Summary
In dit protocol werden varkensspecifieke primers ontworpen, werden plasmidenhoudende varkensspecifieke DNA-fragmenten geconstrueerd en werden standaardkrommen voor kwantificering vastgesteld. Met behulp van soortspecifieke primers werd cpsDNA door qPCR gekwantificeerd in varkens-tot-muisceltransplantatiemodellen en varkens-tot-aap slagaderpatch transplantatiemodellen.
Abstract
Xenotransplantatie is een haalbare methode om orgaanfalen te behandelen. Echter, hoe effectief te controleren van de immuunafstoting van xenotransplantatie is een probleem voor artsen en onderzoekers. Dit manuscript beschrijft een eenvoudige en effectieve methode om immuunafstoting te controleren in celtransplantatiemodellen van varkens tot muis en patchtransplantatiemodellen van varkens tot aap. Circulerend DNA is een potentieel niet-invasieve biomarker voor orgaanschade. In deze studie werd circulerend varkensspecifiek DNA (cpsDNA) gemonitord tijdens xenograft afwijzing door kwantitatieve real-time PCR (qPCR). In dit protocol werden varkensspecifieke primers ontworpen, werden plasmidenhoudende varkensspecifieke DNA-fragmenten geconstrueerd en werden standaardkrommen voor kwantificering vastgesteld. Soortenspecifieke primers werden vervolgens gebruikt om cpsDNA te kwantificeren door qPCR in varkens-tot-muis celtransplantatiemodellen en pig-to-monkey slagaderpatch transplantatiemodellen. De waarde van deze methode suggereert dat het kan worden gebruikt als een eenvoudige, handige, lage kosten, en minder invasieve methode om de immuunafstoting van xenotransplantatie te controleren.
Introduction
Orgaanfalen is een van de belangrijkste doodsoorzaken1. Transplantatie van cellen, weefsels en organen is een effectieve manier om orgaanfalen te behandelen2. Niettemin beperkt het tekort aan donororganen de klinische toepassing van deze methode3,4. Studies hebben aangetoond dat varkens kunnen worden gebruikt als een potentiële bron van menselijke organen voor klinische transplantatie5,6. Echter, kruissoorten orgaantransplantatie gezichten gevaarlijke immuunafstoting. Daarom is het cruciaal om de immuunafstoting van xenotransplantatie te controleren. Momenteel is de klinische monitoring van immuunafstoting voornamelijk afhankelijk van de tekenen en symptomen van de patiënt, evenals laboratoriumtests (bijvoorbeeld biopsie, immunobiochemische analyse en echografie)7,8,9. Deze bewakingsmethoden hebben echter veel nadelen. De tekenen en symptomen van immuunafstoting bij patiënten verschijnen meestal laat10, wat niet bevorderlijk is voor vroegtijdige opsporing en vroegtijdige interventie; biopsie heeft het nadeel invasieve11, wat niet gemakkelijk is voor patiënten te accepteren; immunobiochemische analyse mist gevoeligheid of specificiteit, en echografie is hulp en duur. Daarom is het dringend noodzakelijk om een effectieve en handige methode te vinden om de immuunafstoting te controleren.
Circulerend DNA is een extracellulair type DNA gevonden in bloed. Mandel en Metais12 meldden voor het eerst de aanwezigheid van circulerend DNA in perifeer bloed in 1948. Onder normale fysiologische omstandigheden is circulerend DNA in het bloed van gezonde mensen relatief laag bij aanvang. Echter, in sommige pathologieën, zoals tumoren, hartinfarct, auto-immuunziekten, en transplantatie afwijzing, het niveau van circulerende DNA in het bloed kan aanzienlijk worden verhoogd13,14 als gevolg van de massale afgifte van circulerend DNA veroorzaakt door apoptose en necrose. De oorsprong van circulerend DNA wordt geassocieerd met apoptose en necrose15, die kenmerkend zijn voor xenograftafstotie16.
