Summary
이 연구의 목적은 나노 입자 추적 분석 (NTA)이 건강한 성인의 나노 결정을 포함하는 오줌 칼슘을 감지하고 정량화 할 수 있는지 여부를 결정하는 것이었습니다. 현재 연구 결과에서 사실 인정은 NTA가 신장 결석 질병 도중 오줌 나노 결정을 추정하는 잠재적인 공구일 수 있었다는 것을 건의합니다.
Abstract
신장 결석은 성인과 아이들에서 전 세계적으로 더 널리 퍼지고 있습니다. 신장 결석의 일반적인 모형은 칼슘 옥살레이트 (CaOx) 결정의 구성됩니다. 결정루리아는 소변이 미네랄(예: 칼슘, 옥살레이트, 인산염)으로 과포화되고 신장 결석 형성에 선행될 때 발생합니다. 돌 전자에서 결정루리아를 평가하는 표준 방법은 현미경 검사법, 여과 및 원심 분리를 포함한다. 그러나, 이 방법은 주로 나노 결정이 아닌 마이크로 결정을 검출합니다. 나노 결정은 시험관내 미세 결정보다는 신장 상피 세포에 더 유해하도록 제안되었습니다. 여기서는 나노입자 추적 분석(NTA)이 인간의 오줌 나노 결정을 검출하는 능력을 설명합니다. 건강한 성인은 오줌 나노 결정을 자극하기 위해 옥살레이트 부하를 마시기 전에 통제 된 옥살레이트 식단을 공급받았습니다. 소변은 옥살레이트 하중 전후 24시간 동안 수거되었다. 샘플을 가공하여 에탄올로 세척하여 샘플을 정화했습니다. 요로 나노 결정은 칼슘 결합 형광소, 플루오-4 오전로 염색되었다. 염색 후, 나노 결정의 크기와 수는 NTA를 사용하여 결정되었다. 이 연구 결과에서 사실 인정은 NTA가 건강한 성인에 있는 나노 결정루아를 능통하게 검출할 수 있었다는 것을 보여줍니다. 이 사실 인정은 NTA가 신장 결석 질병을 가진 환자에 있는 나노 결정루리아의 귀중한 조기 탐지 방법일 수 있었다는 것을 건의합니다.
Introduction
소변 결정은 소변이 미네랄로 과포화될 때 형성됩니다. 이것은 건강한 개별에서 생길 수 있습니다 그러나 신장 결석을 가진 개별에서 일반적 입니다1. 오줌 결정의 존재와 축적은 신장 결석을 개발의 위험을 증가시킬 수 있습니다. 구체적으로, 이것은 결정이 랜달의 플라크에 결합할 때, 핵, 축적, 그리고 시간이지남에따라2,3,4증가할 때 생깁니다. 결정루리아는 신장 결석 형성 및 결정성루리아의 평가를 선행하여 신장 결석 전자3,5에서예측값을 가질 수 있다. 구체적으로, 결정루리아는 돌6,7을함유하는 칼슘 산화칼슘의 역사를 가진 환자에서 돌 재발의 위험을 예측하는 데 유용할 것으로 제안되고 있다.
