Summary
كان الهدف من هذه الدراسة هو تحديد ما إذا كان تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA) يمكن الكشف عن الكالسيوم البولي الذي يحتوي على بلورات نانوية من البالغين الأصحاء وقياسه كميا. تشير النتائج المستخلصة من الدراسة الحالية إلى أن NTA يمكن أن يكون أداة محتملة لتقدير البلورات النانوية البولية أثناء أمراض حصى الكلى.
Abstract
حصى الكلى أصبحت أكثر انتشارا في جميع أنحاء العالم في البالغين والأطفال. يتكون النوع الأكثر شيوعا من حصى الكلى من بلورات أوكسالات الكالسيوم (CaOx). يحدث البلورة عندما يصبح البول مشبعا بالمعادن (مثل الكالسيوم والأوكسيالات والفوسفات) ويسبق تكوين حصوات الكلى. وتشمل الطرق القياسية لتقييم البلورات في الحجر السابق المجهر والترشيح والطرد المركزي. ومع ذلك ، فإن هذه الطرق تكشف في المقام الأول البلورات الدقيقة وليس البلورات النانوية. وقد اقترح البلورات النانوية لتكون أكثر ضررا على الخلايا الظهارية الكلى من البلورات الدقيقة في المختبر. هنا، نقوم بوصف قدرة تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA) على اكتشاف البلورات النانوية البولية البشرية. تم تغذية البالغين الأصحاء بنظام غذائي أوكسالات خاضع للرقابة قبل شرب حمولة أوكسالات لتحفيز البلورات النانوية البولية. تم جمع البول لمدة 24 ساعة قبل وبعد الحمل oxalate. وجرى تجهيز العينات وغسلها بالإيثانول لتنقية العينات. كانت البلورات النانوية البولية ملطخة بالفلوروفور الملزم للكالسيوم ، Fluo-4 AM. بعد التلطيخ ، تم تحديد حجم وعدد البلورات النانوية باستخدام NTA. تظهر النتائج المستخلصة من هذه الدراسة أن NTA يمكنها الكشف بكفاءة عن البلورات النانوية لدى البالغين الأصحاء. تشير هذه النتائج إلى أن NTA يمكن أن يكون طريقة اكتشاف مبكر قيمة للبلورات النانوية في المرضى الذين يعانون من مرض حصى الكلى.
Introduction
تتشكل بلورات البول عندما يصبح البول مشبعا بالمعادن. هذا يمكن أن يحدث في الأفراد الأصحاء ولكن هو أكثر شيوعا في الأفراد الذين يعانون من حصى الكلى1. وجود وتراكم بلورات البولية يمكن أن تزيد من خطر واحد لتطوير حصى الكلى. على وجه التحديد، يحدث هذا عندما بلورات ربط لوحة راندال، نواة، تتراكم، وتنمو مع مرور الوقت2،3،4. Crystalluria يسبق تشكيل حصى الكلى وتقييم البلورات قد يكون لها قيمة تنبؤية في الكلى حصى السابقين3,5. على وجه التحديد، وقد اقترح crystalluria لتكون مفيدة للتنبؤ بخطر تكرار الحجر في المرضى الذين يعانون من تاريخ من أوكسالات الكالسيوم التي تحتوي علىالحجارة 6،7.