Circulerend DNA is bewezen een minimaal invasieve biomarker te zijn voor het opsporen van kanker17,18,19. Hoge door-put sequencing van donor-afgeleid circulerend DNA is betrouwbaar voor de opsporing van afstoting na orgaantransplantatie20,21. Deze methode vereist echter een hoge concentratie en kwaliteit van geëxtraheerd DNA. De DNA-eisen in aanvulling op de hoge kosten en tijd-consumptie maken deze methode niet in aanmerking voor routinematig klinisch gebruik. Donor-afgeleid circulerend DNA kan nauwkeurig worden gekwantificeerd door kwantitatieve real-time PCR (qPCR), die zowel specifiek als gevoelig is. Daarom is het kwantificeren van varkens die DNA doorgeven door qPCR een haalbare methode om de immuunafstoting van xenotransplantatie te controleren. Dit is minder invasief, zeer gevoelig en specifiek, lage kosten en tijdbesparend. Varkens en mensen zijn genetisch gescheiden met heel verschillende genomische sequenties(figuur 1). Daarom kan circulerend varkens-DNA worden vrijgegeven in het bloed van de ontvanger na de xenotransplantatie als gevolg van xeno-afwijzing. CpsDNA kan nauwkeurig worden gekwantificeerd door qPCR met soortspecifieke primers in het bloed van de ontvanger. Eerder hebben we de beweegredenen en haalbaarheid van cpsDNA als biomarker voor xenotransplantatie22,23aangetoond . Hier onthullen we meer experimentele tips en details. Het experiment bestaat uit de volgende stappen. Ten eerste werden varkensspecifieke primers ontworpen en werd genomisch DNA geïsoleerd, die werden gebruikt om de specificiteit van de primers te verifiëren door reguliere PCR. Ten tweede, de bouw van de standaardcurve van cpsDNA en het isoleren van cpsDNA uit het monsterbloed. Ten slotte werd het circulerende varkensspecifieke DNA gekwantificeerd met behulp van qPCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de relevante richtlijnen en voorschriften van de Institutional Review Board van Shenzhen Second People's Hospital, First Affiliated Hospital van de Universiteit van Shenzhen.
1. Ontwerp varkensspecifieke primers
- Uitvoeren van het hele genoom BLAST analyse om varkens specifieke genen die anders waren dan die van mensen, apen of muis te identificeren, met behulp van de software NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov).
- Ontwerp primers volgens 19 varkensspecifieke genen (Tabel 1) met behulp van de software van Primer 5.
2. Isoleren genomisch DNA
OPMERKING: Het genomische DNA (inclusief bloed van varkens, apen, vrijwillige mensen, apen met varkenstransplantaties en muizen met varkenscellen) werd geëxtraheerd met behulp van een commerciële genomische DNA-extractiekit(Tabel van materialen).
- Plaats respectievelijk 500 μL van het hele bloed van bovenstaande monsters in verschillende microcentrifugebuizen.
- Voeg 20 μL protease K en 500 μL lysebuffer toe aan de bovenstaande microcentrifugebuizen en schud en meng grondig.
- Doe deze microcentrifugebuizen 10 minuten in een waterbad op 56 °C en schud 2-3 keer tijdens dit proces totdat de oplossing duidelijk wordt.
- Centrifuge kort om de vloeibare kralen te verwijderen uit de binnenwand van de buis covers. Voeg 500 μL watervrije ethylalcohol toe en schud goed.
- Breng het mengsel in de adsorptiekolom, centrifuge bij 12.000 rpm (~ 13.400 x g)gedurende 2 min.
- Voeg 800 μL spoeloplossing toe aan elke adsorptiekolom; centrifuge gedurende 1 min bij 12.000 tpm ( ~ 13.400 x g). Plaats de kolommen op kamertemperatuur gedurende een paar minuten om de resterende spoeloplossing te drogen.
LET OP: De spoeloplossing wordt geleverd door de fabrikant. - Breng de adsorptiekolommen over naar een andere schone centrifugaalbuis, voeg 50 μL elutiebuffer toe aan het midden van de adsorptiefilms en plaats ze 2-5 min op kamertemperatuur. Centrifuge 6.200 x g voor 1 min 12.000 tpm (~13.400 x g).
