Summary
Hensikten med denne studien var å avgjøre om nanopartikkelsporingsanalyse (NTA) kunne oppdage og kvantifisere kalsium i urin som inneholder nanokrystaller fra friske voksne. Funnene fra den nåværende studien tyder på at NTA kan være et potensielt verktøy for å estimere urin nanokrystaller under nyresteinssykdom.
Abstract
Nyrestein blir mer utbredt over hele verden hos voksne og barn. Den vanligste typen nyrestein består av kalsiumoksalat (CaOx) krystaller. Crystalluria oppstår når urin blir overmettet med mineraler (f.eks. kalsium, oksalat, fosfat) og går foran nyresteindannelse. Standardmetoder for å vurdere crystalluria i steinforseninger inkluderer mikroskopi, filtrering og sentrifugering. Imidlertid oppdager disse metodene primært mikrokrystaller og ikke nanokrystaller. Nanokrystaller har blitt foreslått å være mer skadelige for nyre epitelceller enn mikrokrystaller in vitro. Her beskriver vi Nanopartikkelsporingsanalysens evne (NTA) til å oppdage humane urin nanokrystaller. Friske voksne ble matet et kontrollert oksalatdiett før de drakk en oksalatbelastning for å stimulere urin nanokrystaller. Urin ble samlet inn i 24 timer før og etter oksalatbelastningen. Prøver ble behandlet og vasket med etanol for å rense prøver. Urin nanokrystaller ble farget med kalsiumbindende fluorofor, Fluo-4 AM. Etter farging ble størrelsen og tellingen av nanokrystaller bestemt ved hjelp av NTA. Funnene fra denne studien viser at NTA effektivt kan oppdage nanokrystalluri hos friske voksne. Disse funnene tyder på at NTA kan være en verdifull tidlig deteksjonsmetode for nanokrystalluri hos pasienter med nyresteinssykdom.
Introduction
Urinkrystaller dannes når urinen blir overmettet med mineraler. Dette kan forekomme hos friske individer, men er mer vanlig hos personer med nyrestein1. Tilstedeværelsen og akkumuleringen av urinkrystaller kan øke risikoen for å utvikle en nyrestein. Spesielt skjer dette når krystaller binder seg til Randalls plakk, kjernelegemer, akkumulerer og vokser over tid2,3,4. Crystalluria går foran nyresteindannelse og vurdering av crystalluria kan ha prediktiv verdi i nyrestein tidligere3,5. Spesielt har crystalluria blitt foreslått å være nyttig for å forutsi risikoen for tilbakefall av stein hos pasienter med en historie med kalsiumoksalat som inneholder stein6,7.
Krystaller har blitt rapportert å negativt påvirke nyre epitelial og sirkulerende immuncellefunksjon8,9,10,11,12,13. Det har tidligere blitt rapportert at sirkulerende monocytter fra kalsiumoksalat (CaOx) nyrestein tidligere har undertrykt cellulær bioenergi sammenlignet med friske individer14. I tillegg reduserer CaOx-krystaller cellulær bioenergi og forstyrrer redoks homeostase i monocytter8. Forbruk av måltider rik på oksalat kan forårsake krystalliuri som kan føre til nyre tubule skade og endre produksjon og funksjon av urin makromolekyler som er beskyttende mot nyrestein formasjon15,16. Flere studier har vist at urinkrystaller kan variere i form og størrelse avhengig av pH og temperaturen på urinen17,18,19. Videre har urinproteiner vist seg å modulere krystalladferd20. Daudon et al.19, foreslo at crystalluria analyse kunne være nyttig i håndteringen av pasienter med nyrestein sykdom og i vurderingen av deres respons på terapier. Noen konvensjonelle metoder som for tiden er tilgjengelige for å evaluere tilstedeværelsen av krystaller inkluderer polarisert mikroskopi21,22, elektronmikroskopi23, partikkeltellere3, urinfiltrering24, fordampning3,5 eller sentrifugering21. Disse studiene har gitt verdifull innsikt i nyresteinfeltet angående krystalliuri. En begrensning av disse metodene har imidlertid vært manglende evne til å visualisere og kvantifisere krystaller som er mindre enn 1 μm i størrelse. Krystaller av denne størrelsen kan påvirke veksten av CaOx-steiner ved å feste seg til Randalls plakett.