وقد تم الإبلاغ عن بلورات تؤثر سلبا على الظهارية الكلوية وتعميم وظيفة الخلايا المناعية8,9,10,11,12,13. وقد أفيد سابقا أن تعميم monocytes من أوكسالات الكالسيوم (CaOx) حصى الكلى السابقين قد قمعت الجيستيك الحيوي الخلوية بالمقارنة مع الأفراد الأصحاء14. وبالإضافة إلى ذلك، بلورات CaOx تقليل الجيستيك الحيوي الخلوية وتعطيل التوازن الأكسدة في monocytes8. استهلاك وجبات الطعام الغنية في أوكسالات قد يسبب البلورات التي يمكن أن تؤدي إلى تلف أنبوبي كلوي وتغيير إنتاج ووظيفة الجزيئات الكلية البولية التي هي واقية ضد تشكيل حصى الكلى15,16. وقد أثبتت العديد من الدراسات أن بلورات البولية يمكن أن تختلف في الشكل والحجم اعتمادا على درجة الحموضة ودرجة حرارة البول17،18،19. وعلاوة على ذلك، وقد ثبت البروتينات البولية لتعديل السلوك الكريستال20. واقترحت Daudon وآخرون19, أن تحليل البلورات يمكن أن تكون مفيدة في إدارة المرضى الذين يعانون من أمراض حصى الكلى وفي تقييم استجابتهم للعلاجات. وهناك عدد قليل من الطرق التقليدية المتاحة حاليا لتقييم وجود بلورات تشمل المستقطبة المجهر21،22، المجهر الإلكتروني23، عدادات الجسيمات3، ترشيح البول24، التبخر3،5 أو الطرد المركزي21. وقد وفرت هذه الدراسات رؤية قيمة لحقل حصى الكلى فيما يتعلق بالكريستال. ومع ذلك، كان أحد القيود المفروضة على هذه الأساليب هو عدم القدرة على تصور البلورات التي يقل حجمها عن 1 ميكرومتر وقياسها كميا. بلورات من هذا الحجم قد تؤثر على نمو الحجارة CaOx عن طريق إرفاق لوحة راندال.
وقد ثبت أن البلورات النانوية تسبب إصابات واسعة النطاق للخلايا الكلوية مقارنة مع البلورات الدقيقة الأكبر25. وقد تم الإبلاغ عن وجود البلورات النانوية في البول باستخدام محلل الجسيمات النانوية26،27. وقد استخدمت الدراسات الحديثة مسابير الفوسفات المسمى الفلوري (اليندرونات-فلوريسين/اليندرونات-Cy5) لفحص البلورات النانوية باستخدام قياس الخلايا التدفق النانوي28. الحد من هذه الصبغة هو أنه ليس محددا وسوف يرتبط تقريبا جميع أنواع الحجارة باستثناء السيستين. وبالتالي، فإن التقييم الدقيق لوجود البلورات النانوية لدى الأفراد قد يكون أداة فعالة لتشخيص البلورات و/أو التنبؤ بخطر الحجر. كان الغرض من هذه الدراسة هو الكشف عن الكالسيوم المحتوي على بلورات نانوية (<1 ميكرومتر في الحجم) وتحديده كميا باستخدام تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA). ولتحقيق ذلك، تم استخدام تقنية NTA بالاشتراك مع فلوفور ملزم للكالسيوم، فلو-4 AM للكشف عن الكالسيوم الذي يحتوي على بلورات نانوية في بول البالغين الأصحاء وتحديد كميا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع التجارب المبينة في هذا العمل من قبل جامعة ألاباما في برمنغهام (UAB) مجلس المراجعة المؤسسية. تم تسجيل البالغين الأصحاء (33.6 ± 3.3 سنة؛ n =10) في الدراسة إذا كان لديهم لوحة التمثيل الغذائي الشاملة الدم العادي، غير متعاطي التبغ، غير الحوامل، مؤشر كتلة الجسم بين 20-30 كجم / م2،وخالية من الحالات الطبية المزمنة أو الأمراض الحادة. وقع المشاركون الأصحاء على نموذج موافقة مكتوبة مستنيرة قبل بدء الدراسة.
1. البروتوكول السريري وجمع البول
- هل يستهلك المشاركون نظاما غذائيا منخفض الأوكسلات أعده مركز UAB للعلوم السريرية والترجمة الأساسية للتغذية الحيوية لمدة 3 أيام ويصومون بين عشية وضحاها قبل جمع بولهم (عينة على مدار 24 ساعة).
- في اليوم التالي، اطلب من المشاركين إعادة عينة البول على مدار 24 ساعة (ما قبل الأوكسيالات) قبل استهلاك حمولة أوكسالات (عصير يحتوي على الفواكه والخضروات، ~8 mM oxalate). يجب على المشاركين بعد ذلك جمع البول لمدة 24 ساعة (عينة ما بعد أوكسالات) وإعادة بولهم في اليوم التالي.
- الحفاظ على جميع عينات البول في درجة حرارة الغرفة (RT) قبل المعالجة كما هو موضح أدناه والمبينة في الشكل 1.
2. معالجة البول
ملاحظة: جميع المواد والمعدات المستخدمة مدرجة في جدول المواد.
