Summary
In diesem Protokoll wurden schweinespezifische Primer entwickelt, Plasmiden enthaltende Porenspezifische DNA-Fragmente konstruiert und Standardkurven für die Quantifizierung festgelegt. Anhand artspezifischer Primer wurde cpsDNA durch qPCR in Schweine-zu-Maus-Zelltransplantationsmodellen und Schweine-zu-Affen-Arterien-Patch-Transplantationsmodellen quantifiziert.
Abstract
Xenotransplantation ist eine praktikable Methode zur Behandlung von Organversagen. Jedoch, wie die Immunabstoßung von Xenotransplantation effektiv zu überwachen ist ein Problem für Ärzte und Forscher. Dieses Manuskript beschreibt eine einfache und effektive Methode zur Überwachung der Immunabstoßung in Schweine-zu-Maus-Zelltransplantationsmodellen und Schweine-zu-Affen-Arterien-Patch-Transplantationsmodellen. Zirkulierende DNA ist ein potenziell nicht-invasiver Biomarker für Organschäden. In dieser Studie wurde zirkulierende schweinespezifische DNA (cpsDNA) während der Xenograft-Abstoßung durch quantitative Echtzeit-PCR (qPCR) überwacht. In diesem Protokoll wurden schweinespezifische Primer entwickelt, Plasmiden enthaltende Porenspezifische DNA-Fragmente konstruiert und Standardkurven für die Quantifizierung festgelegt. Artspezifische Primer wurden dann verwendet, um cpsDNA durch qPCR in Schweine-zu-Maus-Zell-Transplantationsmodellen und Schweine-zu-Affen-Arterien-Patch-Transplantationsmodellen zu quantifizieren. Der Wert dieser Methode legt nahe, dass es als eine einfache, bequeme, kostengünstige und weniger invasive Methode verwendet werden kann, um die Immunabstoßung von Xenotransplantation zu überwachen.
Introduction
Organversagen ist eine der Haupttodesursachen1. Transplantation von Zellen, Geweben und Organen ist ein effektiver Weg, um Organversagen zu behandeln2. Dennoch schränkt der Mangel an Spenderorganen die klinische Anwendung dieser Methodeein 3,4. Studien haben gezeigt, dass Schweine als potenzielle Quelle menschlicher Organe für die klinische Transplantation verwendet werden können5,6. Die artenübergreifende Organtransplantation ist jedoch mit einer gefährlichen Immunabstoßung konfrontiert. Daher ist es wichtig, die Immunabstoßung von Xenotransplantation zu überwachen. Derzeit hängt die klinische Überwachung der Immunabstoßung hauptsächlich von den Anzeichen und Symptomen des Patienten ab, sowie von Labortests (z.B. Biopsie, immunbiochemische Analyse und Ultraschall)7,8,9. Diese Überwachungsmethoden haben jedoch viele Nachteile. Die Anzeichen und Symptome einer Immunabstoßung bei Patienten erscheinen in der Regel spät10, was nicht förderlich für Früherkennung und frühzeitige Intervention ist; Biopsie hat den Nachteil, invasiv zu sein11, was für Patienten nicht leicht zu akzeptieren ist; Immunbiochemische Analyse fehlt Empfindlichkeit oder Spezifität, und Ultraschall ist Hilfs- und teuer. Daher ist es dringend notwendig, eine effektive und bequeme Methode zu finden, um die Immunabstoßung zu überwachen.
Zirkulierende DNA ist eine extrazelluläre Art von DNA, die im Blut gefunden wird. Mandel und Metais12 berichteten erstmals 1948 über das Vorhandensein von zirkulierender DNA im peripheren Blut. Unter normalen physiologischen Bedingungen ist die zirkulierende DNA im Blut gesunder Menschen zu Beginn relativ niedrig. Jedoch, in einigen Pathologien, wie Tumoren, Myokardinfarkt, Autoimmunerkrankungen, und Transplantation Abstoßung, kann der Grad der zirkulierenden DNA im Blut deutlich erhöht werden13,14 aufgrund der massiven Freisetzung von zirkulierender DNA durch Apoptose und Nekrose verursacht. Der Ursprung der zirkulierenden DNA ist mit Apoptose und Nekrose15verbunden, die für die Xenograft-Abstoßung16charakteristisch sind.
