Summary
여기에 제시된 것은 미생물 기반 방법 및 MALDI-TOF 질량 분석법에 의한 후속 식별을 통해 독특한 눈 면봉 및 배양 기반 농축 단계를 사용하여 호기성 및 학부성 혐기성 마우스 결막 성 세균의 격리 및 증폭을 위한 프로토콜이다.
Abstract
안구 표면은 한 번 면역 특권과 비생물으로 간주되었다, 하지만 최근에는 작지만 지속적인 막연한 막대한 존재가 있는 것으로 보인다. 안구 점막에서 세균 종의 식별 및 모니터링은 그들의 낮은 풍부와 인문 성장 및 식별을위한 적절한 방법론의 제한된 가용성으로 인해 도전하고있다. 문화 기반 또는 DNA 염기서열 분석 방법의 두 가지 표준 접근 법이 있습니다. 첫 번째 방법은 제한된 회수 가능한 박테리아로 인해 문제가 되고 두 번째 접근법은 안구 공간의 비정상적인 표현으로 이어지는 살아있는 박테리아와 죽은 박테리아를 모두 식별합니다. 우리는 표준 미생물 배양 기술을 기반으로 세균 격리를 위한 견고하고 민감한 방법을 개발했습니다. 이것은 "실험실"이 낮은 결막을 대상으로 하는 얇은 면봉을 활용한 면봉 기반 기술이며, 그 다음으로 호기성 및 학부 해부학 적 제네라에 대한 증폭 단계가 뒤따릅니다. 이 프로토콜은 우리가 코린 박테리움 spp., Coagulase 네거티브 황색포도상구균 spp., 연쇄상 구균 spp등과 같은 결막 종을 분리하고 식별할 수 있게 했습니다. 접근은 다른 질병 조건의 마우스에 있는 막증을 정의하는 것이 적합합니다.
Introduction
이 프로토콜의 목적은 안구 내막 에서 실행 가능하고 희귀 한 호기성 및 학부 성 혐기성 미생물의 특정 절연을 강화하여 안구 미생물군유전체를 특성화하는 것입니다. 광범위한 연구는 피부, 창자, 호흡기 및 생식기에 대한 막수 점막 커뮤니티를 프로파일드하고 이러한 지역 사회가 면역 체계의 발달과 반응1,2,3에영향을 미친다는 것을 보여줍니다. 안구 내문 공동체는 안구건조증4,쇼그렌 증후군5 및 당뇨병6과같은 특정 질환 병리학 중에 변화하는 것으로 나타났다. 그러나, 전형적인 안구 표면 발생 공동체를 정의하는 능력은 다른 점막부위에비해 상대적으로 낮은 풍요로움에 의해 방해된다6,7,8. 이것은 상주 안구 미생물군유전체가 있는지, 그리고 존재하는 경우에, 피부 microbiome와 다른지, 결과적으로, 타고난 면역 계통 발달 및 반응에 그것의 현지 효력이 있는지를 통해 논쟁을 자극합니다. 이 프로토콜은 이 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다.
일반적으로, 안구 공생 틈새 시장을 정의하는 접근법은 시퀀싱 및 문화 기반 기술4,7,9에기초한다. 16 S rDNA 염기서열 분석 및 BRISK 분석7은 배양 기반 기술보다 더 넓은 다양성을 나타내지만 살아있는 미생물과 죽은 미생물을 구별할 수는 없습니다. 안구 표면은 눈물 필름의 항균 특성4로 인해 많은 미생물에 적대적이기 때문에 많은 DNA 단편을 생성하며, DNA 기반 접근법은 오염물질이 아닌 상주 교향곡으로 죽은 박테리아의 식별으로 데이터를 왜곡할 수 있는 이러한 유물을 검출할 것이다. 이로 인해 미생물의 풍부와다양성(10)에서더 높은 것으로 안구 공간의 비정상적인 장신 식별 및 특성화가 발생한다. 이것은 DNA 기지를 둔 방법을 통해 상주 안구 미생물군유전체를 정의하는 것을 어렵게 합니다. 반면, 표준 배양 기반 기술은 하중이 너무 낮기 때문에11을감지할 수 없습니다. 우리의 방법은 결막을 표적으로 할 수 있는 얇은 면봉을 사용하여 표준 관행을 향상시키고, 따라서 이웃 피부에서 오염을 피하고, 실행 가능한 유기체가 가능한 그러나 비 culturable를 소생하는 것을 목표로 영양 조밀한 매체에 있는 짧은 문화에 의해 풍부해질 수 있다는 개념뿐만 아니라, 희귀 한 생존 가능한 미생물을 위해 풍부하게 합니다.