결정은 신장 상피 및 순환 면역 세포 기능8,9,10,11,12,13에부정적인 영향을 보고되었다. 이전에는 칼슘 옥살레이트(CaOx) 신장 결석 전자로부터 단핵구를 순환시키는 것이 건강한 개인에 비해 세포 생체 정력을 억제한 것으로 보고되었다14. 또한, CaOx 결정은 세포 생체 에너지를 감소시키고 단핵구8에서레독스 항상성을 방해한다. 옥살레이트가 풍부한 식사의 소비는 신장 관 손상으로 이어질 수 있는 결정루리아를 유발하고 신장 결석 형성에 대한 보호되는 오줌 거대 분자의 생산 및 기능을 변경할 수 있다15,16. 여러 연구는 소변 결정이 소변 의 pH 및 온도에 따라 모양과 크기가 다를 수 있음을입증했다 17,18,19. 또한, 오줌 단백질은 결정거동(20)을조절하는 것으로 나타났다. Daudon외. 19,결정성 루리아 분석은 신장 결석 질병을 가진 환자의 관리에 도움이 될 수 있고 치료에 그들의 반응을 평가하는 데 도움이 될 수 있다는 것을 건의했습니다. 현재 결정의 존재를 평가하기 위해 사용할 수 있는 몇 가지 통상적인 방법은 편광 현미경검사법(21,22,전자 현미경검사법 23,입자 카운터3,소변 여과24,증발3,5 또는 원심분리21)을포함한다. 이 연구 결과는 결정루리아에 관하여 신장 결석 필드에 귀중한 통찰력을 제공했습니다. 그러나 이러한 방법의 한계는 크기가 1 μm 미만인 결정을 시각화하고 정량화할 수 없다는 것입니다. 이 크기의 결정은 랜달의 플라크에 부착하여 CaOx 돌의 성장에 영향을 미칠 수 있습니다.
나노 결정은 더 큰 미세 결정(25)에비해 신장 세포에 광범위한 부상을 일으키는 것으로 나타났습니다. 나노결정의 존재는 나노입자분석기(26,27)를이용하여 소변에서 보고되었다. 최근 연구는 형광으로 표지된 비스포스페이트 프로브(alendronate-fluorescein/alendronate-Cy5)를 사용하여 나노스케일 유동세포측정제(28)를사용하여 나노결정을 검사하였다. 이 염료의 한계는 구체적이지 않으며 시스테인을 제외한 거의 모든 종류의 돌에 결합한다는 것입니다. 따라서, 개별에 있는 나노결정의 존재를 정확하게 평가하는 것은 결정루리아를 진단하고 돌 리스크를 예측하는 효과적인 공구일 수 있습니다. 이 연구의 목적은 나노 입자 추적 분석 (NTA)을 사용하여 나노 결정 (<1 μm 크기)을 포함하는 칼슘을 검출하고 정량화하는 것이었습니다. 이를 달성하기 위해 NTA 기술은 건강한 성인의 소변에 나노 결정을 함유한 칼슘을 검출하고 정량화하기 위해 오전 플루오-4 칼슘 결합 형광소와 병용하여 사용되었습니다.
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Protocol
이 작품에 설명 된 모든 실험은 버밍엄에서 앨라배마 대학에 의해 승인되었다 (UAB) 기관 검토 위원회. 건강한 성인(33.6± 3.3세, n=10)은 정상적인 혈액 종합 대사 패널, 비담배 사용자, 비임신, BMI 20-30kg/m2 사이 BMI, 만성 질환 또는 급성 질환이 없는 경우 연구에 등록되었습니다. 건강한 참가자들은 연구가 시작되기 전에 서면 동의서에 서명했습니다.
1. 임상 프로토콜 및 소변 수집
- 참가자는 임상 및 번역 과학 생물 영양 코어에 대 한 UAB 센터에 의해 준비 된 낮은 oxalate 다이어트를 소비 3 일 그들의 소변을 수집 하기 전에 하룻밤 빠른 (24 시간 샘플).
- 다음 날, 참가자는 옥살레이트 부하 (과일과 채소를 포함하는 스무디, ~ 8 mM 옥살레이트)를 섭취하기 전에 24 시간 소변 샘플 (사전 oxalate)을 반환해야합니다. 참가자는 이후 24 시간 동안 자신의 소변을 수집 (포스트 옥살레이트 샘플) 다음 날 자신의 소변을 반환합니다.
- 아래설명과 같이 처리하기 전에 실온(RT)에서 모든 소변 샘플을 유지하며 도 1에도시되어 있다.
2. 소변 처리
참고: 사용되는 모든 재료 및 장비는 재료 표에나열되어 있습니다.
주의: 임상 샘플 및 시약을 취급하는 동안 항상 개인 보호 장비를 착용하십시오. 특히 장갑, 얼굴 및 안구 방패, 호흡기 보호 및 보호 복.
