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Biology

एक Xenotransplantation मॉडल के रक्त में सुअर विशिष्ट डीएनए परिसंचारी की मात्राकरण

Published: September 22, 2020 doi: 10.3791/61579
Automatic Translation
*1,2, *1,3, 1, 1, 4, 1,5, 6, 7, 1
1Shenzhen Xenotransplantation Medical Engineering Research and Development Center, Institute of Translational Medicine, Shenzhen University Health Science Center, Shenzhen University School of Medicine, First Affiliated Hospital of Shenzhen University, Shenzhen Second People's Hospital, 2Xianning Hospital of Traditional Chinese Medicine, 3Liver-biotechnology (Shenzhen) Co., Ltd., 4Department of Radiology, Shenzhen University Health Science Center, Shenzhen University School of Medicine, First Affiliated Hospital of Shenzhen University, Shenzhen Second People's Hospital, 5Department of Life Sciences, University of Toronto, 6Jiangsu Key Laboratory of Xenotransplantation, Nanjing Medical University, 7Department of Hepatopancreatobiliary Surgery, Shenzhen University Health Science Center, Shenzhen University School of Medicine, First Affiliated Hospital of Shenzhen University, Shenzhen Second People's Hospital
* These authors contributed equally

Summary

इस प्रोटोकॉल में, पोर्सिन विशिष्ट प्राइमर डिजाइन किए गए थे, प्लाज्मिड युक्त पोर्सिन विशिष्ट डीएनए टुकड़े बनाए गए थे, और क्वांटिटेशन के लिए मानक घटता स्थापित किया गया था। प्रजातियों के विशिष्ट प्राइमर का उपयोग करते हुए, सीपीएसडीएनए को क्यूपीसीआर द्वारा सुअर-से-माउस सेल प्रत्यारोपण मॉडल और सुअर-से-बंदर धमनी पैच प्रत्यारोपण मॉडल में निर्धारित किया गया था।

Abstract

ज़ेनोट्रांज्लांटेशन अंग विफलता के इलाज के लिए एक व्यवहार्य तरीका है। हालांकि, कैसे प्रभावी ढंग से xenotransplantation की प्रतिरक्षा अस्वीकृति की निगरानी के लिए चिकित्सकों और शोधकर्ताओं के लिए एक समस्या है । यह पांडुलिपि सुअर से माउस सेल प्रत्यारोपण मॉडल और सुअर से बंदर धमनी पैच प्रत्यारोपण मॉडल में प्रतिरक्षा अस्वीकृति की निगरानी के लिए एक सरल और प्रभावी विधि का वर्णन करता है । परिसंचारी डीएनए अंग क्षति के लिए एक संभावित गैर आक्रामक बायोमार्कर है । इस अध्ययन में, मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (क्यूपीसीआर) द्वारा xenograft अस्वीकृति के दौरान परिसंचारी सुअर-विशिष्ट डीएनए (cpsDNA) पर नजर रखी गई थी। इस प्रोटोकॉल में, पोर्सिन विशिष्ट प्राइमर डिजाइन किए गए थे, प्लाज्मिड युक्त पोर्सिन विशिष्ट डीएनए टुकड़े बनाए गए थे, और क्वांटिटेशन के लिए मानक घटता स्थापित किया गया था। प्रजातियों के विशिष्ट प्राइमर तो सुअर से माउस सेल प्रत्यारोपण मॉडल और सुअर से बंदर धमनी पैच प्रत्यारोपण मॉडल में qPCR द्वारा cpsDNA मात्रा निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया । इस विधि के मूल्य से पता चलता है कि इसे एक सरल, सुविधाजनक, कम लागत और कम आक्रामक विधि के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ताकि ज़ेनोट्रांज्लांटेशन की प्रतिरक्षा अस्वीकृति की निगरानी की जा सके।

Introduction

अंग न होना मृत्यु के मुख्य कारणों में से एक है1. कोशिकाओं, ऊतकों और अंगों का प्रत्यारोपण अंग विफलता के इलाज के लिए एक प्रभावी तरीका है2। फिर भी, दाता अंगों की कमी इस विधि के नैदानिक अनुप्रयोग को सीमित करता है3,4. अध्ययनों से पता चला है कि सूअरों का उपयोग नैदानिक प्रत्यारोपण के लिए मानव अंगों के संभावित स्रोत के रूप में किया जा सकता है5,6. हालांकि, क्रॉस-प्रजाति अंग प्रत्यारोपण खतरनाक प्रतिरक्षा अस्वीकृति का सामना करता है। इसलिए, ज़ेनोट्रांसप्लांटेशन की प्रतिरक्षा अस्वीकृति की निगरानी करना महत्वपूर्ण है। वर्तमान में, प्रतिरक्षा अस्वीकृति की नैदानिक निगरानी मुख्य रूप से रोगी के संकेतों और लक्षणों पर निर्भर करती है, साथ ही प्रयोगशाला परीक्षण (जैसे, बायोप्सी, इम्यूनोबायोकेमिकल विश्लेषण, और अल्ट्रासाउंड)7,8,9। हालांकि, इन निगरानी विधियों के कई नुकसान हैं। रोगियों में प्रतिरक्षा अस्वीकृति के लक्षण और लक्षण आमतौर पर10देर से दिखाई देते हैं, जो जल्दी पता लगाने और जल्दी हस्तक्षेप के लिए अनुकूल नहीं है; बायोप्सी में आक्रामक11होने का नुकसान होता है, जो रोगियों के लिए स्वीकार करना आसान नहीं होता है; इम्यूनोबायोकेमिकल विश्लेषण में संवेदनशीलता या विशिष्टता का अभाव है, और अल्ट्रासाउंड सहायक और महंगा है। इसलिए, प्रतिरक्षा अस्वीकृति की निगरानी के लिए एक प्रभावी और सुविधाजनक विधि खोजना जरूरी है।