결과, 눈 면봉 당 안구 공자의 상대적인 풍부, 결막 상주 미생물군유전체를 특성화 하 고 비교 목적을 위해 중요 하다. 우리의 데이터는 피부와 결막 미생물의 차이뿐만 아니라 증가 된 나이와 풍부한 성별 특정 차이와 더 큰 다양성이 있음을 보여줍니다. 더욱이, 이러한 접근법은 녹아웃마우스(12)에서의기생 차이를 재현적으로 발견했다. 이 프로토콜은 caging 관행, 지리, 또는 질병 상태뿐만 아니라 면역 계통 발달 및 반응에 대한 교만 대사 산물 및 제품의 국소 효과로 인해 달라질 수 있는 안구 미생물군유전체를 설명하기 위해 적용될 수 있다.
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Protocol
마우스와 관련된 모든 절차는 기관 동물 관리 및 사용위원회 지침을 따릅니다. 미생물 및 잠재적으로 오염된 물질로 작업할 때 실험실 안전 지침(기관 환경 보건 및 안전 부서의 지시)을 따르십시오. 잠재적으로 생물학적 오염 물질을 폐기하기 전에 적절한 폐기물 리셉터클 및 오염 제거 절차를 사용합니다.
1. 눈 면봉 준비, 작업 장 설정, 마우스 눈 면봉 및 샘플 농축
- 멸균 눈 면봉 준비
참고: 멸균 눈 면봉은 얇게 코팅 된 나무 이쑤시개와 면 의 섬유 얇은 층이 있는 집에서 만들어집니다.- 면봉을 할 수 있는 마우스 수에 대해 적절한 양의 면 타격과 이쑤시개를 자동 클랩합니다.
- 엄지와 집게 손가락으로 면 타격의 반 센티미터 길이조각을 꼬집습니다. 엄지와 앞손가락으로 가장자리를 당겨 평평한 단일 다공성 층을 형성하여 타격을 애타게하고, 타격이 무너지기 직전에 멈춥니다 (늘어난 타격에 분산 된 면의 작은 비트는 허용됩니다).
- 이쑤시개 끝에 늘어진 조각을 가볍게 잡고 이쑤시개 끝의 날카로운 끝 중 하나 주위의 타격을 소용돌이치며 그림 1을참조하십시오. "완성된" 눈 면봉은 팁 위에 뻗어 있는 매우 얇은 면층을 가지며, 팁에서 약 1cm 에서 1센티미터 정도 연장됩니다.
- "완성된" 면봉을 작은 비커에 넣고, 측면을 아래로 휘청이고 덮습니다. 오토 클레이 브.
- 작업 공간 설정
- 케타민 2mL(100 mg/mL), 자일라진 400 μL(100 mg/ml) 및 멸균식 식염수(dH2O에서0.9% NaCl)를 함유한 마취를 멸균 50mL 멸균 원심분리튜브에 준비한다. 즉시 사용하기 위해 필터 살균 및 알리쿼트 마취 (1 개월 동안 4 °C로 저장 될 수 있습니다. 항상 사용하기 전에 실온에 평형화 할 수 있습니다).
- 오염을 최소화하기 위해 소독제로 작업 영역을 투명하고 청소합니다.
- 알리쿼트 0.5mL의 멸균 뇌 심장 주입 매체(BHI)를 라벨으로 1.5mL 멸균 마이크로센심분리기 튜브(마우스 당 1튜브 및 제어); 미세 원심 분리기 랙에 배열하십시오. 얼음 위에 랙을 설정합니다.
- 마우스 마취스테이션(왼쪽에서 오른쪽)과 같은 작업 흐름을 설정함: 마우스 마취스테이션(실험마우스, 빈멸균 케이지, 실온 마취, 25G 바늘 및 1mL 주사기), 눈 면봉 스테이션(얼음에 대한 알리인용 BHI, 멸균 눈 면봉, 깨끗한 종이 타월, 70% 이소프로판스프레이) 및 플라고 플레이트(실용체)와 플라게팅 플레이트(실용1)와 플라고(실)를 , 10 μL 멸균 일회용 팁, 생물 위험 폐기물 용기).
- 눈 면봉
- 각 성인 마우스에 각각 케타민과 자일라진의 마우스 중량 투여량 1g당 10μL의 마취를 투여하고 오토클레이브 케이지에 넣습니다. 뒷발 패드를 압박하여 마취를 테스트; 움직임이 적절한 마취를 나타내지 않습니다.
- 마취된 마우스만 처리하고 다른 한편으로는 눈 면봉과 배양만 처리하기 위해 한 손을 할당합니다. 스와빙의 경우 케이지에서 완전히 마취된 마우스를 제거합니다. 왼쪽 눈이 노출된 깨끗한 작업 표면 위에 놓입니다. 장갑을 낀 손을 이소프로판올로 스프레이하고 깨끗한 종이 타월로 말리십시오.