- 소변 pH 및 볼륨을 측정하고 기록합니다. 라벨이 부착된 멸균 50mL 원문 튜브에 소변 50mL를 추가하기 전에 철저히 섞는다.
- 원심분리기 샘플은 벤치탑 원심분리기를 사용하여 RT에서 10분 동안 1200 x g의 원심분리기 샘플입니다.
참고: 더 차가운 온도가 결정화를 촉진할 수 있기 때문에 추가 결정 형성을 방지하기 위해 RT에 샘플을 보관하십시오. - 상체를 버리고 100 % 에탄올의 5 mL로 다시 펠릿을 씻고 다시 놓습니다. 원심 분리기는 벤치탑 원심분리기를 사용하여 RT에서 10분 동안 1200 x g의 샘플을 원심분리합니다.
- 상체를 버리고 100 % 에탄올의 1 mL에서 펠릿을 다시 놓습니다. 샘플은 -20°C로 저장하여 아래와 같이 나중에 처리하거나 샘플을 얼룩지게 한다.
참고: 저장된 시료 나 갓 스테인드 된 샘플 사이의 데이터 포인트 (즉, 입자 크기 /농도)에는 큰 차이가 없습니다.
3. 나노 입자 추적 분석 (NTA)
- 샘플 준비
- 금 나노 입자: 금 나노 입자를 사용하여 기기의 설정을 최적화합니다. 초순수수에 100nm 크기의 금 나노입자 1:1000을 희석한다.
- 인간의 소변: 소변 샘플을 20회 희석한 후 오전 5m플루오-4AM(칼슘 형광염)으로 염색하기 전에 물에서 30분 동안 희석합니다. NTA를 사용하여 샘플을 분석합니다.
- 이전에 설명된29와같이 칼슘 옥살레이트(CaOx) 결정을 준비한다. 10mM 스톡 용액(10mL에서 14.6 mg)을 물에 50 μM으로 희석하고 분석 전에 30분 동안 5mM 플루오-4 AM을 사용하여 희석된 시료를 더럽니다.
- 칼슘 인산염(CaP) 결정: NTA 분석 전에 30분 동안 5mM 플루오-4 AM을 사용하여 10mM 스톡 솔루션(10mL에서 50.4 mg)을 물에 50 μM으로 희석하고 희석된 시료를 염색합니다.
- 계측기 설정, 카메라 설정 및 데이터 수집
참고: 이 메서드에 사용되는 컴퓨터 및 계측기 설정은 그림 2에표시됩니다.- 컴퓨터와 계측기를 켭니다. 소프트웨어를 열고 카메라를 켭니다.
- 소프트웨어 창이 열리면 창 왼쪽 상단 모서리에 있는 캡처 아이콘을 클릭하여 캡처 모드를 시작합니다. 카메라 초기화에는 몇 초가 걸립니다.
- 플랫폼이 깨끗하게 나타날 때까지 1 mL 주사기를 사용하여 먼저 공기를 펌핑하여 플랫폼을 청소하십시오. 기포를 제거하기 위해 다른 1 mL 주사기를 사용하여 장치에 물을 2-3 번 부드럽게 추가합니다.
참고: 튜브뿐만 아니라 플랫폼의 기포를 찾습니다. 샘플을 실행하기 전과 실행 하는 동안 장치 전체에 거품을 하지 않는 것이 중요 하다. 거품이 있는 경우 공기와 물로 플랫폼을 다시 청소하십시오. - 플랫폼이 깨끗해지면 카메라를 보면서 표면에 오염이 있는지 확인하기 위해 물을 추가합니다. 다음으로, 금 나노 입자를 시료 로딩 펌프 인젝터에 컨트롤로 추가하여 계측기를 설정합니다.
- 이미지가 컬러 픽셀을 표시하기 시작할 때까지 화면이나 노브의 노브에서 카메라 레벨을 조정한 다음 카메라 레벨을 줄입니다.