OPMERKING: De elutiebuffer wordt geleverd door de fabrikant, maar de TE-buffer, die 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) en 0,1 mM EDTA bevat, kan ook het DNA ontwijken. - Bewaar de DNA-oplossing op -20 °C.
3.
OPMERKING: De soortenspecificiteiten van de bovenstaande 19 primers werden bevestigd door PCR, dat werd uitgevoerd met polymerase (Tabel van materialen) en primers gepresenteerd in tabel 1.
- Bereid de voorgemengde oplossing van 12,5 μL 2x PCR premix (Tabel van materialen),1 μL van 5' primer (10 μM), 1 μL van 3' primer (10 μM), en 8,5 μL van ddH2O. Bereid het mengsel met 2 extra monsters voor.
- Splits 23 μL voor gemengde oplossing in 0,2 mL microcentrifugebuizen, voeg 2 μL genomisch DNA toe en doop de buizen voorzichtig af. Meng en centrifuge vervolgens iets.
- Plaats de 0,2 mL microcentrifugebuizen in de PCR-cycler en voer het volgende uit: Denaturatie: 95 °C voor 5 s; Annealing: 60 °C voor 30 s; 72 °C voor 30 s.
- Voer agarose elektroforese als volgt uit:
- Weeg 1,2 g agarose in een kolf van 100 mL 1x TAE en kook deze gedurende 5 minuten in de magnetron. Voeg 5 μL nucleïnezuurverf (Tabel van materialen) in de kolf toe nadat deze is afgekoeld tot ongeveer 70 °C. Giet het in de plaat langs de rand langzaam, en plaats het op kamertemperatuur totdat het stolt in een gel.
- Voeg 5 μL monster en 2-Log DNA Ladder (0,1–10,0 kb) of Marker I (0,1-0,6 kb), die 1 μL van 6x DNA laadbuffer bevatten, toe in de agarose gel. Dan elektroforese op 120 mA totdat de banden zijn gescheiden.
- Visualiseer de agar gel met DNA-fragmenten met een ultraviolette imager.
- Voer agarose elektroforese uit om versterkte DNA-fragmenten uit de bovenstaande monsters te isoleren, die in een ultraviolette imager werden gevisualiseerd. Met behulp van de PCR werden de primers die specifiek zijn voor versterkt varkens genomic DNA voor het eerst geïdentificeerd (figuur 2A). Verder werden bepaalde soortenspecifieke kenmerken van deze primers bevestigd die specifiek varkens-DNA versterkten in het cohort van aap/menselijk genomic of in het cohort van muisgenomic DNA (Figuur 2B). Ten slotte werden twee soort-specificiteiten primers verder bewezen specifiek versterken varken DNA in de pig-to-monkey slagader patch en / of pig-to-mouse celtransplantatie modellen, respectievelijk (Figuur 2C)
4. Standaardcurve van cpsDNA
- Transformeer de pMD19-T plasmid met een fragment van varkens-DNA in DH5a, die specifiek kan worden versterkt door primer #4 of primer #11 (Tabel 1). Scherm voor positieve bacteriën met behulp van 50 μg/mL ampicilline.
Primer #4 in de mens / aap cohort (vooruit: 5′-TTCAATCCCA CTTCTTCCACCTAA-3′, omgekeerd: 5′-CTTCATTCTCATAATAAC CCTGT-3′)
Primer #11 voor muis model (vooruit: 5′-TGCCGTGGTTTCC GTTGCTTG-3′, achteruit: 5′-TCACATTTGATGGTCGTGTCTTGTCGTC T-3′)
LET OP: Details van alle primers zijn te vinden in tabel 1. - Oogst de bovenstaande plasmiden volgens het onderstaande protocol.
- Isoleer een enkele kolonie van een vers gestreepte selectieve plaat en inenting een cultuur van 1- 5 mL LB medium met de juiste selectieve antibioticum. Incubeer gedurende 12-16 uur bij 37 °C met krachtig schudden (300 rpm).
