hverandre og løser variabelen "t" for å bestemme ABT. Konverter denne verdien tilbake til Celsius ved hjelp av følgende ligning: °C = (1000/t) - 273,15.
MERK: ABT kan også beregnes i R statistisk databehandling miljø ved hjelp av pakken "segmentert"17 i programmet SAS18, eller ved hjelp av "Segmental lineær regresjon" rutine i Prism819.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen beskriver bruken av impedanspnematografi for å få sanntidsdata for hjertefrekvens (i spenning) og temperatur under et temperaturrampingseksperiment. Ved perforing av denne teknikken vil amplituden av de registrerte spenningene og temperaturene variere basert på eksperimentell design og fokalarter. Spenningsutgangen som vises i sanntid følger imidlertid en generisk sinusfordeling når protokollen implementeres riktig (figur 1A). Etter hvert som temperaturen i arenaen økes, endres sanntidsfordelingen av spenningsendringer for å gjenspeile en økt frekvens av spenningstopper (dvs. hjerteslag; Figur 1B). Etter hvert som arenatemperaturen fortsetter å øke til nivåer utenfor testpersonens optimale ytelsesvindu, endres fordelingen for å skildre en redusert frekvens av spenningstopper med en sinuslignende form avbrutt av sporadiske topper og/eller øyeblikk av "flat-lining" (Figur 1C).
Når rådata konverteres ved hjelp av Data Pad-komponenten i LabChart-programvaren, følger den resulterende fordelingen av hjertefrekvens (i slag per minutt) i løpet av temperaturrampen en parabolsk fordeling hvis eksperimentet er vellykket (figur 2). Etter hvert som temperaturen i arenaen økes, øker hjertefrekvensen til testpersonen også for å møte forhøyede energiske krav knyttet til varmere temperaturer. Men etter hvert som temperaturen fortsetter å øke og testpersonen begynner å oppleve moderat til ekstrem termisk stress, begynner hjertefrekvensen å avta eller blir uberegnelig når motivet begynner å vise passiv termisk toleranse (f.eks. innsettende anaerob respirasjon, metabolsk hastighetsundertrykkelse og redusert aktivitet5,7). Når hjertefrekvens- og temperaturdata transformert og en Arrhenius-tomt genereres, kan pulsen som begynner å avta (ABT) beregnes (figur 3). Arrhenius-plottet passer deretter med en stykkevis regresjon ved hjelp av statistisk programvare der skjæringspunktet mellom de to linjene representerer ABT.
Figur 1: Representativ utdata fra LabChart datalogger. Sanntidsendring i spenning på tvers av elektroder i testpersonen vises i rødt, og den samtidige sanntidsutgangen til arenatemperaturen (°C) vises i blått. I begynnelsen av forsøket under kjøligere temperaturer (f.eks. 13,1 °C), bør spenningen følge en generisk sinuslignende fordeling (A). Etter hvert som temperaturen økes (f.eks. 23 °C), bør frekvensen av spenningstopper øke, men fordelingen skal forbli sinuslignende (B). Til slutt, ettersom testpersonen skyves utenfor sitt optimale termiske ytelsesvindu (f.eks. 28,5 °C), bør spenningstoppene bli uberegnelige etter hvert som frekvensen minker (C). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Forventet fordeling av hjertefrekvens over temperaturrampekurset. Spenningsdata som samles inn av dataloggeren konverteres til hjertefrekvens i slag per minutt (BPM) ved hjelp av Data Pad-komponenten i programvaren. Når rampen utføres riktig, vises en parabolsk fordeling av hjertefrekvens over temperaturområdet som er testet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Eksempel på en Arrhenius-tomt. Når data er konvertert i datablokken og eksportert, transformerer de til å generere et Arrhenius-plott. I dette eksemplet er data egnet med en delvis ikke-lineær regresjon i SigmaPlot, og genererer ligninger for venstre- og høyresegmentene (henholdsvis region 1 og region 2) av regresjonslinjen, samt godhet-of-fit-beregninger. Skjæringspunktet mellom de to regresjonslinjene løses som ABT (rød stjerne). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen beskriver bruken av impedanspnematografi for å måle endringer i hjertefrekvensen til sene fasevirvelløse dyr under et temperaturrampingseksperiment. Den primære fordelen med denne teknikken sammenlignet med andre laboratoriebaserte tilnærminger9,10,11 er at den er minimalt invasiv og ikke involverer stor kirurgisk manipulering av eksoskjelettet, og reduserer dermed mengden restitusjonstid som trengs før eksperimentering. Videre er utstyret enkelt å bruke, og resulterende data kan bare manipuleres og tolkes i det foreslåtte programmet. Mens den amerikanske hummeren brukes her som modellemne, har denne teknikken blitt implementert i blåblåskjell (Mytilus spp.14) og kan lett endres for bruk i andre sene stadier virvelløse dyr (dvs. krabber, reker og andre bivalves).
