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कैल्शियम फ्लोरोफोर लेबलिंग और नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण का उपयोग करके मनुष्यों में मूत्र नैनोक्रिस्टल का अनुमान

Published: February 9, 2021 doi: 10.3791/62192
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Urology, University of Alabama at Birmingham

Summary

इस अध्ययन का उद्देश्य यह निर्धारित करना था कि क्या नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण (एनटीए) स्वस्थ वयस्कों से नैनोक्रिस्टल युक्त मूत्र कैल्शियम का पता लगा सकता है और उसकी मात्रा निर्धारित कर सकता है । वर्तमान अध्ययन से निष्कर्ष NTA सुझाव है कि गुर्दे की पथरी रोग के दौरान मूत्र नैनोक्रिस्टल का अनुमान लगाने के लिए एक संभावित उपकरण हो सकता है ।

Abstract

वयस्कों और बच्चों में गुर्दे की पथरी दुनिया भर में अधिक प्रचलित होती जा रही है। गुर्दे की पथरी का सबसे आम प्रकार कैल्शियम ऑक्सलेट (CaOx) क्रिस्टल शामिल है। क्रिस्टलुरिया तब होता है जब मूत्र खनिजों (जैसे, कैल्शियम, ऑक्सालेट, फॉस्फेट) के साथ अधिसंख्य हो जाता है और गुर्दे की पथरी के गठन से पहले होता है। पत्थर के पूर्वे में क्रिस्टलुरिया का आकलन करने के लिए मानक तरीकों में माइक्रोस्कोपी, निस्पंदन और अपकेंद्रित्र शामिल हैं। हालांकि, ये तरीके मुख्य रूप से माइक्रोक्रिस्टल का पता लगाते हैं न कि नैनोक्रिस्टल। नैनोक्रिस्टल्स को विट्रो में माइक्रोक्रिस्टल की तुलना में किडनी एपिथेलियल सेल्स के लिए ज्यादा नुकसानदेह होने का सुझाव दिया गया है। यहां, हम मानव मूत्र नैनोक्रिस्टल का पता लगाने के लिए नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण (एनटीए) की क्षमता का वर्णन करते हैं। स्वस्थ वयस्कों को मूत्र नैनोक्रिस्टल को उत्तेजित करने के लिए ऑक्सलेट लोड पीने से पहले एक नियंत्रित ऑक्सालेट आहार खिलाया गया था। ऑक्सलेट लोड से पहले और बाद में 24 घंटे के लिए मूत्र एकत्र किया गया था। नमूनों को शुद्ध करने के लिए इथेनॉल के साथ कार्रवाई की गई और धोया गया। मूत्र नैनोक्रिस्टल कैल्शियम बाध्यकारी फ्लोरोफोर, फ्लोरो-4 AM के साथ दाग रहे थे । धुंधला होने के बाद एनटीए का उपयोग करके नैनोक्रिस्टल का आकार और गिनती निर्धारित की गई । इस अध्ययन से प्राप्त निष्कर्ष एनटीए स्वस्थ वयस्कों में नैनोक्रिस्टलुरिया का कुशलतापूर्वक पता लगा सकते हैं। इन निष्कर्षों से पता चलता है एनटीए गुर्दे की पथरी रोग के रोगियों में नैनोक्रिस्टलुरिया की एक मूल्यवान जल्दी पता लगाने विधि हो सकता है ।

Introduction

मूत्र क्रिस्टल तब बनते हैं जब मूत्र खनिजों के साथ अधिसंतृप्त हो जाता है। यह स्वस्थ व्यक्तियों में हो सकता है लेकिन गुर्दे की पथरी वाले व्यक्तियों में अधिक आम है1. मूत्र क्रिस्टल की उपस्थिति और संचय गुर्दे की पथरी विकसित करने के जोखिम को बढ़ा सकता है। विशेष रूप से, यह तब होता है जब क्रिस्टल रैंडल की पट्टिका से बांधते हैं, नाभिक, जमा होतेहैं, और समय2,3, 4के साथबढ़तेहैं। क्रिस्टलुरिया गुर्दे के पत्थर के गठन से पहले होता है और क्रिस्टलुरिया के आकलन का गुर्दे के पत्थर के फॉर्मर्स3,5में भविष्य कहनेवाला मूल्य हो सकता है । विशेष रूप से, क्रिस्टलुरिया को6,7कैल्शियम ऑक्सलेट के इतिहास वाले रोगियों में पत्थर पुनरावृत्ति के जोखिम का अनुमान लगाने के लिए उपयोगी होने का सुझाव दिया गया है ।

