Summary
L'obiettivo di questo studio era determinare se l'analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA) potesse rilevare e quantificare il calcio urinario contenente nanocristalli di adulti sani. I risultati dell'attuale studio suggeriscono che l'NTA potrebbe essere un potenziale strumento per stimare i nanocristalli urinari durante la malattia da calcoli renali.
Abstract
I calcoli renali stanno diventando sempre più diffusi in tutto il mondo negli adulti e nei bambini. Il tipo più comune di calcoli renali è costituito da cristalli di ossalato di calcio (CaOx). I cristalli si verificano quando l'urina diventa supersatura di minerali (ad esempio calcio, ossalato, fosfato) e precede la formazione di calcoli renali. I metodi standard per valutare i cristalli nei formatori di pietra includono microscopia, filtrazione e centrifugazione. Tuttavia, questi metodi rilevano principalmente microcristalli e non nanocristalli. I nanocristalli sono stati suggeriti per essere più dannosi per le cellule epiteliali renali rispetto ai microcristalli in vitro. Qui descriviamo la capacità dell'analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA) di rilevare i nanocristalli urinari umani. Gli adulti sani sono stati nutriti con una dieta ossalata controllata prima di bere un carico ossalato per stimolare i nanocristalli urinari. L'urina è stata raccolta per 24 ore prima e dopo il carico di ossalato. I campioni sono stati lavorati e lavati con etanolo per purificare i campioni. I nanocristalli urinari erano macchiati con il fluorofoforo legante il calcio, Fluo-4 AM. Dopo la colorazione, le dimensioni e il conteggio dei nanocristalli sono stati determinati usando l'NTA. I risultati di questo studio mostrano che NTA è in grado di rilevare in modo efficiente la nanocristalluria negli adulti sani. Questi risultati suggeriscono che l'NTA potrebbe essere un prezioso metodo di diagnosi precoce della nanocristalluria nei pazienti con malattia da calcoli renali.
Introduction
I cristalli urinari si formano quando l'urina diventa supersatura di minerali. Questo può verificarsi in individui sani ma è più comune negli individui con calcoli renali1. La presenza e l'accumulo di cristalli urinari può aumentare il rischio di sviluppare un calcolo renale. In particolare, ciò si verifica quando i cristalli si legano alla placca di Randall, nucleato, si accumulano e crescono neltempo 2,3,4. Crystalluria precede la formazione di calcoli renali e la valutazione dei cristalli può avere un valore predittivo nei calcoli renaliex 3,5. Nello specifico, è stato suggerito che i cristalli siano utili per prevedere il rischio di recidiva della pietra in pazienti con una storia di ossalato di calcio contenentepietre 6,7.
È stato riferito che i cristalli hanno un impatto negativo sulla funzione epiteliale renale e sulle cellule immunitariecircolanti 8,9,10,11,12,13. È stato precedentemente riferito che i monociti circolanti da ex calcoli renali di ossalato di calcio (CaOx) hanno soppresso la bioenergetica cellulare rispetto agli individui sani14. Inoltre, i cristalli caOx riducono i bioenergetici cellulari e interrompono l'omeostasi redox nei monociti8. Il consumo di pasti ricchi di ossalato può causare cristalli che potrebbero causare danni tubuli renali e alterare la produzione e la funzione di macromolecole urinarie protettive contro la formazione di calcolirenali 15,16. Diversi studi hanno dimostrato che i cristalli urinari possono variare per forma e dimensioni a seconda del pH e della temperatura delle urine17,18,19. Inoltre, le proteine urinarie hanno dimostrato di modulare il comportamento cristallino20. Daudonet al. Alcuni metodi convenzionali attualmente disponibili per valutare la presenza di cristalli includono microscopia polarizzata21,22,microscopia elettronica23,contatori di particelle3,filtrazione delle urine24,evaporazione3,5 o centrifugazione21. Questi studi hanno fornito preziose informazioni sul campo di calcoli renali per quanto riguarda i cristalli. Tuttavia, una limitazione di questi metodi è stata l'incapacità di visualizzare e quantificare cristalli di dimensioni inferiori a 1 μm. Cristalli di queste dimensioni possono influenzare la crescita delle pietre CaOx attaccandosi alla placca di Randall.
