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Biology

Quantification de l’ADN spécifique du porc circulant dans le sang d’un modèle de xénotransplantation

Published: September 22, 2020 doi: 10.3791/61579
Automatic Translation
*1,2, *1,3, 1, 1, 4, 1,5, 6, 7, 1
1Shenzhen Xenotransplantation Medical Engineering Research and Development Center, Institute of Translational Medicine, Shenzhen University Health Science Center, Shenzhen University School of Medicine, First Affiliated Hospital of Shenzhen University, Shenzhen Second People's Hospital, 2Xianning Hospital of Traditional Chinese Medicine, 3Liver-biotechnology (Shenzhen) Co., Ltd., 4Department of Radiology, Shenzhen University Health Science Center, Shenzhen University School of Medicine, First Affiliated Hospital of Shenzhen University, Shenzhen Second People's Hospital, 5Department of Life Sciences, University of Toronto, 6Jiangsu Key Laboratory of Xenotransplantation, Nanjing Medical University, 7Department of Hepatopancreatobiliary Surgery, Shenzhen University Health Science Center, Shenzhen University School of Medicine, First Affiliated Hospital of Shenzhen University, Shenzhen Second People's Hospital
* These authors contributed equally

Summary

Dans ce protocole, des amorces spécifiques de porcin ont été conçues, des fragments spécifiques d’ADN de porcine contenant des plasmides ont été construits, et des courbes standard pour la quantitation ont été établies. À l’aide d’amorces spécifiques aux espèces, cpsDNA a été quantifié par qPCR dans des modèles de transplantation de cellules de porc à souris et des modèles de transplantation de patchs d’artère de porc à singe.

Abstract

La xénotransplantation est une méthode réalisable pour traiter l’insuffisance des organes. Cependant, comment surveiller efficacement le rejet immunitaire de la xénotransplantation est un problème pour les médecins et les chercheurs. Ce manuscrit décrit une méthode simple et efficace pour surveiller le rejet immunitaire dans les modèles de transplantation de cellules de porc à souris et les modèles de transplantation de patch d’artère de porc à singe. L’ADN circulant est un biomarqueur potentiellement non invasif pour les dommages aux organes. Dans cette étude, l’ADN pigo-spécifique circulant (cpsDNA) a été surveillé pendant le rejet de xénogreffe par PCR quantitatif en temps réel (qPCR). Dans ce protocole, des amorces spécifiques de porcin ont été conçues, des fragments spécifiques d’ADN de porcine contenant des plasmides ont été construits, et des courbes standard pour la quantitation ont été établies. Des amorces spécifiques aux espèces ont ensuite été utilisées pour quantifier la cpsDNA par qPCR dans des modèles de transplantation cellulaire de porc à souris et des modèles de transplantation de patchs d’artère de porc à singe. La valeur de cette méthode suggère qu’elle peut être utilisée comme méthode simple, pratique, peu coûteux et moins invasive pour surveiller le rejet immunitaire de la xénotransplantation.

Introduction

La défaillance des organes est l’une des principales causes dedécès 1. La transplantation de cellules, de tissus et d’organes est un moyen efficace de traiter l’insuffisance organique2. Néanmoins, la pénurie d’organes donneurs limite l’application clinique de cetteméthode 3,4. Des études ont montré que les porcs peuvent être utilisés comme source potentielle d’organes humains pour la transplantationclinique 5,6. Cependant, la transplantation d’organes inter-espèces fait face à un rejet immunitaire dangereux. Par conséquent, il est crucial de surveiller le rejet immunitaire de la xénotransplantation. À l’heure actuelle, la surveillance clinique du rejet immunitaire dépend principalement des signes et symptômes du patient, ainsi que des tests de laboratoire (p. ex., biopsie, analyse immunobiochimique et échographie)7,8,9. Toutefois, ces méthodes de surveillance ont de nombreux inconvénients. Les signes et les symptômes du rejet immunitaire chez les patients apparaissent habituellement à la finde 10, ce qui n’est pas propice à la détection précoce et l’intervention précoce; biopsie a l’inconvénient d’être invasive11, ce qui n’est pas facile pour les patients à accepter; l’analyse immunobiochimique manque de sensibilité ou de spécificité, et l’échographie est auxiliaire et coûteuse. Par conséquent, il est urgent de trouver une méthode efficace et pratique pour surveiller le rejet immunitaire.