क्रिस्टल को गुर्दे के एपिथेलियल पर नकारात्मक प्रभाव डाला गया है और प्रतिरक्षा कोशिका कार्य 8 ,9,10,11,12,13को प्रसारित किया गया है । यह पहले बताया गया है कि कैल्शियम ऑक्सालेट (सीएओएक्स) गुर्दे के पत्थर के पूर्वों से मोनोसाइट्स परिसंचारी ने स्वस्थ व्यक्तियों की तुलना में सेलुलर बायोएनेरेगेटिक्स को दबा दिया है14। इसके अलावा, सीएओसी क्रिस्टल सेलुलर बायोनेरेरेटिक को कम करते हैं और मोनोसाइट्स8में रेडॉक्स होमोसेस्टेसिस को बाधित करते हैं। ऑक्सलेट से भरपूर भोजन के सेवन से क्रिस्टलुरिया हो सकता है जिससे गुर्दे की ट्यूबल क्षति हो सकती है और मूत्र स्थूल अणुओं के उत्पादन और कार्य में परिवर्तन हो सकता है जो गुर्दे की पथरी के निर्माण के खिलाफ सुरक्षात्मक हैं15,16। कई अध्ययनों से यह दर्शाया गया है कि मूत्र के पीएच और मूत्र के तापमान के आधार पर मूत्र क्रिस्टल आकार और आकार में भिन्न होसकतेहैं17, 18,19. इसके अलावा, मूत्र प्रोटीन क्रिस्टल व्यवहार20को मिलाना दिखाया गया है । Daudon एट अल19,प्रस्ताव किया है कि क्रिस्टलुरिया विश्लेषण गुर्दे की पथरी रोग के साथ रोगियों के प्रबंधन में और चिकित्सा के लिए उनकी प्रतिक्रिया का आकलन करने में मददगार हो सकता है । क्रिस्टल की उपस्थिति का मूल्यांकन करने के लिए वर्तमान में उपलब्ध कुछ पारंपरिक तरीकों में ध्रुवीकृत माइक्रोस्कोपी21,22, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी23, कण काउंटर3,मूत्र निस्पंदन24, वाष्पीकरण3,5 या अपकेंद्रित्र21शामिल हैं । इन अध्ययनों ने क्रिस्टलुरिया के बारे में गुर्दे के पत्थर के क्षेत्र को मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान की है। हालांकि, इन तरीकों की एक सीमा आकार में 1 माइक्रोन से कम क्रिस्टल की कल्पना और मात्रा निर्धारित करने में असमर्थता रही है। इस आकार के क्रिस्टल रैंडल की पट्टिका से जोड़कर सीएऑक्स पत्थरों के विकास को प्रभावित कर सकते हैं।

नैनोक्रिस्टल्स को बड़े माइक्रोक्रिस्टल25की तुलना में गुर्दे की कोशिकाओं को व्यापक चोट पहुंचाने के लिए दिखाया गया है । नैनोक्राइक्ले एनालाइजर26,27के उपयोग से मूत्र में नैनोक्रिस्टल की उपस्थिति की सूचना मिली है . हाल के अध्ययनों ने नैनोस्केल फ्लो साइटोमेट्री28का उपयोग करके नैनोक्रिस्टल की जांच करने के लिए फ्लोरोसेंटली लेबल बिस्फोस्फेट प्रोब्स (एलेंड्रोनेट-फ्लोरोसेइन/एलेंड्रोनेट-साइ5) का उपयोग किया है । इस डाई की सीमा यह है कि यह विशिष्ट नहीं है और सिस्टीन को छोड़कर लगभग सभी प्रकार के पत्थरों से बांधेगा। इस प्रकार, व्यक्तियों में नैनोक्रिस्टल की उपस्थिति का सही आकलन क्रिस्टलुरिया का निदान करने और/या पत्थर के जोखिम की भविष्यवाणी करने के लिए एक प्रभावी उपकरण हो सकता है । इस अध्ययन का उद्देश्य नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण (एनटीए) का उपयोग करके नैनोक्रिस्टल (आकार में <1 माइक्रोन) युक्त कैल्शियम का पता लगाना और मात्रा निर्धारित करना था। इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए, एनटीए प्रौद्योगिकी का उपयोग स्वस्थ वयस्कों के मूत्र में नैनोक्रिस्टल युक्त कैल्शियम का पता लगाने और निर्धारित करने के लिए कैल्शियम बाध्यकारी फ्लोरोफोर, फ्लोरो-4 एएम के संयोजन में किया गया था।