En ekstra fordel med protokollen er at den fokuserer på å beregne ABT som en ikke-dødelig indikator på termiske grenser. Selv om mange studier presenterer CTmax som det betydelige endepunktet når du bestemmer termisk fysiologisk ytelse5,8,20,21,22,23, organismer sjelden møter temperaturer i dette området i det naturlige miljøet5. Videre, som CTmax er ofte en dødelig temperatur, ved hjelp av denne målingen som det foretrukne endepunktet utelukker bruk av testpersoner i ekstra eller oppfølging eksperimentering etter termisk stress23. Når man tar sikte på å beregne ABT ved hjelp av denne protokollen, er det avgjørende å øke temperaturen i den eksperimentelle arenaen til det punktet å skyve testen underlagt sin fysiologiske grense uten å indusere døden. Derfor anbefales det å bestemme de potensielle termiske grensene for fokale arter via en pilotstudie (når det er mulig) før du bestemmer hele spekteret av den eksperimentelle temperaturrampen.
Det anbefales også at forskerne bestemmer og observerer naturlige variasjoner i basal hjertefrekvens av en fokal art når temperaturen i den eksperimentelle arenaen opprettholdes på et konstant og ikke-stressende nivå før rampingeksperimentet. Dette er spesielt nyttig for fokale arter der hvilepulsinformasjon ikke er tilgjengelig i den publiserte litteraturen. Det fungerer også som god praksis av elektrodeimplantasjonsteknikker. Dette kan også hjelpe forskere med å bestemme riktig akklimatiseringstid som kreves for å sikre at ingen falske pigger i hjertefrekvensen skyldes håndtering av stress i begynnelsen av et eksperiment.
Selv om protokollen diskuterer bruk av impedanspnematografi i sammenheng med termisk stress alene, kan den også brukes til å utforske de potensielle interaktive effektene av andre stressfaktorer på termisk fysiologi. Organismeytelse kan reduseres i nærvær av miljøstressfaktorer (dvs. hypoksi, hyperkapni, forurensende stoffer og/eller endringer i salinitet), som også kan komprimere optimale temperaturområder for ytelse7,,24,,25,26. Som sådan kan denne protokollen endres for å utforske hvordan eksponering for ulike stressfaktorer før temperaturramping kan påvirke ytelsen.
For eksempel eksponerte Harrington og Hamlin27 juvenile H. americanus for nåværende eller spådde pH-forhold fra slutten av 1900-tallet (henholdsvis 8,0 og 7,6) i 2 måneder før de vurderte hjerteytelse under en temperaturrampe. Hummer pre-utsatt for sure miljøer viste en betydelig reduksjon i gjennomsnittlig ABT sammenlignet med de som holdes under dagens pH-forhold. Dette tyder på at et lavt pH-miljø reduserer termisk ytelse og kan øke risikoen for cellulær skade på grunn av varmestress ved lavere temperaturer27. Fremtidig innsats kan utvide metoden som presenteres her for å inkludere pre-eksponering for en kombinasjon av miljøstressfaktorer før du følger denne protokollen. Videre kan denne protokollen endres for å måle endringer i hjerteytelse under eksponering for biotiske stressfaktorer, samt hvordan termiske grenser kan endres i henhold til ontogeny4,5.
En stor begrensning av denne protokollen er at utstyret som beskrevet er begrenset for bruk i en laboratorieinnstilling, noe som potensielt begrenser anvendelsen for feltbaserte eksperimenter som krever mer spesialisert utstyr8. Denne teknikken krever også tilbakeholdenhet av svært motile testpersoner (f.eks hummer og krabber) for å redusere produksjonen av falske datapunkter som følge av ikke-hjertemuskelbevegelser. Selv om dette kan begrense naturlig atferd under en temperaturrampe, er virkningen av begrensninger konsistent på tvers av alle testpersoner. Viktigst, Det er potensial for vevskade eller død hos testpersoner hvis aggressiv eller uforsiktig boring under elektrodeimplantasjon er implementert. Dette står i skarp kontrast til infrarød fotoplethysmografi, en virkelig ikke-invasiv teknikk som benytter en ekstern infrarød transduser til å passere lys gjennom perikardiet og registrere hjertefunksjon ved å konvertere reflektert lysenergi til spenning8,28.
