Summary
В этом протоколе были разработаны свиные специфические грунтовки, построены плазмиды, содержащие свиные фрагменты ДНК, и установлены стандартные кривые для количественной оценки. Используя вид-специфические грунтовки, cpsDNA было количественно qPCR в моделях трансплантации клетки свиньи к мыши и свинья-к-обезьяна модели трансплантации артерии.
Abstract
Ксенотрансплантация является возможным методом лечения органной недостаточности. Однако, как эффективно контролировать иммунный отказ от ксенотрансплантации является проблемой для врачей и исследователей. В этой рукописи описывается простой и эффективный метод мониторинга иммунного отторжения в моделях трансплантации клеток от свиньи до мыши и моделях трансплантации патчей от свиньи к обезьяне. Циркулирующая ДНК является потенциально неинвазивным биомаркером для повреждения органов. В этом исследовании, циркулирующих свиней конкретных ДНК (cpsDNA) был мониторинг во время ксенотрансплантата отторжения количественных ПЦР в режиме реального времени (qPCR). В этом протоколе были разработаны свиные специфические грунтовки, построены плазмиды, содержащие свиные фрагменты ДНК, и установлены стандартные кривые для количественной оценки. Вид-специфические грунтовки затем были использованы для количественной cpsDNA по qPCR в свинью к мыши модели трансплантации клеток и свиньи до обезьяны артерии патч трансплантации моделей. Значение этого метода предполагает, что он может быть использован в качестве простого, удобного, недорогого и менее инвазивного метода для мониторинга иммунного отторжения ксенотрансплантации.
Introduction
Органная недостаточность является одной из основных причин смерти1. Трансплантация клеток, тканей и органов является эффективным способом лечения органной недостаточности2. Тем не менее, нехватка донорских органов ограничивает клиническое применение этогометода 3,4. Исследования показали, что свиньи могут быть использованы в качестве потенциального источника человеческих органов для клиническойтрансплантации 5,6. Однако пересадка меж вида органов сталкивается с опасным иммунным отторжением. Поэтому крайне важно контролировать иммунный отказ от ксенотрансплантации. В настоящее время клинический мониторинг иммунного отторжения в основном зависит от признаков и симптомов пациента, а также лабораторных тестов (например, биопсия, иммунобиохимический анализ иУЗИ) 7,8,9. Однако эти методы мониторинга имеют много недостатков. Признаки и симптомы иммунного отторжения у пациентов обычнопоявляются поздно 10, что не способствует раннему выявлению и раннему вмешательству; биопсия имеет недостаток бытьинвазивным 11, что не легко для пациентов, чтобы принять; иммунобиохимический анализ не хватает чувствительности или специфичности, а УЗИ является вспомогательным и дорогостоящим. Поэтому необходимо срочно найти эффективный и удобный метод контроля иммунного отторжения.
Циркулирующая ДНК является внеклеточным типом ДНК, найденной в крови. Мандель и Метаис12 впервые сообщили о наличии циркулирующей ДНК в периферической крови в 1948 году. В нормальных физиологических условиях, циркулирующих ДНК в крови здоровых людей является относительно низким на базовом уровне. Однако, в некоторых патологиях, таких как опухоли, инфаркт миокарда, аутоиммунные заболевания и отторжение трансплантации, уровень циркулирующей ДНК вкрови может быть значительно увеличен на 13,14 из-за массового высвобождения циркулирующей ДНК, вызванной апоптозом и некрозом. Происхождение циркулирующей ДНК связано с апоптозом и некрозом15,которые характерны для отторжения ксенотрансплантата16.