परिसंचारी डीएनए रक्त में पाया डीएनए का एक बाह्य प्रकार है । मंडेल और मेटाइस12 ने सबसे पहले १९४८ में परिधीय रक्त में डीएनए परिसंचारी की उपस्थिति की सूचना दी । सामान्य शारीरिक परिस्थितियों में, स्वस्थ लोगों के रक्त में डीएनए परिसंचारी बेसलाइन पर अपेक्षाकृत कम है। हालांकि, ट्यूमर, मायोकार्डियल इन्फेक्शन, ऑटोइम्यून रोगों और प्रत्यारोपण अस्वीकृति जैसी कुछ विकृतियों में, रक्त में परिसंचारी डीएनए के स्तर को एपोप्टोसिस और नेक्रोसिस के कारण परिसंचारी डीएनए की भारी रिहाई के कारण13,14 में काफी वृद्धि की जा सकती है। परिसंचारी डीएनए की उत्पत्ति एपोप्टोसिस और नेक्रोसिस15से जुड़ी हुई है , जो16को ज़ेनोबेड़ा अस्वीकृति की विशेषता है ।

परिसंचारी डीएनए 17,18 ,19के कैंसर का पता लगाने के लिए एक न्यूनतम इनवेसिव बायोमार्कर साबित हुआ है । अंग प्रत्यारोपण20, 21के बाद अस्वीकृति का पता लगाने के लिए दाता-व्युत्पन्न परिसंचारी डीएनए का उच्च माध्यम से अनुक्रमण विश्वसनीय है । हालांकि, इस विधि के लिए एक उच्च एकाग्रता और निकाले गए डीएनए की गुणवत्ता की आवश्यकता होती है। उच्च लागत और समय की खपत के अलावा डीएनए आवश्यकताएं इस विधि को नियमित नैदानिक उपयोग के लिए अयोग्य बनाती हैं। दाता-व्युत्पन्न परिसंचारी डीएनए को मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (क्यूपीसीआर) द्वारा सटीक रूप से निर्धारित किया जा सकता है, जो विशिष्ट और संवेदनशील दोनों है। इसलिए, क्यूपीसीआर द्वारा डीएनए परिसंचारी पोर्सिन की मात्रा बताना एक व्यवहार्य तरीका है जो ज़ेनोट्रांज्लांटेशन की प्रतिरक्षा अस्वीकृति की निगरानी करता है। यह कम आक्रामक, अत्यधिक संवेदनशील और विशिष्ट, कम लागत, और समय की बचत है। सूअर और मनुष्य आनुवंशिक रूप से काफी अलग जीनोमिक दृश्यों(चित्रा 1)के साथ अलग हैं । इसलिए, परिसंचारी पोर्सिन डीएनए को ज़ीनो-अस्वीकृति के कारण प्राप्तकर्ता के रक्त के बाद-ज़ेनोट्रांज्लांटेशन में जारी किया जा सकता है। सीपीएसडीएनए को प्राप्तकर्ता के रक्त में प्रजातियों-विशिष्ट प्राइमर के साथ क्यूपीसीआर द्वारा ठीक से निर्धारित किया जा सकता है। इससे पहले, हमने22, 23के लिए बायोमार्कर के रूप में सीपीएसडीएनए के औचित्य और व्यवहार्यता का प्रदर्शन किया है । यहां, हम अधिक प्रयोगात्मक सुझावों और विवरणों का खुलासा करते हैं। प्रयोग में निम्नलिखित चरण होते हैं। सबसे पहले, पोर्सिन विशिष्ट प्राइमर डिजाइन किए गए थे, और जीनोमिक डीएनए को अलग-थलग कर दिया गया था, जिसका उपयोग नियमित पीसीआर द्वारा प्राइमर की विशिष्टता को सत्यापित करने के लिए किया जाता था। दूसरा, सीपीएसडीएनए के मानक वक्र का निर्माण करना और सीपीएसडीएनए को सैंपल ब्लड से अलग करना। अंत में, परिसंचारी सुअर विशिष्ट डीएनए qPCR का उपयोग कर मात्रा निर्धारित किया गया था ।

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Protocol

सभी प्रयोगों प्रासंगिक दिशा निर्देशों और शेर्ज़ेन दूसरे पीपुल्स अस्पताल, शेनझेन विश्वविद्यालय के पहले संबद्ध अस्पताल के संस्थागत समीक्षा बोर्ड के नियमों के अनुसार प्रदर्शन किया गया ।