Nanokrystaller har vist seg å forårsake omfattende skade på nyreceller sammenlignet med større mikrokrystaller25. Tilstedeværelsen av nanokrystaller er rapportert i urin ved hjelp av en nanopartikkelanalysator26,27. Nyere studier har brukt fluorescerende merket bisfosfat sonder (alendronat-fluorescein / alendronat-Cy5) for å undersøke nanokrystaller ved hjelp av nanoskala strømning cytometri28. Begrensningen av dette fargestoffet er at det ikke er spesifikt og vil binde seg til nesten alle typer steiner unntatt cystein. Dermed kan nøyaktig vurdering av tilstedeværelsen av nanokrystaller hos individer være et effektivt verktøy for å diagnostisere krystalliuri og / eller forutsi steinrisiko. Hensikten med denne studien var å oppdage og kvantifisere kalsiumholdige nanokrystaller (<1 μm i størrelse) ved hjelp av nanopartikkelsporingsanalyse (NTA). For å oppnå dette ble NTA-teknologi brukt i kombinasjon med en kalsiumbindende fluorofor, Fluo-4 AM for å oppdage og kvantifisere kalsiumholdige nanokrystaller i urinen til friske voksne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter skissert i dette arbeidet ble godkjent av University of Alabama ved Birmingham (UAB) Institutional Review Board. Friske voksne (33,6 ± 3,3 år; n =10) ble inkludert i studien hvis de hadde et normalt blod omfattende metabolsk panel, ikke-tobakksbrukere, ikke-gravide, en BMI mellom 20-30 kg / m2, og fri for kroniske medisinske tilstander eller akutte sykdommer. Friske deltakere signerte et skriftlig informert samtykkeskjema før studiestart.
1. Klinisk protokoll og urinoppsamling
- Få deltakerne til å konsumere et lavt oksalatdiett utarbeidet av UAB Center for Clinical and Translational Sciences Bionutrition Core i 3 dager og raskt over natten før de henter urinen (24-timers prøve).
- Neste dag, be deltakerne returnere sin 24-timers urinprøve (pre-oksaalat) før de bruker en oksalatbelastning (smoothie som inneholder frukt og grønnsaker, ~ 8 mM oksalat). Be deltakerne deretter hente urinen i 24 timer (postoksalatprøve) og returnere urinen dagen etter.
- Vedlikehold alle urinprøver ved romtemperatur (RT) før behandling som beskrevet nedenfor og vist i figur 1.
2. Behandling av urin
MERK: Alle materialer og utstyr som brukes er oppført i Materialliste.
FORSIKTIG: Bruk personlig verneutstyr til enhver tid under håndtering av kliniske prøver og reagenser. Spesielt hansker, ansikts- og øyeskjold, åndedrettsvern og verneklær.
- Mål og registrer urin pH og volum. Bland grundig før du tilsetter 50 ml urin i et merket sterilt 50 ml konisk rør.
- Sentrifugeprøve ved 1200 x g i 10 min ved RT ved hjelp av en sentrifuge på benken.
MERK: Hold prøven ved RT for å forhindre ytterligere krystalldannelse, da kjøligere temperaturer kan fremme krystallisering. - Kast supernatanten og vask og resuspend pellet igjen med 5 ml 100% etanol. Sentrifuger prøven ved 1200 x g i 10 minutter ved RT ved hjelp av en sentrifuge på benken.
- Kast supernatanten og resuspender pelletsen i 1 ml 100% etanol. Oppbevar prøven ved -20 °C for senere bearbeiding ELLER flekk prøven som beskrevet nedenfor.
MERK: Det er ingen signifikant forskjell i datapunkter (dvs. partikkelstørrelse/konsentrasjon) mellom lagrede eller nyfargede prøver.
3. Nanopartikkelsporingsanalyse (NTA)
- Prøveforberedelse
- Gull nanopartikler: Bruk gull nanopartikler for å optimalisere innstillingene på instrumentet. Fortynn 100 nm størrelse gull nanopartikler 1:1000 i ultrapure vann.