تنبيه: ارتداء معدات الحماية الشخصية في جميع الأوقات أثناء التعامل مع العينات السريرية والكواشف. على وجه التحديد، والقفازات، ودروع الوجه والعين، وحماية الجهاز التنفسي، والملابس الواقية.
- قياس وتسجيل درجة الحموضة البول والحجم. مزيج جيدا قبل إضافة 50 مل من البول في أنبوب مخروطي 50 مل معقم المسمى.
- عينة الطرد المركزي في 1200 x g لمدة 10 دقائق في RT باستخدام جهاز طرد مركزي على سطح المقعد.
ملاحظة: احتفظ بالعينة في RT لمنع تكوين بلوري إضافي حيث يمكن لدرجات الحرارة الأكثر برودة أن تعزز التبلور. - تجاهل supernatant وغسل وإعادة إنفاق بيليه مرة أخرى مع 5 مل من الإيثانول 100٪. طرد مركزي العينة في 1200 × ز لمدة 10 دقائق في RT باستخدام جهاز طرد مركزي على مقاعد البدلاء.
- تجاهل supernatant وإعادة إنفاق بيليه في 1 مل من الإيثانول 100٪. تخزين العينة في -20 درجة مئوية لمعالجة أو وصمة عار في وقت لاحق العينة كما هو موضح أدناه.
ملاحظة: لا يوجد فرق كبير في نقاط البيانات (أي حجم/تركيز الجسيمات) بين العينات المخزنة أو الطازجة.
3. تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA)
- إعداد العينة
- الجسيمات النانوية الذهبية: استخدم الجسيمات النانوية الذهبية لتحسين الإعدادات على الأداة. تمييع 100 نانومتر من الذهب الحجم 1:1000 في المياه فائقة البور.
- بول الإنسان: تمييع عينات البول 20 مرة في الماء قبل تلطيخ مع 5 MM Fluo-4 AM (صبغة مضان الكالسيوم) لمدة 30 دقيقة في الظلام. تحليل العينات باستخدام NTA.
- إعداد بلورات أوكسالات الكالسيوم (CaOx) كما سبق وصفها29. تمييع محلول مخزون 10 مللي متر (14.6 ملغ في 10 مل من الماء) إلى 50 ميكرومتر في الماء ولطخ العينات المخففة باستخدام 5 مللي متر فلو-4 AM لمدة 30 دقيقة في الظلام قبل التحليل.
- بلورات فوسفات الكالسيوم (CaP): تمييع محلول مخزون 10 مللي متر (50.4 ملغ في 10 مل من الماء) إلى 50 ميكرومتر في الماء ولطخ العينات المخففة باستخدام 5 مللي متر فلوو-4 AM لمدة 30 دقيقة في الظلام قبل تحليل NTA.
- إعداد الأداة وإعدادات الكاميرا وجمع البيانات
ملاحظة: يتم عرض إعداد الكمبيوتر والأدوات المستخدمة لهذا الأسلوب في الشكل 2.- قم بتشغيل الكمبيوتر ثم الجهاز. افتح البرنامج ثم قم بتشغيل الكاميرا.
- بمجرد فتح نافذة البرنامج، انقر فوق رمز الالتقاط في الزاوية اليسرى العليا من النافذة لبدء وضع الالتقاط. تستغرق تهيئة الكاميرا بضع ثوان.
- تنظيف المنصة عن طريق ضخ الهواء لأول مرة في ذلك باستخدام حقنة 1 مل حتى تظهر المنصة نظيفة. أضف الماء برفق إلى الجهاز 2-3 مرات باستخدام حقنة أخرى 1 مل لإزالة أي فقاعات الهواء.
ملاحظة: ابحث عن أي فقاعات الهواء في المنصة وكذلك في الأنابيب. من المهم أن لا يكون فقاعات في جميع أنحاء الجهاز قبل وأثناء تشغيل العينات. إذا كانت الفقاعات موجودة، قم بتنظيف المنصة مرة أخرى بالهواء والماء. - بمجرد أن تكون المنصة نظيفة، أضف الماء للتحقق من أي تلوث على السطح من خلال عرض الكاميرا. بعد ذلك، أضف جسيمات نانوية ذهبية كعنصر تحكم إلى حاقن مضخة تحميل العينة لإعداد الأداة.