1. डिजाइन पोर्सिन विशिष्ट प्राइमर

  1. सॉफ्टवेयर एनसीबीआई (www.ncbi.nlm.nih.gov) का उपयोग करके, मनुष्यों, बंदरों या माउस से अलग पोर्सिन विशिष्ट जीन की पहचान करने के लिए पूरे जीनोम ब्लास्ट विश्लेषण करें।
  2. प्राइमर 5 के सॉफ्टवेयर का उपयोग करके 19 सुअर-विशिष्ट जीन(तालिका 1)के अनुसार प्राइमर डिजाइन करें।

2. जीनोमिक डीएनए को अलग करना

नोट: जीनोमिक डीएनए (सूअरों, बंदरों, स्वयंसेवक मनुष्यों, सुअर कलम के साथ बंदरों, और पोर्सिन कोशिकाओं के साथ चूहों से रक्त सहित) एक वाणिज्यिक जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण किट(सामग्री की मेज) काउपयोग कर निकाला गया ।

  1. उपरोक्त नमूनों के पूरे रक्त के 500 माइक्रोल को क्रमशः विभिन्न माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों में रखें।
  2. ऊपर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों में प्रोटीज के 20 माइक्रोल और लाइसिस बफर के 500 माइक्रोल जोड़ें, और फिर अच्छी तरह से हिलाएं और मिलाएं।
  3. इन माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब को 10 मिनट के लिए 56 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में रखें और समाधान स्पष्ट होने तक इस प्रक्रिया के दौरान 2-3 बार हिलाएं।
  4. अपकेंद्रित्र संक्षेप में ट्यूब कवर की भीतरी दीवार से तरल मोती को हटाने के लिए। इसमें 500 माइक्रोनल का एंहिजर एथिल अल्कोहल डालें और अच्छी तरह हिलाएं।
  5. मिश्रण को 2 मिनट के लिए 12,000 आरपीएम (~ 13,400 x ग्राम)पर एसोक्रिप्शन कॉलम में स्थानांतरित करें।
  6. प्रत्येक सोखने कॉलम में कुल्ला समाधान के 800 μL जोड़ें; 12,000 आरपीएम (~ 13,400 x ग्राम)पर 1 मिनट के लिए सेंट्रलाइज। शेष कुल्ला समाधान को सुखाने के लिए कुछ मिनटों के लिए कॉलम को कमरे के तापमान पर रखें।
    नोट: कुल्ला समाधान निर्माता द्वारा प्रदान की जाती है।
  7. सोखने के कॉलम को एक और साफ अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें, सोखने वाली फिल्मों के बीच में 50 माइक्रोन एल्यूशन बफर जोड़ें, और उन्हें 2-5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर रखें। 1 मिनट 12,000 आरपीएम (~ 13,400 x ग्राम) के लिए सेंट्रलाइज 6,200 एक्स ग्राम।
    नोट: एल्यूशन बफर निर्माता द्वारा प्रदान किया जाता है, लेकिन 10 एमएम ट्रिस-एचसीएल (पीएच 8.0) और 0.1 एमएम ईडीटीए युक्त टीई बफर भी डीएनए को एल्यूट कर सकता है।
  8. डीएनए समाधान को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

3. प्राइमर की विशिष्टता सत्यापित करें

नोट: उपरोक्त 19 प्राइमर की प्रजातियों की विशिष्टताओं की पुष्टि पीसीआर द्वारा की गई थी, जिसे पॉलीमरेज(सामग्री की तालिका)और तालिका 1में प्रस्तुत प्राइमर का उपयोग करके किया गया था ।

