Summary
O objetivo deste estudo foi determinar se a análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) poderia detectar e quantificar o cálcio urinário contendo nanocristais de adultos saudáveis. Os achados do presente estudo sugerem que a NTA pode ser uma ferramenta potencial para estimar os nanocristais urinários durante a doença da pedra nos rins.
Abstract
As pedras nos rins estão se tornando mais prevalentes em todo o mundo em adultos e crianças. O tipo mais comum de pedra renal é composto por cristais de oxalato de cálcio (CaOx). A cristalúria ocorre quando a urina fica supersaturada com minerais (por exemplo, cálcio, oxalato, fosfato) e precede a formação de pedra nos rins. Os métodos padrão para avaliar cristais em pretos de pedra incluem microscopia, filtração e centrifugação. No entanto, esses métodos detectam principalmente microcristais e não nanocristais. Nanocristais têm sido sugeridos como mais prejudiciais às células epiteliais renais do que microcristais in vitro. Aqui, descrevemos a capacidade da análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) de detectar nanocristais urinários humanos. Adultos saudáveis foram alimentados com uma dieta oxala controlada antes de beber uma carga de oxalato para estimular os nanocristais urinários. A urina foi coletada por 24 horas antes e depois da carga de oxalato. As amostras foram processadas e lavadas com etanol para purificar amostras. Os nanocristais urinários foram manchados com o fluorophore de ligação de cálcio, Fluo-4 AM. Após a coloração, o tamanho e a contagem de nanocristais foram determinados por meio da NTA. Os achados deste estudo mostram que a NTA pode detectar de forma eficiente a nanocristaria em adultos saudáveis. Esses achados sugerem que a NTA pode ser um valioso método de detecção precoce de nanocristaria em pacientes com doença de pedra renal.
Introduction
Cristais urinários se formam quando a urina fica supersaturada com minerais. Isso pode ocorrer em indivíduos saudáveis, mas é mais comum em indivíduos com pedras nos rins1. A presença e o acúmulo de cristais urinários podem aumentar o risco de desenvolver uma pedra nos rins. Especificamente, isso ocorre quando cristais se ligam à placa de Randall, nuclear, acumular e crescer ao longo do tempo2,3,4. Cristais precedem a formação de pedra nos rins e a avaliação da cristalúria pode ter valor preditivo em ex-pedras renais3,5. Especificamente, a cristalúria tem sido sugerida para ser útil para prever o risco de recidiva da pedra em pacientes com histórico de oxalato de cálcio contendo pedras6,7.
Os cristais têm sido relatados para impactar negativamente a função epitelial renal e circulante das células imunes8,9,10,11,12,13. Foi relatado anteriormente que monócitos circulantes de oxalato de cálcio (CaOx) ex-fércias de pedra renal suprimiram bioenergetics celulares em comparação com indivíduos saudáveis14. Além disso, os cristais CaOx reduzem a bioenergéstica celular e interrompem a homeostase redox em monócitos8. O consumo de refeições ricas em oxalato pode causar cristalidade que pode levar a danos nos túbulos renais e alterar a produção e função de macromoléculas urinárias que são protetoras contra a formação de pedra nos rins15,16. Vários estudos demonstraram que os cristais urinários podem variar em forma e tamanho dependendo do pH e da temperatura da urina17,18,19. Além disso, as proteínas urinárias têm sido demonstradas para modular o comportamento cristalino20. Daudon et al.19, propuseram que a análise da cristalidade poderia ser útil no manejo de pacientes com doença de pedra renal e na avaliação de sua resposta às terapias. Alguns métodos convencionais atualmente disponíveis para avaliar a presença de cristais incluem microscopia polarizada21,22, microscopia eletrônica23,contadores de partículas3,filtração de urina24,evaporação3,5 ou centrifugação21. Esses estudos forneceram informações valiosas para o campo de pedra nos rins em relação à cristalúria. No entanto, uma limitação desses métodos tem sido a incapacidade de visualizar e quantificar cristais com menos de 1 μm de tamanho. Cristais deste tamanho podem influenciar o crescimento das pedras de CaOx anexando-se à placa de Randall.