Zirkulierende DNA hat sich als minimal-invasiver Biomarker zum Nachweis von Krebserkrankungen17,18,19erwiesen. Eine hohe Durchsatzsequenzierung der von Spendern abgeleiteten zirkulierenden DNA ist zuverlässig für den Nachweis der Abstoßung nach Organtransplantation20,21. Diese Methode erfordert jedoch eine hohe Konzentration und Qualität der extrahierten DNA. Die DNA-Anforderungen zusätzlich zu den hohen Kosten und dem hohen Zeitverbrauch machen diese Methode für eine routinemäßige klinische Anwendung nicht förderfähig. Spender-abgeleitete zirkulierende DNA kann durch quantitative Echtzeit-PCR (qPCR) genau quantifiziert werden, die sowohl spezifisch als auch empfindlich ist. Daher ist die Quantifizierung der zirkulierenden Porcine-DNA durch qPCR eine praktikable Methode, um die Immunabstoßung von Xenotransplantationen zu überwachen. Dies ist weniger invasiv, hochsensibel und spezifisch, kostengünstig und zeitsparend. Schweine und Menschen sind genetisch getrennt mit ganz unterschiedlichen genomischen Sequenzen (Abbildung 1). Daher kann zirkulierende Schweine-DNA aufgrund von Xeno-Abstoßung in das Blut des Empfängers freigesetzt werden. CpsDNA könnte durch qPCR mit artspezifischen Primern im Blut des Empfängers präzise quantifiziert werden. Zuvor haben wir die Gründe und Machbarkeit von cpsDNA als Biomarker für xenotransplantation22,23demonstriert. Hier geben wir weitere experimentelle Tipps und Details bekannt. Das Experiment besteht aus den folgenden Schritten. Erstens wurden porenspezifische Primer entwickelt und genomische DNA isoliert, die verwendet wurde, um die Spezifität der Primer durch regelmäßige PCR zu überprüfen. Zweitens, die Konstruktion der Standardkurve von cpsDNA und die Isolierung von cpsDNA aus dem Probenblut. Schließlich wurde die zirkulierende schweinespezifische DNA mit qPCR quantifiziert.
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Protocol
Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den einschlägigen Richtlinien und Vorschriften des Institutional Review Board des Shenzhen Second People es Hospital, First Affiliated Hospital der Shenzhen University durchgeführt.
1. Entwerfen Sie porcine spezifische Primer
- Führen Sie eine Vollgenom-BLAST-Analyse durch, um porenspezifische Gene zu identifizieren, die sich von denen von Menschen, Affen oder Mäusen unterschieden, mit der Software NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov).
- Designprimer nach 19 schweinespezifischen Genen (Tabelle 1) mit der Software von Primer 5.
2. Isolierung der genomischen DNA
HINWEIS: Die genomische DNA (einschließlich Blut von Schweinen, Affen, freiwilligen Menschen, Affen mit Schweinetransplantaten und Mäusen mit Schweinezellen) wurde mit einem kommerziellen genomischen DNA-Extraktionskit(Table of Materials)extrahiert.
- Legen Sie 500 l des Vollblutes der oben genannten Proben in verschiedene Mikrozentrifugenröhrchen.
- Fügen Sie 20 l Protease K und 500 l Lysepuffer in die oben genannten Mikrozentrifugenrohre und dann gründlich schütteln und mischen.
- Legen Sie diese Mikrozentrifugenrohre 10 min bei 56 °C in ein Wasserbad und schütteln Sie dabei 2-3 Mal, bis die Lösung klar wird.