Циркулирующие ДНК было доказано, что минимально инвазивных биомаркер для обнаружениярака 17,18,19. Высокое секвенирование циркулирующей ДНК доноров является надежным для выявления отторжения послетрансплантации органов 20,21. Однако этот метод требует высокой концентрации и качества извлеченной ДНК. Требования к ДНК в дополнение к высокой стоимости и времени потребления делают этот метод неподходящим для регулярного клинического использования. Циркулирующая ДНК, полученная донорами, может быть точно количественно оценена количественным ПЦР в режиме реального времени (qPCR), который является одновременно специфическим и чувствительным. Таким образом, количественная оценка свиной циркулирующей ДНК с помощью qPCR является возможным методом мониторинга иммунного отторжения ксенотрансплантации. Это менее инвазивные, очень чувствительные и конкретные, низкая стоимость, и экономия времени. Свиньи и люди генетически отделены с совершенно разными геномными последовательностями(рисунок 1). Таким образом, циркулирующая ДНК свинины может быть выпущена в кровь получателя после ксенотрансплантации из-за ксено-отторжения. CpsDNA может быть точно количественно qPCR с видом конкретных грунтовки в крови получателя. Ранее мы продемонстрировали обоснование и осуществимость CPSDNA в качестве биомаркера для ксенотрансплантации22,23. Здесь мы раскрываем более экспериментальные советы и детали. Эксперимент состоит из следующих шагов. Во-первых, были разработаны свиные специфические грунтовки, и геномная ДНК была изолирована, которые использовались для проверки специфичности грунтовки обычным ПЦР. Во-вторых, построение стандартной кривой cpsDNA и изоляции cpsDNA от образца крови. Наконец, циркулирующая ДНК свиней была количественно оценена с помощью qPCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты проводились в соответствии с соответствующими руководящими принципами и положениями Институционального совета по обзору Шэньчжэньской второй народной больницы, Первой аффилированной больницы Шэньчжэньского университета.
1. Дизайн свиной конкретных грунтовки
- Выполните анализ всего генома BLAST для выявления конкретных генов свиней, которые отличались от генов людей, обезьян или мышей, используя программное обеспечение NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov).
- Дизайн грунтовки в соответствии с 19 свиней конкретных генов (Таблица 1) с использованием программного обеспечения Primer 5.
2. Изоляция геномной ДНК
ПРИМЕЧАНИЕ: Геномная ДНК (включая кровь свиней, обезьян, добровольцев, обезьян с свиным трансплантатом и мышей с свиных клеток) были извлечены с помощью коммерческого геномного набора для извлеченияДНК (Таблица материалов).
- Поместите 500 МКЛ всей крови вышеуказанных образцов в различные микроцентрифугные трубки, соответственно.
- Добавьте 20 МКЛ протеазы K и 500 МКЛ буфера лиза в вышеуказанные микроцентрифуговые трубки, а затем тщательно встряхните и перемешайте.
- Положите эти микроцентрифуговые трубки в водяную баню при 56 градусов по Цельсию в течение 10 минут и встряхните 2-3 раза в течение этого процесса, пока раствор не станет ясным.
- Центрифуга кратко удалить жидкие бусы с внутренней стенки трубки охватывает. Добавьте 500 йл этилового спирта ангидроуса и тщательно встряхните.
- Перенесите смесь в колонку adorption, центрифугу при 12 000 об/мин (13 400 х г)в течение 2 мин.
- Добавьте 800 йл раствора для полоскания в каждый столбец adsorption; центрифуга в течение 1 мин при 12 000 об/мин (13 400 евро х г). Поместите колонны при комнатной температуре в течение нескольких минут, чтобы высушить оставшийся раствор для полоскания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор для полоскания предоставляется производителем. - Перенесите столбцы адсорбции в другую чистую центробежную трубку, добавьте 50 МКЛ буфера элюции к середине пленки adorption и поместите их при комнатной температуре в течение 2-5 минут. Центрифуга 6200 х г за 1 мин 12 000 об/мин (13 400 х г).
ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер элюционирования обеспечивается производителем, но буфер TE, содержащий 10 мМ Трис-HCl (рН 8,0) и 0,1 мМ EDTA, также может утаить ДНК. - Храните раствор ДНК при -20 градусов по Цельсию.