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Protocol

इस काम में उल्लिखित सभी प्रयोगों को बर्मिंघम (UAB) संस्थागत समीक्षा बोर्ड में अलबामा विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया था । स्वस्थ वयस्कों (३३.६ ± ३.३ साल पुराना; n= 10) अध्ययन में नामांकित किया गया था अगर वे एक सामांय रक्त व्यापक मेटाबोलिक पैनल, गैर तंबाकू उपयोगकर्ताओं, गैर गर्भवती, 20-30 किलो/एम2के बीच एक बीएमआई था, और पुरानी चिकित्सा स्थितियों या तीव्र बीमारियों से मुक्त । स्वस्थ प्रतिभागियों ने अध्ययन शुरू होने से पहले एक लिखित सूचित सहमति फॉर्म पर हस्ताक्षर किए ।

1. नैदानिक प्रोटोकॉल और मूत्र संग्रह

  1. क्या प्रतिभागी यूएबी सेंटर फॉर क्लीनिकल एंड ट्रांसलेशनल साइंसेज बायोपोषण कोर द्वारा 3 दिनों के लिए तैयार कम ऑक्सलेट आहार का उपभोग करते हैं और अपने मूत्र (24 घंटे के नमूने) को इकट्ठा करने से पहले रात भर तेजी से करते हैं।
  2. अगले दिन, प्रतिभागियों को ऑक्सलेट लोड (फल और सब्जियों युक्त ठग, ~ 8 mm ऑक्सलेट) का उपभोग करने से पहले अपने 24 घंटे के मूत्र नमूना (पूर्व ऑक्सलेट) वापस कर दिया है। क्या प्रतिभागी बाद में 24 घंटे (ऑक्सलेट नमूना के बाद) के लिए अपना मूत्र एकत्र करते हैं और अगले दिन अपना मूत्र वापस करते हैं।
  3. नीचे वर्णित और चित्रा 1में दिखाए गए प्रसंस्करण से पहले कमरे के तापमान (आरटी) पर सभी मूत्र नमूनों को बनाए रखें।

2. यूरिन प्रोसेसिंग

नोट: उपयोग की जाने वाले सभी सामग्री और उपकरण सामग्री की तालिकामें सूचीबद्ध हैं।
सावधानी: नैदानिक नमूनों और अभिकर् ती से निपटने के दौरान हर समय व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनें। विशेष रूप से, दस्ताने, चेहरा और आंख ढाल, श्वसन सुरक्षा, और सुरक्षात्मक कपड़े।

  1. उपाय और मूत्र पीएच और मात्रा रिकॉर्ड। एक लेबल बाँझ 50 एमएल शंकु नली में मूत्र के 50 एमएल जोड़ने से पहले अच्छी तरह से मिलाएं।
  2. एक बेंचटॉप अपकेंद्रित्र का उपयोग कर आरटी में 10 मिनट के लिए 1200 x ग्राम पर सेंट्रलाइज नमूना।
    नोट: आगे क्रिस्टल गठन को रोकने के लिए आरटी में नमूना रखें क्योंकि कूलर तापमान क्रिस्टलीकरण को बढ़ावा दे सकता है।
  3. सुपरनेट को त्यागें और 100% इथेनॉल के 5 एमएल के साथ फिर से गोली को धोएं और फिर से रीसस्ट करें। एक बेंचटॉप अपकेंद्रित्र का उपयोग कर आरटी में 10 मिनट के लिए 1200 x g पर नमूना अपकेंद्रित्र।
  4. सुपरनेट को त्यागें और 100% इथेनॉल के 1 मिलील में गोली को फिर से खर्च करें। बाद में प्रसंस्करण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर नमूना स्टोर करें या नीचे वर्णित नमूने को दाग दें।
    नोट: संग्रहीत या हौसले से दाग नमूनों के बीच डेटा अंक (यानी, कण आकार/एकाग्रता) में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं है ।

3. नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण (एनटीए)

  1. नमूना तैयारी
    1. गोल्ड नैनोकण: उपकरण पर सेटिंग्स को अनुकूलित करने के लिए सोने के नैनोकणों का उपयोग करें। पतला 100 एनएम आकार के सोने के नैनोकण 1:1000 अल्ट्रापुरे पानी में।
    2. मानव मूत्र: अंधेरे में 30 मिनट के लिए 5 एमएम फ्लोरो-4 AM (कैल्शियम फ्लोरेसेंस डाई) के साथ धुंधला होने से पहले पानी में 20 बार मूत्र के नमूनों को पतला करें। एनटीए का उपयोग कर नमूनों का विश्लेषण करें।
    3. कैल्शियम ऑक्सालेट (CaOx) क्रिस्टल तैयार के रूप में पहले29वर्णित है । पतला 10 mm स्टॉक समाधान (पानी की 10 मिलीएल में 14.6 मिलीग्राम) पानी में 50 μM और पतला नमूनों दाग 5 mM Fluo-4 विश्लेषण से पहले अंधेरे में 30 मिनट के लिए सुबह 4 बजे का उपयोग कर।
    4. कैल्शियम फॉस्फेट (सीएपी) क्रिस्टल: पतला 10 mm स्टॉक समाधान (पानी की 10 मिलीग्राम में 50.4 मिलीग्राम) पानी में 50 माइक्रोन और पतला नमूनों दाग 5 mM Fluo-4 का उपयोग कर पतला नमूनों को दाग 30 मिनट के लिए अंधेरे में एनटीए विश्लेषण से पहले।
  2. इंस्ट्रूमेंट सेट-अप, कैमरा सेटिंग्स और डेटा कलेक्शन
    नोट: इस विधि के लिए उपयोग किए जाने वाले कंप्यूटर और इंस्ट्रूमेंट सेटअप को चित्र 2में दिखाया गया है ।
    1. कंप्यूटर चालू करें और फिर साधन। सॉफ्टवेयर खोलें और कैमरा चालू करें।
    2. एक बार सॉफ्टवेयर विंडो ओपन होने के बाद कैप्चर मोड शुरू करने के लिए विंडो पर टॉप लेफ्ट कॉर्नर में कैप्चर आइकन पर क्लिक करें। कैमरा आरंभीकरण में कुछ सेकंड लगते हैं।
    3. 1 एमएल सिरिंज का उपयोग करके पहले पंपिंग एयर द्वारा प्लेटफ़ॉर्म को साफ करें जब तक कि प्लेटफ़ॉर्म साफ न हो जाए। किसी भी हवा के बुलबुले को हटाने के लिए एक और 1 मिलीएल सिरिंज का उपयोग करके धीरे-धीरे उपकरण में 2-3 बार पानी जोड़ें।
      नोट: मंच के साथ-साथ ट्यूबिंग में किसी भी हवा के बुलबुले की तलाश करें। नमूने चलाने से पहले और चलने के दौरान पूरे उपकरण में बुलबुले नहीं होना महत्वपूर्ण है। यदि बुलबुले मौजूद हैं, तो मंच को हवा और पानी से फिर से साफ करें।
    4. एक बार जब प्लेटफ़ॉर्म साफ हो जाता है, तो कैमरे को देखकर सतह पर किसी भी प्रदूषण की जांच करने के लिए पानी जोड़ें। इसके बाद, उपकरण स्थापित करने के लिए नमूना लोडिंग पंप इंजेक्टर में नियंत्रण के रूप में सोने के नैनोकणों को जोड़ें।
    5. स्क्रीन पर या घुंडी पर कैमरा स्तर को उपकरण के दाईं ओर तब तक समायोजित करें जब तक कि छवि रंगीन पिक्सल प्रदर्शित करना शुरू न कर दे और फिर कैमरा स्तर को कम न करे।
    6. फिर छवि को अनुकूलित करने के लिए स्क्रीन को समायोजित करें। लेफ्ट- वीडियो इमेज पर माउस बटन पर क्लिक करें। बाएं माउस बटन को पकड़ें और पूरे दृश्य को प्राप्त करने के लिए छवि को ऊपर और नीचे खींचें।