- 언캡은 특별히 전용 미디어 핸들링 핸드와 BHI 마이크로 원심 분리 튜브를 표시. 튜브를 얼음 위에 미세 원심분리기 랙에 다시 넣습니다. BHI에 눈 면봉의 면 코팅 된 끝을 찍어, 여분의 액체를 제거하기 위해 내부 튜브에 대한 팁을 2 번 소용돌이 튜브에서 눈 면봉을 철회.
- 마우스 핸들링 핸드로 마우스를 목 덜미로 부드럽게 잡습니다. 한편, 왼쪽 눈의 내측 결막 부위에 눈면봉끝을 놓고 도 2A를참조하십시오. 가볍게 안구를 우울하게 하고 창 세척동작(그림 2B)에서면봉을 앞뒤로, 아래 눈꺼풀과 눈 사이, 10회 이동합니다. 일정한 압력을 유지합니다.
- 모피를 건드리지 않고 면봉 끝을 부드럽게 제거하고, 삽입된 위치에 수직으로 면봉면을 직접 내려 놓고 BHI 미디어가 포함된 마이크로 원심분리기 튜브에 직접 놓습니다. 윤활안 방울을 헤딩한 눈에 바레고 발라주세요.
- 마우스를 케이지로 반환합니다.
- 면봉이 얼음 위에 10-15분 동안 서서 10회 회전을 위해 미디어에 팁을 혼합하여 멸균 장갑손으로 눈 면봉을 제거하십시오. 마이크로 원심분리관의 내벽에 대해 5회 회전하여 회전팁으로 면봉을 철회한다. 생물 위험 용기에 면봉을 폐기하십시오.
- 각 마우스와 제어 샘플(피부 또는 모피 면봉)에 대해 1.3.2 ~ 1.3.7 단계를 반복합니다. 각 면봉 사이에 장갑을 적절히 살균합니다.
- 농축
- 37°C에서 1시간 동안 튜브를 정적으로 배양하여 샘플을 풍부하게 합니다.
- 인큐베이션 하는 동안, 마우스 당 5% 양의 혈액 한천 판 (TSA 플레이트)와 함께 한 실온 Trypticase 콩을 표시 하 고 절반으로 나눕니다.
- 눈 면봉 배양 배양 후 인큐베이터에서 농축 된 샘플을 제거하고 얼음 위에 놓습니다.
- 도 3A의회로도에 따라 짧게 소용돌이 샘플을 혼합하고 플레이트한다. 시료의 Aliquot 10 μL을 TSA 플레이트에 기울이고 접시를 기울여 스트립을 형성하고 2회 반복합니다.
- 플레이트 의 분할 선의 반대편에, 점 10 점 10 표본의 천에 샘플, 반복 9 번.
- 플레이트를 37°C에서 18시간, 2일 및 4일 동안 배양합니다(한천판이 건조되는 것을 방지하는 깨끗한 챔버에서). 스트립에서 식민지를 계산하고, 형태학을 기록하고, 형태학적으로 유사한 격리를 위해 면봉 당 콜로니 형성 단위 (CfU)를 계산합니다. 스트립에 캡처되지 않은 독특한 유기체에 대한 점을 보십시오.
2. 마스터 플레이트, 특성화 및 안구 미생물의 식별
-
마스터 플레이트
- TSA 플레이트 뒷면에 그리드를그립니다(그림 3B). 각 마우스 눈 면봉 플레이트에서 멸균 이쑤시개를 가진 식민지를 선택하고 마스터 플레이트 사각형 (그리드), 식민지 번호 와 마우스 정보가있는 라벨 그리드를 줄입니다. 각 형태학적으로 뚜렷한 식민지에 대해 세 개의 다른 식민지를 선택하고 접시.
- 플레이트를 37°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 96시간 동안 배양을 계속하여 매일 새로운 격리의 모양을 확인합니다.
참고: 교만 인구는 마우스 연령, 영양, 질병 상태 및 caging 관행에 따라 달라집니다. 분리 특성은 우리의 실험실에서 발견 하는 주요 호기성 및 육성 혐 기성 박테리아에 기초.
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특징을 나타냄
- 매니톨 솔트 아가(MSA) 및 맥콩키(MAC) 플레이트에13개의 플레이트 미생물을 복제하여 37°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 각 분리 및 MSA에 후광과 왁시 식민지 또는 노란색 식민지의 존재에 대한 성장주의.
- 그램 양성 코치의 경우, 카탈라제테스트(13,14)로테스트한다. 깨끗한 유리 슬라이드에 과산화수소 3% 방울을 놓습니다. 멸균 이쑤시개를 사용하여 눈 면봉 판에서 해당 미생물을 선택합니다. 어떤 기포 형성은 연쇄상 구균 spp를 나타내지 않습니다.