- Zentrifuge kurz, um die flüssigen Perlen von der Innenwand der Rohrabdeckungen zu entfernen. 500 l wasserfreien Ethylalkohol hinzufügen und gründlich schütteln.
- Übertragen Sie die Mischung in die Adsorptionssäule, Zentrifuge bei 12.000 U/min (ca. 13.400 x g) für 2 min.
- Fügen Sie jeder Adsorptionsspalte 800 L Spüllösung hinzu; Zentrifuge für 1 min bei 12.000 U/min ( 13.400 x g). Legen Sie die Säulen für einige Minuten bei Raumtemperatur, um die verbleibende Spüllösung zu trocknen.
HINWEIS: Die Spüllösung wird vom Hersteller bereitgestellt. - Übertragen Sie die Adsorptionssäulen in ein anderes sauberes Zentrifugalrohr, fügen Sie 50 L Elutionspuffer in die Mitte der Adsorptionsfolien ein und platzieren Sie sie bei Raumtemperatur für 2-5 min. Zentrifuge 6.200 x g für 1 min 12.000 U/min (ca. 13.400 x g).
HINWEIS: Der Elutionspuffer wird vom Hersteller bereitgestellt, aber der TE-Puffer, der 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) und 0,1 mM EDTA enthält, kann auch die DNA entschärten. - Bewahren Sie die DNA-Lösung bei -20 °C auf.
3. Überprüfen Sie die Spezifität der Primer
ANMERKUNG: Die Spezifitäten der oben genannten 19 Primer wurden durch PCR bestätigt, die mit Polymerase (Materialtabelle) und Primern in Tabelle 1durchgeführt wurde.
- Bereiten Sie die vorgemischte Lösung von 12,5 l 2x PCR-Vormischung(Materialtabelle),1 l 5' Primer (10 'M), 1 l von 3' Primer (10 'M) und 8,5 l ddH2O vor. Bereiten Sie die Mischung mit 2 zusätzlichen Proben vor.
- Die vorgemischte Lösung mit 23 l in 0,2 ml Mikrozentrifugenröhren aufteilen, 2 l genomische DNA hinzufügen und die Röhrchen vorsichtig verkappen. Dann mischen und Zentrifuge leicht.
- Legen Sie die 0,2 ml Mikrozentrifugenrohre in den PCR-Cycler und führen Sie Folgendes durch: Denaturierung: 95 °C für 5 s; Glühen: 60 °C für 30 s; Verlängerung: 72 °C für 30 s.
- Führen Sie die Agaroseelektrophorese wie folgt auf:
- 1,2 g Agarose in einen Kolben mit 100 ml 1x TAE wiegen und 5 min in der Mikrowelle kochen. Fügen Sie 5 l Nukleinsäurefarbstoff (Materialtabelle) in den Kolben, nachdem er auf ca. 70 °C abgekühlt ist. Gießen Sie es langsam in die Platte entlang der Kante, und legen Sie es bei Raumtemperatur, bis es zu einem Gel verfestigt.
- Fügen Sie dem Agarose-Gel 5 l Probe und 2-Log DNA-Leiter (0,1–10,0 kb) oder Marker I (0,1–0,6 kb) hinzu, die 1 l 6x DNA-Ladepuffer enthalten. Dann Elektrophorese bei 120 mA, bis die Bänder getrennt sind.
- Visualisieren Sie das Agar-Gel, das DNA-Fragmente enthält, mit einem ultravioletten Imager.