- Human urin: Fortynn urinprøver 20 ganger i vann før farging med 5 mM Fluo-4 AM (et kalsiumfluorescensfargestoff) i 30 minutter i mørket. Analyser prøvene ved hjelp av NTA.
- Forbered kalsiumoksalatkrystaller (CaOx) som tidligere beskrevet29. Fortynn 10 mM lageroppløsning (14,6 mg i 10 ml vann) til 50 μM i vann og flekk de fortynnede prøvene ved hjelp av 5 mM Fluo-4 AM i 30 minutter i mørket før analyse.
- Kalsiumfosfat (CaP) krystaller: Fortynn 10 mM lageroppløsning (50,4 mg i 10 ml vann) til 50 μM i vann og flekk de fortynnede prøvene ved hjelp av 5 mM Fluo-4 AM i 30 minutter i mørket før NTA-analyse.
- Instrumentoppsett, kamerainnstillinger og datainnsamling
MERK: Datamaskin- og instrumentoppsettet som brukes for denne metoden, vises i figur 2.- Slå på datamaskinen og deretter instrumentet. Åpne programvaren og slå på kameraet.
- Når programvarevinduet er åpent, klikker du på opptaksikonet øverst til venstre i vinduet for å starte opptaksmodus. Kamerainitialiseringen tar noen sekunder.
- Rengjør plattformen ved først å pumpe luft inn i den med en 1 ml sprøyte til plattformen ser ren ut. Tilsett forsiktig vann til apparatet 2-3 ganger ved hjelp av en annen 1 ml sprøyte for å fjerne eventuelle luftbobler.
MERK: Se etter eventuelle luftbobler i plattformen så vel som i slangen. Det er viktig å ikke ha bobler i hele apparatet før og under kjøring av prøver. Hvis det er bobler til stede, rengjør plattformen igjen med luft og vann. - Når plattformen er ren, tilsett vann for å se etter forurensning på overflaten ved å se på kameraet. Deretter legger du til gull nanopartikler som en kontroll til prøvelastepumpeinjektoren for å sette opp instrumentet.
- Juster kameranivået på skjermen eller på knappen til høyre side av instrumentet til bildet begynner å vise fargede piksler og reduser deretter kameranivået.
- Juster deretter skjermen for å optimalisere bildet. Venstreklikk på museknappen på videobildet. Hold nede venstre museknapp, og dra bildet opp og ned for å få hele visningen.
MERK: Det vanlige kameralinsen og filteret brukes til å vurdere gullnanopartikler og uoppdagede prøver. - Sett opp infusjonshastigheten og fokuser kameraet slik at gullnanopartiklene er synlige på kameraskjermen. Sett infusjonshastigheten til høy (dvs. 500 μL /min) for første oppsett for å sikre at gull nanopartikler oppdages. Når den er oppdaget, reduser hastigheten til 50 μL/min.
- Juster kameranivået for å visualisere partiklene. For unstained prøver, juster skjermforsterkningen på nivå 5 for å oppnå kamerafokuset, og sett kameranivået på 8. Når fokus er satt, registrerer du prøven (dvs. 1 måling bare i 60 sekunder).
MERK: Fokus og kontinuerlig strømningshastighet er viktig for å oppnå klare og skarpe bilder av partiklene for telling. - Etter optimalisering rengjør apparatet igjen med vann før du vurderer prøver. Se kameraet for å sikre at slangen er ren og at partiklene ikke er til stede.
MERK: Vask kammeret mellom hver prøve til ingen partikler oppdages av kameraet. - For å analysere fargede prøver, juster kameraet til filterposisjonen som inneholder det passende fluorescerende filteret. Last fortynnede og fargede prøver på prøvelastepumpeinjektoren og reduser hastigheten til 20 μL/min for analyse av prøven.
- Deretter justerer du skjermforsterkningen og kameranivået, da dette er viktige parametere. For fargede (fluorescerende) prøver setter du skjermforsterkningen til 5 og kameranivået på nivå 13.
MERK: Disse parameterne vil variere avhengig av prøvetypen, og hver prøve må optimaliseres for å få fokus. - Bruk standardmåling til å måle prøvene for 5 opptak per prøve der én opptaksvarighet er i 60 sekunder.