Selv om infrarød fotoplethysmografi reduserer risikoen for håndtering av stress sammenlignet med impedanspneumografi, resulterer riktig implantering av elektroder ved hjelp av den beskrevne metoden i minimaltraume, gir en rask akklimatiseringstid, og fører til rask gjenoppretting uten å indusere dødelighet hos testpersoner etter rampingseksperimentet27. Siden det ikke er noen signifikant forskjell i hjerteproduksjonen registrert ved begge metodene28, er det konkludert med at impedanspneumografi er en pålitelig og minimalinvasiv teknikk for vurdering av hjerteytelse. Til slutt har de mange fordelene og fleksibiliteten i protokollen potensial til å belyse hvordan ulike miljøfaktorer samhandler med temperatur for å påvirke fysiologisk ytelse i sene stadium krepsdyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Paul Rawson for laboratoriehjelp og National Science Foundation award IIA-1355457 til Maine EPSCoR ved Universitetet i Maine for midler til å kjøpe utstyr. Dette prosjektet ble støttet av USDA National Institute of Food and Agriculture, Hatch prosjektnummer MEO-21811 gjennom Maine Agricultural and Forest Experiment Station, samt NOAA National Marine Fisheries Service Saltonstall Kennedy Grant #18GAR039-136. Forfatterne takker også tre anonyme anmeldere for sine kommentarer til en tidligere versjon av dette manuskriptet. Maine Landbruks- og skogseksperimentstasjon Publikasjon nummer 3733.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.6 mm (1/16 in) drill bit | Milwaukee Tool at Home Depot | 1001294900 | This is for a 1.6 mm (1/16 in) diameter drill bit. This item can be found at most home-improvement stores. |
| 38 AWG Copper Magnet Wire | TEMCo | MW0093 | This wire is used to make the wire electrode leads that are implanted into the test subjects. This listing is for a 4 oz coil of 38-gauge magnetic wire. TemCo also has 36-gauge magnetic wire that is also suitable for use in constructing wire electrodes. |
| Cyanoacrylate glue | Loctite | 852882 | This item includes a brush tip, which makes it easier to control the amount of glue used to secure electrodes to the carapace. |
| Ethanol, 70% Solution, Molecular Biology Grade | Fisher BioReagents | BP82931GAL | This reagent is used in combination with the sterile cotton balls to disinfect the carapace prior to electrode implantation. |
| Excel | Microsoft | N/A | This program is used in the protocol for organizing, manipulating, and analyzing data. It is compatible with both PC and Mac operating systems. |
| Fisherbrand 8-Piece Dissection Kit | Fisher Scientific | 08-855 | This kit includes the forceps, scissors, dissecting knife (and blades), and dissecting needle needed to accomplish the electrode implantation steps in the protocol. |
| Fisherbrand Isotemp Refrigerated/Heated Bath Circulators: 5.4-6.5L, 115V/60Hz | Fisher Scientific | 13-874-180 | This is a complete system that consists of an immersion circulator and a bath. It can be used as a temperature controlled bath or to circulate fluid externally to an application. Temperature range of this water bath is -20 to +100 °C, and the unit heats/cools rapidly and is easy to drain upon conclusion of use. |
| Fisherbrand Sterile Cotton Balls | Fisher Scientific | 22-456-885 | These swabs should be soaked in 70% ethanol before being used to disinfect the carapace prior to electrode implantation. |
| Fork Terminal, Red Vinyl, Butted Seam, 22 to 16 AWG, 100 PK | Grainger | 5WHE6 | Terminals are soldered to the magnetic wire to construct the wire electrodes. These can be purchased from a variety of home-improvement vendors. |
| Impedance converter | UFI | Model 2991 | Measures impedance changes correlated with very small voltage changes, ranging from 0.2 ohm to over 5 ohms. This model can convert impedance changes that stem from resistance, capacitance, or inductance variations, as well as a combination of all three. |
| LabChart software | ADInstruments | N/A | Purchase of the PowerLab datalogger includes the LabChart software, but a license for the software can also be directly downloaded online. LabChart allows the user to record data, open and read LabChart files, analyze data, as well as save and export files. There is a free version of the software, LabChart Reader, but users can only open and read LabChart files and analyze them (i.e., it cannot be used to record, save, or export data files). One also has the option of selecting LabChart Pro, which includes LabChart teaching modules that can be used for educational purposes. |