      नोट: सामान्य कैमरा लेंस और फिल्टर सोने के नैनोकणों और दाग नमूनों का आकलन करने के लिए प्रयोग किया जाता है।
    7. जलसेक गति सेट करें और कैमरे को ध्यान केंद्रित करें ताकि कैमरा स्क्रीन पर सोने के नैनोकण दिखाई दे। सोने के नैनोकणों का पता लगाने के लिए प्रारंभिक सेट अप के लिए जलसेक गति को उच्च (यानी, 500 μL/मिनट) निर्धारित करें। एक बार पता चला, गति को ५० μL/min तक कम करें ।
    8. कणों की कल्पना करने के लिए कैमरा स्तर को समायोजित करें। अन दाग नमूनों के लिए, कैमरा फोकस प्राप्त करने के लिए स्तर 5 पर स्क्रीन लाभ समायोजित करें, और कैमरे के स्तर को 8 पर सेट करें। एक बार फोकस सेट होने के बाद, नमूना रिकॉर्ड करें (यानी, केवल 60 सेकंड के लिए 1 माप)।
      नोट: ध्यान और निरंतर प्रवाह की गति गिनती के लिए कणों की स्पष्ट और तेज छवियों को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण हैं ।
    9. अनुकूलन के बाद, नमूनों का आकलन करने से पहले उपकरण को पानी से फिर से साफ करें। यह सुनिश्चित करने के लिए कैमरा देखें कि ट्यूबिंग साफ है और कण मौजूद नहीं हैं।
      नोट: कैमरे द्वारा कोई कणों का पता नहीं चलने तक प्रत्येक नमूने के बीच कक्ष धोएं।
    10. दाग नमूनों का विश्लेषण करने के लिए, उपयुक्त फ्लोरोसेंट फिल्टर युक्त फ़िल्टर स्थिति में कैमरे को समायोजित करें। नमूना लोडिंग पंप इंजेक्टर पर पतला और दाग नमूने लोड करें और नमूने के विश्लेषण के लिए गति को 20 μL/मिनट तक कम करें।
    11. इसके बाद स्क्रीन गेन और कैमरा लेवल को एडजस्ट करें क्योंकि ये महत्वपूर्ण पैरामीटर हैं। दाग (फ्लोरोसेंट) नमूनों के लिए, स्क्रीन लाभ को 5 और कैमरा स्तर 13 के स्तर पर सेट करें।
      नोट: ये पैरामीटर नमूना प्रकार के आधार पर भिन्न होंगे और ध्यान केंद्रित करने के लिए हर नमूने को अनुकूलित करने की आवश्यकता होगी।
    12. नमूनों के लिए नमूनों को मापने के लिए मानक माप का उपयोग करें, जहां एक कैप्चर-अवधि 60 सेकंड के लिए है।
    13. प्रत्येक माप के बाद डेटा को सहेजें और स्टोर करें। सॉफ्टवेयर प्रत्येक माप के लिए छवि और वीडियो फ़ाइलों को सहेजेगा। सॉफ्टवेयर एक्सेल और पीडीएफ दोनों प्रारूपों में आउटपुट डेटा (उदाहरण के लिए, क्रिस्टल आकार: 10 एनएम - 1000 एनएम और एकाग्रता) प्रदान करता है।
    14. प्रत्येक व्यक्ति के नमूने के लिए सभी 5 रीडिंग के लिए नैनोकणों की औसत संख्या की गणना करें। मानक विचलन या मतलब की मानक त्रुटि का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण करें और युग्मित विश्लेषण के लिए टी-परीक्षणों का उपयोग करें।