  1. 2x पीसीआर प्रीमिक्स(सामग्रीकी तालिका), 5' प्राइमर (10 माइक्रोन) के 1 माइक्रोन, 3 ' प्राइमर (10 माइक्रोन) के 1 माइक्रोन और डीडीएच2ओ के 8.5 माइक्रोन के पूर्व मिश्रित समाधान तैयार करें। 2 अतिरिक्त नमूनों सहित मिश्रण तैयार करें।
  2. 0.2 मिली माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों में पूर्व मिश्रित समाधान के 23 माइक्रोल को विभाजित करें, जीनोमिक डीएनए के 2 माइक्रोल जोड़ें, और ध्यान से ट्यूबों को कैप करें। फिर थोड़ा मिक्स और सेंट्रलाइज करें।
  3. पीसीआर-साइकिलर में 0.2 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब रखें और निम्नलिखित प्रदर्शन करें: डेनैचुरेशन: 5 एस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस; एनीलिंग: 30 एस के लिए 60 डिग्री सेल्सियस; विस्तार: 30 एस के लिए 72 डिग्री सेल्सियस।
  4. इस प्रकार के रूप में agarose इलेक्ट्रोफोरेसिस प्रदर्शन:
    1. 1x TAE के 100 एमएल युक्त फ्लास्क में 1.2 ग्राम का वजन करें और इसे माइक्रोवेव में 5 मिनट के लिए उबालें। लगभग 70 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा होने के बाद फ्लास्क में न्यूक्लिक एसिड डाई(सामग्री की तालिका)के 5 माइक्रोन जोड़ें। इसे धीरे-धीरे किनारे के साथ प्लेट में डालें, और इसे कमरे के तापमान पर तब तक रखें जब तक कि यह जेल में न जम जाए।
    2. नमूना के 5 μL जोड़ें और 2-लॉग डीएनए सीढ़ी (0.1-10.0 kb) या मार्कर मैं (0.1-0.6 kb), जो 6x डीएनए लोडिंग बफर के 1 μL होते हैं, agarose जेल में । फिर बैंड अलग होने तक 120 एमए पर इलेक्ट्रोफोरस।
    3. एक पराबैंगनी इमेजर के साथ डीएनए टुकड़े युक्त आगर जेल की कल्पना करें।
  5. उपरोक्त नमूनों से प्रवर्धित डीएनए टुकड़ों को अलग करने के लिए एगरॉ वे इलेक्ट्रोफोरेसिस करें, जिसे पराबैंगनी इमेजर में कल्पना की गई थी। पीसीआर का उपयोग करते हुए, प्रवर्धित पोर्सिन जीनोमिक डीएनए के लिए विशिष्ट प्राइमर की पहचान पहले(चित्रा 2 ए)की गई थी। इसके अलावा, इन प्राइमरों की कुछ प्रजातियों-विशिष्टताओं जो विशेष रूप से बंदर/मानव जीनोमिक या माउस जीनोमिक डीएनए की पलटन में सुअर डीएनए परिलक्षित(चित्रा 2B)की पुष्टि की गई । अंत में, दो प्रजातियों-विशिष्टताएं प्राइमर आगे विशेष रूप से सुअर में सुअर डीएनए बढ़ाना-बंदर धमनी पैच और/या सुअर से माउस सेल प्रत्यारोपण मॉडल, क्रमशः साबितहुए (चित्रा 2C)