- Lagre og lagre data etter hver måling. Programvaren vil lagre bilde- og videofiler for hver måling. Programvaren gir utgangsdata (f.eks. krystallstørrelse: 10 nM - 1000 nM og konsentrasjon) i både Excel- og PDF-formater.
- Beregn gjennomsnittlig antall nanopartikler for alle de 5 avlesningene for hver enkelt prøve. Analyser dataene ved hjelp av standardavvik eller standardfeil for gjennomsnittet, og bruk t-tester for sammenkoblet analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Funnene fra denne studien viser at NTA effektivt kan oppdage gjennomsnittsstørrelsen og konsentrasjonen av kalsium som inneholder urin nanokrystaller i human urin. Dette ble oppnådd ved hjelp av fluorofor, Fluo-4 AM og nanopartikkelsporingsanalyse. Fluo-4 AM var i stand til å binde seg til både CaOx og CaP krystaller. Som vist i figur 3Able CaOx-krystaller fastslått å være mellom 50-270 nm i størrelse og har en gjennomsnittlig konsentrasjon på 1,26 x 109 partikler / ml. CaP-krystaller var mellom 30-225 nm i størrelse og hadde en gjennomsnittlig konsentrasjon på 2,22 x 109 partikler/ml (figur 3B). For å avgjøre om NTA kunne vurdere nanokrystaller i human urin, ble friske voksne bedt om å konsumere et kontrollert oksalatdiett etterfulgt av en høy oksaalatbelastning. Tjuefire timers urinprøver før og etter at lasten ble samlet inn for å vurdere urin nanokrystall størrelse og konsentrasjon. Urinprøver før oksalat inneholdt noen urin nanokrystaller (1,65 x 108 ± 3,29 x 107 partikler/ml) mellom 110-300 nm (Figur 4). Derimot var det en betydelig økning (p<0.0001) i urin nanokrystaller til stede i postoksalatprøver (7,05 x 108 ± 1,08 x 108 partikler/ml; 100-320 nm) (Figur 4). For å bekrefte metodens reproduserbarhet ble prøver målt tre ganger, og det var ingen signifikant variasjon i tekniske replikeringer (figur 5).
Figur 1: Protokoll for isolering og farging av humane urinnanokrystaller. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Beskrivelse av nanopartikkelsporingsanalyse (NTA). (A) Datamaskin og instrument som er satt opp brukt til disse studiene. (B) Prøver injiseres i en innløpsslange ved hjelp av en sprøytepumpe med kontinuerlig hastighet før den optiske overflaten fylles. Prøver observeres deretter av objektivlinsen og fanges opp av kameraet når prøver strømmer gjennom plattformen før de går ut gjennom utløpsslangen som skal kastes. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: NTA oppdager Fluo-4 AM merket kalsiumoksalat (CaOx) og kalsiumfosfatkrystaller (CaP). Representative grafer av (A) CaOx og (B) CaP-krystaller som viser størrelsesfordeling og konsentrasjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: NTA oppdager Fluo-4 AM merket 24-timers humane urin nanokrystaller. Representativ graf over Fluo-4 AM merket urin nanokrystaller i 24-timers pre-oksalat og postoksalatprøver fra en sunn voksen på et kontrollert oksalat diett. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Tekniske replikeringer av humane nanokrystaller i 24-timers urinsamlinger ved hjelp av NTA. Tekniske replikeringer av Fluo-4 AM merket urin nanokrystaller i 24-timers (A) pre-oksalat og (B) postoksalatprøver fra en sunn voksen på et kontrollert oksalat diett. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
NTA har blitt brukt i den nåværende studien for å vurdere nanokrystaller i human urin ved hjelp av en kalsiumbindende sonde, Fluo-4 AM. Det er ingen standardmetode tilgjengelig for å oppdage nanokrystaller i urinen. Noen forskningsgrupper har oppdaget nanokrystaller i urinen og stolt på bruk av omfattende protokoller eller metoder som er begrenset i deres evne til å kvantifisere prøvene27,28. Denne studien viser en spesifikk og sensitiv metode for å oppdage kalsiumholdige nanokrystaller i urinen til mennesker som deltok i en diettfôringsstudie som besto av å innta en høy oksalatbelastning. Mengden oksalat som forbrukes var tilsvarende det virkelige verdensforbruket av oksalat (f.eks. 1/2 spinatsalat).