- Führen Sie eine Agarose-Elektrophorese durch, um verstärkte DNA-Fragmente aus den oben genannten Proben zu isolieren, die in einem ultravioletten Imager visualisiert wurden. Mit Hilfe der PCR wurden zunächst die für die genomische DNA von Amplifinporen spezifischen Primer identifiziert (Abbildung 2A). Darüber hinaus wurden bestimmte Artenspezifitäten dieser Primer bestätigt, die die Schweine-DNA in der Kohorte des Affen/menschlichen Genoms oder in der Kohorte der genomischen DNA der Maus gezielt verstärkten (Abbildung 2B). Schließlich wurden zwei Arten-Spezifitäten-Primer nachgewiesen, um die Schweine-zu-Affen-Arterie und/oder die Schweine-zu-Maus-Zelltransplantationsmodelle gezielt zu verstärken (Abbildung 2C)
4. Standardkurve von cpsDNA
- Transformieren Sie das pMD19-T Plasmid, das ein Fragment der Schweine-DNA enthält, in DH5a um, das speziell durch Primer-#4 oder Primer-#11 verstärkt werden könnte (Tabelle 1). Bildschirm für positive Bakterien mit 50 g/ml Ampicillin.
Primer #4 in der Human-/Affenkohorte (vorwärts: 5-TTCAATCCCA CTTCTTCCACCTAA-3, Rückseite: 5'-CTTCATTCCATCTTCATAATAAC CCTGT-3')
Primer #11 für Mausmodell (vorwärts: 5'-TGCCGTGGTTTCC GTTGCTTG-3', Rückseite: 5'-TCACATTTGATGGTCCTTGTCGTC T-3')
HINWEIS: Einzelheiten zu allen Primern finden Sie in Tabelle 1. - Ernten Sie die oben genannten Plasmide nach dem folgenden Protokoll.
- Isolieren Sie eine einzelne Kolonie von einer frisch gestreiften selektiven Platte und impfen Sie eine Kultur von 1- 5 ml LB-Medium, das das entsprechende selektive Antibiotikum enthält. 12-16 Stunden bei 37 °C mit kräftigem Schütteln (300 Rpm) inkubieren.
- Zentrifuge bei 10.000 x g für 1 Minute bei Raumtemperatur. Dekantieren oder aspirieren und verwerfen Sie die Kulturmedien.
- Fügen Sie 250 L Solution I/RNase A. Vortex oder Pipette nach oben und unten hinzu, um sie gründlich zu mischen. Eine vollständige Resuspension des Zellpellets ist entscheidend, um gute Erträge zu erzielen.
HINWEIS: RNase A muss Lösung I vor der Verwendung hinzugefügt werden. - Transfersuspension in ein neues 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr. Fügen Sie 250 L von Lösung II hinzu. Invertieren und drehen Sie das Rohr mehrmals, um ein klares Lysat zu erhalten. Eine 2-3 Minuten Inkubation kann erforderlich sein.
HINWEIS: Vermeiden Sie eine kräftige Vermischung, da dies chromosomale DNA und geringere Plasmidreinheit scheren wird. Lassen Sie die Lysereaktion nicht mehr als 5 Minuten dauern. - Fügen Sie 350 L der Lösung III hinzu. Sofort mehrmals umkehren, bis sich ein flockendes weiß ausgefälltes bildet.
HINWEIS: Es ist wichtig, dass die Lösung gründlich und unmittelbar nach dem Hinzufügen von Lösung III gemischt wird, um lokalisierte Niederschläge zu vermeiden. - Zentrifuge mit maximaler Geschwindigkeit (≥13.000 x g) für 10 Minuten. Ein kompaktes weißes Pellet bildet sich. Gehen Sie umgehend mit dem nächsten Schritt fort.
- Legen Sie eine DNA-Minisäule in ein 2 ml-Sammelrohr ein.
- Übertragen Sie den gelöschten Überstand von 4.2.7, indem Sie ihn sorgfältig in die DNA-Minisäule untersuchen. Achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören und dass kein Zellmüll auf die DNA-Minisäule übertragen wird.
- Zentrifuge mit maximaler Geschwindigkeit für 1 Minute. Entsorgen Sie das Filtrat, und verwenden Sie das Sammelrohr wieder.
- Fügen Sie 500 L HBC Buffer hinzu. Zentrifuge mit maximaler Geschwindigkeit für 1 Minute. Entsorgen Sie das Filtrat und verwenden Sie das Sammelrohr wiederverwenden.