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식별: MALDI-TOF MS 분석
참고: 세균 성 식별은 MALDI-TOF 및 소프트웨어 데이터베이스를 사용하여 수행됩니다. 이 시스템은 식별을 위해 알려진 세균 스펙트럼과 비교하여 스펙트럼 프로파일을 개발하기 위해 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 시간 비행 질량 분석법(MALDI-TOF MS)을 사용합니다. 대장균,ATCC 8739는 시스템 교정에 사용됩니다.- 플레이트 세균은 5%의 양 혈액을 함유한 TSA 플레이트에 분리하고 37°C에서 5%의 이산화탄소로 하룻밤 동안 배양합니다.
- 1 μL 루프를 사용하여, MALDI-TOF 표적 슬라이드에 순수 박테리아의 얇은 층을 적용; MALDI-TOF MS CHCA 매트릭스 용액(알파-시아노-4-하이드록시신나마이산)의 1μL은 오버레이되어 MALDI-TOF 계측기로 슬라이드를 적재하기 전에 완전히 건조할 수 있습니다.
- 각 격리는 중복으로 발견됩니다.
- 확률 점수가 80% 이상인 보고서는 차별 가치가 높음을 나타내며 신뢰할 수 있는 결과로 받아들여지고 세균 식별이 허용됩니다.
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Representative Results
도금에 대한 다양한 방법을 보여주는 눈 면봉 판에 대한 대표적인 결과는 C57BL/6 마우스로부터 형태학적으로 다양한 분리를 보여주는 도 3A에 그려지고 있다. 각 뚜렷한 격리에 대해, 식민지는 스트립과 상대적 풍부, 눈 면봉 당 독특한 콜로니 형성 단위 (CfU)에 계산하고 비교 목적을 위해 플롯하였다. 미생물 특성화를 위해, 박테리아는 마스터 TSA 플레이트를 생산하기 위해 개별 마우스 눈 면봉 플레이트에서 수확되었다 (각 마우스 눈 면봉 플레이트에서 삼중 분리체에서 형태학적으로 뚜렷한 분리를 따기하여 생성). 마스터 플레이트에서, 후속 날 또는 성장이 나타날 때, 추가 테스트는 미생물을 특성화하거나 식별하기 위해 실행되었다. 마스터 플레이트는 각각의 분리를 확장하기에 충분한 접종을 제공하는 데 사용되었습니다.
종은 미생물학적 기술을 사용하여 특징지어졌으며 MALDI-TOF MS 분석에 의해 확인되었습니다. 각 분리판은 카탈라제시험(13,14)에 의해 시험되고 선택적 매체에서 성장시켰다. 우리의 연구에서 주요 미생물은 연쇄상 구균 spp., 황색 포도상 구균 spp. 및 코네박테리움 spp., 매니톨 소금 아가 (MSA) 및 맥 콩키 아가 (MAC)는 선택적 한천으로 사용되었다13. 매니톨 소금 아가의 성장은 황색포도상구균 spp13,16을나타냅니다. MSA는 페놀 레드를 포함하기 때문에, 식민지 주변의 노란 후광은 황색 포도상 구균으로 매니톨 발효 및 분류를 나타냅니다 (Coagulase 테스트와 같은 대체 시험으로 확인)13. 맥콩키 한고에 성장은 담즙 염과 크리스탈 바이올렛이 세균막을 범법하고 그람 양성 세균 성장을 억제 할 수 있기 때문에 그람 부정적인 박테리아를 나타냅니다13. MSA에 왁스 성장은 진동산의 생산을 나타내며 코니박테리움 spp13과같은 유기체 때문일 수있다. 마지막으로, 카탈라제 시험은 황색포도상구균 spp에서 Streptococcus spp를구별합니다 13,16,어떤 경우에는, 약한 양성 시험은 Aerococcus spp 15를나타낼 수 있습니다.
격리를 식별하기 위해 TSA 플레이트는 이산화탄소 5%와 37°C 환경 및 MALDI-TOF MS로 하룻밤 사이에 줄무늬와 배양을 수행하였다. 도 4는 결과 S. acidominimus를 나타낸다 (비리단스 연쇄상 구균 spp의 구성원. 17)및 A. 비리단 . 종종 에어로 코커스 spp. 생화학적 및 현상 검사를 기반으로 연쇄상 구균18,19의비리단 그룹으로 오인된다. MALDI-TOF MS는 식별할 수 없는 종없이 99.9의 신뢰 수준으로 격리를 식별 할 수 있었습니다.
성 편향된 차이는 도 5에서관찰될 수 있으며, 여기서 기만유기체의 상당히 다른 수준이 남성과 여성 C57BL/6 마우스로부터 회복되었다. 각 분리에 대한 상대적 풍요로움이 결정되었습니다. 연쇄상 구균 산성소미니무스, 에어로코커스 비리단 및 응고성 네거티브 포도상 구균(CNS)분리 #1 및 대장균 spp. 모든 쥐에서 발견 되었다, 높은 상대적인 풍부하 고 더 큰 다양성을 보여주는 남성.