È stato dimostrato che i nanocristalli causano lesioni estese alle cellule renali rispetto ai microcristalli più grandi25. La presenza di nanocristalli è stata segnalata nelle urine utilizzando un analizzatore di nanoparticelle26,27. Recenti studi hanno utilizzato sonde bisfosfato etichettate fluorescentmente (alendronato-fluoresceina/alendronato-Cy5) per esaminare i nanocristalli usando citometria a flusso su scala nanometrica28. La limitazione di questo colorante è che non è specifico e si legherà a quasi tutti i tipi di pietre tranne la cisteina. Pertanto, valutare con precisione la presenza di nanocristalli negli individui può essere uno strumento efficace per diagnosticare i cristalli e / o prevedere il rischio di pietra. Lo scopo di questo studio era quello di rilevare e quantificare il calcio contenente nanocristalli (<1 μm di dimensioni) utilizzando l'analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA). Per raggiungere questo obiettivo, la tecnologia NTA è stata utilizzata in combinazione con un fluorofore legante il calcio, Fluo-4 AM per rilevare e quantificare il calcio contenente nanocristalli nelle urine di adulti sani.
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Protocol
Tutti gli esperimenti delineati in questo lavoro sono stati approvati dall'University of Alabama at Birmingham (UAB) Institutional Review Board. Gli adulti sani (33,6 ± 3,3 anni; n=10) sono stati iscritti allo studio se avevano un normale pannello metabolico completo del sangue, consumatori non di tabacco, non in gravidanza, un IMC tra 20-30 kg / m2e privo di condizioni mediche croniche o malattie acute. I partecipanti sani hanno firmato un modulo di consenso informato scritto prima dell'inizio dello studio.
1. Protocollo clinico e raccolta delle urine
- Chiedere ai partecipanti di consumare una dieta a basso contenuto di ossalati preparata dal Nucleo di Bionutrizione dell'UAB Center for Clinical and Translational Sciences per 3 giorni e veloce durante la notte prima di raccogliere le urine (campione di 24 ore).
- Il giorno seguente, i partecipanti restituiscono il loro campione di urina 24 ore su 24 (pre-ossalato) prima di consumare un carico ossalato (frullato contenente frutta e verdura, ~8 mM ossalato). Chiedere ai partecipanti di raccogliere successivamente l'urina per 24 ore (campione post-ossalato) e restituire l'urina il giorno seguente.
- Mantenere tutti i campioni di urina a temperatura ambiente (RT) prima della lavorazione, come descritto di seguito e mostrato nella figura 1.
2. Trattamento delle urine
NOTA: Tutti i materiali e le attrezzature utilizzati sono elencati nella tabella dei materiali.
ATTENZIONE: Indossare dispositivi di protezione individuale in ogni momento durante la manipolazione di campioni clinici e reagenti. In particolare, guanti, occhiali per il viso e gli occhi, protezione respiratoria e indumenti protettivi.
- Misurare e registrare il pH e il volume delle urine. Mescolare accuratamente prima di aggiungere 50 ml di urina in un tubo conico sterile etichettato da 50 ml.
- Campione di centrifuga a 1200 x g per 10 minuti a RT utilizzando una centrifuga da banco.
NOTA: Conservare il campione a RT per evitare un'ulteriore formazione di cristalli poiché le temperature più fredde possono favorire la cristallizzazione. - Scartare il supernatante e lavare e rimescolare nuovamente il pellet con 5 mL di etanolo al 100%. Centrifugare il campione a 1200 x g per 10 minuti a RT utilizzando una centrifuga da banco.
- Scartare il supernatante e resospendare il pellet in 1 mL di etanolo al 100%. Conservare il campione a -20 °C per una successiva lavorazione o macchiare il campione come descritto di seguito.
NOTA: Non vi è alcuna differenza significativa nei punti dati (cioè dimensione/concentrazione delle particelle) tra campioni immagazzinati o appena macchiati.
3. Analisi del tracciamento delle nanoparticelle (NTA)
- Preparazione del campione
- Nanoparticelle d'oro: usa nanoparticelle d'oro per ottimizzare le impostazioni sullo strumento. Diluire nanoparticelle d'oro di dimensioni 100 nm 1:1000 in acqua ultrapura.
- Urina Umana: Diluire campioni di urina 20 volte in acqua prima di colorazione con 5 mM Fluo-4 AM (un colorante a fluorescenza calcio) per 30 min al buio. Analizzare i campioni utilizzando NTA.
- Preparare cristalli di ossalato di calcio (CaOx) come descritto in precedenza29. Diluire la soluzione stock da 10 mM (14,6 mg in 10 mL di acqua) a 50 μM in acqua e macchiare i campioni diluiti utilizzando 5 mM Fluo-4 AM per 30 minuti al buio prima dell'analisi.
- Cristalli di fosfato di calcio (CaP): diluire la soluzione stock di 10 mM (50,4 mg in 10 mL di acqua) a 50 μM in acqua e macchiare i campioni diluiti utilizzando 5 mM Fluo-4 AM per 30 minuti al buio prima dell'analisi NTA.