L’ADN circulant est un type extracellulaire d’ADN trouvé dans le sang. Mandel et Metais12 ont signalé pour la première fois la présence d’ADN circulant dans le sang périphérique en 1948. Dans des conditions physiologiques normales, l’ADN circulant dans le sang des personnes en bonne santé est relativement faible à la ligne de base. Cependant, dans quelques pathologies, telles que des tumeurs, l’infarctus du myocarde, les maladies auto-immunes, et le rejet de greffe, le niveau de l’ADN circulant dans le sang peutêtre sensiblement augmenté 13,14 dû à la libération massive de l’ADN circulant provoqué par l’apoptose et la nécrose. L’origine de l’ADN circulant est associée à l’apoptose et à la nécrose15,qui sont caractéristiques du rejet de xénogreffe16.

Il a été prouvé que l’ADN circulant est un biomarqueur mini-invasif pour détecter les cancers17,18,19. Le séquençage par voie élevée de l’ADN circulant dérivé du donneur est fiable pour la détection du rejet après transplantationd’organe 20,21. Cependant, cette méthode exige une concentration élevée et la qualité de l’ADN extrait. Les exigences en matière d’ADN, en plus du coût élevé et de la consommation de temps, rendent cette méthode inadmissible à une utilisation clinique de routine. L’ADN circulant dérivé du donneur peut être quantifié avec précision par pcr quantitatif en temps réel (QPCR), qui est à la fois spécifique et sensible. Par conséquent, la quantification de l’ADN circulant porcin par qPCR est une méthode faisable pour surveiller le rejet immunitaire de la xénotransplantation. Il s’agit d’un gain de temps moins invasif, hautement sensible et spécifique, peu coûteux et moins coûteux. Les porcs et les êtres humains sont génétiquement séparés avec des séquences génomiques très différentes (Figure 1). Par conséquent, l’ADN porcin circulant peut être libéré dans le sang du destinataire post-xénotransplantation en raison du xéno-rejet. CpsDNA pourrait être précisément quantifié par qPCR avec des amorces spécifiques aux espèces dans le sang du receveur. Auparavant, nous avons démontré la justification et la faisabilité de cpsDNA en tant que biomarqueur pour la xénotransplantation22,23. Ici, nous divulguons plus de conseils expérimentaux et de détails. L’expérience se compose des étapes suivantes. Tout d’abord, des amorces spécifiques de porcine ont été conçues, et l’ADN génomique a été isolé, qui ont été utilisés pour vérifier la spécificité des amorce par PCR régulier. Deuxièmement, la construction de la courbe standard de cpsDNA et l’isolement de cpsDNA à partir du sang échantillonné. Enfin, l’ADN spécifique au porc en circulation a été quantifié à l’aide de qPCR.

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Protocol

Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux directives et règlements pertinents du Conseil d’examen institutionnel du Shenzhen Second People’s Hospital, first affiliated hospital of Shenzhen University.

1. Concevoir des amorces spécifiques de porcin

  1. Effectuez l’analyse blast du génome entier pour identifier des gènes spécifiques aux porcins qui étaient différents de ceux des humains, des singes ou des souris, à l’aide du logiciel NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov).
  2. Concevoir des amorces selon 19 gènes spécifiques au porc (tableau 1) à l’aide du logiciel d’Amorce 5.

2. Isoler l’ADN génomique

REMARQUE : L’ADN génomique (y compris le sang des porcs, des singes, des humains volontaires, des singes avec des greffes de porc, et des souris avec des cellules porcines) ont été extraits à l’aide d’un kit commercial d’extraction d’ADN génomique (Tableau des matériaux).

