Summary
Medir a freqüência cardíaca durante um desafio térmico fornece uma visão das respostas fisiológicas dos organismos como conseqüência de mudanças ambientais agudas. Usando a lagosta americana (Homarus americanus) como um organismo modelo, este protocolo descreve o uso da pneumografia de impedância como uma abordagem relativamente não invasiva e não letal para medir a freqüência cardíaca em invertebrados em estágio tardio.
Abstract
As temperaturas nos oceanos estão aumentando rapidamente como consequência de mudanças generalizadas nos climas mundiais. Como a fisiologia organisma é fortemente influenciada pela temperatura ambiental, isso tem o potencial de alterar o desempenho fisiológico térmico em uma variedade de organismos marinhos. Usando a lagosta americana (Homarus americanus) como organismo modelo, este protocolo descreve o uso da pneumografia de impedância para entender como o desempenho cardíaco em invertebrados em estágio tardio muda sob estresse térmico agudo. O protocolo apresenta uma técnica minimamente invasiva que permite a coleta em tempo real da freqüência cardíaca durante um experimento de rampa de temperatura. Os dados são facilmente manipulados para gerar uma parcela de Arrhenius que é usada para calcular a temperatura de ruptura de Arrhenius (ABT), a temperatura em que a freqüência cardíaca começa a diminuir com o aumento das temperaturas. Esta técnica pode ser usada em uma variedade de invertebrados em estágio tardio (ou seja, caranguejos, mexilhões ou camarões). Embora o protocolo se concentre apenas no impacto da temperatura no desempenho cardíaco, ele pode ser modificado para entender o potencial de estressores adicionais (por exemplo, hipóxia ou hipercapnia) interagirem com a temperatura para influenciar o desempenho fisiológico. Assim, o método tem potencial para aplicações abrangentes para entender melhor como os invertebrados marinhos respondem a mudanças agudas no ambiente.
Introduction
Nas últimas décadas, o aumento da entrada de gases de efeito estufa (isto é, dióxido de carbono, metano e óxido nitroso) na atmosfera resultou em padrões generalizados de mudança ambiental1. Os oceanos do mundo estão aquecendo rapidamente2,3,uma tendência que pode ter impactos severos na fisiologia organismal. A temperatura influencia fortemente as taxas fisiológicas, e os organismos têm uma faixa de temperatura ideal para o desempenho4,5,6. Como tal, os indivíduos podem encontrar dificuldades em manter a entrega adequada de oxigênio aos tecidos à medida que as temperaturas se afastam dessa faixa. Isso tem o potencial de levar a declínios no desempenho aeróbico em face do aquecimento das temperaturas dos oceanos5,7.
Em um ambiente laboratorial, um método para entender os impactos fisiológicos das mudanças ambientais é examinar o desempenho cardíaco no contexto do estresse térmico. Isso fornece uma visão de como a exposição às condições de aquecimento previstas pode alterar as curvas de desempenho5,6, bem como o potencial de plasticidade de aclimatação8. Uma variedade de métodos foram implementados com sucesso para medir previamente a freqüência cardíaca em invertebrados marinhos. No entanto, muitas dessas técnicas envolvem remoção cirúrgica ou grande manipulação do exoesqueleto e implantação prolongada de dispositivos de medição9,10,11, que introduz estresse adicional ao sujeito do teste e aumenta o tempo necessário para uma recuperação bem sucedida antes da experimentação. Além disso, técnicas menos invasivas (por exemplo, observação visual, videografia) podem ser restritas aos estágios iniciais da história da vida quando os organismos podem ser totalmente ou semitransparentes12. Além disso, podem ser apresentados desafios adicionais aos pesquisadores que não são bem versados em metodologias tecnologicamente avançadas (por exemplo, observações via transdutores infravermelhos ou perfusão do Ppler8,11).
Este protocolo usa a lagosta americana (Homarus americanus) como um modelo de invertebrado marinho em estágio tardio para demonstrar o uso de pneumografia de impedância para avaliar mudanças na freqüência cardíaca durante um experimento de rampa de temperatura. A pneumografia de impedância envolve a passagem de uma corrente elétrica oscilante (AC) através de dois eletrodos posicionados em ambos os lados do pericárdio para medir mudanças de tensão à medida que o coração contrai e relaxa13,14. Esta técnica é minimamente invasiva, pois emprega o uso de pequenos eletrodos (ou seja, 0,10-0,12 mm de diâmetro) que são suavemente implantados logo abaixo do exoesqueleto. Finalmente, ele fornece avaliações em tempo real da freqüência cardíaca e temperatura da água durante a rampa através do uso de um data logger.