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Representative Results

इस अध्ययन से प्राप्त निष्कर्षों से पता चलता है एनटीए मानव मूत्र में मूत्र नैनोक्रिस्टल युक्त कैल्शियम के औसत आकार और एकाग्रता का कुशलतापूर्वक पता लगा सकता है । यह फ्लोरोफोर, फ्लोरो-4 AM, और नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण का उपयोग करके हासिल किया गया था। फ्लू-4 AM दोनों CaOx और CaP क्रिस्टल के लिए बाध्य करने में सक्षम था । जैसा कि चित्रा 3Aमें दिखाया गया है, CaOx क्रिस्टल आकार में 50-270 एनएम के बीच होने के लिए निर्धारित किया गया था और १.२६ x 109 कणों/एमएल का मतलब एकाग्रता है । CaP क्रिस्टल आकार में 30-225 एनएम के बीच थे और २.२२ x 109 कणों/एमएल(चित्रा 3B)की एक औसत एकाग्रता था । यह निर्धारित करने के लिए कि क्या एनटीए मानव मूत्र में नैनोक्रिस्टल का आकलन कर सकता है, स्वस्थ वयस्कों को एक उच्च ऑक्सलेट लोड के बाद एक नियंत्रित ऑक्सलेट आहार का उपभोग करने के लिए कहा गया था । मूत्र नैनोक्रिस्टल आकार और एकाग्रता का आकलन करने के लिए लोड से पहले और बाद में चौबीस घंटे मूत्र के नमूने एकत्र किए गए थे। प्री-ऑक्सालेट मूत्र नमूनों में 110-300 एनएम(चित्रा 4)के बीच कुछ मूत्र नैनोक्रिस्टल (1.65 x 108 ±3.29 x 10 7 कण/एमएल) थे। इसके विपरीत, पोस्ट-ऑक्सलेट नमूनों (7.05 x 10 8 ± 1.08 x10 8 कण/एमएल; 100-320 एनएम) (चित्रा 4) में मौजूद मूत्र नैनोक्रिस्टल में एक महत्वपूर्ण वृद्धि हुई(पी<0.0001)। विधि की प्रजनन क्षमता की पुष्टि करने के लिए, नमूनों को तीन बार मापा गया था और तकनीकी प्रतिकृति(चित्र 5)में कोई महत्वपूर्ण भिन्नता नहीं थी।

Figure 1
चित्र 1-मानव मूत्र नैनोक्रिस्टल को अलग-थलग करने और धुंधला करने के लिए प्रोटोकॉल. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2-नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग एनालिसिस (एनटीए) का विवरण। (A)इन अध्ययनों के लिए उपयोग किए जाने वाले कंप्यूटर और इंस्ट्रूमेंट का उपयोग किया जाता है। (ख)नमूनों को ऑप्टिकल सतह को भरने से पहले एक सतत दर पर एक सिरिंज पंप का उपयोग करके एक इनलेट ट्यूबिंग में इंजेक्ट किया जाता है । नमूनों तो उद्देश्य लेंस द्वारा मनाया जाता है और कैमरे द्वारा कब्जा कर लिया के रूप में नमूने आउटलेट ट्यूबिंग के माध्यम से बाहर निकलने से पहले मंच के माध्यम से प्रवाह को खारिज कर दिया जाएगा । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3:एनटीए का पता लगाता है Fluo-4 AM लेबल कैल्शियम ऑक्सलेट (CaOx) और कैल्शियम फॉस्फेट (सीएपी) क्रिस्टल । आकार वितरण और एकाग्रता दिखाने वाले(ए)सीएओक्स और(बी)सीएपी क्रिस्टल के प्रतिनिधि रेखांकन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4:एनटीए का पता लगाता है Fluo-4 AM लेबल 24 घंटे मानव मूत्र नैनोक्रिस्टल । फ्लूो के प्रतिनिधि ग्राफ-4 AM एक नियंत्रित ऑक्सलेट आहार पर एक स्वस्थ वयस्क से 24 घंटे के पूर्व ऑक्सलेट और पोस्ट-ऑक्सलेट नमूनों में मूत्र नैनोक्रिस्टल लेबल । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5:एनटीए का उपयोग करके 24 घंटे के मूत्र संग्रह में मानव नैनोक्रिस्टल की तकनीकी प्रतिकृति। फ्लूओ-4 AM की तकनीकी प्रतिकृति 24 घंटे में मूत्र नैनोक्रिस्टल लेबल(ए)प्री-ऑक्सलेट और(बी)एक नियंत्रित ऑक्सलेट आहार पर एक स्वस्थ वयस्क से ऑक्सलेट नमूने के बाद । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