Os nanocristais têm sido mostrados para causar lesões extensas nas células renais em comparação com microcristais maiores25. A presença de nanocristais foi relatada na urina usando um analisador de nanopartículas26,27. Estudos recentes têm usado sondas de bisfosfato fluorescente (alendronate-fluoresceína/alendronate-Cy5) para examinar nanocristais usando citometria de fluxo nanoescala28. A limitação deste corante é que ele não é específico e se ligará a quase todos os tipos de pedras, exceto a cisteína. Assim, avaliar com precisão a presença de nanocristais em indivíduos pode ser uma ferramenta eficaz para diagnosticar cristais e/ou prever o risco de pedra. O objetivo deste estudo foi detectar e quantificar o cálcio contendo nanocristais (< 1 μm de tamanho) utilizando análise de rastreamento de nanopartículas (NTA). Para isso, a tecnologia NTA foi usada em combinação com um fluorohore de ligação de cálcio, Fluo-4 AM para detectar e quantificar cálcio contendo nanocristais na urina de adultos saudáveis.
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Protocol
Todos os experimentos descritos neste trabalho foram aprovados pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade do Alabama em Birmingham (UAB). Adultos saudáveis (33,6 ± 3,3 anos; n=10) foram inscritos no estudo se tivessem um painel metabólico normal e abrangente, usuários não-tabaco, não gestantes, um IMC entre 20-30 kg/m2, e livres de condições médicas crônicas ou doenças agudas. Os participantes saudáveis assinaram um termo de consentimento livre e esclarecido por escrito antes do início do estudo.
1. Protocolo clínico e coleta de urina
- Os participantes consomem uma dieta de baixo oxalato preparada pelo Núcleo de Bionutrição de Ciências Clínicas e Translacionais da UAB por 3 dias e rápido durante a noite antes de coletar sua urina (amostra de 24 horas).
- No dia seguinte, os participantes retornam sua amostra de urina 24 horas (pré-oxalato) antes de consumir uma carga de oxalato (smoothie contendo frutas e legumes, ~8 mM oxalato). Os participantes posteriormente coletam sua urina por 24 horas (amostra pós-oxalato) e devolvem sua urina no dia seguinte.
- Mantenha todas as amostras de urina à temperatura ambiente (RT) antes do processamento conforme descrito abaixo e mostrado na Figura 1.
2. Processamento de urina
NOTA: Todos os materiais e equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.
ATENÇÃO: Use equipamentos de proteção individual o tempo todo enquanto manuseia amostras clínicas e reagentes. Especificamente, luvas, escudos faciais e oculares, proteção respiratória e roupas protetoras.
- Medir e registrar pH e volume de urina. Misture bem antes de adicionar 50 mL de urina em um tubo cônico estéril rotulado de 50 mL.
- Amostra de centrífuga a 1200 x g por 10 min no RT usando uma centrífuga de bancada.
NOTA: Mantenha a amostra em RT para evitar a formação de cristais, pois temperaturas mais frias podem promover a cristalização. - Descarte o supernasce e lave e resuspenque a pelota novamente com 5 mL de 100% de etanol. Centrifugar a amostra a 1200 x g por 10 minutos no RT usando uma centrífuga de bancada.
- Descarte o supernasce e resuspenque a pelota em 1 mL de 100% de etanol. Armazene a amostra a -20 °C para posterior processamento ou manche a amostra conforme descrito abaixo.
NOTA: Não há diferença significativa nos pontos de dados (ou seja, tamanho/concentração de partículas) entre amostras armazenadas ou recém-manchadas.
3. Análise de rastreamento de nanopartículas (NTA)
- Preparação da Amostra
- Nanopartículas de ouro: Use nanopartículas de ouro para otimizar as configurações do instrumento. Diluir nanopartículas de ouro de tamanho 100 nm 1:1000 em água ultrapura.
- Urina humana: Diluir amostras de urina 20 vezes na água antes da coloração com 5 mM Fluo-4 AM (um corante de fluorescência de cálcio) por 30 min no escuro. Analise as amostras utilizando NTA.