O protocolo também fornece instruções para calcular a temperatura de ruptura de Arrhenius (ABT), a temperatura em que a freqüência cardíaca começa a diminuir com o aumento das temperaturas13,15. O ABT serve como um indicador não letal do limite térmico de capacidade em cobaias que podem ser favorecidos sobre a medição do máximo térmico crítico (CTmax, o limite superior da função cardíaca5,6), pois os limites letais são muitas vezes extremos e raramente encontrados no ambiente natural5.
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Protocol
1. Configuração do equipamento
- Enrole tubos claros e maleáveis em torno de si mesmo para criar uma bobina de troca de calor que tem aproximadamente 8-10 cm de diâmetro e tem extensões de 40-70 cm de comprimento. Fixar a bobina usando fita elétrica.
- Conecte a bobina de troca de calor à fonte externa e retorne os encaixes de um banho de água circulante de resfriamento/aquecimento. Certifique-se de que a conexão está segura usando grampos de mangueira.
- Encha o poço do banho de água circulante de resfriamento/aquecimento com água de osmose reversa (RO) e conecte o cabo de alimentação a uma tomada. Ligue o banho de água e certifique-se de que não há vazamentos em sua conexão com a bobina de troca de calor.
- Configure o conversor de impedância conectando o cabo BNC preto à saída CA na unidade e conectando-o ao data logger(Tabela de Materiais)usando a porta do Canal 1.
- Conecte a sonda termopar (gravador de temperatura) ao pod tipo T e, em seguida, conecte a cápsula do tipo T à porta do Canal 2 do data logger.
- Conecte o cabo de alimentação do registro de dados a uma fonte de alimentação e conecte o registrador de dados a um computador de PC usando o conector de cabo USB.
- Encha a câmara de aclimatação e a arena experimental com 7,5 L de água artificial do mar (salinidade = 35 ppt, pH = 8,1, temperatura = ~12 °C).
NOTA: O volume, a temperatura e a química da água necessária para a câmara de aclimatação e as condições de partida na arena experimental dependem do projeto experimental. É importante ressaltar que esses recipientes devem ser grandes o suficiente para submergir confortavelmente o sujeito de teste.
2. Implantação de eletrodos
- Coloque a lagosta em uma grade de plástico que se encaixa facilmente na arena experimental de tal forma que o corpo confortavelmente faça uma forma de Y em uma extremidade do retângulo.
- Fixe cuidadosamente as garras e o abdômen da lagosta na grade plástica usando pequenas amarras de cabo. Os cabos devem ser apertados o suficiente para evitar o movimento, mas permitem espaço para a tesoura cirúrgica removê-las após a conclusão do experimento.
- Seque a carapaça com uma toalha de papel e limpe-a com uma bola de algodão encharcada em 70% de etanol.
- Crie os buracos para os eletrodos.
- Usando uma pequena broca (por exemplo, 1,6 mm), faça a broca devagar e cuidadosamente dois pequenos furos (quase) através da carapaça em ambos os lados do pericárdio.
- Termine cada orifício inserindo suavemente uma agulha de dissecação estéril.
- Se a agulha não passar facilmente pela carapaça, continue a perfurar lentamente antes de tentar a agulha novamente.
NOTA: Para minimizar o estresse em animais experimentais, é altamente recomendável praticar essa técnica antes da experimentação. Com o tempo, os usuários podem facilmente determinar sentindo quando a broca está quase na carapaça e mudar para a agulha. A perfuração manual é apropriada para lagostas e caranguejos, especialmente se o exoesqueleto é macio (ou seja, o animal foi recentemente fundido). No entanto, se o sujeito de teste tiver um exoesqueleto ou concha mais espesso (ou seja, uma biválvula), uma ferramenta Dremel é mais apropriada.
- Obtenha os eletrodos (fio magnético de 36-38 G, 0,10-0,12 mm de diâmetro) e raspe um pouco de isolamento na ponta do fio usando uma lâmina de faca dissecando. Dobre cuidadosamente a ponta de cada fio em um pequeno gancho usando fórceps e insira um em cada um dos furos recém-perfurados.