NTA er et godt karakterisert høyoppløselig verktøy som bruker Brownian bevegelse for å måle partikler i løsning30. Den har blitt brukt til å vurdere biologiske nanopartikler i en rekke biologiske prøver31,32,33. I tillegg kan NTA nøyaktig forutsi størrelsen og konsentrasjonen av partikler i alle typer biologiske prøver. Denne metoden krever ingen merking. Merking kan imidlertid brukes til å oppdage spesifikke partikler. Fluo-4 AM ble brukt i denne studien for å effektivt og spesifikt oppdage kalsiumholdige nanokrystaller i urinprøver. Kalsiumfluorescerende sonder ble opprinnelig brukt til å måle fritt cytosolisk kalsium34. Fluo-4 er en analog av Fluo-3 hvis fluorescens øker >100 ganger ved binding til fritt kalsium35. I tillegg har Fluo-4 vist seg å vurdere kalsiumpartikler i synovialvæsken til pasienter med leddgikt ved hjelp av strømningscytometri36. Dermed brukte vi Fluo-4 AM for disse studiene.
Alle prøver ble kontinuerlig injisert i plattformen for nøyaktig deteksjon. Fastsettelse av konsentrasjon og partikkelstørrelse avhenger av strømningshastigheten, da en høy strømningshastighet (dvs. 50 μL / min) kan påvirke nøyaktig vurdering av konsentrasjonen, samt partikkelstørrelsen sammenlignet med en statisk innstilling og en lavere strømningshastighet (dvs. 20 μL / min)37. Dermed gir en jevn langsom strømningshastighet nøyaktig måling av antall partikler som finnes i prøver. Andre viktige parametere som kan påvirke partikkelantallet og -størrelsen inkluderer kameranivå, deteksjonsterskel og fokus38,39,40. En konsistent partikkelmåling i prøver (CV ca. 20%) ble observert i den nåværende studien, som var i samsvar med funn fra en annen studie39. Til slutt har tilstedeværelsen av nanokrystaller i menneskelig urin blitt bekreftet ved hjelp av elektronmikroskopi29. Denne forskningen viser at NTA med hell kan måle urin nanokrystaller fra mennesker.
En fordel med denne protokollen er bruk av Fluo-4 AM for å evaluere kalsiumholdige partikler i oppløsning. En annen fordel er den minimale variasjonen som observeres ved å oppdage nanokrystaller i prøver. En begrensning av NTA i denne innstillingen, er manglende evne til å skille morfologien til nanokrystaller. Denne metoden kan imidlertid være gunstig for å oppdage crystalluria for å forutsi steinrisiko hos personer med en historie med kalsiumholdige nyrestein. Denne protokollen kan ikke erstatte gjeldende metoder, men kan gi ny innsikt om urin nanokrystaller. Bruken av NTA for å vurdere urinkalsiumholdige krystaller er en ny tilnærming som bør fremheve betydningen av nanokrystalluri utover standard mikroskopi og metoder nevnt ovenfor. Ytterligere undersøkelser er garantert å utforske påliteligheten til denne metoden i nyresteinpopulasjonen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Forfatterne takker alle studiedeltakere og UAB CCTS Bionutrition Core og UAB High Resolution Imaging Service Center for deres bidrag. Dette arbeidet ble støttet av NIH grants DK106284 og DK123542 (TM) og UL1TR003096 (National Center for Advancing Translational Sciences).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Benchtop Centrifuge | Jouan Centrifuge | CR3-12 | |
| Calcium Oxalate monohydrate | Synthesized in the lab as previously described29. | Store at RT; Stock 10 mM | |
| Calcium Phosphate crystals (hydroxyapatite nanopowder) | Sigma | 677418 | Store at RT; Stock 10 mM |
| Ethanol | Fischer Scientific | AC615095000 | Store at RT; Stock 100% |
| Fluo-4 AM* | AAT Bioquest, Inc. | 20550 | Store at Freezer (-20°C); Stock 5 mM |
| Gold Nanoparticles | Sigma | 742031 | Store at 2-8°C |
| NanoSight Instrument | Malvern Instruments, UK | NS300 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 98-4730 | |
| Virkon Disinfectant | LanXESS Energizing Company, Germany | LSP | |
| *Fluorescence dyes are light sensitive; stock and aliquots should be stored in the dark at -20°C. |
References
- Fogazzi, G. B. Crystalluria: a neglected aspect of urinary sediment analysis. Nephrology, Dialysis, Transplantation. 11 (2), 379-387 (1996).