| LED Soldering Iron | Grainger | 28EA35 | This is a generic soldering iron that can be used to solder the magnetic wire to the fork terminals to create the wire electrodes. |
| PowerLab datalogger | ADInstruments | ML826 | There are a variety of models of the PowerLab. This catalog number is for the 2/26 model that is a 2 channel, 16 bit resolution recorder with two analog input channels, independently selectable input sensitivities, two independent analog outputs for stimulation or pulse generation and a trigger input. The PowerLab features a wide range of low-pass filters, AC or DC coupling and adaptive mains filter. This unit has a USB interface for connection to Windows or Mac OS computers and a sampling rate of 100,000 samples/s per channel. |
| Prism8 | GraphPad | N/A | This program provides an additional option for calculating the Arrhenius Break Temperature through its “Segmental linear regression” data analysis option. This program does not require any programming and is compatible with both Mac and Windows operating systems. |
| R | R Project | N/A | This is free software for statistical computing that is compatible with UNIX platforms, as well as Windows and Mac operating systems. This program can also be used to calculate the Arrhenius Break Temperature using the “segmented” package. There are a number of tutorials and user guides available online through the r-project.org website. |
| Rosin Core Solder | Grainger | 331856 | This product has a diameter of 0.031 in (0.76 mm) and is ideal for use in soldering speaker wire (similar gauge as magnetic wire used for electrodes). |
| SAS | SAS Institute | N/A | This program provides an additional option for calculating the Arrhenius Break Temperature. However, it does require programming and is not compatible with Mac operating systems. |
| SigmaPlot | Systat Software, Inc. | N/A | This is the authors’ preferred program for statistical determination of the Arrhenius Break Temperature. The “Regression Wizard” is easy to use and does not require any programming. One can obtain a free 30-day trial license before purchase. However, it is compatible only with PC computers. |
| T-type Pod | ADInstruments | ML312 | Suitable for measurement of temperatures from 0-50 °C using T-type thermocouples. |
| T-type Thermocouple Probe | ADInstruments | MLT1401 | Compatible with the T-type Pod for connection. Measures temperature up to 150 °C, and is suitable for immersion in various solutions, semi-solids, and tissue (includes a needle for implantation). This product is a 0.6 mm diameter isolated probe that is sheathed in chemical-resistant Teflon and a lead length of 1.0 m. |
| UV Cable Tie, Black | Home Depot | 295813 | This is for a 100-pack of 8-inch (20.32 cm), black cable ties. However, based on the size of test subjects, smaller or larger cable ties may be needed. This item, and others like it, can be purchased at any home-improvement store. |
References
- Stocker, T. F., et al. Climate Change 2013: The Physical Basis. Contribution of Working Group I to the Fifth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change. , Cambridge University Press. Cambridge, UK, and New York, NY, USA. (2013).
- Pershing, A. J., et al. Slow adaptation in the face of rapid warming leads to collapse of the Gulf of Maine cod fishery. Science. 350 (6262), 809-812 (2015).
- Smale, D. A., et al. Marine heat waves threaten global biodiversity and the provision of ecosystem services. Nature Climate Change. 9 (4), 306-316 (2019).
- Pörtner, H. O., Farrell, A. P.
- Pörtner, H. O., Bock, C., Mark, F. C. Oxygen- and capacity-limited thermal tolerance: bridging ecology and physiology. Journal of Experimental Biology. 220 (15), 2685-2696 (2017).
- Somero, G. N., Lockwood, B. L., Tomanek, L. Biochemical adaptation: response to environmental challenges, from life's origins to the Anthropocene. , Sinauer Associates, Incorporated Publishers. Sunderland, MA, USA. (2017).
- Sokolova, I. M., Frederich, M., Bagwe, R., Lanning, G., Sukhotin, A. A. Energy homeostasis as an integrative tool for assessing limits of environmental stress tolerance in aquatic invertebrates. Marine Environmental Research. 79, 1-15 (2012).
- Tepolt, C. K., Somero, G. N. Master of all trades: thermal acclimation and adaptation of cardiac function in a broadly distributed marine invasive species, the European green crab, Carcinus maenas. Journal of Experimental Biology. 217 (7), 1129-1138 (2014).