4. सीपीएसडीएनए का मानक वक्र

  1. डीएच5ए में पोर्सिन डीएनए के एक टुकड़े से युक्त pMD19-T प्लाज्मिड को बदल दें, जिसे विशेष रूप से प्राइमर #4 या प्राइमर #11(टेबल 1)द्वारा परिलक्षित किया जा सकता है। 50 μg/mL एम्पीसिलिन का उपयोग कर सकारात्मक बैक्टीरिया के लिए स्क्रीन।
    मानव/बंदर पलटन में प्राइमर #4 (फॉरवर्ड: 5′-TTCAATCCCA CTTCTCCCCCCTAA-3′, रिवर्स: 5'-CTTCATTCCATCATCATATAAC CCTGT-3')
    माउस मॉडल के लिए प्राइमर #11 (फॉरवर्ड: 5′-TGCCGTGGTTTCC GTTGCTTG-3′, रिवर्स: 5′-TCACATTTGATGGTCGTCTCTCTCTC T-3')
    नोट: सभी प्राइमर का विवरण तालिका 1में पाया जा सकता है ।
  2. नीचे दिए गए प्रोटोकॉल का पालन करते हुए उपरोक्त प्लाज्मिड्स को काटें।
    1. एक ताजा लकीर चयनात्मक प्लेट से एक ही कॉलोनी को अलग करें और उचित चयनात्मक एंटीबायोटिक युक्त एलबी माध्यम की 1-5 एमएल की संस्कृति का टीका लगाते हैं। जोरदार झटकों (300 आरपीएम) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 12-16 घंटे तक इनक्यूबेट।
    2. कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए 10,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज। डिकेंट या एस्पिरेट और संस्कृति मीडिया को त्यागें।
    3. समाधान I/RNase ए भंवर या पिपेट ऊपर और नीचे के २५० μL जोड़ें अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए । अच्छी पैदावार प्राप्त करने के लिए सेल पेलेट का पूर्ण पुनर्पेंशन महत्वपूर्ण है।
      नोट: RNase A उपयोग से पहले समाधान मैं करने के लिए जोड़ा जाना चाहिए।
    4. एक नई 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में निलंबन स्थानांतरित करें। समाधान द्वितीय के 250 μL जोड़ें। उलटा और धीरे-धीरे ट्यूब को कई बार घुमाएं ताकि स्पष्ट रूप से प्राप्त हो सके। 2-3 मिनट इनक्यूबेशन जरूरी हो सकता है।
      नोट: जोरदार मिश्रण से बचें क्योंकि इससे क्रोमोसोमल डीएनए और लोअर प्लाज्मिड शुद्धता होगी। लाइसिस रिएक्शन को 5 मिनट से ज्यादा आगे न बढ़ने दें।
    5. समाधान III के 350 μL जोड़ें। तुरंत कई बार उलटा जब तक एक फ्लोक्युलेट सफेद वर्षा रूपों।
      नोट: यह महत्वपूर्ण है कि समाधान को स्थानीयकृत वर्षा से बचने के लिए समाधान III के अलावा अच्छी तरह से और तुरंत बाद मिलाया जाता है।
    6. अधिकतम गति पर सेंट्रलाइज (≥13,000 x ग्राम)10 मिनट के लिए। एक कॉम्पैक्ट सफेद गोली बनेगी। तुरंत अगले कदम के लिए आगे बढ़ें।
    7. एक डीएनए मिनी कॉलम एक 2 एमएल संग्रह ट्यूब में डालें।
    8. इसे डीएनए मिनी कॉलम में सावधानीपूर्वक एस्पिरेशन करके 4.2.7 से स्वीकृत सुपरनेट को स्थानांतरित करें। सावधान रहें कि गोली को परेशान न करें और डीएनए मिनी कॉलम में कोई सेलुलर मलबे को स्थानांतरित न करें।
    9. 1 मिनट के लिए अधिकतम गति से अपकेंद्रित्र। फिल्ट्रेट को त्यागें और संग्रह ट्यूब का पुन: उपयोग करें।
    10. एचबीसी बफर के 500 माइक्रोन जोड़ें। 1 मिनट के लिए अधिकतम गति से अपकेंद्रित्र। फिल्ट्रेट को त्यागें और संग्रह ट्यूब का पुन: उपयोग करें।
      नोट: एचबीसी बफर को उपयोग से पहले 100% आइसोप्रोपैनॉल के साथ पतला किया जाना चाहिए।
    11. डीएनए वॉश बफर के 700 माइक्रोन जोड़ें। 1 मिनट के लिए अधिकतम गति से अपकेंद्रित्र। फिल्ट्रेट को त्यागें और संग्रह ट्यूब का पुन: उपयोग करें।
      नोट: डीएनए वॉश बफर को उपयोग करने से पहले 100% इथेनॉल के साथ पतला किया जाना चाहिए।
      1. वैकल्पिक: एक दूसरे डीएनए धोने बफर धोने कदम के लिए दोहराएं ।
    12. कॉलम मैट्रिक्स को सुखाने के लिए अधिकतम गति से 2 मिनट के लिए खाली डीएनए मिनी कॉलम को सेंट्रलाइज करें।
      नोट: यह संलसंक्षा से पहले डीएनए मिनी कॉलम मैट्रिक्स सूखी करने के लिए महत्वपूर्ण है । अवशिष्ट इथेनॉल डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों में हस्तक्षेप कर सकता है।
    13. डीएनए मिनी कॉलम को साफ 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    14. कॉलम झिल्ली के केंद्र में सीधे एल्यूशन बफर या बाँझ डिएकोन्ड पानी के 30-100 माइक्रोन जोड़ें।
      नोट: डीएनए मिनी कॉलम से डीएनए eluting की दक्षता पीएच पर निर्भर है । यदि बाँझ डिएकॉनाइज्ड पानी का उपयोग कर रहे हैं, तो सुनिश्चित करें कि पीएच 8.5 के आसपास है।
    15. 1 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर बैठने दें।
    16. 1 मिनट के लिए अधिकतम गति से अपकेंद्रित्र।
      नोट: यह बाध्य डीएनए के लगभग 70% का प्रतिनिधित्व करता है। एक वैकल्पिक दूसरा एल्यूशन किसी भी अवशिष्ट डीएनए निकलेगा, हालांकि कम एकाग्रता पर।
  3. इकोआर I (15 यू/माइक्रोन) और बाम एच1 (15 यू/माइक्रोन)22का उपयोग करके दोहरे प्रतिबंध एंजाइम पाचन का उपयोग करके उपरोक्त प्लाज्मिड्स को सत्यापित करें ।
    1. बर्फ पर मेकअप स्टेप्स करें। इकोआर I (15 यू), बाम एच1 (15 यू) के 1 माइक्रोन, 10x बफर के 2μL, प्लाज्मिड के 1 माइक्रोन की प्रतिक्रिया प्रणाली तैयार करें; कुल मात्रा के20माइक्रोन में डीडीएच 2 ओ जोड़ें, अच्छी तरह से मिलाएं। 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी स्नान में इनक्यूबेट करें।
    2. पचाने वाले उत्पादों को 1% से अलग करें, इसके बाद इलेक्ट्रोफोरेसिस और पहले की तरह यूवी लाइट का पर्दाफाश करें।
  4. डीडीएच 2 ओ का उपयोग करके शुरुआती मानक समाधान के लिए केंद्रित प्लाज्मिड को2x10 11 प्रतियां/एमएल में पतला करें। प्रतियों की गणना के उदाहरण के लिए पोर्सिन डीएनए का एक टुकड़ा युक्त प्लाज्मिड (P2) लें:
    1. मानक समाधान शुरू करने के 1 एमएल में प्लाज्मिड की संख्या कीगणना करें: एन = (2 x 10 11)/(6.02 x 1023)मोल।
    2. पी 2 के आणविक वजन की गणना करें: एम = 2810 बीपी एक्स 650 डी/बीपी = 2810 x 650 डी (जी/मोल)।
    3. पी 2 के द्रव्यमान की गणना करें: m=N*M = (2 x 10 11)//(6.02 x10 23)मोल x 2810 x 650 ग्राम/मोल।
    4. पी 2 की मात्रा की गणना करें: V = m/C = [(2 x 10 11)/(6.02 x 1023)x 2810 x 650] जी/सी (सी पी 2 (एनजी/माइक्रोन) की एकाग्रता है, जिसे स्पेक्ट्रोफोटोमीटर द्वारा मापा जाता है ।
  5. शुरुआती मानक समाधान को पतला करें 10-गुना 2 x10 10 प्रतियां/एमएल, 2 x 109 प्रतियां/एमएल, 2 x 108 प्रतियां/एमएल, 2 x 107 प्रतियां/एमएल..., और डीएच 2 ओ. 2 ओ. Vortex का उपयोग करते हुए मानक समाधान के लिए2x10 0 प्रतियां/एमएल पूरी तरह से मंदा होने के दौरान ।
  6. मानक वक्र स्थापित करें।
    1. क्यूपीसीआर की प्रतिक्रिया प्रणाली तैयार करें (सभी चरण प्रकाश से सुरक्षित हैं): प्री-मिक्स्ड समाधान जोड़ें जिसमें क्यूपीसीआर मिक्स(सामग्री की तालिका),5' प्राइमर के 13 माइक्रोन शामिल हैं, 3 ' प्राइमर के 13 माइक्रोन, और डीडीएच2ओ के 169 माइक्रोल को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में, जिसे तब अच्छी तरह से मिलाया गया था और थोड़ा अपकेंद्रित्र किया गया था।
    2. 8-ट्यूब स्ट्रिप में पूर्व-मिश्रित समाधान के ऊपर 40 माइक्रोन विभाजित करें और विभिन्न सांद्रता के मानक डीएनए के 10 माइक्रोन जोड़ें। ध्यान से कैप करें, मिक्स करें और सेंट्रलाइज थोड़ा करें।
    3. चित्रा 3में दिखाई गई प्रक्रिया के बाद क्यूपीसीआर मशीन में 8 ट्यूब स्ट्रिप रखो ।