3. Проверить специфику грунтовки
ПРИМЕЧАНИЕ: Виды специфики выше 19 грунтовки были подтверждены ПЦР, который был выполнен с использованием полимеразы (Таблица материалов) и грунтовки представлены в таблице 1.
- Подготовь предварительно смешанное решение из 12,5 МКЛ 2x премикса ПЦР(Таблицаматериалов), 1 МКЛ из 5' грунтовки (10 МКМ), 1 йл 3' грунтовки (10 МКМ) и 8,5 мл ddH2O. Подготовье смеси, включая 2 дополнительных образца.
- Разделите 23 МКЛ предварительно смешанного раствора на 0,2 мл микроцентрифугных трубок, добавьте 2 МКЛ геномной ДНК и тщательно замахите трубки. Затем слегка перемешать и центрифугу.
- Поместите микроцентрифугные трубки 0,2 мл в ПЦР-циклер и выполните следующее: Денатурация: 95 градусов по Цельсию на 5 с; Аннеаля: 60 градусов по Цельсию на 30 с; расширение:72 КК на 30 с.
- Выполните агарозный электрофорез следующим образом:
- Взвесите 1,2 г агарозы в колбу, содержащую 100 мл 1x TAE и варите его в течение 5 минут в микроволновой печи. Добавьте 5 мкл нуклеиновой кислоты красителя(таблица материалов)в колбу после того, как она остынет примерно до 70 градусов по Цельсию. Налейте его в тарелку вдоль края медленно, и поместите его при комнатной температуре, пока он не затвердевает в гель.
- Добавьте 5 кб образца и 2-логовую лестницу ДНК (0,1-10,0 кб) или маркер I (0,1-0,6 кб), которые содержат 1 кЛ буфера загрузки ДНК 6x, в гель агарозы. Затем электрофорез на 120 мА до тех пор, пока полосы не будут разделены.
- Визуализуй агар-гель, содержащий фрагменты ДНК с ультрафиолетовым изображением.
- Выполните агарозный электрофорез, чтобы изолировать усиленные фрагменты ДНК из вышеуказанных образцов, которые были визуализированы в ультрафиолетовом изображении. Используя ПЦР, праймеры, специфичные для усиленной геномной ДНК свиней, были впервые идентифицированы(рисунок 2A). Кроме того, некоторые виды-специфичности этих грунтовки, которые специально усиливается ДНК свиньи в когорте обезьяны / человека геномных или в когорте мыши геномной ДНК были подтверждены (Рисунок 2B). Наконец, два вида специфичности грунтовки были дополнительно доказано, специально усилить ДНК свиньи в свиней до обезьяны артерии патч и / или свиньи к мыши модели трансплантации клеток, соответственно (Рисунок 2C)
4. Стандартная кривая cpsDNA
- Превратите плазмиду pMD19-T, содержащую фрагмент свиной ДНК, в DH5a, которая может быть специально усилена грунтовки #4 или грунтовки #11 (Таблица 1). Экран для положительных бактерий, использующих 50 мкг/мл ампициллина.
Праймер #4 когорте человека/обезьяны (вперед: 5'-TTCAATCCCA CTTCTTCCACCTAA-3", реверс: 5'-CTTCATCTCTTCATAATAAC CCTGT-3")
Праймер #11 мышиной модели (вперед: 5'-TGCCGTGGTTTCC GTTGCTTG-3 ", реверс: 5"-TCACATTTGATGGGTCGTTGTCGTCTTCTTCTTCTTC T-3 ")
ПРИМЕЧАНИЕ: Подробная информация о всех грунтовок можно найти в таблице 1. - Урожай выше плазмиды после протокола ниже.
- Изолировать одну колонию от свежесрезанной селективной пластины и привить культуру 1- 5 мл среды LB, содержащей соответствующий селективный антибиотик. Инкубировать в течение 12-16 часов при 37 градусов по Цельсию с энергичной тряской (300 об/мин).