- Fixar cada fio usando uma pequena gota de cola cianoacrilato e deixá-lo secar por 5-10 min.
NOTA: É crucial usar a cola com moderação, pois adicionar muito irá resisolar o fio e evitar que o sinal seja gravado. - Uma vez que a cola esteja seca, conecte o fio ao conversor de impedância e ligue-o. Coloque a lagosta na câmara de aclimatação e deixe-a se adaptar aos eletrodos implantados por 15-20 min.
NOTA: Movimentos rápidos ou de, bem como cola seca incompletamente, podem fazer com que os eletrodos se sedem da carapaça. Se isso acontecer, retorne ao passo 2.6. - Ligue o data logger e abra o software LabChart no computador. Clique em Novo Experimento e deixe a tela Chart View aberta.
- Em Chart View,localize o menu Função do Canal 1 a partir da seção à direita da tela. Escolha o amplificador de entrada no menu e selecione Acoplamento CA. O sinal de entrada da cobaia será agora exibido na tela em tempo real.
NOTA: A sensibilidade do canal pode ser ajustada selecionando o menu pop-up Range. Ajuste o intervalo até que os picos de sinal sejam de 25%-75% da escala completa. Feche o amplificador de entrada clicando em OK. - No conversor de impedância, ajuste o Ganho (tamanho) e o Equilíbrio até que um sinal forte seja observado na saída do data logger, visando manter o Saldo perto de zero.
- No Canal 2, selecione o pod T-Type para gravar dados de temperatura em tempo real.
- Quando ambos os canais estiverem configurados corretamente, clique no botão Iniciar e o registrador de dados começará a registrar dados.
3. Rampa de temperatura
- Após o período de aclimatação, coloque a grade plástica com a lagosta presa cuidadosamente na arena experimental e coloque a bobina de troca de calor no topo da grade.
- Coloque a sonda termopar perto da lagosta, garantindo que ela esteja totalmente submersa antes de colocar a tampa na arena experimental para reduzir o estresse visual ao sujeito do teste.
- Ajuste o equilíbrio conforme necessário e coloque um comentário sobre a saída afirmando que o julgamento já começou.
- A saída pode e deve ser salva periodicamente durante todo o experimento.
- Clique em 'Arquivo' e selecione Salvar como para salvar inicialmente a saída no computador.
- Ao salvar durante o experimento, clique em 'Arquivo' e selecione Salvar.
NOTA: Embora o software LabChart possa recuperar arquivos no caso de um desligamento acidental do programa (por exemplo, uma queda de energia), recomenda-se salvar arquivos ativos a cada 15-20 min durante o experimento para evitar a perda de dados.
- Aumente a temperatura da água da arena experimental a uma taxa de ~1,5 °C a cada 15 min para obter uma rampa de 12 °C a 30 °C durante um período de 2,5 h, ajustando a temperatura do banho de água que recircula.
NOTA: A distribuição geográfica da lagosta americana abrange um gradiente térmico de 25 °C, e os indivíduos podem se adaptar e sobreviver a temperaturas de até 30 °C16. Como tal, 30 °C foi escolhido como o limite superior para esta rampa de temperatura, pois garante que as lagostas experimentem um cenário estressante que não atinja o máximo térmico críticode 13, o que poderia levar à mortalidade. A taxa específica de aquecimento foi selecionada porque se enquadra em uma faixa de taxas de aquecimento implementadas em estudos utilizando outras espécies8,14 bem como pesquisas anteriores sobre a lagosta americana13,27. Antes de implementar este protocolo, é importante determinar a faixa de temperatura apropriada para um determinado experimento e 2) realizar uma rampa de temperatura pré-julgamento com uma arena experimental vazia, pois isso ajudará a determinar o ajuste de temperatura necessário do banho de água para alcançar a rampa desejada. Isso também pode diferir dependendo do volume de água na arena. - Ao longo da rampa de temperatura, registre sempre que ocorrer um ajuste que possa afetar a saída.
- Observe que o equilíbrio no conversor de impedância provavelmente precisará ser ajustado ao longo do experimento, e isso pode causar um pico não intencional na saída.
- À medida que a temperatura na arena experimental começa a atingir níveis fora da faixa térmica preferida do sujeito do teste, contrações musculares involuntárias podem resultar em um "pico" errôneo na saída. Se isso ocorrer, faça um comentário para identificar áreas da saída que devem ser removidas durante o processo de conversão de dados.