- Centrifuge op 10.000 x g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur. Decanteren of aanzuigen en gooi de cultuurmedia weg.
- Voeg 250 μL Solution I/RNase A. Vortex of pipet op en neer toe om goed te mengen. Volledige resuspensie van celpellet is van vitaal belang voor het verkrijgen van goede opbrengsten.
LET OP: RNase A moet worden toegevoegd aan Solution I voor gebruik. - Breng suspensie over in een nieuwe 1,5 mL microcentrifugebuis. Voeg 250 μL oplossing II toe. Draai de buis meerdere keren om en draai voorzichtig om een helder lysaat te verkrijgen. Een 2-3 minuten incubatie kan nodig zijn.
OPMERKING: Vermijd krachtig mengen omdat dit chromosomale DNA en lagere plasmidezuiverheid zal afschuinen. Laat de lysereactie niet langer dan 5 minuten doorgaan. - Voeg 350 μL oplossing III toe. Onmiddellijk meerdere keren omkeren tot een flocculent wit neerslag vormen.
OPMERKING: Het is van vitaal belang dat de oplossing grondig en onmiddellijk na de toevoeging van oplossing III wordt gemengd om gelokaliseerde neerslag te voorkomen. - Centrifuge 10 minuten bij maximale snelheid (≥13.000 x g). Er zal een compacte witte pellet ontstaan. Ga onmiddellijk naar de volgende stap.
- Steek een DNA minikolom in een 2 mL-opvangbuis.
- Breng de gewiste supernatant van 4.2.7 door het zorgvuldig te aspirating in de DNA minikolom. Wees voorzichtig niet te verstoren de pellet en dat er geen cellulaire puin wordt overgebracht naar de DNA mini-kolom.
- Centrifuge op maximale snelheid gedurende 1 minuut. Gooi het filtraat weg en gebruik de opvangbuis opnieuw.
- Voeg 500 μL HBC Buffer toe. Centrifuge op maximale snelheid gedurende 1 minuut. Gooi de filtraat weg en gebruik de opvangbuis opnieuw.
LET OP: HBC Buffer moet worden verdund met 100% isopropanol voor gebruik. - Voeg 700 μL DNA Wash Buffer toe. Centrifuge op maximale snelheid gedurende 1 minuut. Gooi het filtraat weg en gebruik de opvangbuis opnieuw.
LET OP: DNA Wash Buffer moet voor gebruik met 100% ethanol worden verdund.- Optioneel: Herhaal dit voor een tweede DNA-wasbufferwasstap.
- Centrifuge de lege DNA minikolom gedurende 2 minuten op maximale snelheid om de kolommatrix te drogen.
LET OP: Het is belangrijk om de DNA mini kolom matrix te drogen voor elutie. Rest ethanol kan interfereren met downstream toepassingen. - Breng de DNA minikolom over naar een schone 1,5 mL microcentrifugebuis.
- Voeg 30-100 μL Elution Buffer of steriel gedeïmiseerd water direct toe aan het midden van het kolommembraan.
LET OP: De efficiëntie van het eluting DNA uit de DNA Mini kolom is afhankelijk van pH. Bij gebruik van steriel gedeïioneerd water, zorg ervoor dat de pH is ongeveer 8,5. - Laat 1 minuut op kamertemperatuur zitten.
- Centrifuge op maximale snelheid gedurende 1 minuut.
LET OP: Dit vertegenwoordigt ongeveer 70% van gebonden DNA. Een optionele tweede elutie levert eventueel rest-DNA op, zij het bij een lagere concentratie.
- Controleer de bovenstaande plasmiden met behulp van dubbele beperking enzymvertering met behulp van EcoR I (15 U/μL) en Bam H1(15 U/μL)22.
- Voer de make-up stappen op het ijs. Bereid het reactiesysteem voor van 1 μL EcoR I (15 U), 1 μL van Bam H1 (15 U), 2 μL van 10x Buffer, 1 μg plasmide; voeg ddH2O tot 20 μL totaal volume toe, meng goed. Incubeer in een waterbad bij 37 °C gedurende 2 uur.