- Configurazione dello strumento, impostazioni della fotocamera e raccolta dati
NOTA: l'impostazione del computer e dello strumento utilizzata per questo metodo è illustrata nella figura 2.- Accendere il computer e quindi lo strumento. Aprire il software e accendere la fotocamera.
- Una volta aperta la finestra del software, fare clic sull'icona di acquisizione nell'angolo in alto a sinistra della finestra per avviare la modalità di acquisizione. L'inizializzazione della fotocamera richiede alcuni secondi.
- Pulire la piattaforma pompando prima aria utilizzando una siringa da 1 ml fino a quando la piattaforma non appare pulita. Aggiungere delicatamente acqua all'apparecchio 2-3 volte utilizzando un'altra siringa da 1 ml per rimuovere eventuali bolle d'aria.
NOTA: Cerca eventuali bolle d'aria nella piattaforma e nei tubi. È importante non avere bolle in tutto l'apparato prima e durante l'esecuzione dei campioni. Se sono presenti bolle, pulire nuovamente la piattaforma con aria e acqua. - Una volta che la piattaforma è pulita, aggiungere acqua per verificare la presenza di eventuali contaminazioni sulla superficie visualizzando la fotocamera. Successivamente, aggiungere nanoparticelle d'oro come controllo all'iniettore della pompa di carico del campione per impostare lo strumento.
- Regolare il livello della fotocamera sullo schermo o sulla manopola sul lato destro dello strumento fino a quando l'immagine inizia a visualizzare pixel colorati e quindi ridurre il livello della fotocamera.
- Quindi regola lo schermo per ottimizzare l'immagine. Fare clic con il pulsante sinistro del mouse sull'immagine video. Tenere premuto il pulsante sinistro del mouse e trascinare l'immagine su e giù per ottenere l'intera visualizzazione.
NOTA: L'obiettivo e il filtro normali della fotocamera vengono utilizzati per valutare nanoparticelle d'oro e campioni non contaminati. - Impostare la velocità di infusione e mettere a fuoco la fotocamera in modo che le nanoparticelle d'oro siano visibili sullo schermo della fotocamera. Impostare la velocità di infusione su alta (cioè 500 μL/min) per l'installazione iniziale per garantire che vengano rilevate le nanoparticelle d'oro. Una volta rilevato, ridurre la velocità a 50 μL/min.
- Regolare il livello della fotocamera per visualizzare le particelle. Per i campioni non macchiati, regola il guadagno dello schermo al livello 5 per ottenere la messa a fuoco della fotocamera e imposta il livello della fotocamera su 8. Una volta impostato lo stato attivo, registrare il campione (cioè 1 misurazione solo per 60 secondi).
NOTA: La messa a fuoco e la velocità di flusso continua sono importanti per ottenere immagini chiare e nitide delle particelle per il conteggio. - Dopo l'ottimizzazione, pulire nuovamente l'apparecchio con acqua prima di valutare i campioni. Visualizzare la fotocamera per assicurarsi che il tubo sia pulito e che le particelle non siano presenti.
NOTA: Lavare la camera tra ogni campione fino a quando la fotocamera non rileva particelle. - Per analizzare campioni macchiati, regolare la fotocamera in base alla posizione del filtro contenente il filtro fluorescente adatto. Caricare campioni diluiti e macchiati sull'iniettore della pompa di carico del campione e ridurre la velocità a 20 μL/min per l'analisi del campione.
- Quindi regola il guadagno dello schermo e il livello della fotocamera in quanto questi sono parametri importanti. Per i campioni macchiati (fluorescenti), impostare il guadagno dello schermo su 5 e il livello della fotocamera al livello 13.
NOTA: questi parametri variano in base al tipo di campione e ogni campione dovrà essere ottimizzato per ottenere messa a fuoco. - Usa la misurazione standard per misurare i campioni per 5 acquisizioni per campione in cui una durata di acquisizione è di 60 secondi.
- Salvare e archiviare i dati dopo ogni misurazione. Il software salverà file di immagini e video per ogni misurazione. Il software fornisce dati di output (ad esempio, dimensioni del cristallo: 10 nM - 1000 nM e concentrazione) sia in formato excel che pdf.
- Calcola il numero medio di nanoparticelle per tutte e 5 le letture per ogni singolo campione. Analizzare i dati utilizzando la deviazione standard o l'errore standard della media e utilizzare i test t per l'analisi accoppiata.