- Quando a rampa estiver concluída, retire a lagosta da arena experimental e coloque-a em um banho de recuperação (12 °C) por ~20 min. Se desejar, continue monitorando a freqüência cardíaca da lagosta até que ela retorne aos níveis basais.
- Depois de 20 min, aperte o botão Stop na saída do PowerLab e salve o arquivo. Remova cuidadosamente os eletrodos e corte os laços do cabo com uma tesoura cirúrgica antes de retornar o teste sujeito ao seu tanque de retenção.
NOTA: Em vez de colocar uma lagosta diretamente no banho de recuperação, outra opção é retornar lentamente a arena experimental à sua temperatura inicial. Isso é feito resfriando a arena experimental em ~1,5 °C a cada 15 min ao longo de 2,5 h adicionais.
4. Conversão de dados
- Abrir data pad. Defina a coluna A a tempo clicando duas vezes na Coluna A e clicando em Seleção e Ponto Ativo no lado esquerdo do menu Configuração da Coluna data pad. Selecione Tempo no lado direito do menu e feche a janela clicando em OK.
- Defina a Coluna B à temperatura média clicando duas vezes na Coluna B e selecionando a opção Estatísticas do lado esquerdo do menu de configuração da Coluna B do Data Pad. Selecione Mean do lado direito do menu e canal 2 como a fonte de cálculo na parte inferior da janela do menu. Clique em OK para fechar a janela.
- Convertendo a tensão gravada em batidas por minuto
- Clique duas vezes na Coluna C e selecione Seleção e Ponto Ativo no lado esquerdo do menu. Selecione Duração de seleção do lado direito do menu e clique em OK para fechar a janela.
- Clique duas vezes na Coluna D e selecione Medidas Cíclicas no lado esquerdo do menu. Selecione Contagem de eventos do lado direito do menu e canal 1 como fonte de cálculo. Clique em OK para fechar a janela. Isso contará os picos dos dados para determinar a freqüência cardíaca em uma parte selecionada dos dados.
NOTA: Se necessário, selecione o botão Opções na parte inferior do menu e ajuste as Configurações de detecção para ler com mais precisão os dados. Escaneie o arquivo de dados e determine se as opções de forma "Sine" ou "Spikey" resultam em contagens apenas dos picos principais da saída de batimentos cardíacos. Além disso, ajuste o limiar de ajuste de detecção no lado direito do menu para ignorar o ruído no arquivo de saída. - Clique duas vezes na Coluna E e selecione Medidas Cíclicas no lado esquerdo do menu. Selecione Taxa Cíclica Médiae Canal 1 como fonte de cálculo. Ajuste as configurações de detecção e ajuste de detecção para corresponder às configurações da Coluna D (se manipulada na etapa 4.4.2). Clique em OK para fechar a janela. Isso fornece a estimativa final da freqüência cardíaca (como batidas por minuto) sobre uma parte selecionada dos dados.
- Quando as colunas estiverem configuradas, retorne ao arquivo de dados e destaque as seções desejadas da saída, omitindo áreas de dados errôneos identificadas por comentários na seção 3.6.
- Selecione comandos e adicionar múltiplos ao data pad.
- Selecione Tempo no Find usando menu suspenso e puxe dados a cada 30 s, verificando a caixa Cada e digitando "30" no menu Selecionar.
- Clique na opção Corrente de seleção no menu Passo a passo e clique em Adicionar.
- Retorne à tela do Data Pad e selecione Arquivo e Salvar como para salvar a saída como um arquivo Excel.
NOTA: Aqui, a freqüência cardíaca é relatada (em batimentos por minuto) a cada 30 s, em oposição a cada minuto com base na pesquisa anterior8,27. Isso também ajuda a capturar com mais precisão as alterações nos dados de tensão coletados em tempo real. É possível selecionar dados em intervalos de tempo mais curtos ou mais longos com base na preferência individual.
5. Cálculo da temperatura de ruptura de Arrhenius
- Abra o arquivo de dados no Excel e manipule a saída do software LabChart.
- Converta a temperatura de Celsius para a recíproca de Kelvin usando a seguinte equação: [1000/(temperatura °C + 273,15 K)].
- Obter o registro natural da freqüência cardíaca: In (BPM).
- Gerar um enredo de Arrhenius plotando a freqüência cardíaca em função da temperatura, expressa como Ln(BPM) vs. recíproco (K)13,15.