  1. Placer 500 μL de sang entier d’échantillons ci-dessus dans différents tubes de microcentrifugeuse, respectivement.
  2. Ajouter 20 μL de protéase K et 500 μL de tampon de lyse dans les tubes de microcentrifugeuses ci-dessus, puis bien secouer et mélanger.
  3. Mettez ces tubes de microcentrifugeuse dans un bain d’eau à 56 °C pendant 10 min et secouez 2-3 fois au cours de ce processus jusqu’à ce que la solution devienne claire.
  4. Centrifugeuse brièvement pour enlever les perles liquides de la paroi intérieure des couvercles du tube. Ajouter 500 μL d’alcool éthylique anhydre et bien agiter.
  5. Transférer le mélange dans la colonne d’adsorption, centrifugeuse à 12 000 rpm (~13 400 x g)pendant 2 min.
  6. Ajouter 800 μL de solution de rinçage à chaque colonne d’adsorption; centrifugeuse pendant 1 min à 12 000 rpm (~13 400 x g). Placez les colonnes à température ambiante pendant quelques minutes pour sécher le reste de la solution de rinçage.
    REMARQUE : La solution de rinçage est fournie par le fabricant.
  7. Transférez les colonnes d’adsorption dans un autre tube centrifuge propre, ajoutez 50 μL de tampon d’élitution au milieu des films d’adsorption et placez-les à température ambiante pendant 2-5 min. Centrifugeuse 6 200 x g pendant 1 min 12 000 rpm (~13 400 x g).
    REMARQUE : Le tampon d’élitution est fourni par le fabricant, mais le tampon TE, contenant 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) et 0,1 mM EDTA, peut également élucider l’ADN.
  8. Conservez la solution ADN à -20 °C.

3. Vérifier la spécificité des amorces

REMARQUE : Les spécificités des espèces des 19 amorces ci-dessus ont été confirmées par pcr, qui a été exécuté à l’aide de polymése (Tableau des matériaux) et d’amorces présentées dans le tableau 1.

  1. Préparer la solution prémémorée de 12,5 μL de prémétème PCR 2x(tableau des matériaux),1 μL d’amorce de 5' (10 μM), 1 μL d’amorce de 3' (10 μM), et 8,5 μL de ddH2O. Préparer le mélange comprenant 2 échantillons supplémentaires.
  2. Divisez 23 μL de solution pré-mélangée en tubes de microcentrifugeuse de 0,2 mL, ajoutez 2 μL d’ADN génomique et plafonnez soigneusement les tubes. Mélanger et centrifuger légèrement.
  3. Placez les tubes de microcentrifugeuse de 0,2 mL dans le cycleur PCR et effectuez ce qui suit : Dénaturation : 95 °C pour 5 s; Annealing: 60 °C pour 30 s; extension: 72 °C pour 30 s.
  4. Effectuez l’électrophoresis agarose comme suit :
    1. Peser 1,2 g d’agarose dans un flacon contenant 100 mL de 1x TAE et le faire bouillir pendant 5 min au micro-ondes. Ajouter 5 μL de colorant à l’acide nucléique(Tableau des matériaux)dans le flacon après qu’il refroidisse à environ 70 °C. Versez-le dans la plaque le long du bord lentement, et placez-le à température ambiante jusqu’à ce qu’il se solidifie en gel.
    2. Ajouter 5 μL d’échantillon et 2-Log DNA Ladder (0.1-10.0 kb) ou Marker I (0.1-0.6 kb), qui contiennent 1 μL de tampon de chargement d’ADN 6x, dans le gel d’agarose. Puis électrophorese à 120 mA jusqu’à ce que les bandes soient séparées.
    3. Visualisez le gel d’agar contenant des fragments d’ADN à l’aide d’un imageur ultraviolet.
  5. Effectuer une électrophorèse agarose pour isoler les fragments d’ADN amplifiés des échantillons ci-dessus, qui a été visualisé dans un imageur ultraviolet. À l’aide du PCR, les amorces spécifiques à l’ADN génomique porcin amplifié ont d’abord été identifiées (figure 2A). De plus, certaines spécificités spécifiques de ces amorces qui ont spécifiquement amplifié l’ADN des porcs dans la cohorte des singes/génomiques humains ou dans la cohorte de l’ADN génomique des souris ont été confirmées (figure 2B). Enfin, il a été prouvé que deux amorces de spécificités d’espèces amplifient spécifiquement l’ADN de porc dans le patch d’artère de porc à singe et/ou les modèles de transplantation de cellules de porc à souris, respectivement (figure 2C)