5. रक्त के नमूनों से डीएनए परिसंचारी अलग

  1. EDTA ट्यूबों का उपयोग करना, सुअर से बंदर धमनी पैच मॉडल और सुअर से माउस सेल प्रत्यारोपण मॉडल में अलग-अलग समय बिंदुओं पर रक्त के नमूने एकत्र करें।
  2. लगभग 400 माइक्रोन (सुअर से बंदर धमनी पैच मॉडल) या 100 माइक्रोल (सुअर से माउस सेल प्रत्यारोपण मॉडल से) के रक्त नमूने एकत्र करें और 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें। रक्त कोशिकाओं को कम तापमान और उच्च गति (3,000 x ग्राम,4 डिग्री सेल्सियस, 5 मिनट) पर अपकेंद्रित्र द्वारा रक्त के नमूनों से हटा दें।
  3. सुपरनेट को एक नए 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और 10 मिनट के लिए 16,000 एक्स ग्राम पर अपकेंद्रित्र द्वारा सेल मलबे को हटा दें।
  4. सुपरनेट को एक नए 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। अलग जीनोमिक डीएनए निर्माताओं के प्रोटोकॉल के प्रोटोकॉल 2 के बाद एक वाणिज्यिक सीरम/परिसंचारी डीएनए निष्कर्षण किट का उपयोग कर ऊपर सुपरनैक्टेंट से परिसंचारी डीएनए निकालें ।
  5. डीएनए को 40 माइक्रोन में परिसंचारी की मात्रा को गाढ़ा करें और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

6. सुअर विशिष्ट डीएनए परिसंचारी की मात्रा

  1. क्यूपीसीआर मिक्स(सामग्रीकी तालिका), 5 'प्राइमर के 1 माइक्रोन, 3' प्राइमर के 1 माइक्रोन, नमूना डीएनए के 10 माइक्रोन, और डीडीएच 2 ओ के 13 माइक्रोन के25माइक्रोल का पूर्व मिश्रित समाधान तैयार करें। 2 अतिरिक्त नमूनों सहित मिश्रण तैयार करें।
  2. 40 माइक्रोन प्री-मिक्स्ड समाधान को 8-ट्यूब स्ट्रिप में विभाजित करें, और नमूना डीएनए के 10 माइक्रोन जोड़ें, इसके बाद सावधानीपूर्वक कैपिंग करें। जरूरत से दो और प्रतिक्रियाएं तैयार करें।
  3. मानक वक्र के रूप में एक ही प्रक्रिया के बाद qPCR मशीन में 8 ट्यूब पट्टी रखो । यह सुनिश्चित करने के लिए पहले एक मानक चलाना बेहतर है कि प्रतिक्रिया पहले से मात्राकरण के लिए महत्वपूर्ण है। क्यूपीसीआर की प्रतिक्रिया प्रणाली की प्रक्रिया चित्र 3में दिखाई गई थी .

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल में, पोर्सिन विशिष्ट प्राइमर डिजाइन किए गए थे, प्लाज्मिड युक्त पोर्सिन विशिष्ट डीएनए टुकड़े बनाए गए थे, और क्वांटिटेशन के लिए मानक घटता स्थापित किया गया था(चित्र 4)। पीसीआर द्वारा 19 प्राइमर की प्रजातियों की विशिष्टताओं की पुष्टि की गई । प्रजातियों के विशिष्ट प्राइमर (प्राइमर #4 और प्राइमर #11) तो सुअर से माउस सेल प्रत्यारोपण मॉडल और सुअर से बंदर धमनी पैच प्रत्यारोपण मॉडल में qPCR द्वारा cpsDNA मात्रा का उपयोग किया गया ।