- Scheid de verteerde producten met 1% agarose, gevolgd door elektroforese en bloot te stellen aan UV-licht als voorheen.
- Verdun de geconcentreerde plasmid in 2 x 1011 exemplaren/mL voor de startstandaardoplossing met ddH2O. Neem de plasmide (P2) met een fragment van varkens-DNA bijvoorbeeld van kopieën berekenen:
- Bereken het aantal plasmiden in 1 mL van de startstandaardoplossing: N = (2 x10 11)/ (6,02 x 1023) mol.
- Bereken het molecuulgewicht van P2: M = 2810 bp x 650 D/bp = 2810 x 650 D (g/mol).
- Bereken de massa van P2: m=N*M= (2 x10 11)/ (6,02 x 1023) mol x 2810 x 650 g/mol.
- Bereken het volume van P2: V = m/C = [(2 x 1011)/(6.02 x 1023) x 2810 x 650] g/C. (C is de concentratie van P2 (ng/μL), die wordt gemeten met een spectrofotometer).
- Verdun de standaardoplossing serieel 10-voudig in 2 x10 10 exemplaren/mL, 2 x 109 exemplaren/mL, 2 x 108 exemplaren/mL, 2 x 107 exemplaren/mL..., en 2 x 100 copies/mL voor standaard gebruik van oplossing ddH2O. Vortex grondig tijdens verdunning.
- Stel de standaardcurve vast.
- Voorbereiden reactiesysteem van qPCR (alle stappen zijn beschermd tegen licht): Voeg de pre-gemengde oplossing die 325 μL qPCR Mix (Tabel van materialen),13 μL van 5 ' primer bevat, 13 μL van 3' primer, en 169 μL ddH2O in een 1,5 mL microcentrifuge buis, die vervolgens grondig werd gemengd en licht centrifuged.
- Splits de 40 μL boven voorgemixte oplossing in een 8-buisstrip en voeg 10 μL standaard-DNA van verschillende concentraties toe. Dop voorzichtig, meng en centrifuge lichtjes.
- Plaats de 8-buisstrip in de qPCR-machine volgens de procedure in figuur 3.
5. Isoleren circulerend DNA uit de bloedmonsters
- Met behulp van EDTA buizen, het verzamelen van bloedmonsters op verschillende tijdstippen in de pig-to-monkey slagader patch modellen en de pig-to-mouse cel transplantatie modellen.
- Verzamel bloedmonsters van ongeveer 400 μL (van de varkens-tot-aap slagader patch modellen) of 100 μL (van de varkens-tot-muis celtransplantatie modellen) en overdracht naar 1,5 mL microcentrifuge buizen. Verwijder de bloedcellen uit de bloedmonsters door middel van centrifugatie bij lage temperatuur en hoge snelheid (3.000 x g, 4 °C, 5 min).
- Breng de supernatant over op een nieuwe 1,5 mL microcentrifugebuis en verwijder het celpuin door centrifugatie op 16.000 x g gedurende 10 minuten.
- Breng de supernatant over op een nieuwe 1,5 mL microcentrifugebuis. Haal het circulerende DNA uit de bovenstaande supernatant met behulp van een commercieel serum/circulerende DNA-extractiekit volgens protocol 2 van het protocol van de isolerende genomische DNA-fabrikanten.
- Condenseer het volume circulerend DNA tot 40 μL en bewaar bij -20 °C.
6. Kwantificering van circulerend varkensspecifiek DNA
- Bereid de pre-mixed oplossing van 25 μL qPCR Mix (Tabel van materialen),1 μL van 5' primer, 1 μL van 3' primer, 10 μL monster DNA, en 13 μL van ddH2O. Bereid de mix met 2 extra monsters.
- Splits de 40 μL pre-gemengde oplossing in een 8-buisstrip en voeg 10 μL monster-DNA toe, gevolgd door zorgvuldige aftopping. Bereid twee reacties meer voor dan nodig is.