- 그런 다음 화면을 조정하여 이미지를 최적화합니다. 비디오 이미지의 마우스 버튼을 왼쪽 단추로 클릭합니다. 왼쪽 마우스 버튼을 길게 잡고 이미지를 위아래로 드래그하여 전체 보기를 가져옵니다.
참고: 일반 카메라 렌즈와 필터는 금 나노 입자와 스테인드되지 않은 샘플을 평가하는 데 사용됩니다. - 주입 속도를 설정하고 카메라 화면에 금 나노 입자가 보이면 카메라를 집중시킵니다. 금 나노 입자가 검출되도록 초기 설정에 대한 주입 속도를 높음 (즉, 500 μL/min)으로 설정합니다. 일단 감지되면 속도를 50 μL/분으로 줄입니다.
- 카메라 레벨을 조정하여 파티클을 시각화합니다. 스테인드되지 않은 샘플의 경우 화면 게인을 레벨 5에서 조정하여 카메라 포커스를 달성하고 카메라 레벨을 8로 설정합니다. 포커스가 설정되면 샘플을 기록합니다(즉, 60초 동안만 1측정)을 기록합니다.
참고: 초점 과 연속 유량 속도는 계산을 위해 입자의 명확하고 선명한 이미지를 얻는 데 중요합니다. - 최적화 후 샘플을 평가하기 전에 다시 물로 장치를 청소하십시오. 튜브가 깨끗하고 파티클이 없는지 확인하기 위해 카메라를 봅니다.
참고: 카메라에서 입자가 감지되지 않을 때까지 각 샘플 간에 챔버를 세척합니다. - 스테인드 샘플을 분석하려면 적절한 형광 필터를 포함하는 필터 위치로 카메라를 조정합니다. 희석 및 염색된 샘플을 샘플 로딩 펌프 인젝터에 적재하고 시료 분석을 위해 속도를 20 μL/min으로 줄입니다.
- 다음으로 중요한 매개 변수이기 때문에 화면 게인 및 카메라 레벨을 조정합니다. 스테인드(형광) 샘플의 경우 화면 게인을 5로 설정하고 카메라 레벨을 레벨 13에서 설정합니다.
참고: 이러한 매개 변수는 샘플 유형에 따라 다르며 모든 샘플을 최적화하여 포커스를 확보해야 합니다. - 표준 측정을 사용하여 1개의 캡처 지속 시간이 60초인 샘플당 5개의 캡처에 대한 샘플을 측정합니다.
- 각 측정 후 데이터를 저장하고 저장합니다. 이 소프트웨어는 각 측정에 대한 이미지 및 비디오 파일을 저장합니다. 이 소프트웨어는 출력 데이터 (예 : 10 nM - 1000 nM 및 농도)를 엑셀 및 PDF 형식으로 제공합니다.
- 각 개별 샘플에 대해 5개의 판독값 모두에 대한 평균 나노입자 수를 계산합니다. 평균의 표준 편차 또는 표준 오류를 사용하여 데이터를 분석하고 쌍분석에 t-테스트를 사용합니다.
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Representative Results
이 연구 결과에서 사실 인정은 NTA가 인간 적인 소변에 있는 오줌 나노 결정을 포함하는 칼슘의 평균 크기 그리고 사격을 능통하게 검출할 수 있습니다 보여줍니다. 이는 플루오로포레, 플루오-4 AM 및 나노입자 추적 분석을 사용하여 달성되었다. 플루오-4 AM은 카옥스와 CaP 크리스탈 모두에 결합할 수 있었습니다. 도 3A에도시된 바와 같이, CaOx 결정은 50-270 nm 크기로 결정되었고 평균 농도가 1.26 x 109 입자/mL이다. CaP 결정은 30-225 nm 크기사이였으며 평균 농도는 2.22 x 109 입자/mL(도3B)이었다. NTA가 인간의 소변에서 나노 결정을 평가할 수 있는지 확인하기 위해 건강한 성인은 통제 된 옥살레이트 식단을 섭취한 다음 높은 옥살레이트 부하를 섭취하도록 요청받았습니다. 24시간 소변 샘플은 하중 전후에 요로 나노결정 크기 및 농도를 평가하기 위해 수집되었다. 사전 oxalate 소변 샘플은 110-300 nm(도 4)사이에 일부 오줌 나노 결정 (1.65 x 108 ± ± 3.29 x 107 입자 / mL)을 포함했다. 대조적으로, 옥살레이트 후 시료(7.05 x 108 ± 1.08 x108 입자/mL; 100-320 nm)에 존재하는 오줌 나노결정에서 상당한 증가(p<0.0001)가 있었다(그림4). 방법의 재현성을 확인하기 위해 샘플을 세 번 측정하고 기술적복제(도 5)에상당한 변화가 없었다.