HINWEIS: HBC Buffer muss vor der Anwendung mit 100% Isopropanol verdünnt werden. - Fügen Sie 700 l DNA-Waschpuffer hinzu. Zentrifuge mit maximaler Geschwindigkeit für 1 Minute. Entsorgen Sie das Filtrat, und verwenden Sie das Sammelrohr wieder.
HINWEIS: DER DNA Wash Buffer muss vor der Verwendung mit 100% Ethanol verdünnt werden.- Optional: Wiederholen Sie dies für einen zweiten DNA-Waschpuffer-Waschschritt.
- Zentrifugieren Sie die leere DNA-Minisäule für 2 Minuten mit maximaler Geschwindigkeit, um die Säulenmatrix zu trocknen.
HINWEIS: Es ist wichtig, die DNA-Mini-Säulenmatrix vor der Elution zu trocknen. Restethanol kann nachgeschaltete Anwendungen beeinträchtigen. - Übertragen Sie die DNA-Minisäule in ein sauberes 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr.
- Fügen Sie 30-100 L Elution Buffer oder steriles deionisiertes Wasser direkt in die Mitte der Säulenmembran.
HINWEIS: Die Effizienz der Verdünnung von DNA aus der DNA Mini-Säule ist vom pH-Wert abhängig. Wenn Sie steriles entionisiertes Wasser verwenden, stellen Sie sicher, dass der pH-Wert bei etwa 8,5 liegt. - Lassen Sie bei Raumtemperatur für 1 Minute sitzen.
- Zentrifuge mit maximaler Geschwindigkeit für 1 Minute.
HINWEIS: Dies entspricht etwa 70% der gebundenen DNA. Eine optionale zweite Elution ergibt eine Rest-DNA, wenn auch in einer niedrigeren Konzentration.
- Überprüfen Sie die oben genannten Plasmide mit Hilfe der doppelten Enzymverdauung mit EcoR I (15 U/L) und Bam H1(15 U/L)22.
- Führen Sie die Make-up-Schritte auf dem Eis. Bereiten Sie das Reaktionssystem von 1 l EcoR I (15 U), 1 l Bam H1 (15 U), 2 l von 10x Puffer, 1 g Plasmid vor; ddH2O bis 20 L des Gesamtvolumens hinzufügen, gründlich mischen. Inkubieren Sie in einem Wasserbad bei 37 °C für 2 Stunden.
- Trennen Sie die verdauten Produkte durch 1% Agarose, gefolgt von Elektrophorese und setzen Sie UV-Licht wie bisher aus.
- Verdünnen Sie das konzentrierte Plasmid in 2 x 1011 Kopien/ml für die Ausgangsstandardlösung mit ddH2O. Nehmen Sie das Plasmid (P2), das ein Fragment der Schweine-DNA enthält, zum Beispiel von Kopien, die berechnen:
- Berechnen Sie die Anzahl der Plasmide in 1 ml der Ausgangsstandardlösung: N = (2 x 1011)/ (6.02 x 1023) mol.
- Berechnen Sie das Molekulargewicht von P2: M = 2810 bp x 650 D/bp = 2810 x 650 D (g/mol).
- Berechnen Sie die Masse von P2: m=N*M= (2 x 1011)/ (6.02 x 1023) mol x 2810 x 650 g/mol.
- Berechnen Sie das Volumen von P2: V = m/C = [(2 x 1011)/(6.02 x 1023) x 2810 x 650] g/C. (C ist die Konzentration von P2 (ng/l), die mit einem Spektralphotometer gemessen wird).
- Verdünnen Sie die Ausgangsstandardlösung seriell 10-fach in 2 x 1010 Kopien/ml, 2 x 109 Kopien/ml, 2 x 108 Kopien/ml, 2 x 107 Kopien/ml... und 2 x 100 Kopien/ml für Standardlösung mit ddH2O. Vortex gründlich während der Verdünnung.
- Legen Sie die Standardkurve fest.