- Prepare os cristais de Oxalato de Cálcio (CaOx) como descrito anteriormente29. Diluir a solução de estoque de 10 mM (14,6 mg em 10 mL de água) a 50 μM de água e manchar as amostras diluídas usando 5 mM Fluo-4 AM por 30 minutos no escuro antes da análise.
- Cristais de fosfato de cálcio (CaP): Diluir a solução de estoque de 10 mM (50,4 mgs em 10 mL de água) a 50 μM de água e manchar as amostras diluídas usando 5 mM Fluo-4 AM por 30 minutos no escuro antes da análise da NTA.
- Configuração de instrumentos, configurações da câmera e coleta de dados
NOTA: A configuração do computador e do instrumento utilizada para este método são mostradas na Figura 2.- Ligue o computador e depois o instrumento. Abra o software e ligue a câmera.
- Uma vez que a janela de software esteja aberta, clique no ícone de captura no canto superior esquerdo da janela para iniciar o modo de captura. A inicialização da câmera leva alguns segundos.
- Limpe a plataforma bombeando ar para dentro usando uma seringa de 1 mL até que a plataforma pareça limpa. Adicione suavemente água ao aparelho 2-3 vezes usando outra seringa de 1 mL para remover quaisquer bolhas de ar.
NOTA: Procure por quaisquer bolhas de ar na plataforma, bem como na tubulação. É importante não ter bolhas em todo o aparelho antes e durante a execução de amostras. Se as bolhas estiverem presentes, limpe a plataforma novamente com ar e água. - Uma vez que a plataforma esteja limpa, adicione água para verificar se há alguma contaminação na superfície, visualizando a câmera. Em seguida, adicione nanopartículas de ouro como controle ao injetor da bomba de carregamento de amostras para configurar o instrumento.
- Ajuste o nível da câmera na tela ou no botão para o lado direito do instrumento até que a imagem comece a exibir pixels coloridos e, em seguida, reduza o nível da câmera.
- Em seguida, ajuste a tela para otimizar a imagem. Clique à esquerda no botão do mouse na imagem do vídeo. Segure o botão esquerdo do mouse e arraste a imagem para cima e para baixo para obter toda a vista.
NOTA: A lente e o filtro normais da câmera são usados para avaliar nanopartículas de ouro e amostras não manchadas. - Configure a velocidade de infusão e concentre a câmera para que as nanopartículas de ouro sejam visíveis na tela da câmera. Defina a velocidade de infusão em alta (ou seja, 500 μL/min) para configuração inicial para garantir que as nanopartículas de ouro sejam detectadas. Uma vez detectado, reduza a velocidade para 50 μL/min.
- Ajuste o nível da câmera para visualizar as partículas. Para amostras não manchadas, ajuste o ganho de tela no nível 5 para alcançar o foco da câmera e ajuste o nível da câmera em 8. Uma vez definido o foco, registo a amostra (ou seja, 1 medição por apenas 60 segundos).
NOTA: O foco e a velocidade contínua de fluxo são importantes para obter imagens claras e nítidas das partículas para contagem. - Após a otimização, limpe novamente o aparelho com água antes de avaliar amostras. Veja a câmera para garantir que a tubulação esteja limpa e que as partículas não estejam presentes.
NOTA: Lave a câmara entre cada amostra até que nenhuma partícula seja detectada pela câmera. - Para analisar amostras manchadas, ajuste a câmera à posição do filtro contendo o filtro fluorescente adequado. Carregue amostras diluídas e manchadas no injetor da bomba de carga da amostra e reduza a velocidade para 20 μL/min para análise da amostra.
- Em seguida, ajuste o ganho de tela e o nível da câmera, pois estes são parâmetros importantes. Para amostras manchadas (fluorescentes), defina o ganho da tela para 5 e o nível da câmera no nível 13.
NOTA: Esses parâmetros variam de acordo com o tipo de amostra e cada amostra precisará ser otimizada para ganhar foco. - Use a medição padrão para medir as amostras para 5 capturas por amostra onde uma duração de captura é de 60 segundos.