- ضبط مستوى الكاميرا على الشاشة أو على مقبض الباب إلى الجانب الأيمن من الصك حتى تبدأ الصورة لعرض بكسل الملونة ومن ثم تقليل مستوى الكاميرا.
- ثم ضبط الشاشة لتحسين الصورة. انقر بزر الماوس الأيسر على صورة الفيديو. اضغط على زر الماوس الأيسر واسحب الصورة لأعلى ول لأسفل للحصول على العرض بالكامل.
ملاحظة: يتم استخدام عدسة الكاميرا العادية والفلتر لتقييم الجسيمات النانوية الذهبية والعينات غير الملطخة. - قم بإعداد سرعة التسريب وركز الكاميرا بحيث تكون الجسيمات النانوية الذهبية مرئية على شاشة الكاميرا. تعيين سرعة التسريب إلى عالية (أي 500 ميكرولتر / دقيقة) لإعداد الأولي لضمان الكشف عن الجسيمات النانوية الذهب. بمجرد اكتشافها، خفض السرعة إلى 50 ميكرولتر / دقيقة.
- ضبط مستوى الكاميرا لتصور الجسيمات. للعينات غير الملطخة، اضبط كسب الشاشة عند المستوى 5 لتحقيق تركيز الكاميرا، وحدد مستوى الكاميرا عند 8. بمجرد ضبط التركيز، سجل العينة (أي قياس واحد لمدة 60 ثانية فقط).
ملاحظة: التركيز وسرعة التدفق المستمر مهمة للحصول على صور واضحة وحادة للجسيمات للعد. - بعد التحسين، تنظيف الجهاز مرة أخرى بالماء قبل تقييم العينات. عرض الكاميرا للتأكد من أن الأنابيب نظيفة والجسيمات غير موجودة.
ملاحظة: اغسل الغرفة بين كل عينة حتى لا تكتشف الكاميرا أي جزيئات. - لتحليل عينات ملونة، قم بضبط الكاميرا على موضع الفلتر الذي يحتوي على فلتر فلوري مناسب. تحميل عينات مخففة وملطخة على حاقن مضخة تحميل العينة وتقليل السرعة إلى 20 ميكرولتر / دقيقة لتحليل العينة.
- بعد ذلك ضبط كسب الشاشة ومستوى الكاميرا وهذه هي المعلمات الهامة. لعينات ملونة (فلورية)، قم بتعيين كسب الشاشة إلى 5 ومستوى الكاميرا في المستوى 13.
ملاحظة: هذه المعلمات تختلف استنادا إلى نوع العينة و كل عينة سوف تحتاج إلى تحسين للحصول على التركيز. - استخدم القياس القياسي لقياس العينات ل 5 التقاطات لكل عينة حيث تكون مدة التقاط واحدة لمدة 60 ثانية.
- حفظ البيانات وتخزينها بعد كل قياس. سيقوم البرنامج بحفظ ملفات الصور والفيديو لكل قياس. يوفر البرنامج بيانات الإخراج (على سبيل المثال، حجم الكريستال: 10 nM - 1000 nM والتركيز) في كل من صيغ excel و pdf.