그림 1: 사내 눈 면봉.
(A)얇고 약 1cm, 당겨진 면 타격조각이 멸균 이쑤시개와 검지 손가락 사이에 유지되었고, 이쑤시개를 압연하면서 면이 이쑤시개 끝에 완전히 압연될 때까지 검지 손가락에 약간의 압력을 가하였다. (B)눈 면봉의 예. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 마우스 결막 눈 면봉 배치.
(A)BHI 젖은 눈 면봉 팁은 90° 각도로 마취된 마우스의 왼쪽 눈의 내측 모서리에 삽입되어 안구를 우울하게 하였다. (B)면봉은 앞뒤로 움직여 10번, 눈에 약간의 압력을 유지하면서 결막을 따라 움직였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 눈 면봉 및 마스터 플레이트의 대표적인 결과.
(A)10 μL 의 눈 면봉 접종 농축 된 농축 된 매체는 혈액 천물 판의 오른쪽에 알리 인용하고 미디어가 스트립을 형성 할 수 있도록 30 ~ 60도 기울어져 플레이트의 왼쪽에, 샘플의 10 μL 점을 분배하였다. 인큐베이션된 판의 사진은 개별 식민지와 형태학적 다양성을 보여줍니다. (B)분리의 마스터 플레이트는 눈 면봉 판에서 식민지를 따기와 사각형 (그리드) 중 하나 내에서 줄무늬에 의해 만들어졌습니다. 세 가지 형태학적으로 유사한 식민지는 별도의 격자로 줄무늬가 있습니다. 모든 그리드에는 마우스 눈 면봉 판에서 수확 된 동일한 식민지의 세 줄무늬가 있습니다. 성장이 접시에 나타난 후, 분리는 선택적 도금 및 카탈라제 테스트를 특징으로했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: MALDI-TOF MS 결과의 예입니다.
각 격리는 하룻밤 TSA에서 배양되었고, MALDI-TOF MS 슬라이드에 적용되고 MALDI-TOF MS 솔루션과 오버레이되어 공기가 건조되고 중복으로 발견되었습니다. 연쇄상 구균 산산성미무스(A)와 에어로코커스 비리단(B)의 결과는 99.9의 신뢰값으로 긍정적으로 확인되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 성편향 결막 성장.
나이 일치 C57BL6/N 마우스는 상대적인 장엄 다양성을 위해 비교되었습니다. 눈은 면봉되었고, 명목 유기체가 확인되었다. 가장 우세한 종은 연쇄상 구균 산산성소미니무스였는데,이는 암컷 마우스(2-way ANOVA, p<0.0001)보다 남성에서 훨씬 더 풍부했다. 5 다른 CNS 격리가 확인되었다, 에어로 코커스 비리단과 대장균. CNS 분리물의 일부는 모든 마우스에 존재하지 않았지만, 연쇄상 구균 산산성소미니무스, 에어로코커스 비리단, CNS 격리 1, 대장균은 뚜렷한 풍부한 모든 마우스에서발견되었다.
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Discussion
안구 표면의 파시균 상태로 인해 많은 실험실에서 안구 공생을 분리하는 데어려움이 있어7,20의성장, 낮은 풍부및 낮은 다양성8을가진 시료수가 적어집니다. 이 방법은 MALDI-TOF MS에 의한 재설계된 눈 면봉 및 식별뿐만 아니라 농축 단계의 첨가에 의해 표준 배양 관행4,21에 크게 향상됩니다. 농축 단계는 세균 부하를 증폭시켜 낮은 회수율을 해결합니다. 야생형 남성 마우스에 대한 눈당 2,500CFU의 상대적 풍부에 100 CFU 미만에서 회복 가능한 박테리아의 현저한 증가는 영양이 풍부한 매체의 배양이 실행 가능하지만 비 재배성박테리아(22,23)를재활성화시켜 휴면 미생물의 회복을 허용한다는 것을 시사한다. 최근 배양 기반 농축 단계는 숙주 및 미생물 발현 시그니처24,25,26사이의 차별을 가능하게 하고 희귀 한 제네라를 증폭시키기 위해 미생물 분자 염기서열 분석 연구에 통합되었습니다. 우리의 프로토콜 농축 단계는 안구 미생물 연구에 적용되고 살아있는 미생물을 선택하기 위해 농축을 활용하고, 회수 가능한 부족 분리의 수를 확장하고 아마도 실행 가능하지만 재배 할 수없는 교공성을 소생시합니다. 또한, 집에서 만든 눈 면봉은 결막의 표적 면봉을 허용하여 작은 크기와 얇은 뾰족한 테이퍼 모양으로 인해 주변 피부 / 모피의 오염을 줄입니다. 면봉 코팅 두께 및 재료의 선택은 중요21. 이 실험실에서 만든 눈 면봉은 무독성 면 타격의 얇은 층으로 코팅되어 면봉 재료 내에서 면봉을 방지할 뿐만 아니라, cytoxic27일수 있는 칼슘 알기네이트 눈 면봉에 바람직하다. 경도 테스트는 우리의 방법이 재현 할 수 있음을 보여줍니다; 연쇄상 구균 spp., Coagulase 네거티브 황색포도상구균 (CNS), 코리네박테리움 spp를포함한 눈 면봉에서 회복된 지배적인 박테리아. 이러한 결과는 문화 기반 또는 이미징 기반 방법을 통해 검출된 지배적인 자극성 혐기성 안구 제네라7,9,20에 대한 발표된 연구 결과에 동의합니다. 이 방법은 결막에서 분리의 넓은 스펙트럼을 발견했다, 에체리치아 대장균과 슈도모나스 spp를포함. 또한 MALDI-TOF MS의 식별은 연쇄상 구균 및 에어로코치 스프의 비리단 그룹과 같은 제네라와 종 사이의 더 나은 차별을 가능하게합니다. 19,28.