4. Courbe standard de cpsDNA

  1. Transformer le plasmide pMD19-T contenant un fragment d’ADN porcin en DH5a, qui pourrait être spécifiquement amplifié par des #4 d’amorce ou des #11 d’amorce (tableau 1). Dépistage des bactéries positives à l’aide d’ampicilline de 50 μg/mL.
    Primer #4 dans la cohorte homme / singe (vers l’avant: 5′-TTCAATCCCA CTTCTTCCACCTAA-3′, inverse: 5′-CTTCATCATCTTCATAATAAC CCTGT-3′)
    Primer #11 pour le modèle de souris (vers l’avant: 5′-TGCCGTGGTTTCC GTTGCTTG-3′, revers: 5′-TCACATTTGATGGTCGTTGTCGTC T-3′)
    REMARQUE : Les détails de toutes les amorces se trouvent dans le tableau 1.
  2. Récoltez les plasmides ci-dessus suivant le protocole ci-dessous.
    1. Isoler une seule colonie d’une plaque sélective fraîchement striée et inoculer une culture de 1 à 5 mL de milieu LB contenant l’antibiotique sélectif approprié. Incuber pendant 12-16 heures à 37 °C avec des secousses vigoureuses (300 rpm).
    2. Centrifugeuse à 10 000 x g pendant 1 minute à température ambiante. Décanter ou aspirer et jeter les médias culturels.
    3. Ajouter 250 μL de solution I/RNase A. Vortex ou pipet de haut en bas pour bien mélanger. La résuspension complète de la pastille cellulaire est essentielle pour obtenir de bons rendements.
      REMARQUE : RNase A doit être ajouté à la solution I avant utilisation.
    4. Transférer la suspension dans un nouveau tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL. Ajouter 250 μL de solution II. Inverser et faire pivoter doucement le tube plusieurs fois pour obtenir un lysate clair. Une incubation de 2 à 3 minutes peut être nécessaire.
      REMARQUE : Évitez le mélange vigoureux car cela cisaillera l’ADN chromosomique et abaissera la pureté plasmide. Ne laissez pas la réaction de lyse se poursuivre plus de 5 minutes.
    5. Ajouter 350 μL de solution III. Inversez immédiatement plusieurs fois jusqu’à ce qu’un blanc flocculent se forme.
      REMARQUE : Il est essentiel que la solution soit bien mélangée et immédiatement après l’ajout de la solution III afin d’éviter les précipitations localisées.
    6. Centrifugeuse à vitesse maximale (≥13 000 x g)pendant 10 minutes. Une pastille blanche compacte se formera. Passez rapidement à l’étape suivante.
    7. Insérez une mini colonne d’ADN dans un tube de collecte de 2 mL.
    8. Transférez le supernatant effacé de 4,2,7 en l’aspirant soigneusement dans la mini colonne d’ADN. Veillez à ne pas déranger la pastille et qu’aucun débris cellulaire n’est transféré à la mini colonne d’ADN.
    9. Centrifugeuse à vitesse maximale pendant 1 minute. Jeter le filtrate et réutiliser le tube de collecte.
    10. Ajouter 500 μL de tampon HBC. Centrifugeuse à vitesse maximale pendant 1 minute. Jeter le filtrate et réutiliser le tube de collecte.
      REMARQUE : Le tampon HBC doit être dilué avec 100 % d’isopropanol avant utilisation.
    11. Ajouter 700 μL de tampon de lavage d’ADN. Centrifugeuse à vitesse maximale pendant 1 minute. Jeter le filtrate et réutiliser le tube de collecte.
      REMARQUE : Le tampon de lavage d’ADN doit être dilué avec 100 % d’éthanol avant utilisation.
      1. Facultatif : Répétez une deuxième étape de lavage tampon de lavage de l’ADN.
    12. Centrifugez la mini colonne d’ADN vide pendant 2 minutes à vitesse maximale pour sécher la matrice de colonne.
      REMARQUE : Il est important de sécher la matrice de mini colonne d’ADN avant l’éution. L’éthanol résiduel peut interférer avec les applications en aval.
    13. Transférez la mini colonne d’ADN dans un tube de microcentrifugeuse propre de 1,5 mL.
    14. Ajouter 30-100 μL d’Elution Buffer ou d’eau déionisée stérile directement au centre de la membrane de la colonne.
      REMARQUE : L’efficacité de l’éludage de l’ADN de la colonne DNA Mini dépend du pH. Si vous utilisez de l’eau déionisée stérile, assurez-vous que le pH est d’environ 8,5.
    15. Laisser reposer à température ambiante pendant 1 minute.
    16. Centrifugeuse à vitesse maximale pendant 1 minute.
      REMARQUE : Cela représente environ 70 % de l’ADN lié. Une deuxième élitution facultative donnera n’importe quel ADN résiduel, bien qu’à une concentration inférieure.
  3. Vérifiez les plasmides ci-dessus à l’aide de la digestion enzymatique à double restriction à l’aide d’EcoR I (15 U/μL) et bam H1 (15 U/μL)22.
    1. Effectuez les étapes de maquillage sur la glace. Préparer le système de réaction de 1 μL d’EcoR I (15 U), 1 μL de Bam H1 (15 U), 2 μL de tampon 10x, 1 μg de plasmide; ajouter ddH2O à 20 μL de volume total, bien mélanger. Incuber dans un bain d’eau à 37 °C pendant 2 heures.
    2. Séparez les produits digérés de 1% d’agarose suivi de l’électrophoresis et exposez à la lumière UV comme avant.
  4. Diluer le plasmide concentré en 2 x 1011 copies/mL pour la solution standard de départ à l’aide de ddH2O. Prenez le plasmide (P2) contenant un fragment d’ADN porcin par exemple des copies calculant :
    1. Calculer le nombre de plasmides dans 1 mL de solution standard de départ: N = (2 x 1011)/ (6,02 x 1023) mol.
    2. Calculer le poids moléculaire de P2: M = 2810 bp x 650 D/bp = 2810 x 650 D (g/mol).
    3. Calculer la masse de P2: m=N*M= (2 x 1011)/ (6,02 x 1023) mol x 2810 x 650 g/mol.
    4. Calculer le volume de P2 : V = m/C = [(2 x 1011)/(6,02 x 1023) x 2810 x 650] g/C. (C est la concentration de P2 (ng/μL), qui est mesurée par un spectrophotomètre).
  5. Diluer la solution standard de départ en série 10 fois en 2 x 1010 copies/mL, 2 x 109 copies/mL, 2 x 108 copies/mL, 2 x 107 copies/mL..., et 2 x 100 copies/mL pour la solution standard utilisant ddH2O. Vortex complètement pendant la dilution.
  6. Établissez la courbe standard.
    1. Préparer le système de réaction du qPCR (toutes les étapes sont protégées de la lumière) : Ajouter la solution pré-mélangée qui contient 325 μL de mélange qPCR (table dematériaux),13 μL d’amorce de 5', 13 μL d’amorce de 3' et 169 μL de ddH2O dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL, qui a ensuite été soigneusement mélangé et légèrement centrifugé.
    2. Divisez les 40 μL au-dessus de la solution prémêlé en une bande de 8 tubes et ajoutez 10 μL d’ADN standard de différentes concentrations. Capuchon soigneusement, mélanger et centrifugeuse légèrement.
    3. Mettez la bande à 8 tubes dans la machine qPCR suivant la procédure indiquée dans la figure 3.