그림 1: 인간의 오줌 나노 결정을 격리하고 염색하기위한 프로토콜.
그림 2: 나노 입자 추적 분석 (NTA)에 대한 설명.(A)컴퓨터 및 계측기 는 이러한 연구에 사용되는 설정. (B)샘플은 광학 표면을 채우기 전에 연속 속도로 주사기 펌프를 사용하여 입구 튜브에 주입된다. 샘플은 객관적인 렌즈에 의해 관찰되고 샘플이 플랫폼을 통해 흐르면서 카메라에 의해 캡처된 후 콘센트 튜브를 통해 종료하여 폐기됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: NTA는 플루오-4 AM 라벨 칼슘 옥살레이트 (CaOx) 및 칼슘 인산염 (CaP) 결정을 감지합니다. (A)CaOx 및(B)CaP 결정의 대표적인 그래프는 크기 분포 및 농도를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: NTA는 플루오-4 AM을 24시간 인간 오줌 나노결정으로 분류합니다. 플루오-4 AM의 대표적인 그래프는 조절된 옥살레이트 식단에 건강한 성인의 24시간 전산화 및 후 옥살레이트 샘플에 오줌 나노결정으로 표지되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: NTA를 사용하여 24 시간 소변 수집에서 인간의 나노 결정의 기술적 복제. 플루오-4 AM의 기술적 복제는24시간(A)전옥소에서 오줌 나노결정으로 표시되고(B)조절된 옥살레이트 식단에서 건강한 성인의 후옥산시료. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
NTA는 칼슘 결합 프로브, Fluo-4 AM을 사용하여 인간의 소변에 있는 나노 결정을 평가하기 위하여 본 연구 결과에서 이용되었습니다. 소변에서 나노 결정을 검출하는 데 사용할 수있는 표준 방법은 없습니다. 일부 연구 그룹은 소변에서 나노 결정을 검출하고 샘플27,28을정량화하는 능력에 제한된 광범위한 프로토콜 또는 방법의 사용에 의존했다. 이 연구는 높은 옥살레이트 하중섭취로 구성된 식이 공급 연구에 참여한 인간의 소변에 나노 결정을 함유한 칼슘을 검출하기 위한 구체적이고 민감한 방법을 보여줍니다. 소비된 옥살레이트의 양은 옥살레이트(예: 시금치 샐러드 1/2)의 실제 소비량과 동일하였다.
NTA는 브라우니아 모션을 사용하여 용액30에서입자를 측정하는 잘 특징인 고해상도 도구입니다. 다양한 생물학적 샘플에서 생물학적 나노입자를 평가하는 데 사용되어 왔다31,32,33. 또한 NTA는 모든 유형의 생물학적 샘플에서 입자의 크기뿐만 아니라 농도를 정확하게 예측할 수 있습니다. 이 메서드는 레이블을 필요로 하지 않습니다. 그러나 라벨링은 특정 입자를 감지하는 데 사용될 수 있다. 플루오-4 AM은 소변 샘플에서 나노 결정을 포함하는 칼슘을 효율적이고 구체적으로 검출하기 위해 이 연구에서 사용되었습니다. 칼슘 형광 프로브는 처음에는 무료 세포색 칼슘34를측정하는 데 사용되었습니다. 플루오-4는 플루오-3의 유사체로, 형광이 100배 증가하여 자유칼슘(35)에결합하면 > 100배 증가한다. 또한, 플루오-4는 혈류세포측정제(36)를이용한 관절염 환자의 활액에서 칼슘 입자를 평가하는 것으로 나타났다. 따라서, 우리는 이러한 연구에 대 한 Fluo-4 오전 사용.