눈 면봉 제조, 눈 면봉 기술 및 눈 면봉 판에서 독특한 분리 선택 : 세 단계는 결과를 극대화에 중요하다. 위에서 설명한 바와 같이, 매우 얇은 평평한 면층은 안구 표면에서 의문을 포착하고 농축 매체로의 후속 방출에 중요합니다. 두껍거나 울퉁불퉁한 면봉은 위촉 팁 내에서 분리를 유지뿐만 아니라 오염 물질의 선택으로 이어질 수 있습니다. 둘째, 주변 표면의 오염을 최소화하기 위해 스왑하는 동안 안구의 지속적인 우울증이 필요합니다. 이상적인 면봉 기술은 중간 열등한 결막 에 면봉의 정상 (90도) 삽입과 느린 연속 운동과 결합 된 꾸준한 스와핑 압력을 포함한다. 마지막으로, 눈 면봉 판은 완전히 대표적인 미생물군유전체를 포착하기 위해 새로 나타나는 분리또는 다른 속도로 성장하는 사람들을 선택하기 위해 매일 모니터링되어야 한다.
프로토콜의 결과 또는 수정에 대한 명확한 이해로 해결할 수 있는 몇 가지 프로토콜 제한이 있습니다. 결과는 안구 교반 공동체를 정의하는 것을 목적으로 상대적인 실행 가능한 이해성 풍부의 척도이고, 실제 결막 세균 부담이 아닙니다. 상대적 풍부와 다양성은 세균성 각막염의 비교 목적을 위해 연구에서 사용되어 왔으며, 노크 아웃 및 야생 형 마우스(12)에서타고난 면역 반응을 조사합니다. 또한 MALDI-TOF MS의 식별은 현재 데이터베이스 사용의 중요성을 강조하여 알 수 없는 격리 스펙트럼 프로필에 대해 "ID 없음"의 결과를 제공하는 실질적인데이터베이스(28)에따라 달라집니다. 마지막으로, 이 프로토콜은 호기성 및 학부 혐기성 박테리아만 감지하지만, 그 프레임 워크는 적응할 수 있으며 농축 매체, 판 성장 조건 및 선택 매체의 수정에 의해 안구 미생물 공간을 정의하는 데 도움이 될 수 있습니다. 마스터 플레이트 및 농축 성장 조건을 혐기성으로 변경함으로써, 다른 일반적으로 격리된 안구 교인, 프로피오니박테리움 spp. 또는 다른혐기성이 검출될 수 있다; 그러나, 우리의 손에 우리는 거의 혐기성 성장을 보았다.
아마도, 이 프레임 워크는 깊은 DNA 염기서열 분석 기술과 함께 사용할 수 있습니다. DNA 시퀀싱을 통한 미생물 식별의 주요 장애물은 생존가능성10을평가할 수 없다는 것이다. 이 프로토콜은 후보 격리(DNA 시퀀싱에 의해 식별) 바람직한 성장 기준에 맞게 농축 매체 및 도금 조건을 수정하여 직교 방법을 제공할 수 있다. 이것은 실행 가능하지만 육성 할 수없는 박테리아 또는 존재하지만 낮은 풍부한 종에서 공모를 캡처하는 귀중한 문화 기반 접근 방식을 초래할 수 있습니다.