- Plaats de 8-buis strip in de qPCR machine volgens dezelfde procedure als de standaard curve. Het is beter om eerst een standaard uit te voeren om ervoor te zorgen dat de reactie van cruciaal belang is voor kwantificering op voorhand. De procedure van het reactiesysteem van qPCR werd weergegeven in figuur 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In dit protocol werden varkensspecifieke primers ontworpen, werden plasmidenhoudende varkensspecifieke DNA-fragmenten geconstrueerd en werden standaardkrommen voor kwantificering vastgesteld (figuur 4). De specifieke kenmerken van de soorten van de 19 primers werden bevestigd door PCR. Soortenspecifieke primers (primer #4 en primer #11) werden vervolgens gebruikt om cpsDNA te kwantificeren door qPCR in varkens-tot-muis celtransplantatiemodellen en pig-to-monkey slagader patch transplantatie modellen.
Agarose elektroforese werd gebruikt om versterkte DNA-fragmenten te isoleren uit de bovenstaande monsters, die vervolgens worden gevisualiseerd in een ultraviolette imager. Met behulp van PCR werden de primers die specifiek zijn voor versterkt varkens genomic DNA voor het eerst geïdentificeerd (Figuur 2A). Verder werden bepaalde soortenspecifieke kenmerken van deze primers bevestigd die specifiek varkens-DNA versterkten in het cohort van aap/menselijk genomic of in het cohort van muisgenomic DNA (Figuur 2B). Ten slotte werden twee soort-specificiteiten primers verder bewezen specifiek versterken varken DNA in de pig-to-monkey slagader patch en / of pig-to-mouse celtransplantatie modellen, respectievelijk (Figuur 2C).
Figuur 1: Genidentiteit tussen varken(sus scrofa, ssc) en mens(homo sapiens, heeft) of aap (Macaca fascicularis, mfa). De gensequenties van drie verschillende soorten werden vergeleken door BLAST analyse. BLAST sequentie analyse gebruikt genomische annotatie informatie (de mRNA sequentie) van de drie soorten gedownload van NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov). De mRNA sequenties van menselijke, aap- en varkensgenen waren respectievelijk 139116, 65927 en 71498,respectievelijk 22. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Reguliere PCR valideert de specificiteit van varkensspecifieke primers. (A De varkens genomic DNA fragmenten werden versterkt door primers 1-19. (B) Het genomische DNA-fragment van mens/aap/muizen kon niet worden versterkt door sommige primers (primer #4 en #11). De sterren (*) geven geen versterkingen aan in menselijk/aap genomisch DNA. Het pondteken (#) wijst op geen versterking in muis genomic DNA. (C) De twee soortspecifieke primers (primer #4 en #11) bleken verder specifiek het varkens-DNA in de varkens-tot-aap-slagaderpatch en/of celtransplantatiemodellen van pig-to-mouse te versterken, respectievelijk22. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: De procedure voor de qPCR-reactie22. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Vaststelling van de standaardcurve voor absolute kwantificering. De versterkingspercelen, de smeltcurvepercelen en de standaardcurveweergaven van (A) primer #4 en (B)primer #11 van de qPCR-machine (zie Tabel van materialen)worden tentoongesteld. Een goede standaard (R-waarde dicht bij 1, versterking efficiëntie is binnen 100% ±5%) kan worden gebruikt voor maximaal een half jaar22. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het kwantificeren van varkens dat circulerend DNA circuleert, is een haalbare aanpak om de immuunafstoting van xenotransplantatie te monitoren. Gadi et al.24 vonden dat het circulatie-DNA(ddcfDNA) van donoren in het bloed van patiënten met acute afstoting aanzienlijk hoger was dan dat van patiënten zonder afstoting. Deze studies suggereren dat ddcfDNA kan een gemeenschappelijke biomarker voor het toezicht op orgaantransplantatie schade. In de afgelopen jaren is qPCR steeds meer toegepast op de analyse van nucleïnezuren vanwege de eenvoudige werking, hoge mate van automatisering, hoge gevoeligheid, goede specificiteit en lage kosten.