एनटीए का इस्तेमाल वर्तमान अध्ययन में कैल्शियम बाइंडिंग प्रोब, फ्लूो-4 एएम का उपयोग करके मानव मूत्र में नैनोक्रिस्टल का आकलन करने के लिए किया गया है । मूत्र में नैनोक्रिस्टल का पता लगाने के लिए कोई मानक विधि उपलब्ध नहीं है। कुछ शोध समूहों ने मूत्र में नैनोक्रिस्टल का पता लगाया है और व्यापक प्रोटोकॉल या तरीकों के उपयोग पर भरोसा किया है जो नमूनों की मात्रा निर्धारित करने की उनकी क्षमता में सीमित हैं, 27,28 यह अध्ययन मनुष्यों के मूत्र में नैनोक्रिस्टल युक्त कैल्शियम का पता लगाने के लिए एक विशिष्ट और संवेदनशील विधि दिखाता है, जिसमें आहार आहार अध्ययन में भाग लिया गया था जिसमें उच्च ऑक्सलेट लोड शामिल था। ऑक्सलेट की मात्रा ऑक्सलेट (जैसे, 1/2 पालक सलाद) की वास्तविक दुनिया की खपत के बराबर थी।

एनटीए एक अच्छी तरह से विशेषता वाला उच्च संकल्प उपकरण है जो समाधान30में कणों को मापने के लिए ब्राउनियन गति का उपयोग करता है। इसका उपयोग विभिन्न प्रकार के जैविक नमूनों31 , 32,33में जैविक नैनोकणों का आकलन करने के लिए किया गयाहै. इसके अलावा, एनटीए किसी भी प्रकार के जैविक नमूने में कणों के आकार के साथ-साथ एकाग्रता का सटीक अनुमान लगा सकता है। इस विधि के लिए किसी भी लेबलिंग की आवश्यकता नहीं है; हालांकि, लेबलिंग का उपयोग विशिष्ट कणों का पता लगाने के लिए किया जा सकता है। फ्लू-4 AM का उपयोग इस अध्ययन में मूत्र के नमूनों में नैनोक्रिस्टल युक्त कैल्शियम का कुशलतापूर्वक और विशेष रूप से पता लगाने के लिए किया गया था। कैल्शियम फ्लोरोसेंट जांच शुरू में मुक्त साइटोसोलिक कैल्शियम34को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया था। फ्लू-4 फ्लोरो-3 का एनालॉग है जिसका फ्लोरेसेंस कैल्शियम35को मुक्त करने के लिए बाध्यकारी होने पर >100 गुना बढ़ जाता है। इसके अलावा, फ्लोर-4 को प्रवाह साइटोमेट्री36का उपयोग करके गठिया रोगियों के सिनोवियल तरल पदार्थ में कैल्शियम कणों का आकलन करने के लिए दिखाया गया है। इस प्रकार, हम इन अध्ययनों के लिए Fluo-4 AM का इस्तेमाल किया ।