- Центрифуга при температуре 10 000 х г в течение 1 минуты при комнатной температуре. Декант или аспирировать и отказаться от культуры средств массовой информации.
- Добавьте 250 мкл раствора I/RNase A. Vortex или пипетку вверх и вниз, чтобы тщательно перемешать. Полное повторное получение клеточных гранул имеет жизненно важное значение для получения хороших урожаев.
ПРИМЕЧАНИЕ: RNase A должен быть добавлен в решение I перед использованием. - Перенесите подвеску в новую микроцентрифугную трубку 1,5 мл. Добавьте 250 мкл решения II. Инвертировать и аккуратно повернуть трубку несколько раз, чтобы получить четкий лизат. Может потребоваться инкубация через 2-3 минуты.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте энергичного смешивания, как это будет стрижка хромосомной ДНК и нижней плазмидной чистоты. Не позволяйте реакции лиза продолжаться более 5 минут. - Добавьте 350 мкл решения III. Немедленно инвертировать несколько раз, пока не образуется flocculent белый осадок формы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно, чтобы раствор смешивался тщательно и сразу после добавления решения III, чтобы избежать локализованных осадков. - Центрифуга на максимальной скорости (≥13 000 х г)в течение 10 минут. Сформируются компактные белые гранулы. Быстро перейти к следующему шагу.
- Вставьте мини-колонку ДНК в трубку для сбора 2 мл.
- Перенесите очищенное супернатант с 4.2.7, тщательно аспирируя его в мини-колонку ДНК. Будьте осторожны, чтобы не беспокоить гранулы и что не клеточный мусор передается в мини-колонку ДНК.
- Центрифуга на максимальной скорости в течение 1 минуты. Откажитесь от фильтрата и повторно имитуйте трубку для сбора.
- Добавьте 500 мкл буфера HBC. Центрифуга на максимальной скорости в течение 1 минуты. Откажитесь от фильтрата и повторного использования трубки сбора.
ПРИМЕЧАНИЕ: HBC Буфер должен быть разбавлен 100% изопропанол перед использованием. - Добавьте 700 МКЛ буфера мытья ДНК. Центрифуга на максимальной скорости в течение 1 минуты. Откажитесь от фильтрата и повторно имитуйте трубку для сбора.
ПРИМЕЧАНИЕ: ДНК мыть буфер должен быть разбавлен 100% этанола до использования.- Дополнительно: Повторите для второго шага мытья буфера ДНК.
- Центрифуга пустой мини-колонки ДНК в течение 2 минут на максимальной скорости, чтобы высушить матрицу столбца.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно высушить матрицу мини-колонки ДНК перед элюционом. Остаточный этанол может помешать вниз по течению приложений. - Перенесите мини-колонку ДНК в чистую микроцентрифугную трубку 1,5 мл.
- Добавьте 30-100 мкл elution Buffer или стерильной деионизированной воды непосредственно к центру мембраны колонки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эффективность eluting ДНК из колонки ДНК Мини зависит от рН. При использовании стерильной деионизированной воды убедитесь, что рН составляет около 8,5. - Пусть сидят при комнатной температуре в течение 1 минуты.
- Центрифуга на максимальной скорости в течение 1 минуты.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это составляет примерно 70% связанной ДНК. Необязательная вторая элюция даст любую остаточную ДНК, хотя и при более низкой концентрации.
- Проверить выше плазмиды с помощью двойного пищеварения фермента ограничения с помощью EcoR I (15 U / йЛ) и Бам H1 (15 U /L) 22.
- Выполните макияж шаги на льду. Подготовь систему реакции 1 МКЛ EcoR I (15 U), 1 МКЛ Бам H1 (15 U), 2 МКЛ 10x буфера, 1 мкг плазмиды; добавить ddH2O до 20 МКЛ от общего объема, тщательно перемешать. Инкубировать на водяной бане при 37 градусов по Цельсию в течение 2 часов.