In deze studie werden varkensspecifieke primers ontworpen op basis van de resultaten van de analyse van de bioinformatica. Hun specificiteit werd geverifieerd door reguliere PCR. De cpsDNA van de bloedmonsters van de pig-to-monkey slagader patch modellen en de pig-to-mouse celtransplantatie modellen kunnen nauwkeurig worden gekwantificeerd door qPCR met soort-specifieke primers. De belangrijkste voordelen van de aanpak zijn als volgt. Ten eerste, op basis van de zeer specifieke primers, is deze methode om DNA te kwantificeren zeer gevoelig en specifiek. Bovendien is het protocol van de aanpak zeer eenvoudig uit te voeren, dat bestond uit het ontwerpen van specifieke primers, isolatie van DNA en qPCR-analyse in één werkdag, die tijdbesparend is. Het is een niet-invasieve methode die vertrekt van een klein volume serum of plasmamateriaal. Ondertussen hebben we aangetoond dat deze methode zeer reproduceerbaar is22. In tegenstelling tot hoge doorvoer sequencing en vlucht massaspectrometrie, deze methode is lage kosten.
Monitoring van immuunafstoting door kwantificering van circulerend varkensspecifiek DNA in het bloed van varkens-naar-aap slagader patch modellen en pig-to-mouse celtransplantatie modellen met behulp van qPCR heeft de basis gelegd voor het basisonderzoek en de klinische toepassing van varkens-menselijke xenotransplantatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs melden geen belangenconflicten.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies van het National Key R&D Program of China (2017YFC1103704), Shenzhen Foundation of Science and Technology (JCYJ20170817172116272), Special Funds for the Construction of High Level Hospitals in Guangd provincie (2019), Sanming Project of Medicine in Shenzhen (SZSM201412020), Fonds voor high level medical discipline bouw van Shenzhen (2016031638), Shenzhen Foundation of Health and Family Planning Commission (SZXJ2017021 , SZXJ2018059).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Biowest, Barcelona, Spain | 111860 | |
| BamHI-HF | New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA | R3136S | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Axygen Biosciences, Union City, CA, USA | MCT-150-C | |
| 0.2 mL PCR tube | Axygen Biosciences, Union City, CA, USA | PCR-02-C | |
| C57BL/6 Mice | Medical Animal Center of Guangdong Province, China | 8~10 weeks | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Walt- ham, MA, USA | Micro 21R | |
| 2-Log DNA Ladder | New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA | N3200S | 0.1–10.0 kb |
| Marker I | Tiangen, Beijing, China | MD101-02 | 0.1–0.6 kb |
| DNA Mini Column(HiBind DNA Mini Columns) | Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA | DNACOL-01 | |
| DNA loading buffer | Solarbio, Beijing, China | D1010 | |
| E.Z.N.A.Plasmid DNA Mini Kit I and E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit II | Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA | D6942 | |
| D6943 | |||
| EcoR I | Takara Bio, Shiga, Japan | 1040S | |
| Female Bama mini pigs | BGI Ark Biotechnology, Shenzhen, China | 2~4 months | |
| Genomic DNA Extraction Kit ? | Tiangen, Beijing, China | DP304-02 | |
| SYBR Green Realtime PCR Master Mix | Toyobo, Osaka, Japan | QPK-201 | |
| Gel Doc XR | Bio-Rad, Hercules, USA | ||
| Male cynomolgus monkeys | Guangdong Landau Biotechnology, Guangzhou, China | 8 years | |
| Nucleic acid dye(Gelred) | Biotium, Fremont, USA | 42003 | |
| polymerase(Premix Taq) | Takara Bio, Shiga, Japan | RR901A | |
| pMD19-T plasmid | Takara Bio, Shiga, Japan | D102A | |
| qPCR machine | Applied Biosystems QSDx, Waltham, USA | ||
| Serum/Circulating DNA Extraction Kit | Tiangen, Beijing, China | DP339 | |
| TAE | sangon Biotech, Shanghai, China | B548101 |
References
- Buchman, T.