- Em SigmaPlot, encaixe os dados com uma regressão em pedaços e determine o ponto de intersecção, que é o ABT.
- Copie e cole os dados transformados em uma nova pasta de trabalho. Selecione a opção Estatísticas no menu principal e o Assistente de Regressão na lista suspenso.
- Na janela Equação, selecione em parte no menu Categoria equação e 2 segmentos lineares sob a caixa Nome da equação. Clique em Next.
- Na janela Variáveis, selecione os dados de temperatura transformada para serem a variável t e os dados de freqüência cardíaca transformados para serem a variável y, usando as opções suspensas no menu Colunas Variáveis. Certifique-se de que o XY Pair esteja selecionado no menu Dados De antes de clicar em Next.
- Depois de revisar a janela 'Resultados de ajuste', clique em 'Avançar' e verifique a caixa para Criar relatório na janela Opções de saída numérica. Clique em Next.
- Na janela Opções de gráfico, verifique a opção Criar novo gráfico na seção Gráfico de resultados de ajuste e adicione a equação ao título do gráfico na Seção De Características do Gráfico. Clique em Concluir.
- Na página de saída de Resultados, recupere as equações e os valores dos parâmetros para as duas regiões da regressão em parte, bem como a produção estatística para a regressão (por exemplo, R2, F-statistic e p-value).
- Utilizando os valores e equações dos parâmetros gerados, defina os dois segmentos iguais entre si e resolva a variável "t" para determinar o ABT. Converta este valor de volta para Celsius usando a seguinte equação: °C = (1000/t) - 273,15.
NOTA: O ABT também pode ser calculado no ambiente de computação estatística R utilizando o pacote "segmentado"17 no programa SAS18, ou utilizando a rotina de "regressão linear segmental" no Prisma819.
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Representative Results
Este protocolo descreve o uso de pneumografia de impedância para obter dados em tempo real para freqüência cardíaca (em tensão) e temperatura durante um experimento de rampa de temperatura. Ao perforar esta técnica, a amplitude das tensões e temperaturas registradas variará com base no desenho experimental e espécies focais. No entanto, a saída de tensão exibida em tempo real segue uma distribuição seno genérica quando o protocolo é implementado corretamente (Figura 1A). À medida que a temperatura na arena é aumentada, a distribuição em tempo real das mudanças de tensão para refletir uma freqüência aumentada de picos de tensão (ou seja, batimentos cardíacos; Figura 1B). À medida que a temperatura da arena continua a aumentar para níveis fora da janela de desempenho ideal do sujeito de teste, a distribuição muda para retratar uma frequência reduzida de picos de tensão com uma forma senoida interrompida por picos esporádicos e/ou momentos de "flat-lining"(Figura 1C).
Uma vez que os dados brutos são convertidos usando o componente Data Pad do software LabChart, a distribuição resultante da freqüência cardíaca (em batidas por minuto) ao longo da rampa de temperatura segue uma distribuição parabólica se o experimento for bem sucedido(Figura 2). À medida que a temperatura na arena aumenta, a freqüência cardíaca do sujeito teste também aumenta para atender a demandas energéticas elevadas associadas a temperaturas mais quentes. No entanto, à medida que a temperatura continua a aumentar e o sujeito do teste começa a experimentar estresse térmico moderado a extremo, a freqüência cardíaca começa a diminuir ou se torna errática à medida que o sujeito começa a apresentar tolerância térmica passiva (por exemplo, início da respiração anaeróbica, supressão da taxa metabólica e atividade reduzida5,7). Quando os dados de freqüência cardíaca e temperatura são transformados e uma parcela de Arrhenius é gerada, o ponto em que a freqüência cardíaca começa a diminuir (ABT) pode ser calculado (Figura 3). O enredo de Arrhenius é então ajustado com uma regressão em parte usando software estatístico no qual a intersecção das duas linhas representa o ABT.