- حساب متوسط عدد الجسيمات النانوية لجميع القراءات 5 لكل عينة على حدة. تحليل البيانات باستخدام الانحراف المعياري أو الخطأ المعياري للوسط واستخدام t-tests للتحليل المقترن.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تظهر النتائج المستخلصة من هذه الدراسة أن NTA يمكنها الكشف بكفاءة عن متوسط حجم وتركيز الكالسيوم الذي يحتوي على بلورات نانوية بولية في بول الإنسان. وقد تحقق ذلك باستخدام الفلوروفور، وفلو-4 صباحا، وتحليل تتبع الجسيمات النانوية. فلو-4 AM كان قادرا على ربط كل من CaOx وبلورات CAP. وكما هو مبين في الشكل 3A، تم تحديد بلورات CaOx لتكون بين 50-270 نانومتر في الحجم ولها متوسط تركيز 1.26 × 109 جزيئات / مل. كانت بلورات CaP بين 30-225 نانومتر في الحجم وكان متوسط تركيزها 2.22 × 109 جزيئات / مل (الشكل 3B). لتحديد ما إذا كان NTA يمكن تقييم البلورات النانوية في البول البشري، وطلب من البالغين الأصحاء لاستهلاك نظام غذائي أوكسالات تسيطر عليها تليها حمولة أوكسالات عالية. تم جمع عينات البول لمدة 24 ساعة قبل وبعد الحمل لتقييم حجم البلورات النانوية البولية وتركيزها. تحتوي عينات البول قبل أوكسالات على بعض البلورات النانوية البولية (1.65 × 108 ± 3.29 × 107 جزيئات / مل) بين 110-300 نانومتر(الشكل 4). وعلى النقيض من ذلك، كانت هناك زيادة كبيرة (p<0.0001) في البلورات النانوية البولية الموجودة في عينات ما بعد الأوكسيالات (7.05 × 108 ± 1.08 × 108 جزيئات/مل؛ 100-320 نانومتر)(الشكل 4). 10- للتأكد من إمكانية استنساخ الطريقة، تم قياس العينات ثلاث مرات ولم يكن هناك تباين كبير في النسخ المتماثلة التقنية(الشكل 5).
الشكل 1:بروتوكول لعزل وتلطيخ البلورات النانوية البولية البشرية.
الشكل 2: وصف تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA). (أ) الكمبيوتر والأدوات التي تم إعدادها المستخدمة لهذه الدراسات. (ب)يتم حقن عينات في مدخل أنابيب باستخدام مضخة حقنة بمعدل مستمر قبل ملء السطح البصري. ثم يتم مراقبة العينات من قبل العدسة الموضوعية والتقاطها من قبل الكاميرا كما تتدفق العينات من خلال المنصة قبل الخروج من خلال أنابيب منفذ ليتم التخلص منها. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: NTA يكشف فلوو-4 AM المسمى أوكسالات الكالسيوم (CaOx) وفوسفات الكالسيوم (CaP) بلورات. الرسوم البيانية التمثيلية ل (أ) CaOx و (B) بلورات CaP التي تظهر توزيع الحجم والتركيز. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: NTA يكشف فلوو-4 AM المسمى 24 ساعة النانوية البولية البشرية. الرسم البياني التمثيلي ل Fluo-4 AM المسمى البلورات النانوية البولية في عينات ما قبل الأوكسيالات وما بعد الأوكسيالات على مدار 24 ساعة من شخص بالغ سليم على نظام غذائي أوكسالات خاضع للرقابة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5:تكرارات تقنية للبلورات النانوية البشرية في مجموعات البول على مدار 24 ساعة باستخدام NTA. التقنية replicates من فلوو-4 AM المسمى البلورات النانوية البولية في 24 ساعة (أ) قبل أوكسالات و (ب) عينات ما بعد أوكسالات من شخص بالغ صحي على نظام غذائي أوكسالات تسيطر عليها. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد استخدمت NTA في هذه الدراسة لتقييم البلورات النانوية في البول البشري باستخدام مسبار ربط الكالسيوم، فلو-4 AM. لا توجد طريقة قياسية متاحة للكشف عن البلورات النانوية في البول. وقد اكتشفت بعض المجموعات البحثية البلورات النانوية في البول واعتمدت على استخدام بروتوكولات واسعة النطاق أو أساليب محدودة في قدرتها على تحديدالعينات 27،28. تظهر هذه الدراسة طريقة محددة وحساسة للكشف عن الكالسيوم الذي يحتوي على بلورات نانوية في بول البشر الذين شاركوا في دراسة التغذية الغذائية التي تألفت من تناول حمولة عالية من الأوكسيالات. وكانت كمية الأوكسيالات المستهلكة تعادل استهلاك العالم الحقيقي من الأوكسيالات (على سبيل المثال، سلطة السبانخ).