- Kuo, R. L. Urine calcium and volume predict coverage of renal papilla by Randall's plaque. Kidney International. 64 (6), 2150-2154 (2003).
- Robertson, W. G., Peacock, M., Nordin, B. E. Calcium crystalluria in recurrent renal-stone formers. Lancet. 2 (7610), 21-24 (1969).
- Robertson, W. G., Peacock, M. Calcium oxalate crystalluria and inhibitors of crystallization in recurrent renal stone-formers. Clinical Science. 43 (4), 499-506 (1972).
- Hallson, P. C., Rose, G. A. A new urinary test for stone "activity". British Journal of Urology. 50 (7), 442-448 (1978).
- Daudon, M., Hennequin, C., Boujelben, G., Lacour, B., Jungers, P. Serial crystalluria determination and the risk of recurrence in calcium stone formers. Kidney International. 67 (5), 1934-1943 (2005).
- Baumann, J. M., Affolter, B. From crystalluria to kidney stones, some physicochemical aspects of calcium nephrolithiasis. World Journal of Nephrology. 3 (4), 256-267 (2014).
- Patel, M., et al. Oxalate induces mitochondrial dysfunction and disrupts redox homeostasis in a human monocyte derived cell line. Redox Biology. 15, 207-215 (2018).
- Khan, S. R. Role of renal epithelial cells in the initiation of calcium oxalate stones. Nephron Experimental Nephrology. 98 (2), 55-60 (2004).
- Mulay, S. R., et al. Calcium oxalate crystals induce renal inflammation by NLRP3-mediated IL-1beta secretion. Journal of Clinical Investigation. 123 (1), 236-246 (2013).
- Umekawa, T., Chegini, N., Khan, S. R. Oxalate ions and calcium oxalate crystals stimulate MCP-1 expression by renal epithelial cells. Kidney International. 61 (1), 105-112 (2002).
- Huang, M. Y., Chaturvedi, L. S., Koul, S., Koul, H. K. Oxalate stimulates IL-6 production in HK-2 cells, a line of human renal proximal tubular epithelial cells. Kidney International. 68 (2), 497-503 (2005).
- Lu, X. Renal tubular epithelial cell injury, apoptosis and inflammation are involved in melamine-related kidney stone formation. Urological Research. 40 (6), 717-723 (2012).
- Williams, J., Holmes, R. P., Assimos, D. G., Mitchell, T. Monocyte Mitochondrial Function in Calcium Oxalate Stone Formers. Urology. 93, 221-226 (2016).
- Balcke, P., et al. Transient hyperoxaluria after ingestion of chocolate as a high risk factor for calcium oxalate calculi. Nephron. 51 (1), 32-34 (1989).
- Khan, S. R., Kok, D. J.
- Rodgers, A., Allie-Hamdulay, S., Jackson, G. Therapeutic action of citrate in urolithiasis explained by chemical speciation: increase in pH is the determinant factor. Nephrology, Dialysis, Transplantation. 21 (2), 361-369 (2006).
- Verplaetse, H., Verbeeck, R. M., Minnaert, H., Oosterlinck, W. Solubility of inorganic kidney stone components in the presence of acid-base sensitive complexing agents. European Urology. 11 (1), 44-51 (1985).
- Frochot, V., Daudon, M. Clinical value of crystalluria and quantitative morphoconstitutional analysis of urinary calculi. International Journal of Surgery. 36, London, England. Pt D 624-632 (2016).
- Grover, P. K., Thurgood, L. A., Wang, T., Ryall, R. L. The effects of intracrystalline and surface-bound proteins on the attachment of calcium oxalate monohydrate crystals to renal cells in undiluted human urine. BJU International. 105, 708-715 (2010).