5. Isoler l’ADN circulant des échantillons de sang

  1. À l’aide de tubes EDTA, prélever des échantillons de sang à différents moments dans les modèles de patch d’artère de porc à singe et les modèles de transplantation de cellules de porc à souris.
  2. Prélever des échantillons de sang d’environ 400 μL (des modèles de patchs d’artère de porc à singe) ou de 100 μL (des modèles de transplantation cellulaire de porc à souris) et transférer à 1,5 mL de tubes de microcentrifugeuse. Retirer les cellules sanguines des échantillons de sang par centrifugation à basse température et à grande vitesse (3 000 x g,4 °C, 5 min).
  3. Transférer le supernatant dans un nouveau tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL et enlever les débris cellulaires par centrifugation à 16 000 x g pendant 10 min.
  4. Transférer le supernatant dans un nouveau tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL. Extraire l’ADN circulant du supernatant ci-dessus à l’aide d’un kit commercial d’extraction d’ADN sérique/circulant suivant le protocole 2 du protocole isolant des fabricants d’ADN génomique.
  5. Condenser le volume d’ADN circulant à 40 μL et conserver à -20 °C.

6. Quantitation de l’ADN circulant spécifique aux porcs

  1. Préparer la solution pré-mélangée de 25 μL de mélange qPCR(tableau des matériaux),1 μL d’amorce de 5', 1 μL d’amorce de 3', 10 μL d’ADN de l’échantillon, et 13 μL de ddH2O. Préparer le mélange comprenant 2 échantillons supplémentaires.
  2. Divisez la solution pré-mélangée de 40 μL en une bande de 8 tubes et ajoutez 10 μL d’ADN de l’échantillon, suivi d’un plafonnement minutieux. Préparez deux réactions de plus que nécessaire.
  3. Mettez la bande de 8 tubes dans la machine qPCR suivant la même procédure que la courbe standard. Il est préférable d’exécuter une norme d’abord pour s’assurer que la réaction est critique pour la quantification à l’avance. La procédure du système de réaction du QPCR a été indiquée à la figure 3.