실행 가능한 안구 발생 커뮤니티의 정의는 안구 문명 식 프로필을 검사하는 데 필수적입니다. 광범위한 연구에 따르면 짧은 사슬 지방산 및 미생물 제품은 안구 면역 반응3,29,30,31,32,33을조절하고 현지에서 작용한다고 합니다. 이것은 말단 생산뿐만 아니라 이러한 요인의 현지 생산이 중요하다는 것을 시사합니다. 또한, 안구건조증 및 당뇨병 등의 질환 상태는 안구 표면 미생물군유전체4, 6,33,34를변화시다. 이것은 건강과 질병에 있는 실행 가능한 안구 미생물군유전체가 더 잘 정의될 수 있다 그래야 DNA 기지를 둔 순서분석뿐만 아니라 문화 기지를 둔 접근을 연결하는 방법에 대한 필요를 강조합니다.
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Disclosures
공개할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
P30 DK034854의 자금 지원VY, LB 및 매사추세츠 호스트-미생물군유전체 센터의 연구 및 NIH/NEI R01 EY022054의 자금 지원 MG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 to 10 µl pipet tip | USA Scientific | 1110-300 | autoclave before use |
| 0.5 to 10 µl Eppendorf pipet | Fisher Scientific | 13-690-026 | |
| 1 ml syringe | Fisher Scientific | BD309623 | 1 syringe for each eye swab group |
| 1.5 ml Eppendorf tubes | USA Scientific | 1615-5500 | autoclave before use |
| 1000 µ ml pipet tip | USA Scientific | 1111-2021 | autoclave before use |
| 200 to 1000µl Gilson pipetman (P1000) | Fisher Scientific | F123602G | |
| 25 G needle | Fisher Scientific | 14-826AA | 1 needle per eye swab group |
| 3 % Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | S25359 | |
| 37 ° C Incubator | Lab equipment | ||
| 70 % Isopropanol | Fisher Scientific | PX1840-4 | |
| Ana-Sed Injection (Xylazine 100 mg/ml) | Santa Cruz Animal Health | SC-362949Rx | |
| BD BBL Gram Stain kit | Fisher Scientific | B12539 | |
| Bunsen Burner | Lab equipment | ||
| Clean paper towels | Lab equipment | ||
| Cotton Batting/Sterile rolled cotton | CVS | ||
| Disposable 1 ml Pipets | Fisher Scientific | 13-711-9AM | for Gram stain and catalase tests |
| E.coli | ATTC | ATCC 8739 | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | for Gram stain and catalase tests |
| Ketamine (100mg/ml) | Henry Schein | 9950001 | |
| Mac Conkey Agar Plates | Fisher Scientific | 4321270 | store at 4 °C until ready to use |
| Mannitol Salt Agar | Carolina Biological Supply | 784641 | Prepare plates according to mfr's instructions, store at 4 °C for 1 week |
| Mice | Jackson Labs | C57/BL6J | |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | 08-757-12 | for Mannitol Salt agar plates |
| RPI Brain Heart Infusion Media | Fisher Scientific | 50-488525 | prepare according to directions and autoclave |
| SteriFlip (0.22 µm pore size polyester sulfone) | EMD/Millipore, Fisher Scientifc | SCGP00525 | to sterilize anesthesia |
| Sterile Corning Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 430829 | anesthesia preparation |
| Sterile mouse cage | Lab equipment | ||
| Tooth picks (round bamboo) | Kitchen Essentials | autoclave before use and swab preparation | |
| Trypticase Soy Agar II with 5% Sheep's Blood Plates | Fisher Scientific | 4321261 | store at 4 °C until ready to use |
| Vitek target slide | BioMerieux Inc. Durham,NC | ||
| Vitek-MS | BioMerieux Inc. Durham,NC | ||
| Vitek-MS CHCA matrix solution | BioMerieux Inc. Durham, NC | 411071 | |
| Single use eye drops | CVS Pharmacy | Bausch and Lomb Soothe Lubricant Eye Drops, 28 vials, 0.02 fl oz. each |
References
- Arpaia, N., et al. Metabolites produced by commensal bacteria promote peripheral regulatory T cell generation. Nature. 504 (7480), 451-455 (2013).
- Hooper, L. V., Littman, D. R., Macpherson, A. J. Interactions between the microbiota and the immune system. Science. 336 (6086), 1268-1273 (2010).
- Nagpal, R., et al. Human-origin probiotic cocktail increases short chain fatty acid production via modulation of mice and human gut microbiome. Scientific Reports. 8 (1), 12649 (2018).
- Graham, J. E., et al. Ocular pathogen or commensal: a PCR based study of surface bacterial flora in normal and dry eyes. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (12), 5616-5623 (2007).
- Wang, C., et al. Sjögren-Like Lacrimal Keratoconjunctivitis in Germ-Free Mice. International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), 565-584 (2018).
- Ham, B., Hwang, H. B., Jung, S. H., Chang, S., Kang, K. D., Kwon, M. J. Distribution and diversity of ocular microbial communities in diabetic patients compared with healthy subjects. Current Eye Research. 43 (3), 314-324 (2018).