एगरजॉरज इलेक्ट्रोफोरेसिस का उपयोग उपरोक्त नमूनों से प्रवर्धित डीएनए टुकड़ों को अलग करने के लिए किया गया था, जिसे तब एक पराबैंगनी इमेजर में कल्पना की जाती है। पीसीआर का उपयोग करते हुए, प्रवर्धित पोर्सिन जीनोमिक डीएनए के लिए विशिष्ट प्राइमर की पहचान पहले(चित्रा 2 ए)की गई थी। इसके अलावा, इन प्राइमर की कुछ प्रजातियों-विशिष्टताओं जो विशेष रूप से बंदर/मानव जीनोमिक या माउस जीनोमिक डीएनए की पलटन में सुअर डीएनए को परिलक्षित करते हैं(चित्रा 2B)की पुष्टि की गई थी । अंत में, दो प्रजातियों-विशिष्टताओं प्राइमर आगे विशेष रूप से सुअर में सुअर डीएनए बढ़ाना-बंदर धमनी पैच और/या सुअर से माउस सेल प्रत्यारोपण मॉडल, क्रमशः(चित्रा 2C)साबित किया गया ।

Figure 1
चित्रा 1: सुअर(sus scrofa,एसएससी) और मानव(होमो सेपियंस,है) या बंदर(Macaca fascicularis,mfa) के बीच जीन पहचान। तीन विभिन्न प्रजातियों के जीन दृश्यों की तुलना ब्लास्ट विश्लेषण द्वारा की गई थी । ब्लास्ट सीक्वेंस विश्लेषण ने एनसीबीआई (www.ncbi.nlm.nih.gov) से डाउनलोड की गई तीन प्रजातियों से जीनोमिक एनोटेशन जानकारी (एमआरएनए अनुक्रम) का इस्तेमाल किया। मानव, बंदर और सुअर जीन के एमआरएनए दृश्य क्रमशः 13 9 116, 65927 और 71498थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 2: नियमित पीसीआर पोर्सिन विशिष्ट प्राइमर की विशिष्टता को मान्य करता है। (एक सुअर जीनोमिक डीएनए टुकड़े प्राइमर 1-19 द्वारा परिलक्षित किया गया । (ख)मानव/बंदर/चूहों जीनोमिक डीएनए टुकड़ा कुछ प्राइमर (प्राइमर #4 और #11) द्वारा परिलक्षित नहीं किया जा सकता है । तारे (*) मानव/बंदर जीनोमिक डीएनए में कोई प्रवर्धन का संकेत नहीं देते हैं । पाउंड साइन (#) माउस जीनोमिक डीएनए में कोई प्रवर्धन इंगित करता है । (ग)दो प्रजातियों-विशिष्टताओं प्राइमर (प्राइमर #4 और #11) को विशेष रूप से सुअर से बंदर धमनी पैच और/या सुअर से माउस सेल प्रत्यारोपण मॉडल, क्रमशः22में सुअर डीएनए बढ़ाना साबित किया गया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 3: क्यूपीसीआर प्रतिक्रिया के लिए प्रक्रिया22। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें । 

Figure 3
चित्र 4: पूर्ण मात्राकरण के लिए मानक वक्र की स्थापना। प्रवर्धन भूखंड, पिघल वक्र भूखंड, और क्यूपीसीआर मशीन (सामग्रीकी तालिका देखें) से(ए)प्राइमर #4 और(बी)प्राइमर #11 के मानक वक्र दृश्य प्रदर्शित किए जाते हैं। एक अच्छा मानक (आर मूल्य 1 के करीब, प्रवर्धन दक्षता 100% ±5% के भीतर है) अप अप एक साल22लिए इस्तेमाल किया जा सकता है . कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

तालिका 1. कृपया इस टेबल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

डीएनए परिसंचारी पोर्सिन की मात्रा निर्धारित करना ज़ेनोट्रांज्लांटेशन की प्रतिरक्षा अस्वीकृति की निगरानी करने के लिए एक व्यवहार्य दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है। गादी एट अल24 ने पाया कि तीव्र अस्वीकृति वाले रोगियों के रक्त में दाता-व्युत्पन्न परिसंचारी डीएनए (डीडीसीएफडीएनए) सामग्री अस्वीकृति के बिना रोगियों की तुलना में काफी अधिक थी । इन अध्ययनों से पता चलता है कि डीडीसीएफडीएनए अंग भ्रष्टाचार के नुकसान की निगरानी के लिए एक आम बायोमार्कर हो सकता है। हाल के वर्षों में, क्यूपीसीआर को अपने सरल ऑपरेशन, उच्च स्तर के स्वचालन, उच्च संवेदनशीलता, अच्छी विशिष्टता और कम लागत के कारण न्यूक्लिक एसिड के विश्लेषण के लिए तेजी से लागू किया गया है।