모든 샘플은 정확한 검출을 위해 플랫폼에 지속적으로 주입되었습니다. 농도 및 입자 크기를 결정하는 것은 유량에 따라 달라지며, 높은 유량(즉, 50 μL/min)은 정적 설정 및 낮은 유량(즉, 20 μL/min)에 비해 입자 크기뿐만 아니라 농도의 정확한 평가에 영향을 미칠 수 있다( 즉 20 μL/min)37. 따라서, 꾸준한 느린 유량은 시료에 존재하는 입자의 수를 정확하게 측정한다. 파티클 수와 크기에 영향을 줄 수 있는 기타 중요한 매개변수에는 카메라 레벨, 감지 임계값 및 초점38,39,40이포함됩니다. 샘플에서 일관된 입자 측정(CV 약 20%) 현재 연구에서 관찰되었다, 이는 다른 연구에서 결과와 일치했다39. 마지막으로, 인간 소변에 나노결정의 존재는 전자 현미경검사법(29)을사용하여 확인되었다. 이 연구는 NTA가 인간에게서 오줌 나노 결정을 성공적으로 측정할 수 있다는 것을 보여줍니다.
이 프로토콜의 한 가지 장점은 플루오-4 AM을 사용하여 용액에 입자가 함유된 칼슘을 평가하는 것입니다. 또 다른 장점은 샘플 내의 나노 결정 검출에서 관찰되는 최소한의 가변성입니다. 이 설정에서 NTA의 한 가지 제한은 나노 결정의 형태를 구별할 수 없다는 것입니다. 그러나, 이 방법은 신장 결석을 포함하는 칼슘의 역사를 가진 개별에 있는 돌 리스크를 예측하기 위한 결정루리아를 검출하기 위하여 유익할 수 있었습니다. 이 프로토콜은 현재 방법론을 대체할 수 없지만 오줌 나노 결정에 대한 새로운 통찰력을 제공할 수 있습니다. NTA의 사용은 결정을 포함하는 오줌 칼슘을 평가하기 위하여 전술한 표준 현미경 검사법과 방법을 넘어 나노 결정루리아의 중요성을 강조해야 하는 새로운 접근법입니다. 추가 조사는 신장 결석 인구에 있는 이 방법의 신뢰성을 탐구하기 위하여 보증됩니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
저자는 모든 연구 참가자와 UAB CCTS 바이오 영양 코어 및 UAB 고해상도 이미징 서비스 센터에서 기여에 감사드립니다. 이 작품은 NIH 보조금 DK106284 및 DK123542 (TM), UL1TR003096 (국립 번역 과학 센터)에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Benchtop Centrifuge | Jouan Centrifuge | CR3-12 | |
| Calcium Oxalate monohydrate | Synthesized in the lab as previously described29. | Store at RT; Stock 10 mM | |
| Calcium Phosphate crystals (hydroxyapatite nanopowder) | Sigma | 677418 | Store at RT; Stock 10 mM |
| Ethanol | Fischer Scientific | AC615095000 | Store at RT; Stock 100% |
| Fluo-4 AM* | AAT Bioquest, Inc. | 20550 | Store at Freezer (-20°C); Stock 5 mM |
| Gold Nanoparticles | Sigma | 742031 | Store at 2-8°C |
| NanoSight Instrument | Malvern Instruments, UK | NS300 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 98-4730 | |
| Virkon Disinfectant | LanXESS Energizing Company, Germany | LSP | |
| *Fluorescence dyes are light sensitive; stock and aliquots should be stored in the dark at -20°C. |
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