Figura 1: Saída representativa do registrador de dados labChart. A mudança de tensão em tempo real entre os eletrodos do sujeito de teste é exibida em vermelho, e a saída concomitante em tempo real da temperatura da arena (°C) é exibida em azul. No início do experimento sob temperaturas mais frias (por exemplo, 13,1 °C), a tensão deve seguir uma distribuição genérica semelhante ao seno(A). À medida que a temperatura é aumentada (por exemplo, 23 °C), a frequência dos picos de tensão deve aumentar, mas a distribuição deve permanecer sine-like(B). Finalmente, como o sujeito do teste é empurrado para fora de sua janela de desempenho térmico ideal (por exemplo, 28,5 °C), os picos de tensão devem tornar-se erráticos à medida que a frequência diminui(C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Distribuição esperada da freqüência cardíaca sobre o curso da rampa de temperatura. Os dados de tensão coletados pelo data logger são convertidos em freqüência cardíaca em batimentos por minuto (BPM) usando o componente Data Pad do software. Quando a rampa é conduzida corretamente, é exibida uma distribuição parabólica da freqüência cardíaca sobre a faixa de temperatura testada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Exemplo de uma trama de Arrhenius. Uma vez que os dados foram convertidos no Data Pad e exportados, eles são transformados para gerar um lote arrhenius. Neste exemplo, os dados se encaixam com uma regressão não linear em SigmaPlot, gerando equações para os segmentos esquerdo e direito (região 1 e região 2, respectivamente) da linha de regressão, bem como métricas de bondade de ajuste. A intersecção das duas linhas de regressão é resolvida como a ABT (estrela vermelha). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este protocolo descreve o uso de pneumografia de impedância para medir alterações na freqüência cardíaca de invertebrados de estágio tardio durante um experimento de rampa de temperatura. O principal benefício dessa técnica em comparação com outras abordagens baseadas em laboratório9,10,11 é que ela é minimamente invasiva e não envolve grande manipulação cirúrgica do exoesqueleto, reduzindo assim o tempo de recuperação necessário antes da experimentação. Além disso, o equipamento é fácil de usar, e os dados resultantes podem ser simplesmente manipulados e interpretados no programa de software sugerido. Embora a lagosta americana seja usada aqui como um tema modelo, esta técnica foi implementada com sucesso em mexilhões azuis (Mytilus spp.14) e pode ser facilmente modificada para uso em outros invertebrados em estágio tardio (ou seja, caranguejos, camarões e outras biválvulas).
Um benefício adicional do protocolo é que ele se concentra no cálculo do ABT como um indicador não letal de limites térmicos. Embora inúmeros estudos apresentem a TomografiaComputador máxima como o ponto final significativo ao determinar o desempenho fisiológico térmico5,8,20,21,22,23, organismos raramente encontram temperaturas nesta faixa no ambiente natural5. Além disso, como atomografia máxima é muitas vezes uma temperatura letal, usar essa métrica como ponto final preferido impede o uso de cobaias em experimentação adicional ou de seguimento pós-estresse térmico23. Ao tentar calcular o ABT usando este protocolo, é crucial aumentar a temperatura na arena experimental a ponto de empurrar o sujeito de teste ao seu limite fisiológico sem induzir a morte. Portanto, recomenda-se determinar os potenciais limites térmicos da espécie focal através de um estudo piloto (quando possível) antes de determinar a amplitude total da rampa de temperatura experimental.
Recomenda-se também que os pesquisadores determinem e observem variações naturais na freqüência cardíaca basal de uma espécie focal quando a temperatura na arena experimental é mantida em um nível constante e não estressante antes do experimento de rampa. Isso é particularmente útil para espécies focais nas quais as informações de freqüência cardíaca em repouso não estão disponíveis na literatura publicada. Também serve como ampla prática de técnicas de implantação de eletrodos. Isso também pode ajudar os pesquisadores a determinar o tempo de aclimatação adequado necessário para garantir que não há picos falsos na freqüência cardíaca devido ao manuseio do estresse no início de um experimento.
Embora o protocolo discuta o uso da pneumografia de impedância apenas no contexto do estresse térmico, ele também pode ser utilizado para explorar os potenciais efeitos interativos de outros estressores na fisiologia térmica. O desempenho do organismo pode ser reduzido na presença de estressores ambientais (ou seja, hipóxia, hipercapnia, poluentes e/ou alterações na salinidade), que também podem comprimir faixas de temperatura ideais para o desempenho7,24,25,26. Como tal, este protocolo pode ser modificado para explorar como a exposição a vários estressores antes da rampa de temperatura pode afetar o desempenho.