- Reaktionssystem von qPCR vorbereiten (alle Schritte sind lichtgeschützt): Fügen Sie die vorgemischte Lösung, die 325 l qPCR Mix(Materialtabelle),13 l 5' Primer, 13 'L von 3' Primer und 169 l ddH2O enthält, in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr, das dann gründlich gemischt und leicht zentrifugiert wurde.
- Teilen Sie die 40 l über vorgemischte Lösung in einen 8-Rohr-Streifen auf und fügen Sie 10 l Standard-DNA mit unterschiedlichen Konzentrationen hinzu. sorgfältig kappen, mischen und zentrifugieren leicht.
- Setzen Sie den 8-Rohr-Streifen nach dem in Abbildung 3beschriebenen Verfahren in die qPCR-Maschine ein.
5. Isolieren Zirkulierender DNA aus den Blutproben
- Sammeln Sie mit EDTA-Röhren Blutproben zu verschiedenen Zeitpunkten in den Schweine-zu-Affen-Arterien-Patch-Modellen und den Schweine-zu-Maus-Zelltransplantationsmodellen.
- Sammeln Sie Blutproben von ca. 400 l (aus den Schweine-zu-Affen-Arterien-Patch-Modellen) oder 100 l (aus den Schweine-zu-Maus-Zell-Transplantationsmodellen) und übertragen Sie sie in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhren. Entfernen Sie die Blutkörperchen aus den Blutproben durch Zentrifugation bei niedriger Temperatur und hoher Geschwindigkeit (3.000 x g,4 °C, 5 min).
- Übertragen Sie den Überstand auf ein neues 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr und entfernen Sie den Zellabfall durch Zentrifugation bei 16.000 x g für 10 min.
- Übertragen Sie den Überstand auf ein neues 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr. Extrahieren Sie die zirkulierende DNA aus dem obigen Überstand mit einem kommerziellen Serum/zirkulierenden DNA-Extraktionskit nach Protokoll 2 des Protokolls der isolierenden genomischen DNA-Hersteller.
- Kondensieren Sie das Volumen der zirkulierenden DNA auf 40 l und lagern Sie es bei -20 °C.
6. Quantifizierung zirkulierender schweinespezifischer DNA
- Bereiten Sie die vorgemischte Lösung von 25 l qPCR Mix(Materialtabelle), 1 l 5' Primer, 1 l 3' Primer, 10 l Sample DNA und 13 l ddH2O vor. Bereiten Sie die Mischung mit 2 zusätzlichen Proben vor.
- Teilen Sie die vorgemischte Lösung von 40 l in einen 8-Rohr-Streifen auf, und fügen Sie 10 l Proben-DNA hinzu, gefolgt von einer sorgfältigen Verkappung. Bereiten Sie zwei weitere Reaktionen als nötig vor.
- Setzen Sie den 8-Rohr-Streifen nach dem gleichen Verfahren wie die Standardkurve in die qPCR-Maschine. Es ist besser, zuerst einen Standard auszuführen, um sicherzustellen, dass die Reaktion für die Quantifizierung im Voraus entscheidend ist. Das Verfahren des Reaktionssystems von qPCR war in Abbildung 3dargestellt.
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Representative Results
In diesem Protokoll wurden schweinespezifische Primer entwickelt, Plasmiden enthaltende Porenspezifische DNA-Fragmente konstruiert und Standardkurven für die Quantifizierung festgelegt (Abbildung 4). Die Spezifitäten der 19 Primer wurden von PCR bestätigt. Artspezifische Primer (Primer #4 und Primer #11) wurden dann verwendet, um cpsDNA durch qPCR in Schweine-zu-Maus-Zell-Transplantationsmodellen und Schweine-zu-Affen-Arterien-Patch-Transplantationsmodellen zu quantifizieren.