NTA هي أداة عالية الدقة تتميز بشكل جيد تستخدم الحركة البراونية لقياس الجسيمات في الحل30. وقد استخدم لتقييم الجسيمات النانوية البيولوجية في مجموعة متنوعة من العينات البيولوجية31،32،33. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يتنبأ NTA بدقة بحجم وتركيز الجسيمات في أي نوع من العينات البيولوجية. لا يتطلب هذا الأسلوب أي وضع العلامات; ومع ذلك، يمكن استخدام وضع العلامات للكشف عن جزيئات محددة. تم استخدام Fluo-4 AM في هذه الدراسة للكشف بكفاءة وتحديدا عن الكالسيوم الذي يحتوي على بلورات نانوية في عينات البول. استخدمت مسابير الفلورسنت الكالسيوم في البداية لقياس الكالسيوم الخلوي الحر34. فلوو-4 هو التماثلية من فلوو-3 الذي يزيد من الفلورية >100 أضعاف على ملزمة لتحرير الكالسيوم35. وبالإضافة إلى ذلك، وقد ثبت فلوو-4 لتقييم جزيئات الكالسيوم في السائل الزليلي من المرضى الذين يعانون من التهاب المفاصل باستخدام قياس التدفق الخلوي36. وهكذا استخدمنا Fluo-4 AM لهذه الدراسات.
تم حقن جميع العينات باستمرار في المنصة للكشف الدقيق. يعتمد تحديد التركيز وحجم الجسيمات على معدل التدفق، حيث يمكن أن يؤثر معدل التدفق المرتفع (أي 50 ميكرولتر/دقيقة) على التقييم الدقيق للتركيز، وكذلك حجم الجسيمات مقارنة بالإعداد الثابت ومعدل التدفق المنخفض (أي 20 ميكرولتر/دقيقة)37. وبالتالي، يوفر معدل التدفق البطيء المطرد قياسا دقيقا لعدد الجسيمات الموجودة في العينات. المعلمات الهامة الأخرى التي قد تؤثر على عدد الجسيمات وحجمها تشمل مستوى الكاميرا، عتبة الكشف، والتركيز38،39،40. قياس الجسيمات متسقة في العينات (السيرة الذاتية حوالي 20٪) لوحظ في الدراسة الحالية، والتي كانت متسقة مع النتائج المستخلصة من دراسة أخرى39. وأخيرا، تم تأكيد وجود البلورات النانوية في البول البشري باستخدام المجهر الإلكتروني29. يوضح هذا البحث أن NTA يمكنها قياس البلورات النانوية البولية بنجاح من البشر.
إحدى مزايا هذا البروتوكول هي استخدام Fluo-4 AM لتقييم جزيئات تحتوي على الكالسيوم في المحلول. ميزة أخرى هي الحد الأدنى من التباين لوحظ في الكشف عن البلورات النانوية داخل العينات. أحد قيود NTA في هذا الإعداد ، هو عدم القدرة على التمييز بين مورفولوجيا البلورات النانوية. ومع ذلك، يمكن أن تكون هذه الطريقة مفيدة للكشف عن البلورات للتنبؤ بخطر الحجر في الأفراد الذين لهم تاريخ من الكالسيوم الذي يحتوي على حصى الكلى. لا يمكن أن يحل هذا البروتوكول محل المنهجيات الحالية ولكنه قد يوفر رؤية جديدة حول البلورات النانوية البولية. استخدام NTA لتقييم الكالسيوم البولي الذي يحتوي على بلورات هو نهج جديد ينبغي أن يسلط الضوء على أهمية البلورات النانوية وراء المجهر القياسي والأساليب المذكورة أعلاه. هناك ما يبرر إجراء تحقيقات إضافية لاستكشاف موثوقية هذه الطريقة في سكان حصى الكلى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون جميع المشاركين في الدراسة وUAB CCTS التغذية الحيوية الأساسية ومركز خدمة التصوير عالي الدقة UAB لمساهماتهم. تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة منح DK106284 و DK123542 (TM) ، وUL1TR003096 (المركز الوطني للنهوض بالعلوم الترجمية).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Benchtop Centrifuge | Jouan Centrifuge | CR3-12 | |
| Calcium Oxalate monohydrate | Synthesized in the lab as previously described29. | Store at RT; Stock 10 mM | |
| Calcium Phosphate crystals (hydroxyapatite nanopowder) | Sigma | 677418 | Store at RT; Stock 10 mM |
| Ethanol | Fischer Scientific | AC615095000 | Store at RT; Stock 100% |
| Fluo-4 AM* | AAT Bioquest, Inc. | 20550 | Store at Freezer (-20°C); Stock 5 mM |
| Gold Nanoparticles | Sigma | 742031 | Store at 2-8°C |
| NanoSight Instrument | Malvern Instruments, UK | NS300 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 98-4730 | |
| Virkon Disinfectant | LanXESS Energizing Company, Germany | LSP | |
| *Fluorescence dyes are light sensitive; stock and aliquots should be stored in the dark at -20°C. |
References
- Fogazzi, G. B. Crystalluria: a neglected aspect of urinary sediment analysis. Nephrology, Dialysis, Transplantation. 11 (2), 379-387 (1996).