Por exemplo, Harrington e Hamlin27 expuseram o h. americanus juvenil às condições atuais ou previstas de pH do século final (8,0 e 7,6, respectivamente) durante 2 meses antes de avaliar o desempenho cardíaco durante uma rampa de temperatura. As lagostas pré-expostas a ambientes mais ácidos apresentaram uma redução significativa na média de ABT em comparação com as mantidas em condições atuais de pH. Isso sugere que um ambiente de pH baixo reduz o desempenho térmico e pode aumentar o risco de danos celulares devido ao estresse térmico a temperaturas mais baixas27. Esforços futuros poderiam expandir o método aqui apresentado para incluir a pré-exposição a qualquer combinação de estressores ambientais antes de seguir este protocolo. Além disso, este protocolo pode ser modificado para medir alterações no desempenho cardíaco durante a exposição a estressores bióticos, bem como como os limites térmicos podem mudar de acordo com ontogeny4,5.
Uma grande limitação deste protocolo é que o equipamento descrito é restrito para uso em ambiente laboratorial, limitando potencialmente sua aplicabilidade para experimentos baseados em campo que requerem equipamentos mais especializados8. Esta técnica também requer a contenção de sujeitos de teste altamente motile (por exemplo, lagostas e caranguejos) para reduzir a produção de falsos pontos de dados resultantes de movimentos musculares não cardíacos. Embora isso possa restringir comportamentos naturais durante uma rampa de temperatura, o impacto das restrições são consistentes em todos os sujeitos do teste. Mais importante, há o potencial de danos teciduais ou morte em sujeitos de teste se a perfuração agressiva ou descuidada durante a implantação do eletrodo for implementada. Isso contrasta fortemente com a fotoplethysmografia infravermelha, uma técnica verdadeiramente não invasiva que utiliza um transdutor infravermelho externo para passar luz através do pericárdio e gravar a função cardíaca convertendo energia de luz refletida em tensão8,28.
Embora a fotoplethysmografia infravermelha reduz o risco de manuseio do estresse em comparação com a pneumografia de impedância, implantar corretamente eletrodos usando o método descrito resulta em trauma mínimo, permite um tempo de aclimatação rápido, e leva a uma rápida recuperação sem induzir mortalidade em sujeitos de teste após o experimento de rampa27. Como não há diferença significativa na produção cardíaca registrada pelos dois métodos28,conclui-se que a pneumografia de impedância é uma técnica confiável e minimamente invasiva para avaliar o desempenho cardíaco. Finalmente, os inúmeros benefícios e flexibilidade do protocolo têm o potencial de elucidar como vários fatores ambientais interagem com a temperatura para impactar o desempenho fisiológico em crustáceos em estágio tardio.
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Disclosures
Os autores não têm nada para revelar.
Acknowledgments
Os autores agradecem a Paul Rawson pela assistência laboratorial e ao prêmio IIA-1355457 da Maine EPSCoR na Universidade do Maine por fundos para a compra de equipamentos. Este projeto foi apoiado pelo Instituto Nacional de Alimentos e Agricultura do USDA, o número do projeto Hatch MEO-21811 através da Estação de Experimentos Agrícolas e Florestais do Maine, bem como pelo Serviço Nacional de Pesca Marinha da NOAA Saltonstall Kennedy Grant #18GAR039-136. Os autores também agradecem a três revisores anônimos por seus comentários sobre uma versão anterior deste manuscrito. Maine Agricultural and Forest Experiment Station Publicação número 3733.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.6 mm (1/16 in) drill bit | Milwaukee Tool at Home Depot | 1001294900 | This is for a 1.6 mm (1/16 in) diameter drill bit. This item can be found at most home-improvement stores. |
| 38 AWG Copper Magnet Wire | TEMCo | MW0093 | This wire is used to make the wire electrode leads that are implanted into the test subjects. This listing is for a 4 oz coil of 38-gauge magnetic wire. TemCo also has 36-gauge magnetic wire that is also suitable for use in constructing wire electrodes. |
| Cyanoacrylate glue | Loctite | 852882 | This item includes a brush tip, which makes it easier to control the amount of glue used to secure electrodes to the carapace. |
| Ethanol, 70% Solution, Molecular Biology Grade | Fisher BioReagents | BP82931GAL | This reagent is used in combination with the sterile cotton balls to disinfect the carapace prior to electrode implantation. |
| Excel | Microsoft | N/A | This program is used in the protocol for organizing, manipulating, and analyzing data. It is compatible with both PC and Mac operating systems. |
| Fisherbrand 8-Piece Dissection Kit | Fisher Scientific | 08-855 | This kit includes the forceps, scissors, dissecting knife (and blades), and dissecting needle needed to accomplish the electrode implantation steps in the protocol. |