Die Agarose-Elektrophorese wurde verwendet, um verstärkte DNA-Fragmente aus den oben genannten Proben zu isolieren, die dann in einem ultravioletten Imager visualisiert werden. Mit PCR wurden zunächst die für die genomische DNA des verstärkten Porcine-Porens spezifischen Primer identifiziert (Abbildung 2A). Darüber hinaus wurden bestimmte Artenspezifitäten dieser Primer bestätigt, die die Schweine-DNA in der Kohorte des Affen/menschlichen Genoms oder in der Kohorte der genomischen DNA der Maus spezifisch verstärkten (Abbildung 2B). Schließlich wurden zwei Arten-Spezifitäten-Primer nachgewiesen, um die Schweine-zu-Affen-Arterien-Patch bzw./oder Schwein-zu-Maus-Zelltransplantationsmodelle spezifisch zu verstärken (Abbildung 2C).
Abbildung 1: Genidentität zwischen Schwein (sus scrofa, ssc) und Human (homo sapiens, hat) oder Affe (Macaca fascicularis, mfa). Die Gensequenzen von drei verschiedenen Arten wurden durch BLAST-Analyse verglichen. Die BLAST-Sequenzanalyse verwendete genomische Anmerkungsinformationen (die mRNA-Sequenz) der drei aus NCBI heruntergeladenen Arten (www.ncbi.nlm.nih.gov). Die mRNA-Sequenzen von Human-, Affen- und Schweinegenen waren 139116, 65927 bzw. 71498 bzw.22. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Regelmäßige PCR validiert die Spezifität von schweinespezifischen Primern. (A Die genomischen DNA-Fragmente des Schweins wurden durch Primer 1-19 verstärkt. (B) Das genomische DNA-Fragment mensch/affe/Mäuse konnte durch einige Primer (Primer #4 und #11) nicht verstärkt werden. Die Sterne (*) weisen auf keine Amplifikationen in der genomischen DNA von Mensch und Affe hin. Das Pfundzeichen () zeigt keine Amplifikation in der genomischen DNA der Maus an. (C) Die beiden Arten-Spezifitäten-Primer (Primer #4 und #11) haben sich ferner als spezifisch zur Verstärkung der Schweine-zu-Affen-Arterien-Patch- und/oder Schweine-zu-Maus-Zelltransplantationsmodelle, bzw.22,erwiesen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Das Verfahren für die qPCR-Reaktion22. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Festlegung der Standardkurve für die absolute Quantifizierung. Die Amplifikationsdiagramme, die Schmelzkurvendiagramme und die Standardkurvenansichten von (A) Primer #4 und (B) Primer #11 von der qPCR-Maschine (siehe Tabelle der Materialien) werden ausgestellt. Ein guter Standard (R-Wert nahe 1, Verstärkungseffizienz liegt innerhalb von 100%±5%) bis zu einem halben Jahr22verwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Tabelle 1. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
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Discussion
Die Quantifizierung der zirkulierenden Poren-DNA stellt einen praktikablen Ansatz zur Überwachung der Immunabstoßung von Xenotransplantationen dar. Gadi et al.24 fanden heraus, dass der von Spendern abgeleitete zirkulierende DNA-Gehalt (ddcfDNA) im Blut von Patienten mit akuter Abstoßung signifikant höher war als der von Patienten ohne Abstoßung. Diese Studien deuten darauf hin, dass ddcfDNA ein häufiger Biomarker für die Überwachung von Organtransplantatschäden sein kann. In den letzten Jahren wurde qPCR aufgrund seiner einfachen Bedienung, seines hohen Automatisierungsgrades, der hohen Empfindlichkeit, der guten Spezifität und der niedrigen Kosten zunehmend auf die Analyse von Nukleinsäuren angewendet.