- Salve e armazene dados após cada medição. O software salvará arquivos de imagem e vídeo para cada medição. O software fornece dados de saída (por exemplo, tamanho de cristal: 10 nM - 1000 nM e concentração) em formatos excel e pdf.
- Calcule o número médio de nanopartículas para todas as 5 leituras para cada amostra individual. Analise os dados usando desvio padrão ou erro padrão da média e use t-tests para análise emparelhada.
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Representative Results
Os achados deste estudo mostram que a NTA pode detectar eficientemente o tamanho médio e a concentração de cálcio contendo nanocristais urinários na urina humana. Isso foi conseguido utilizando-se a análise de rastreamento de fluoforas, Fluo-4 AM e nanopartículas. Fluo-4 AM foi capaz de se ligar tanto aos cristais CaOx quanto aos cap. Como mostrado na Figura 3A,os cristais caOx foram determinados entre 50-270 nm de tamanho e têm uma concentração média de 1,26 x 109 partículas/mL. Os cristais CaP tinham entre 30-225 nm de tamanho e tinham uma concentração média de 2,22 x 109 partículas/mL(Figura 3B). Para determinar se a NTA poderia avaliar nanocristais na urina humana, adultos saudáveis foram convidados a consumir uma dieta oxala controlada seguida de uma alta carga de oxalato. Amostras de urina de 24 horas antes e depois da carga foram coletadas para avaliar o tamanho e concentração do nanocristal urinário. As amostras de urina pré-oxalato continham alguns nanocristais urinários (1,65 x 108 ± 3,29 x 107 partículas/mL) entre 110-300 nm(Figura 4). Em contrapartida, houve um aumento significativo (p<0,0001) em nanocristais urinários presentes em amostras pós-oxalato (7,05 x 108 ± 1,08 x 108 partículas/mL; 100-320 nm)(Figura 4). Para confirmar a reprodutibilidade do método, as amostras foram medidas três vezes e não houve variação significativa nas réplicas técnicas(Figura 5).
Figura 1: Protocolo para isolar e manchar nanocristais urinários humanos. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Descrição da Análise de Rastreamentode Nanopartículas (NTA). (B) As amostras são injetadas em uma tubulação de entrada usando uma bomba de seringa a uma taxa contínua antes de encher a superfície óptica. As amostras são então observadas pela lente objetiva e capturadas pela câmera à medida que as amostras fluem através da plataforma antes de sair pela tubulação de saída para serem descartadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: NTA detecta cristais de oxalato de cálcio rotulado Fluo-4 AM (CaOx) e fosfato de cálcio (CaP). Gráficos representativos deCOxe(B) Cristais CaP mostrando distribuição e concentração de tamanho. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: NTA detecta Fluo-4 AM rotulado nanocristais urinários humanos 24 horas. Gráfico representativo de Fluo-4 AM rotulado nanocristais urinários em amostras de pré-oxalato e pós-oxalato de 24 horas de um adulto saudável em uma dieta oxala controlada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Replicações técnicas de nanocristais humanos em coleções de urina 24 horas utilizando NTA. Réplicas técnicas de nanocristais urinários rotulados fluo-4 AM em amostras pré-oxalatos de 24 horas(A)e(B)pós-oxalato de um adulto saudável em uma dieta oxalal controlada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A NTA tem sido utilizada no presente estudo para avaliar nanocristais na urina humana usando uma sonda de ligação de cálcio, Fluo-4 AM. Não há um método padrão disponível para detectar nanocristais na urina. Alguns grupos de pesquisa detectaram nanocristais na urina e se basearam no uso de protocolos ou métodos extensos que são limitados em sua capacidade de quantificar as amostras27,28. Este estudo mostra um método específico e sensível para detectar cálcio contendo nanocristais na urina de humanos que participaram de um estudo de alimentação dietética que consistia em ingerir uma alta carga de oxalato. A quantidade de oxalato consumida foi equivalente ao consumo real de oxalato (por exemplo, salada de espinafre 1/2).