| Fisherbrand Isotemp Refrigerated/Heated Bath Circulators: 5.4-6.5L, 115V/60Hz | Fisher Scientific | 13-874-180 | This is a complete system that consists of an immersion circulator and a bath. It can be used as a temperature controlled bath or to circulate fluid externally to an application. Temperature range of this water bath is -20 to +100 °C, and the unit heats/cools rapidly and is easy to drain upon conclusion of use. |
| Fisherbrand Sterile Cotton Balls | Fisher Scientific | 22-456-885 | These swabs should be soaked in 70% ethanol before being used to disinfect the carapace prior to electrode implantation. |
| Fork Terminal, Red Vinyl, Butted Seam, 22 to 16 AWG, 100 PK | Grainger | 5WHE6 | Terminals are soldered to the magnetic wire to construct the wire electrodes. These can be purchased from a variety of home-improvement vendors. |
| Impedance converter | UFI | Model 2991 | Measures impedance changes correlated with very small voltage changes, ranging from 0.2 ohm to over 5 ohms. This model can convert impedance changes that stem from resistance, capacitance, or inductance variations, as well as a combination of all three. |
| LabChart software | ADInstruments | N/A | Purchase of the PowerLab datalogger includes the LabChart software, but a license for the software can also be directly downloaded online. LabChart allows the user to record data, open and read LabChart files, analyze data, as well as save and export files. There is a free version of the software, LabChart Reader, but users can only open and read LabChart files and analyze them (i.e., it cannot be used to record, save, or export data files). One also has the option of selecting LabChart Pro, which includes LabChart teaching modules that can be used for educational purposes. |
| LED Soldering Iron | Grainger | 28EA35 | This is a generic soldering iron that can be used to solder the magnetic wire to the fork terminals to create the wire electrodes. |
| PowerLab datalogger | ADInstruments | ML826 | There are a variety of models of the PowerLab. This catalog number is for the 2/26 model that is a 2 channel, 16 bit resolution recorder with two analog input channels, independently selectable input sensitivities, two independent analog outputs for stimulation or pulse generation and a trigger input. The PowerLab features a wide range of low-pass filters, AC or DC coupling and adaptive mains filter. This unit has a USB interface for connection to Windows or Mac OS computers and a sampling rate of 100,000 samples/s per channel. |
| Prism8 | GraphPad | N/A | This program provides an additional option for calculating the Arrhenius Break Temperature through its “Segmental linear regression” data analysis option. This program does not require any programming and is compatible with both Mac and Windows operating systems. |
| R | R Project | N/A | This is free software for statistical computing that is compatible with UNIX platforms, as well as Windows and Mac operating systems. This program can also be used to calculate the Arrhenius Break Temperature using the “segmented” package. There are a number of tutorials and user guides available online through the r-project.org website. |
| Rosin Core Solder | Grainger | 331856 | This product has a diameter of 0.031 in (0.76 mm) and is ideal for use in soldering speaker wire (similar gauge as magnetic wire used for electrodes). |
| SAS | SAS Institute | N/A | This program provides an additional option for calculating the Arrhenius Break Temperature. However, it does require programming and is not compatible with Mac operating systems. |
| SigmaPlot | Systat Software, Inc. | N/A | This is the authors’ preferred program for statistical determination of the Arrhenius Break Temperature. The “Regression Wizard” is easy to use and does not require any programming. One can obtain a free 30-day trial license before purchase. However, it is compatible only with PC computers. |
| T-type Pod | ADInstruments | ML312 | Suitable for measurement of temperatures from 0-50 °C using T-type thermocouples. |
| T-type Thermocouple Probe | ADInstruments | MLT1401 | Compatible with the T-type Pod for connection. Measures temperature up to 150 °C, and is suitable for immersion in various solutions, semi-solids, and tissue (includes a needle for implantation). This product is a 0.6 mm diameter isolated probe that is sheathed in chemical-resistant Teflon and a lead length of 1.0 m. |
| UV Cable Tie, Black | Home Depot | 295813 | This is for a 100-pack of 8-inch (20.32 cm), black cable ties. However, based on the size of test subjects, smaller or larger cable ties may be needed. This item, and others like it, can be purchased at any home-improvement store. |
References
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