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Representative Results

Dans ce protocole, des amorces spécifiques aux porcins ont été conçues, des fragments d’ADN spécifiques aux porcins contenant des plasmides ont été construits et des courbes standard de quantitation ont été établies (figure 4). Les spécificités des espèces des 19 amorces ont été confirmées par PCR. Des amorces spécifiques aux espèces (#4 d’amorce et #11 d’amorce) ont ensuite été utilisées pour quantifier la cpsDNA par qPCR dans des modèles de transplantation cellulaire de porc à souris et des modèles de transplantation de patchs d’artère de porc à singe.

L’électrophoresis d’Agarose a été employé pour isoler des fragments amplifiés d’ADN des échantillons ci-dessus, qui sont alors visualisés dans un imageur ultraviolet. À l’aide du PCR, les amorces spécifiques à l’ADN génomique porcin amplifié ont d’abord été identifiées (figure 2A). De plus, certaines spécificités spécifiques de ces amorces qui ont spécifiquement amplifié l’ADN des porcs dans la cohorte de singes/génomiques humains ou dans la cohorte de l’ADN génomique des souris ont été confirmées (figure 2B). Enfin, il a été prouvé que deux amorces de spécificités d’espèces amplifient spécifiquement l’ADN de porc dans le patch d’artère de porc à singe et/ou les modèles de transplantation de cellules de porc à souris, respectivement (figure 2C).

Figure 1
Figure 1: Identité génétique entre le porc (sus scrofa, ssc) et l’homme (homo sapiens, a) ou le singe (Macaca fascicularis, mfa). Les séquences génétiques de trois espèces différentes ont été comparées par l’analyse BLAST. L’analyse de séquence blast a utilisé des informations d’annotation génomique (la séquence de l’ARNm) des trois espèces téléchargées à partir de NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov). Les séquences d’ARNm des gènes humains, de singe et de porc étaient 139116, 65927, et 71498,respectivement 22. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 2 : Le PCR régulier valide la spécificité des amorces spécifiques au porcin. (R Les fragments d’ADN génomique du porc ont été amplifiés par des amorces 1-19. (B) Le fragment d’ADN génomique humain/singe/souris n’a pas pu être amplifié par certains amorces (amorce #4 et #11). Les étoiles (*) n’indiquent aucune amplification dans l’ADN génomique humain/singe. Le signe de livre (#) n’indique aucune amplification dans l’ADN génomique de souris. (C) Les deux amorces de spécificités d’espèces (amorce #4 et #11) ont été prouvées pour amplifier spécifiquement l’ADN de porc dans le patch d’artère de porc-à-singe et/ou les modèles de transplantation de cellules de porc-à-souris,respectivement 22. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 3 : La procédure pour la réaction qPCR22. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. 

Figure 3
Figure 4 : Établissement de la courbe standard pour la quantification absolue. Les parcelles d’amplification, les parcelles de courbe de fonte et les vues courbes standard de (A) #4 d’amorce et (B) #11 d’amorce de la machine qPCR (voir tableau des matériaux) sont exposées. Un bon standard (valeur R proche de 1, efficacité d’amplification est dans les 100% ±5%) jusqu’à la moitié de l’année22. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Tableau 1. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette table.

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Discussion

Quantifier l’ADN circulant porcin représente une approche réalisable pour surveiller le rejet immunitaire de la xénotransplantation. Gadi et coll.24 ont constaté que la teneur en ADN circulant (DdcfDNA) dérivée du donneur dans le sang des patients présentant un rejet aigu était significativement plus élevée que celle des patients sans rejet. Ces études suggèrent que le ddcfDNA puisse être un biomarqueur commun pour surveiller des dommages de greffe d’organe. Ces dernières années, qPCR a de plus en plus été appliqué à l’analyse des acides nucléiques en raison de son fonctionnement simple, haut degré d’automatisation, sensibilité élevée, bonne spécificité, et faible coût.