- Разделим переваренные продукты на 1% агарозу с электрофорезом и подвергнется ультрафиолетовому свету, как и прежде.
- Разбавить концентрированную плазмиду в 2 х10 11 экземпляров/мл для стартового стандартного раствора с помощью ddH2O. Возьмем плазмид (P2), содержащий фрагмент свиной ДНК, например, копии расчета:
- Рассчитайте количество плазмидов в 1 мл стартового стандартного раствора: N q (2 x 1011)/(6.02 x 1023) mol.
- Рассчитайте молекулярный вес P2: M 2810 bp x 650 D/bp 2810 x 650 D (g/mol).
- Рассчитайте массу P2: m'N'M ( 2 x 1011)/ (6.02 x 1023) mol x 2810 x 650 g/mol.
- Рассчитайте объем P2: V й/C (2 x 1011)/(6.02 x 1023) x 2810 x 650 г/c. (C является концентрацией P2 (ng/L), которая измеряется спектрофотометром).
- Разбавить стартовое стандартное решение последовательно 10 раз в 2 х10 10 экземпляров / мл, 2 х10 9 копий / мл, 2 х 108 копий / мл, 2 х 107 копий / МЛ ..., и 2 х 100 экземпляров / мл для стандартного решения с использованием ddH2O. Vortex тщательно во время разбавления.
- Установите стандартную кривую.
- Подготовь систему реакции qPCR (все шаги защищены от света): Добавьте предварительно смешанное решение, которое содержит 325 зл qPCR Mix (Таблица материалов), 13 ЗЛ 5' грунтовка, 13 мкл из 3' грунтовки и 169 мкл ddH2O в микроцентрифугную трубку 1,5 мл, которая затем была тщательно смешана и слегка центрифугирована.
- Разделите 40 МКЛ выше предварительно смешанного раствора на 8-трубчатую полосу и добавьте 10 МКЛ стандартной ДНК различных концентраций. Крышку осторожно, слегка перемешать и центрифугу.
- Положите 8-трубчатую полосу в машину qPCR после процедуры, показанной на рисунке 3.
5. Изолировать циркулирующую ДНК из образцов крови
- Используя трубки EDTA, собирайте образцы крови в разных точках времени в моделях патчей артерий от свиньи до обезьяны и моделях трансплантации клеток от свиньи до мыши.
- Соберите образцы крови около 400 йл (от свиньи до обезьяны модели патч артерии) или 100 йл (от свиньи до мыши модели трансплантации клеток) и передачи 1,5 мл микроцентрифуг труб. Удалите клетки крови из образцов крови путем центрифугации при низкой температуре и высокой скорости (3000 х г,4 градусов по Цельсию, 5 мин).
- Перенесите супернатант в новую микроцентрифугную трубку 1,5 мл и удалите клеточный мусор путем центрифугации при 16 000 х г в течение 10 мин.
- Перенесите супернатант в новую микроцентрифугную трубку 1,5 мл. Извлекайте циркулирующую ДНК из вышеупомянутого супернатанта с помощью коммерческой сыворотки/циркулирующего набора для извлечения ДНК в соответствии с протоколом 2 протокола производителей геномной ДНК.
- Конденсировать объем циркулирующей ДНК до 40 МКЛ и хранить при -20 градусов по Цельсию.
6. Количественная количественная ДНК свиней
- Подготовь предварительно смешанный раствор из 25 мкл qPCR Mix(Таблицаматериалов), 1 ЗЛ 5' грунтовки, 1 ЗЛ 3' грунтовки, 10 ЗЛ образцов ДНК, и 13 зл ddH2O. Подготовка смеси, включая 2 дополнительных образцов.