- Doan, T., et al. Paucibacterial microbiome and resident DNA virome of the healthy conjunctiva. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (13), 5116-5126 (2016).
- Kugadas, A., Gadjeva, M. Impact of microbiome on ocular health. Ocular Surface. 14 (3), 342-349 (2016).
- Dong, Q., et al. Diversity of bacteria at healthy human conjunctiva. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (8), 5408-5413 (2011).
- Zegans, M. E., Van Gelder, R. N. Considerations in understanding the ocular surface microbiome. American Journal of Opthalmology. 158 (3), 420-422 (2014).
- Fleiszig, S. M., Efron, N. Microbial flora in eyes of current and former contact lens wearers. Journal of Clinical Microbiology. 30 (5), 1156-1161 (1992).
- Lu, X., et al. Neutrophil L-Plastin Controls Ocular Paucibacteriality and Susceptibility to Keratitis. Frontiers in Immunology. 11, 547 (2020).
- Johnson, T. R., Case, C. L. Laboratory Experiments in Microbiology. , Pearson Benjamin Cummings Pubs. San Francisco, CA. (2010).
- Reiner, K.
- UK SMI. Standards for Microbiology Investigation. UK SMI. , Gov.UK. (2014).
- Sharp, S. E., Searcy, C. Comparison of mannitol salt agar and blood agar plates for identification and susceptibility testing of Staphylococcus aureus in specimens from cystic fibrosis patients. Journal of Clinical Microbiology. 44 (12), 4545-4546 (2006).
- Siegman-Igra, Y., Azmon, Y., Schwartz, D. Milleri group streptococcus--a stepchild in the viridans family. European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 31 (9), 2453-2459 (2012).
- Mohan, B., Zaman, K., Anand, N., Taneja, N. Aerococcus Viridans: A Rare Pathogen Causing Urinary Tract Infection. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 11 (1), 1-3 (2017).
- Senneby, E., Nilson, B., Petersson, A. C., Rasmussen, M. Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry is a sensitive and specific method for identification of aerococci. Journal of Clinical Microbiology. 51 (4), 1303-1304 (2013).
- Wan, S. J., et al. IL-1R and MyD88 contribute to the absence of a bacterial microbiome on the healthy murine cornea. Frontiers in Microbiology. 9, 1117 (2018).
- Ozkan, J., et al. Temporal Stability and Composition of the Ocular Surface Microbiome. Scientific Reports. 7 (1), 9880 (2017).
- Oliver, J. M. The viable but non-culturable state in bacteria. Journal of Microbiology. 43 (1), 93-100 (2005).
- Epstein, S. S.
- Whelan, F. J., et al. Culture-enriched metagenomic sequencing enables in-depth profiling of the cystic fibrosis lung microbiota. Nature Microbiology. 5 (2), 379-390 (2020).
- Raymond, F., et al. Culture-enriched human gut microbiomes reveal core and accessory resistance genes. Microbiome. 7, 56 (2019).
- Peto, L., et al. Selective culture enrichment and sequencing of feces to enhance detection of antimicrobial resistance genes in third-generation cephalosporin resistant Enterobacteriaceae. PLoS One. 14 (11), 0222831 (2019).
- Lauer, B. A., Masters, H. B. Toxic effect of calcium alginate swabs on Neisseria gonorrhoeae. Journal of Clinical Microbiology. 26 (1), 54-56 (1988).
- Dubois, D., et al. Performances of the Vitek MS matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry system for rapid identification of bacteria in routine clinical microbiology. Journal of Clinical Microbiology. 50 (8), 2568-2576 (2012).
- Kawakita, T., et al. double-blind study of the safety and Efficacy of 1%D-3-Hydroxybutyrate eye drops for Dry Eye Disease. Scientific Reports. 6, 20855 (2016).
- Lee, H. S., Hattori, T., Stevenson, W., Cahuhan, S. K., Dana, R. Expression of toll-like receptor 4 contributes to corneal inflammation in experimental dry eye disease. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (9), 5632-5640 (2012).
- Simmons, K. T., Xiao, Y., Pflugfelder, S. C., de Paiva, C. S. Inflammatory response to lipopolysaccharide on the ocular surface in a murine dry eye model. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (6), 2444-2450 (2016).
- Miller, D., Ioviano, A. The role of microbial flora on the ocular surface. Current Opinion in Allergy and Immunology. 9 (5), 466-470 (2009).
- Nayyar, A., Gindina, S., Barron, A., Hu, Y., Danias, J. Do epigenetic changes caused by commensal microbiota contribute to development of ocular disease? A review of evidence. Human Genomics. 14 (1), 11 (2020).
- Stevenson, W., et al. Dry eye disease: an immune-mediated ocular surface disorder. Archives of Ophthalmology. 130 (1), 90-100 (2012).