In dieser Studie wurden auf der Grundlage der Ergebnisse der Bioinformatik-Analyse schweinespezifische Primer entwickelt. Ihre Spezifität wurde durch regelmäßige PCR überprüft. Die cpsDNA der Blutproben der Schweine-Zu-Affen-Arterien-Patch-Modelle und der Schweine-zu-Maus-Zelltransplantationsmodelle konnten durch qPCR mit artspezifischen Primern präzise quantifiziert werden. Die Hauptvorteile des Ansatzes sind wie folgt. Erstens ist diese Methode der Quantifizierung der DNA auf der Grundlage der hochspezifischen Primer hochsensibel und spezifisch. Darüber hinaus ist das Protokoll des Ansatzes sehr einfach durchzuführen, das aus dem Design spezifischer Primer, der Isolierung der DNA und der qPCR-Analyse an einem Arbeitstag bestand, was zeitsparend ist. Es ist eine nicht-invasive Methode, die von einem kleinen Volumen an Serum oder Plasmamaterial ausgeht. Inzwischen haben wir gezeigt, dass diese Methode sehr reproduzierbar ist22. Im Gegensatz zur Hochdurchsatzsequenzierung und Flugmassenspektrometrie ist diese Methode kostengünstig.
Die Überwachung der Immunabstoßung durch Quantifizierung zirkulierender schweinespezifischer DNA im Blut von Schweine-zu-Affen-Arterien-Patchmodellen und Schweine-zu-Maus-Zelltransplantationsmodellen mit qPCR hat den Grundstein für die Grundlagenforschung und die klinische Anwendung von Schweine-Human-Xenotransplantationgelegtgelegt gelegt.
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Disclosures
Die Autoren berichten von keinen Interessenkonflikten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Stipendien des National Key R&D Program of China (2017YFC1103704), Shenzhen Foundation of Science and Technology (JCYJ20170817172116272), Special Funds for the Construction of High Level Hospitals in Guangdong unterstützt. Provinz (2019), Sanming Project of Medicine in Shenzhen (SZSM201412020), Fund for High Level Medical Discipline Construction of Shenzhen (2016031638), Shenzhen Foundation of Health and Family Planning Commission (SZXJ2017021 , SZXJ2018059).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Biowest, Barcelona, Spain | 111860 | |
| BamHI-HF | New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA | R3136S | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Axygen Biosciences, Union City, CA, USA | MCT-150-C | |
| 0.2 mL PCR tube | Axygen Biosciences, Union City, CA, USA | PCR-02-C | |
| C57BL/6 Mice | Medical Animal Center of Guangdong Province, China | 8~10 weeks | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Walt- ham, MA, USA | Micro 21R | |
| 2-Log DNA Ladder | New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA | N3200S | 0.1–10.0 kb |
| Marker I | Tiangen, Beijing, China | MD101-02 | 0.1–0.6 kb |
| DNA Mini Column(HiBind DNA Mini Columns) | Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA | DNACOL-01 | |
| DNA loading buffer | Solarbio, Beijing, China | D1010 | |
| E.Z.N.A.Plasmid DNA Mini Kit I and E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit II | Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA | D6942 | |
| D6943 | |||
| EcoR I | Takara Bio, Shiga, Japan | 1040S | |
| Female Bama mini pigs | BGI Ark Biotechnology, Shenzhen, China | 2~4 months | |
| Genomic DNA Extraction Kit ? | Tiangen, Beijing, China | DP304-02 | |
| SYBR Green Realtime PCR Master Mix | Toyobo, Osaka, Japan | QPK-201 | |
| Gel Doc XR | Bio-Rad, Hercules, USA | ||
| Male cynomolgus monkeys | Guangdong Landau Biotechnology, Guangzhou, China | 8 years | |
| Nucleic acid dye(Gelred) | Biotium, Fremont, USA | 42003 | |
| polymerase(Premix Taq) | Takara Bio, Shiga, Japan | RR901A | |
| pMD19-T plasmid | Takara Bio, Shiga, Japan | D102A | |
| qPCR machine | Applied Biosystems QSDx, Waltham, USA | ||
| Serum/Circulating DNA Extraction Kit | Tiangen, Beijing, China | DP339 | |
| TAE | sangon Biotech, Shanghai, China | B548101 |
References
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