सभी नमूनों को सही पता लगाने के लिए लगातार प्लेटफार्म में इंजेक्ट किया गया। एकाग्रता और कण आकार का निर्धारण प्रवाह दर पर निर्भर करता है, एक उच्च प्रवाह दर के रूप में (यानी, ५० μL/min) एकाग्रता के सटीक आकलन को प्रभावित कर सकते हैं, साथ ही एक स्थिर सेटिंग और एक कम प्रवाह दर (यानी 20 μL/मिनट)३७की तुलना में कण का आकार । इस प्रकार, एक स्थिर धीमी गति से प्रवाह दर नमूनों में मौजूद कणों की संख्या का सटीक माप प्रदान करता है। कण की गिनती और आकार को प्रभावित करने वाले अन्य महत्वपूर्ण मापदंडों में कैमरा स्तर, पता लगाने की सीमा और फोकस38,39,40शामिल हैं। नमूनों में एक सुसंगत कण माप (सीवी लगभग 20%) वर्तमान अध्ययन में देखा गया था, जो एक और अध्ययन39से निष्कर्षों के अनुरूप था . अंत में, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी29का उपयोग करके मानव मूत्र में नैनोक्रिस्टल की उपस्थिति की पुष्टि की गई है। यह शोध दर्शाता है एनटीए सफलतापूर्वक मनुष्यों से मूत्र नैनोक्रिस्टल उपाय कर सकते हैं ।

इस प्रोटोकॉल का एक लाभ समाधान में कैल्शियम युक्त कणों का मूल्यांकन करने के लिए फ्लू-4 AM का उपयोग है। एक अन्य लाभ नमूनों के भीतर नैनोक्रिस्टल का पता लगाने में देखी गई न्यूनतम परिवर्तनशीलता है। इस सेटिंग में एनटीए की एक सीमा, नैनोक्रिस्टल के आकृति विज्ञान को अलग करने में असमर्थता है। हालांकि, यह विधि गुर्दे की पथरी युक्त कैल्शियम के इतिहास वाले व्यक्तियों में पत्थर के जोखिम की भविष्यवाणी करने के लिए क्रिस्टलुरिया का पता लगाने के लिए फायदेमंद हो सकती है। यह प्रोटोकॉल वर्तमान पद्धतियों की जगह नहीं ले सकता है लेकिन मूत्र नैनोक्रिस्टल के बारे में नई अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है। क्रिस्टल युक्त मूत्र कैल्शियम का आकलन करने के लिए एनटीए का उपयोग एक उपन्यास दृष्टिकोण है जो मानक माइक्रोस्कोपी और ऊपर उल्लिखित तरीकों से परे नैनोक्रिस्टलुरिया के महत्व को उजागर करना चाहिए। गुर्दे की पथरी की आबादी में इस विधि की विश्वसनीयता का पता लगाने के लिए अतिरिक्त जांच की आवश्यकता है।

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Disclosures

लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं ।

Acknowledgments

लेखक सभी अध्ययन प्रतिभागियों और यूएबी सीसीटीएस बायोपोषण कोर और यूएबी हाई रिजॉल्यूशन इमेजिंग सर्विस सेंटर को उनके योगदान के लिए धन्यवाद देते हैं। इस काम को एनआईएच ग्रांट DK106284 और DK123542 (टीएम), और UL1TR003096 (नेशनल सेंटर फॉर एंडलिंग ट्रांसलेशनल साइंसेज) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Benchtop Centrifuge Jouan Centrifuge CR3-12
Calcium Oxalate monohydrate Synthesized in the lab as previously described29. Store at RT; Stock 10 mM
Calcium Phosphate crystals (hydroxyapatite nanopowder) Sigma 677418 Store at RT; Stock 10 mM
Ethanol Fischer Scientific AC615095000 Store at RT; Stock 100%
Fluo-4 AM* AAT Bioquest, Inc. 20550 Store at Freezer (-20°C); Stock 5 mM
Gold Nanoparticles Sigma 742031 Store at 2-8°C
NanoSight Instrument Malvern Instruments, UK NS300
Syringe pump Harvard Apparatus 98-4730
Virkon Disinfectant LanXESS Energizing Company, Germany LSP
*Fluorescence dyes are light sensitive; stock and aliquots should be stored in the dark at -20°C.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Kumar, P., Bell, A., Mitchell, T. Estimation of Urinary Nanocrystals in Humans using Calcium Fluorophore Labeling and Nanoparticle Tracking Analysis. J. Vis. Exp. (168), e62192, doi:10.3791/62192 (2021).

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