- Kuo, R. L. Urine calcium and volume predict coverage of renal papilla by Randall's plaque. Kidney International. 64 (6), 2150-2154 (2003).
- Robertson, W. G., Peacock, M., Nordin, B. E. Calcium crystalluria in recurrent renal-stone formers. Lancet. 2 (7610), 21-24 (1969).
- Robertson, W. G., Peacock, M. Calcium oxalate crystalluria and inhibitors of crystallization in recurrent renal stone-formers. Clinical Science. 43 (4), 499-506 (1972).
- Hallson, P. C., Rose, G. A. A new urinary test for stone "activity". British Journal of Urology. 50 (7), 442-448 (1978).
- Daudon, M., Hennequin, C., Boujelben, G., Lacour, B., Jungers, P. Serial crystalluria determination and the risk of recurrence in calcium stone formers. Kidney International. 67 (5), 1934-1943 (2005).
- Baumann, J. M., Affolter, B. From crystalluria to kidney stones, some physicochemical aspects of calcium nephrolithiasis. World Journal of Nephrology. 3 (4), 256-267 (2014).
- Patel, M., et al. Oxalate induces mitochondrial dysfunction and disrupts redox homeostasis in a human monocyte derived cell line. Redox Biology. 15, 207-215 (2018).
- Khan, S. R. Role of renal epithelial cells in the initiation of calcium oxalate stones. Nephron Experimental Nephrology. 98 (2), 55-60 (2004).
- Mulay, S. R., et al. Calcium oxalate crystals induce renal inflammation by NLRP3-mediated IL-1beta secretion. Journal of Clinical Investigation. 123 (1), 236-246 (2013).
- Umekawa, T., Chegini, N., Khan, S. R. Oxalate ions and calcium oxalate crystals stimulate MCP-1 expression by renal epithelial cells. Kidney International. 61 (1), 105-112 (2002).
- Huang, M. Y., Chaturvedi, L. S., Koul, S., Koul, H. K. Oxalate stimulates IL-6 production in HK-2 cells, a line of human renal proximal tubular epithelial cells. Kidney International. 68 (2), 497-503 (2005).
- Lu, X. Renal tubular epithelial cell injury, apoptosis and inflammation are involved in melamine-related kidney stone formation. Urological Research. 40 (6), 717-723 (2012).
- Williams, J., Holmes, R. P., Assimos, D. G., Mitchell, T. Monocyte Mitochondrial Function in Calcium Oxalate Stone Formers. Urology. 93, 221-226 (2016).
- Balcke, P., et al. Transient hyperoxaluria after ingestion of chocolate as a high risk factor for calcium oxalate calculi. Nephron. 51 (1), 32-34 (1989).
- Khan, S. R., Kok, D. J.
- Rodgers, A., Allie-Hamdulay, S., Jackson, G. Therapeutic action of citrate in urolithiasis explained by chemical speciation: increase in pH is the determinant factor. Nephrology, Dialysis, Transplantation. 21 (2), 361-369 (2006).
- Verplaetse, H., Verbeeck, R. M., Minnaert, H., Oosterlinck, W. Solubility of inorganic kidney stone components in the presence of acid-base sensitive complexing agents. European Urology. 11 (1), 44-51 (1985).
- Frochot, V., Daudon, M. Clinical value of crystalluria and quantitative morphoconstitutional analysis of urinary calculi. International Journal of Surgery. 36, London, England. Pt D 624-632 (2016).
- Grover, P. K., Thurgood, L. A., Wang, T., Ryall, R. L. The effects of intracrystalline and surface-bound proteins on the attachment of calcium oxalate monohydrate crystals to renal cells in undiluted human urine. BJU International. 105, 708-715 (2010).