NTA é uma ferramenta de alta resolução bem caracterizada que usa movimento browniano para medir partículas na solução30. Tem sido usado para avaliar nanopartículas biológicas em uma variedade de amostras biológicas31,32,33. Além disso, a NTA pode prever com precisão o tamanho, bem como a concentração de partículas em qualquer tipo de amostra biológica. Este método não requer nenhuma rotulagem; no entanto, a rotulagem pode ser usada para detectar partículas específicas. Fluo-4 AM foi utilizado neste estudo para detectar de forma eficiente e especificamente cálcio contendo nanocristais em amostras de urina. Sondas fluorescentes de cálcio foram inicialmente usadas para medir o cálcio citosomico livre34. Fluo-4 é um análogo do Fluo-3 cuja fluorescência aumenta >100 vezes ao ligar ao cálcio livre35. Além disso, o Fluo-4 tem sido mostrado para avaliar partículas de cálcio no fluido sinovial de pacientes com artrite usando citometria de fluxo36. Assim, utilizamos Fluo-4 AM para esses estudos.
Todas as amostras foram continuamente injetadas na plataforma para detecção precisa. Determinar a concentração e o tamanho das partículas depende da taxa de fluxo, pois uma alta taxa de fluxo (ou seja, 50 μL/min) pode afetar a avaliação precisa da concentração, bem como o tamanho das partículas em comparação com uma configuração estática e uma taxa de fluxo mais baixa (ou seja, 20 μL/min)37. Assim, uma taxa de fluxo lento constante fornece uma medição precisa do número de partículas presentes nas amostras. Outros parâmetros importantes que podem afetar a contagem e o tamanho das partículas incluem o nível da câmera, o limiar de detecção e o foco38,39,40. Uma medição consistente de partículas em amostras (cv aproximadamente 20%) observou-se no presente estudo, consistente com os achados de outro estudo39. Por fim, a presença de nanocristais na urina humana foi confirmada usando microscopia eletrônica29. Esta pesquisa demonstra que a NTA pode medir com sucesso os nanocristais urinários de humanos.
Uma vantagem deste protocolo é o uso de Fluo-4 AM para avaliar partículas contendo cálcio em solução. Outra vantagem é a variabilidade mínima observada na detecção de nanocristais dentro das amostras. Uma limitação da NTA neste cenário, é a incapacidade de distinguir a morfologia dos nanocristais. No entanto, este método pode ser benéfico para detectar cristalúria para prever o risco de pedra em indivíduos com histórico de cálcio contendo pedras nos rins. Este protocolo não pode substituir as metodologias atuais, mas pode fornecer uma nova visão sobre os nanocristais urinários. O uso da NTA para avaliar cristais contendo cálcio urinário é uma nova abordagem que deve destacar a importância da nanocristaria além da microscopia padrão e dos métodos mencionados acima. Investigações adicionais são justificadas para explorar a confiabilidade deste método na população de pedras renais.
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Disclosures
Os autores não declaram conflitos de interesse.
Acknowledgments
Os autores agradecem a todos os participantes do estudo e ao Núcleo de Bionutrição da UAB CCTS e ao Centro de Serviços de Imagem de Alta Resolução da UAB por suas contribuições. Este trabalho foi apoiado pelas bolsas NIH DK106284 e DK123542 (TM), e UL1TR003096 (Centro Nacional de Promoção de Ciências Translacionais).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Benchtop Centrifuge | Jouan Centrifuge | CR3-12 | |
| Calcium Oxalate monohydrate | Synthesized in the lab as previously described29. | Store at RT; Stock 10 mM | |
| Calcium Phosphate crystals (hydroxyapatite nanopowder) | Sigma | 677418 | Store at RT; Stock 10 mM |
| Ethanol | Fischer Scientific | AC615095000 | Store at RT; Stock 100% |
| Fluo-4 AM* | AAT Bioquest, Inc. | 20550 | Store at Freezer (-20°C); Stock 5 mM |
| Gold Nanoparticles | Sigma | 742031 | Store at 2-8°C |
| NanoSight Instrument | Malvern Instruments, UK | NS300 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 98-4730 | |
| Virkon Disinfectant | LanXESS Energizing Company, Germany | LSP | |
| *Fluorescence dyes are light sensitive; stock and aliquots should be stored in the dark at -20°C. |
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