Dans cette étude, des amorces spécifiques à la porcine ont été conçues sur la base des résultats de l’analyse bioinformatique. Leur spécificité a été vérifiée par pcr régulier. Le cpsDNA des échantillons de sang des modèles de correction d’artère de porc-à-singe et des modèles de transplantation de cellules de porc-à-souris pourrait être précisément quantifié par qPCR avec des amorces spécifiques à l’espèce. Les principaux avantages de l’approche sont les suivants. Tout d’abord, sur la base des amorces très spécifiques, cette méthode de quantification de l’ADN est très sensible et spécifique. En outre, le protocole de l’approche est très simple à exécuter, qui consistait en la conception d’amorces spécifiques, l’isolement de l’ADN, et l’analyse qPCR en une journée de travail, qui est gain de temps. Il s’agit d’une méthode non invasive qui commence à partir d’un petit volume de sérum ou de matériau plasmatique. Pendant ce temps, nous avons démontré que cette méthode est hautement reproductible22. Contrairement au séquençage à haut débit et à la spectrométrie de masse de vol, cette méthode est peu coûteux.

La surveillance du rejet immunitaire par quantification de l’ADN circulant spécifique aux porcs dans le sang des modèles de timbres d’artère de porc à singe et des modèles de transplantation de cellules de porc à souris utilisant qPCR a jeté les bases de la recherche fondamentale et de l’application clinique de la xénotransplantation porcine-humaine.

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Disclosures

Les auteurs ne signalent aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgments

Ces travaux ont été soutenus par des subventions du National Key R&D Program of China (2017YFC1103704), de la Shenzhen Foundation of Science and Technology (JCYJ20170817172116272), des fonds spéciaux pour la construction d’hôpitaux de haut niveau à Guangd province de Sanming (2019), Projet sanming de médecine à Shenzhen (SZSM201412020), Fonds pour la construction de discipline médicale de haut niveau de Shenzhen (2016031638), Shenzhen Foundation of Health and Family Planning Commission (SZXJ2017021 , SZXJ2018059).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Biowest, Barcelona, Spain 111860
BamHI-HF New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA R3136S
1.5 mL microcentrifuge tube Axygen Biosciences, Union City, CA, USA MCT-150-C
0.2 mL PCR tube Axygen Biosciences, Union City, CA, USA PCR-02-C
C57BL/6 Mice Medical Animal Center of Guangdong Province,  China 8~10 weeks
Centrifuge Thermo Fisher Scientific, Walt- ham, MA, USA Micro 21R
2-Log DNA Ladder New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA N3200S 0.1–10.0 kb
Marker I  Tiangen, Beijing, China MD101-02 0.1–0.6 kb
DNA Mini Column(HiBind DNA Mini Columns) Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA DNACOL-01
DNA loading buffer Solarbio, Beijing, China D1010
E.Z.N.A.Plasmid DNA Mini Kit I and E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit II Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA D6942
D6943
EcoR I Takara Bio, Shiga, Japan  1040S
Female Bama mini pigs BGI Ark Biotechnology, Shenzhen, China 2~4 months
Genomic DNA Extraction Kit ? Tiangen, Beijing, China DP304-02
SYBR Green Realtime PCR Master Mix Toyobo, Osaka, Japan QPK-201
Gel Doc XR Bio-Rad, Hercules, USA
Male cynomolgus monkeys Guangdong Landau Biotechnology, Guangzhou, China 8 years
Nucleic acid dye(Gelred) Biotium, Fremont, USA 42003
polymerase(Premix Taq) Takara Bio, Shiga, Japan RR901A
pMD19-T plasmid Takara Bio, Shiga, Japan D102A
qPCR machine Applied Biosystems QSDx, Waltham, USA
Serum/Circulating DNA Extraction Kit Tiangen, Beijing, China DP339
TAE sangon Biotech, Shanghai, China B548101

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References

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Biologie Numéro 163 amorces spécifiques circulation de l’ADN spécifique aux porcs qPCR xénotransplantation biomarqueur rejet immunitaire
Quantification de l’ADN spécifique du porc circulant dans le sang d’un modèle de xénotransplantation
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Deng, Y., Zhou, M., Lu, Y., Chen, J., Pu, Z., Yu, D., Dai, Y., Zhan, Y., Mou, L. Quantification of Circulating Pig-Specific DNA in the Blood of a Xenotransplantation Model. J. Vis. Exp. (163), e61579, doi:10.3791/61579 (2020).

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