- Smith, M., Dominguez-Gil, B., Greer, D., Manara, A., Souter, M. Organ donation after circulatory death: current status and future potential. Intensive care medicine. 45 (3), 310-321 (2019).
- Lopez-Fraga, M., et al. A needed Convention against trafficking in human organs. Lancet. 383 (9936), 2187-2189 (2014).
- Sykes, M., Sachs, D. Transplanting organs from pigs to humans. Science immunology. 4 (41), 6298 (2019).
- Reardon, S. New life for pig-to-human transplants. Nature. 527 (7577), 152-154 (2015).
- Song, Z., Cooper, D. K., Mou, Z. Expression and Regulation Profile of Mature MicroRNA in the Pig: Relevance to Xenotransplantation. BioMed Research International. 2018, 2983908 (2018).
- Chung, H., et al. CD4(+) /CD8(+) T-cell ratio correlates with the graft fate in pig-to-non-human primate islet xenotransplantation. Xenotransplantation. 27 (2), 12562 (2020).
- Yoon, C. H., Choi, S. H., Lee, H. J., Kang, H. J., Kim, M. K. Predictive biomarkers for graft rejection in pig-to-non-human primate corneal xenotransplantation. Xenotransplantation. 26 (4), 12515 (2019).
- Agbor-Enoh, S., et al. Circulating cell-free DNA as a biomarker of tissue injury: Assessment in a cardiac xenotransplantation model. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 37 (8), 967-975 (2018).
- Vito Dabbs, D., et al. Are symptom reports useful for differentiating between acute rejection and pulmonary infection after lung transplantation. Heart & Lung. 33 (6), 372-380 (2004).
- Miller, C. A., et al. Non-invasive approaches for the diagnosis of acute cardiac allograft rejection. Heart. 99 (7), 445-453 (2013).
- Mandel, P., Metais, P. Les acides nucléiques du plasma sanguin chez l'homme. Comptes Rendus des Seances de l Academie des Sciences. 142 (3-4), 241-243 (1948).
- Okkonen, M., et al. Plasma cell-free DNA in patients needing mechanical ventilation. Critical Care. 15 (4), 196 (2011).
- Wagner, J. Free DNA--new potential analyte in clinical laboratory diagnostics. Biochemia Medica. 22 (1), 24-38 (2012).
- Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer. Nature Reviews Clinical Oncology. 11 (3), 145-156 (2014).
- Mohiuddin, M. M., et al. Chimeric 2C10R4 anti-CD40 antibody therapy is critical for long-term survival of GTKO.hCD46.hTBM pig-to-primate cardiac xenograft. Nature Communications. 7, 11138 (2016).
- Bettegowda, C., et al. Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies. Science Translational Medicine. 6 (224), 24 (2014).
- Dawson, S. J., et al. Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer. New England Journal of Medicine. 368 (13), 1199-1209 (2013).
- Newman, A. M., et al. An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage. Nature Medicine. 20 (5), 548-554 (2014).
- Snyder, T. M., Khush, K. K., Valantine, H. A., Quake, S. R. Universal noninvasive detection of solid organ transplant rejection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (15), 6229-6234 (2011).
- De Vlaminck, I., et al. Noninvasive monitoring of infection and rejection after lung transplantation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (43), 13336-13341 (2015).
- Zhou, M., et al. Circulating pig-specific DNA as a novel biomarker for monitoring xenograft rejection. Xenotransplantation. 26 (4), 12522 (2019).
- Huo, Q., et al. Circulating mi RNA or circulating DNA —Potential biomarkers for organ transplant rejection. Xenotransplantation. 26 (1), 12444 (2019).
- Gadi, V. K., Nelson, J. L., Boespflug, N. D., Guthrie, K. A., Kuhr, C. S. Soluble donor DNA concentrations in recipient serum correlate with pancreas-kidney rejection. Clinical Chemistry. 52 (3), 379-382 (2006).