- Frederich, M., Pörtner, H. O. Oxygen limitation of thermal tolerance defined by cardiac and ventilatory performance in spider crab, Maja squinado. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 279 (5), 1531-1538 (2000).
- Metzger, R., Sartoris, F. J., Langenbuch, M., Pörtner, H. O. Influence of elevated CO2 concentrations on thermal tolerance of the edible crab Cancer pagurus. Journal of Thermal Biology. 32, 144-151 (2007).
- Walther, K., Sartoris, F. J., Bock, C., Pörtner, H. O. Impact of anthropogenic ocean acidification on thermal tolerance of the spider crab Hyas araneus. Biogeosciences. 6 (10), 2207-2215 (2009).
- Styf, H. K., Sköld, H. N., Eriksson, S. P. Embryonic response to long-term exposure of the marine crustacean Nephrops norvegicus to ocean acidification. Ecology and Evolution. 3 (15), 5055-5065 (2013).
- Camacho, J., Qadri, S. A., Wang, H., Worden, M. K. Temperature acclimation alters cardiac performance in the lobster Homarus americanus. Journal of Comparative Physiology A. 192 (12), 1327-1334 (2006).
- Braby, C., Somero, G. N. Ecological gradients and relative abundance of native (Mytilus trossulus) and invasive (Mytilus galloprovincialis) blue mussels in the California hybrid zone. Marine Biology. 148 (6), 1249-1262 (2006).
- Stenseng, E., Braby, C. E., Somero, G. N. Evolutionary and acclimation-induced variation in the thermal limits of heart function in congeneric marine snails (Genus Tegula): implications for vertical zonation. Biological Bulletin. 208 (2), 138-144 (2005).
- Factor, J. Biology of the Lobster: Homarus americanus. , Academic Press. Boston, MA, USA. (1995).
- Muggeo, V. M. Segmented: an R package to fit regression models with broken-lin relationships. R News. 8 (1), 20-25 (2008).
- Ryan, S. E., Porth, L. S. A tutorial on the piecewise regression approach applied to bedload transport data. General Technical Report RMS-GTR-189. , US Department of Agriculture, Forest Service, . Rocky Mountain Research Station, Fort Collins, CO, USA. (2007).
- Prism8 Statistics Guide. , GraphPad Software, Inc. San Diego, California, USA. www.graphpad.com (2020).
- Cuculescu, M., Hyde, D., Bowler, K. Thermal tolerance of two species of marine crab, Cancer pagurus and Carcinus maenas. Journal of Thermal Biology. 23 (2), 107-110 (1998).
- Stillman, J. H. A comparative analysis of plasticity of thermal limits in porcelain crabs across latitudinal and intertidal zone clines. International Congress Series. 1275, 267-274 (2004).
- Maderia, D., et al. cellular and biochemical thermal stress response of intertidal shrimps with different vertical distributions: Palaemon elegans and Palaemon serratus. Comparative Biochemistry and Physiology, Part A. 183, 107-115 (2015).
- Padilla-Ramirez, S., et al. The effects of thermal acclimation on the behavior, thermal tolerance, and respiratory metabolism in a crab inhabiting a wide range of thermal habitats (Cancer antennarius Stimpson, 1856, the red shore crab). Marine and Freshwater Behaviour and Physiology. 48 (2), 89-101 (2017).
- Pörtner, H. O. Ecosystem effects of ocean acidification in times of ocean warming: a physiologist's view. Marine Ecology Progress Series. 373, 203-217 (2008).
- Pörtner, H. O. Oxygen- and capacity-limitation of thermal tolerance: a matrix for integrating climate-related stressor effects in marine ecosystems. Journal of Experimental Biology. 213 (6), 881-893 (2010).
- Zittier, Z. M. C., Hirse, T., Pörtner, H. O. The synergistic effects of increasing temperature and CO2 levels on activity capacity and acid-base balance in the spider crab, Hyas araneus. Marine Biology. 160 (8), 2049-2062 (2013).
- Harrington, A. M., Hamlin, H. J. Ocean acidification alters thermal cardiac performance, hemocyte abundance, and hemolymph chemistry in subadult American lobsters Homarus americanus H. Milne Edwards, 1837 (Decapoda: Malcostraca: Nephropidae). Journal of Crustacean Biology. 39 (4), 468-476 (2019).
- Depledge, M. H. Photoplethysmography - a non-invasive technique for monitoring heart beat and ventilation rate in decapod crustaceans. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Physiology. 77 (2), 369-371 (1984).