- Bader, C. A., Chevalier, A., Hennequin, C., Jungers, P., Daudon, M. Methodological aspects of spontaneous crystalluria studies in calcium stone formers. Scanning Microscopy. 8 (2), 215-231 (1994).
- Daudon, M., Cohen-Solal, F., Jungers, P. Eurolithiasis. 9th European Symposium on Urolithiasis. , Shaker Publishing. Maastricht. 261-263 (2001).
- Werness, P. G., Bergert, J. H., Smith, L. H.
- Fan, J., Chandhoke, P. S. Examination of crystalluria in freshly voided urines of recurrent calcium stone formers and normal individuals using a new filter technique. Journal of Urology. 161 (5), 1685-1688 (1999).
- Sun, X. Y., Ouyang, J. M., Yu, K. Shape-dependent cellular toxicity on renal epithelial cells and stone risk of calcium oxalate dihydrate crystals. Scientific Reports. 7 (1), 7250 (2017).
- He, J. Y., Deng, S. P., Ouyang, J. M. Morphology, particle size distribution, aggregation, and crystal phase of nanocrystallites in the urine of healthy persons and lithogenic patients. IEEE Trans Nanobioscience. 9 (2), 156-163 (2010).
- Gao, J., et al. Comparison of Physicochemical Properties of Nano- and Microsized Crystals in the Urine of Calcium Oxalate Stone Patients and Control Subjects. Journal of Nanomaterials. 2014, 9 (2014).
- Gavin, C. T., et al. Novel Methods of Determining Urinary Calculi Composition: Petrographic Thin Sectioning of Calculi and Nanoscale Flow Cytometry Urinalysis. Scientific Reports. 6, 19328 (2016).
- Kumar, P., et al. Dietary Oxalate Induces Urinary Nanocrystals in Humans. Kidney International Reports. 5 (7), 1040-1051 (2020).
- Carr, B., Hole, P., Malloy, A., Nelson, P., Smith, J. Applications of nanoparticle tracking analysis in nanoparticle research--A mini-review. European Journal of Parenteral Sciences and Pharmaceutical Sciences. 14 (2), 45 (2009).
- Dragovic, R. A., et al. Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 7 (6), 780-788 (2011).
- Dragovic, R. A., et al. Isolation of syncytiotrophoblast microvesicles and exosomes and their characterisation by multicolour flow cytometry and fluorescence Nanoparticle Tracking Analysis. Methods. 87, 64-74 (2015).
- Gercel-Taylor, C., Atay, S., Tullis, R. H., Kesimer, M., Taylor, D. D. Nanoparticle analysis of circulating cell-derived vesicles in ovarian cancer patients. Analytical Biochemistry. 428 (1), 44-53 (2012).
- Minta, A., Kao, J. P., Tsien, R. Y. Fluorescent indicators for cytosolic calcium based on rhodamine and fluorescein chromophores. Journal of Biological Chemistry. 264 (14), 8171-8178 (1989).
- Harkins, A. B., Kurebayashi, N., Baylor, S. M. Resting myoplasmic free calcium in frog skeletal muscle fibers estimated with fluo-3. Biophysical Journal. 65 (2), 865-881 (1993).
- Hernandez-Santana, A., Yavorskyy, A., Loughran, S. T., McCarthy, G. M., McMahon, G. P. New approaches in the detection of calcium-containing microcrystals in synovial fluid. Bioanalysis. 3 (10), 1085-1091 (2011).
- Tong, M., Brown, O. S., Stone, P. R., Cree, L. M., Chamley, L. W. Flow speed alters the apparent size and concentration of particles measured using NanoSight nanoparticle tracking analysis. Placenta. 38, 29-32 (2016).
- Maas, S. L., et al. Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics. Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).
- Hole, P., et al. Interlaboratory comparison of size measurements on nanoparticles using nanoparticle tracking analysis (NTA). Journal of Nanoparticle Research. 15, 2101 (2013).
- Tomlinson, P. R., et al. Identification of distinct circulating exosomes in Parkinson's disease. Annals of Clinical and Translational Neurology. 2 (4), 353-361 (2015).