- Разделите предварительно смешанный раствор на 40 МКЛ на 8-трубчатую полосу и добавьте 10 МКЛ образцовой ДНК, после чего будет тщательно укупорки. Подготовь еще две реакции, чем нужно.
- Поместите 8-трубчатую полосу в машину qPCR после той же процедуры, что и стандартная кривая. Лучше сначала запустить стандарт, чтобы убедиться, что реакция имеет решающее значение для количественной оценки заранее. Процедура реакционной системы qPCR была показана на рисунке 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В этом протоколе были разработаны свиные специфические грунтовки, плазмиды, содержащие свиной специфические фрагменты ДНК, и были установлены стандартные кривые для количественнойоценки (рисунок 4). Специфика видов 19 грунтовок была подтверждена ПЦР. Вид-специфические грунтовки (primer #4 и грунтовка #11) затем были использованы для количественной cpsDNA по qPCR в свиной к мыши модели трансплантации клеток и свиной-обезьяны артерии патч трансплантации моделей.
Электрофорез агароза использовался для изоляции усиленных фрагментов ДНК из вышеуказанных образцов, которые затем визуализируются в ультрафиолетовом изображении. Используя ПЦР, праймеры, специфичные для усиленной геномной ДНК свинины, были впервые идентифицированы(рисунок 2A). Кроме того, некоторые виды-специфичности этих грунтовки, которые специально усиливается ДНК свиньи в когорте обезьяны / человека геномных или в когорте мыши геномной ДНК были подтверждены (Рисунок 2B). Наконец, два вида-специфических грунтовки были дополнительно доказано, специально усилить ДНК свиньи в свиней до обезьяны артерии патч и / или свиньи к мыши модели трансплантации клеток, соответственно (Рисунок 2C).
Рисунок 1: Генная идентичность между свиньей(sus scrofa, ssc) и человеком(homo sapiens, имеет) или обезьяной(Macaca fascicularis, mfa). Последовательности генов трех различных видов были сопоставлены с помощью анализа BLAST. Анализ последовательности BLAST использовал геномную аннотацию (последовательность мРНК) трех видов, загруженных из NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov). Последовательности мРНК генов человека, обезьяны и свиньи были 139116, 65927 и 71498,соответственно 22. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Регулярный ПЦР подтверждает специфичность свинины конкретных грунтовок. (Фрагменты геномной ДНК свиньи были усилены грунтовки 1-19. (B) Фрагмент геномной ДНК человека/обезьяны/мышей не может быть усилен некоторыми грунтовщиками (#4 и #11). Звезды не указывают на усиление геномной ДНК человека/обезьяны. Знак фунта (к) не указывает на усиление геномной ДНК мыши. (C) Два вида специфичности грунтовки (праймер #4 и #11) были дополнительно доказано, специально усилить ДНК свиньи в свиней до обезьяны артерии патч и / или свиньи к мыши модели трансплантации клеток,соответственно 22. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Процедура реакции qPCR22. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Создание стандартной кривой для абсолютной количественной оценки. Выставлены участки усиления, участки кривой расплава и стандартные виды кривой(A)грунтовка #4 и(B) грунтовка #11 от машины qPCR (см. Таблицу материалов). Хороший стандарт (R значение близко к 1, эффективность усиления находится в пределах 100% ±5%) может быть использован на срок до полугода22. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Таблица 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Количественная оценка распространяемой ДНК свиней представляет собой осуществимый подход к мониторингу иммунного отторжения ксенотрансплантации. Гади и др.24 обнаружили, что содержание циркулирующей ДНК (ddcfDNA) в крови пациентов с острым отторжением было значительно выше, чем у пациентов без отторжения. Эти исследования показывают, что ddcfDNA может быть общим биомаркером для мониторинга повреждения трансплантата органов. В последние годы qPCR все чаще применяется к анализу нуклеиновых кислот из-за его простой работы, высокой степени автоматизации, высокой чувствительности, хорошей специфичности и низкой стоимости.