- Bader, C. A., Chevalier, A., Hennequin, C., Jungers, P., Daudon, M. Methodological aspects of spontaneous crystalluria studies in calcium stone formers. Scanning Microscopy. 8 (2), 215-231 (1994).
- Daudon, M., Cohen-Solal, F., Jungers, P. Eurolithiasis. 9th European Symposium on Urolithiasis. , Shaker Publishing. Maastricht. 261-263 (2001).
- Werness, P. G., Bergert, J. H., Smith, L. H.
- Fan, J., Chandhoke, P. S. Examination of crystalluria in freshly voided urines of recurrent calcium stone formers and normal individuals using a new filter technique. Journal of Urology. 161 (5), 1685-1688 (1999).
- Sun, X. Y., Ouyang, J. M., Yu, K. Shape-dependent cellular toxicity on renal epithelial cells and stone risk of calcium oxalate dihydrate crystals. Scientific Reports. 7 (1), 7250 (2017).
- He, J. Y., Deng, S. P., Ouyang, J. M. Morphology, particle size distribution, aggregation, and crystal phase of nanocrystallites in the urine of healthy persons and lithogenic patients. IEEE Trans Nanobioscience. 9 (2), 156-163 (2010).
- Gao, J., et al. Comparison of Physicochemical Properties of Nano- and Microsized Crystals in the Urine of Calcium Oxalate Stone Patients and Control Subjects. Journal of Nanomaterials. 2014, 9 (2014).
- Gavin, C. T., et al. Novel Methods of Determining Urinary Calculi Composition: Petrographic Thin Sectioning of Calculi and Nanoscale Flow Cytometry Urinalysis. Scientific Reports. 6, 19328 (2016).
- Kumar, P., et al. Dietary Oxalate Induces Urinary Nanocrystals in Humans. Kidney International Reports. 5 (7), 1040-1051 (2020).
- Carr, B., Hole, P., Malloy, A., Nelson, P., Smith, J. Applications of nanoparticle tracking analysis in nanoparticle research--A mini-review. European Journal of Parenteral Sciences and Pharmaceutical Sciences. 14 (2), 45 (2009).
- Dragovic, R. A., et al. Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 7 (6), 780-788 (2011).
- Dragovic, R. A., et al. Isolation of syncytiotrophoblast microvesicles and exosomes and their characterisation by multicolour flow cytometry and fluorescence Nanoparticle Tracking Analysis. Methods. 87, 64-74 (2015).
- Gercel-Taylor, C., Atay, S., Tullis, R. H., Kesimer, M., Taylor, D. D. Nanoparticle analysis of circulating cell-derived vesicles in ovarian cancer patients. Analytical Biochemistry. 428 (1), 44-53 (2012).
- Minta, A., Kao, J. P., Tsien, R. Y. Fluorescent indicators for cytosolic calcium based on rhodamine and fluorescein chromophores. Journal of Biological Chemistry. 264 (14), 8171-8178 (1989).
- Harkins, A. B., Kurebayashi, N., Baylor, S. M. Resting myoplasmic free calcium in frog skeletal muscle fibers estimated with fluo-3. Biophysical Journal. 65 (2), 865-881 (1993).
- Hernandez-Santana, A., Yavorskyy, A., Loughran, S. T., McCarthy, G. M., McMahon, G. P. New approaches in the detection of calcium-containing microcrystals in synovial fluid. Bioanalysis. 3 (10), 1085-1091 (2011).
- Tong, M., Brown, O. S., Stone, P. R., Cree, L. M., Chamley, L. W. Flow speed alters the apparent size and concentration of particles measured using NanoSight nanoparticle tracking analysis. Placenta. 38, 29-32 (2016).
- Maas, S. L., et al. Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics. Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).
- Hole, P., et al. Interlaboratory comparison of size measurements on nanoparticles using nanoparticle tracking analysis (NTA). Journal of Nanoparticle Research. 15, 2101 (2013).
- Tomlinson, P. R., et al. Identification of distinct circulating exosomes in Parkinson's disease. Annals of Clinical and Translational Neurology. 2 (4), 353-361 (2015).