इस अध्ययन में, पोर्सिन विशिष्ट प्राइमर बायोइन्फॉर्मेटिक्स विश्लेषण के परिणामों के आधार पर डिजाइन किए गए थे। उनकी विशिष्टता का सत्यापन नियमित पीसीआर द्वारा किया जाता था। सुअर से बंदर धमनी पैच मॉडल और सुअर से माउस सेल प्रत्यारोपण मॉडल के रक्त नमूनों के cpsDNA प्रजातियों विशिष्ट प्राइमर के साथ qPCR द्वारा ठीक मात्रा निर्धारित किया जा सकता है । दृष्टिकोण के मुख्य फायदे इस प्रकार हैं। सबसे पहले, अत्यधिक विशिष्ट प्राइमर के आधार पर, डीएनए की मात्रा निर्धारित करने की यह विधि अत्यधिक संवेदनशील और विशिष्ट है । इसके अलावा, दृष्टिकोण का प्रोटोकॉल प्रदर्शन करने के लिए बहुत सरल है, जिसमें विशिष्ट प्राइमर का डिजाइन, डीएनए का अलगाव और एक कार्य दिवस में क्यूपीसीआर विश्लेषण शामिल था, जो बारासेविंग है। यह एक गैर-आक्रामक विधि है जो सीरम या प्लाज्मा सामग्री की एक छोटी मात्रा से शुरू होती है। इस बीच, हमने दिखा दिया है कि यह विधि अत्यधिक पुन: उत्पन्न करने योग्य22है । उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण और उड़ान द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री के विपरीत, यह विधि कम लागत है।

क्यूपीसीआर का उपयोग करके सुअर-से-बंदर धमनी पैच मॉडल और सुअर-से-माउस सेल प्रत्यारोपण मॉडल के रक्त में परिसंचारी सुअर-विशिष्ट डीएनए की मात्राकरण द्वारा प्रतिरक्षा अस्वीकृति की निगरानी ने बुनियादी अनुसंधान और पोर्सिन-ह्यूमन ज़ेनोट्रांज्लांटेशन के नैदानिक अनुप्रयोग की नींव रखी है।

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Disclosures

लेखकों की रिपोर्ट हितों का कोई टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को चीन के राष्ट्रीय कुंजी अनुसंधान और विकास कार्यक्रम (2017YFC1103704), शेनझेन फाउंडेशन ऑफ साइंस एंड टेक्नोलॉजी (JCYJ201708172116272), गुआंगदोंग प्रांत में उच्च स्तरीय अस्पतालों के निर्माण के लिए विशेष धन (2017YFC1103704) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था । 2019), शेनझेन में चिकित्सा परियोजना (SZSM201412020), शेनझेन के उच्च स्तरीय चिकित्सा अनुशासन निर्माण के लिए निधि (2016031638), शेर्ज़ेन फाउंडेशन ऑफ हेल्थ एंड फैमिली प्लानिंग कमीशन (SZXJ2017021 , SZXJ2018059) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Biowest, Barcelona, Spain 111860
BamHI-HF New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA R3136S
1.5 mL microcentrifuge tube Axygen Biosciences, Union City, CA, USA MCT-150-C
0.2 mL PCR tube Axygen Biosciences, Union City, CA, USA PCR-02-C
C57BL/6 Mice Medical Animal Center of Guangdong Province,  China 8~10 weeks
Centrifuge Thermo Fisher Scientific, Walt- ham, MA, USA Micro 21R
2-Log DNA Ladder New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA N3200S 0.1–10.0 kb
Marker I  Tiangen, Beijing, China MD101-02 0.1–0.6 kb
DNA Mini Column(HiBind DNA Mini Columns) Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA DNACOL-01
DNA loading buffer Solarbio, Beijing, China D1010
E.Z.N.A.Plasmid DNA Mini Kit I and E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit II Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA D6942
D6943
EcoR I Takara Bio, Shiga, Japan  1040S
Female Bama mini pigs BGI Ark Biotechnology, Shenzhen, China 2~4 months
Genomic DNA Extraction Kit ? Tiangen, Beijing, China DP304-02
SYBR Green Realtime PCR Master Mix Toyobo, Osaka, Japan QPK-201
Gel Doc XR Bio-Rad, Hercules, USA
Male cynomolgus monkeys Guangdong Landau Biotechnology, Guangzhou, China 8 years
Nucleic acid dye(Gelred) Biotium, Fremont, USA 42003
polymerase(Premix Taq) Takara Bio, Shiga, Japan RR901A
pMD19-T plasmid Takara Bio, Shiga, Japan D102A
qPCR machine Applied Biosystems QSDx, Waltham, USA
Serum/Circulating DNA Extraction Kit Tiangen, Beijing, China DP339
TAE sangon Biotech, Shanghai, China B548101

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References

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जीव विज्ञान अंक 163 विशिष्ट प्राइमर सुअर-विशिष्ट डीएनए क्यूपीसीआर ज़ेनोट्रांज्लांटेशन बायोमार्कर प्रतिरक्षा अस्वीकृति
एक Xenotransplantation मॉडल के रक्त में सुअर विशिष्ट डीएनए परिसंचारी की मात्राकरण
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Deng, Y., Zhou, M., Lu, Y., Chen,… More

Deng, Y., Zhou, M., Lu, Y., Chen, J., Pu, Z., Yu, D., Dai, Y., Zhan, Y., Mou, L. Quantification of Circulating Pig-Specific DNA in the Blood of a Xenotransplantation Model. J. Vis. Exp. (163), e61579, doi:10.3791/61579 (2020).

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