В этом исследовании, свиные конкретные грунтовки были разработаны на основе результатов анализа биоинформатики. Их специфика была проверена обычным ПЦР. CPSDNA образцов крови свиньи к обезьяне артерии патч моделей и свиньи к мыши модели трансплантации клеток может быть точно количественно qPCR с видом конкретных грунтовок. Основные преимущества этого подхода следующие. Во-первых, на основе высокоспецифических грунтовок, этот метод количественной оценки ДНК является весьма чувствительным и специфическим. Кроме того, протокол подхода очень прост в работе, который состоял из проектирования конкретных грунтовок, изоляции ДНК и анализа qPCR в один рабочий день, который является временем. Это неинвазивный метод, который начинается с небольшого объема сыворотки или плазменного материала. Между тем, мы показали, что этот метод является весьма воспроизводимым22. В отличие от секвенирования высокой пропускной способности и масс-спектрометрии полетов, этот метод является недорогим.
Мониторинг иммунного отторжения путем количественной оценки циркулирующих свиней конкретных ДНК в крови свиньи к обезьяне артерии патч моделей и свиньи к мыши модели трансплантации клеток с использованием qPCR заложил основу для фундаментальных исследований и клинического применения свиной ксенотрансплантации человека.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не сообщают о конфликте интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами от Национальной ключевой программы НИОКР Китая (2017YFC1103704), Шэньчжэньского фонда науки и техники (JCYJ20170817172116272), специальных фондов для строительства больниц высокого уровня в провинции Гуандун (2019), Санминг-проект медицины в Шэньчжэне (SSM201412020), Фонд высокого уровня медицинской дисциплины Строительство Шэньчжэня (2016031638), Шэньчжэнь Фонд здравоохранения и планирования семьи комиссии (S'XJ2017021 , S'XJ2018059).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Biowest, Barcelona, Spain | 111860 | |
| BamHI-HF | New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA | R3136S | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Axygen Biosciences, Union City, CA, USA | MCT-150-C | |
| 0.2 mL PCR tube | Axygen Biosciences, Union City, CA, USA | PCR-02-C | |
| C57BL/6 Mice | Medical Animal Center of Guangdong Province, China | 8~10 weeks | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Walt- ham, MA, USA | Micro 21R | |
| 2-Log DNA Ladder | New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA | N3200S | 0.1–10.0 kb |
| Marker I | Tiangen, Beijing, China | MD101-02 | 0.1–0.6 kb |
| DNA Mini Column(HiBind DNA Mini Columns) | Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA | DNACOL-01 | |
| DNA loading buffer | Solarbio, Beijing, China | D1010 | |
| E.Z.N.A.Plasmid DNA Mini Kit I and E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit II | Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA | D6942 | |
| D6943 | |||
| EcoR I | Takara Bio, Shiga, Japan | 1040S | |
| Female Bama mini pigs | BGI Ark Biotechnology, Shenzhen, China | 2~4 months | |
| Genomic DNA Extraction Kit ? | Tiangen, Beijing, China | DP304-02 | |
| SYBR Green Realtime PCR Master Mix | Toyobo, Osaka, Japan | QPK-201 | |
| Gel Doc XR | Bio-Rad, Hercules, USA | ||
| Male cynomolgus monkeys | Guangdong Landau Biotechnology, Guangzhou, China | 8 years | |
| Nucleic acid dye(Gelred) | Biotium, Fremont, USA | 42003 | |
| polymerase(Premix Taq) | Takara Bio, Shiga, Japan | RR901A | |
| pMD19-T plasmid | Takara Bio, Shiga, Japan | D102A | |
| qPCR machine | Applied Biosystems QSDx, Waltham, USA | ||
| Serum/Circulating DNA Extraction Kit | Tiangen, Beijing, China | DP339 | |
| TAE | sangon Biotech, Shanghai, China | B548101 |
References
- Buchman, T.
- Smith, M., Dominguez-Gil, B., Greer, D., Manara, A., Souter, M. Organ donation after circulatory death: current status and future potential. Intensive care medicine. 45 (3), 310-321 (2019).
- Lopez-Fraga, M., et al. A needed Convention against trafficking in human organs. Lancet. 383 (9936), 2187-2189 (2014).
- Sykes, M., Sachs, D. Transplanting organs from pigs to humans. Science immunology. 4 (41), 6298 (2019).
- Reardon, S. New life for pig-to-human transplants. Nature. 527 (7577), 152-154 (2015).
- Song, Z., Cooper, D. K., Mou, Z. Expression and Regulation Profile of Mature MicroRNA in the Pig: Relevance to Xenotransplantation. BioMed Research International. 2018, 2983908 (2018).
- Chung, H., et al. CD4(+) /CD8(+) T-cell ratio correlates with the graft fate in pig-to-non-human primate islet xenotransplantation. Xenotransplantation. 27 (2), 12562 (2020).
- Yoon, C. H., Choi, S. H., Lee, H. J., Kang, H. J., Kim, M. K. Predictive biomarkers for graft rejection in pig-to-non-human primate corneal xenotransplantation. Xenotransplantation. 26 (4), 12515 (2019).
- Agbor-Enoh, S., et al. Circulating cell-free DNA as a biomarker of tissue injury: Assessment in a cardiac xenotransplantation model. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 37 (8), 967-975 (2018).
- Vito Dabbs, D., et al. Are symptom reports useful for differentiating between acute rejection and pulmonary infection after lung transplantation. Heart & Lung. 33 (6), 372-380 (2004).
- Miller, C. A., et al. Non-invasive approaches for the diagnosis of acute cardiac allograft rejection. Heart. 99 (7), 445-453 (2013).
- Mandel, P., Metais, P. Les acides nucléiques du plasma sanguin chez l'homme. Comptes Rendus des Seances de l Academie des Sciences. 142 (3-4), 241-243 (1948).
- Okkonen, M., et al. Plasma cell-free DNA in patients needing mechanical ventilation. Critical Care. 15 (4), 196 (2011).
- Wagner, J. Free DNA--new potential analyte in clinical laboratory diagnostics. Biochemia Medica. 22 (1), 24-38 (2012).
- Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer. Nature Reviews Clinical Oncology. 11 (3), 145-156 (2014).
- Mohiuddin, M. M., et al. Chimeric 2C10R4 anti-CD40 antibody therapy is critical for long-term survival of GTKO.hCD46.hTBM pig-to-primate cardiac xenograft. Nature Communications. 7, 11138 (2016).
- Bettegowda, C., et al. Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies. Science Translational Medicine. 6 (224), 24 (2014).
- Dawson, S. J., et al. Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer. New England Journal of Medicine. 368 (13), 1199-1209 (2013).
- Newman, A. M., et al. An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage. Nature Medicine. 20 (5), 548-554 (2014).
- Snyder, T. M., Khush, K. K., Valantine, H. A., Quake, S. R. Universal noninvasive detection of solid organ transplant rejection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (15), 6229-6234 (2011).
- De Vlaminck, I., et al. Noninvasive monitoring of infection and rejection after lung transplantation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (43), 13336-13341 (2015).
- Zhou, M., et al. Circulating pig-specific DNA as a novel biomarker for monitoring xenograft rejection. Xenotransplantation. 26 (4), 12522 (2019).
- Huo, Q., et al. Circulating mi RNA or circulating DNA —Potential biomarkers for organ transplant rejection. Xenotransplantation. 26 (1), 12444 (2019).
- Gadi, V. K., Nelson, J. L., Boespflug, N. D., Guthrie, K. A., Kuhr, C. S. Soluble donor DNA concentrations in recipient serum correlate with pancreas-kidney rejection. Clinical Chemistry. 52 (3), 379-382 (2006).