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Representative Results
I risultati di questo studio mostrano che l'NTA è in grado di rilevare in modo efficiente le dimensioni medie e la concentrazione di calcio contenente nanocristalli urinari nelle urine umane. Questo è stato ottenuto usando l'analisi del fluoroforo, fluo-4 AM e tracciamento delle nanoparticelle. Fluo-4 AM è stato in grado di legarsi sia ai cristalli CaOx che CaP. Come mostrato nella figura 3A, i cristalli di CaOx sono stati determinati in dimensioni compresa tra 50 e 270 nm e hanno una concentrazione media di 1,26 x 109 particelle/mL. I cristalli cap avevano dimensioni compresa tra 30 e 225 nm e avevano una concentrazione media di 2,22 x 109 particelle/mL (Figura 3B). Per determinare se l'NTA potesse valutare i nanocristalli nelle urine umane, agli adulti sani è stato chiesto di consumare una dieta ossatalata controllata seguita da un elevato carico di ossalato. 24 ore di campioni di urina prima e dopo il carico sono stati raccolti per valutare le dimensioni e la concentrazione nanocristalelle urinarie. I campioni di urina pre-ossalato contenevano alcuni nanocristalli urinari (1,65 x 108 ± 3,29 x 107 particelle/mL) tra 110-300 nm(figura 4). Per contro, si è registrato un aumento significativo (p<0.0001) dei nanocristalli urinari presenti nei campioni post-ossalati (7,05 x 108 ± 1,08 x 108 particelle/mL; 100-320 nm)(figura 4). Per confermare la riproducibilità del metodo, i campioni sono stati misurati tre volte e non vi sono state variazioni significative nelle repliche tecniche (Figura 5).
Figura 1: Protocollo per l'isolamento e la colorazione di nanocristalli urinari umani. Fare clic qui per visualizzare una versione più ampia di questa figura.
Figura 2: Descrizione dell'analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA). (A) Computer e strumento utilizzati per questi studi. (B) I campioni vengono iniettati in un tubo di ingresso utilizzando una pompa per siringhe a velocità continua prima di riempire la superficie ottica. I campioni vengono quindi osservati dall'obiettivo e acquisiti dalla fotocamera mentre i campioni scorrono attraverso la piattaforma prima di uscire attraverso i tubi di uscita da scartare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: L'NTA rileva i cristalli di ossalato di calcio (CaOx) e fosfato di calcio (CaP) fluo-4 AM. Grafici rappresentativi deicristalliCaOx e(B)CaP ( A ) rappresentativi che mostrano la distribuzione e la concentrazione delle dimensioni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: NTA rileva fluo-4 AM etichettati nanocristalli urinari umani di 24 ore. Grafico rappresentativo dei nanocristalli urinari etichettati Fluo-4 AM in campioni pre-ossalati e post-ossalati 24 ore su 24 da un adulto sano con una dieta ossatalata controllata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Repliche tecniche di nanocristalli umani nelle raccolte di urina 24 ore su 24 utilizzando NTA. Repliche tecniche di nanocristalli urinari etichettati Fluo-4 AM in campioni post-ossalati(A)pre-ossatalati e(B)post-ossalati di un adulto sano con una dieta ossalata controllata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
L'NTA è stata utilizzata nel presente studio per valutare i nanocristalli nelle urine umane utilizzando una sonda legante il calcio, Fluo-4 AM. Non esiste un metodo standard disponibile per rilevare i nanocristalli nelle urine. Alcuni gruppi di ricerca hanno rilevato nanocristalli nelle urine e si sono affidati all'uso di ampi protocolli o metodi che sono limitati nella loro capacità di quantificarei campioni 27,28. Questo studio mostra un metodo specifico e sensibile per rilevare il calcio contenente nanocristalli nelle urine degli esseri umani che hanno partecipato a uno studio alimentare che consisteva nell'ingerire un elevato carico di ossalato. La quantità di ossalato consumato era equivalente al consumo reale di ossalato (ad esempio, 1/2 insalata di spinaci).
NTA è uno strumento ad alta risoluzione ben caratterizzato che utilizza il moto browniano per misurare le particelle nellasoluzione 30. È stato utilizzato per valutare nanoparticelle biologiche in una varietà di campioni biologici31,32,33. Inoltre, l'NTA può prevedere con precisione le dimensioni e la concentrazione di particelle in qualsiasi tipo di campione biologico. Questo metodo non richiede alcuna etichettatura; tuttavia, l'etichettatura può essere utilizzata per rilevare particelle specifiche. Fluo-4 AM è stato utilizzato in questo studio per rilevare in modo efficiente e specifico il calcio contenente nanocristalli nei campioni di urina. Le sonde fluorescenti di calcio sono state inizialmente utilizzate per misurare il calcio citosolicolibero 34. Fluo-4 è un analogo di Fluo-3 la cui fluorescenza aumenta >100 volte al legame con il calciolibero 35. Inoltre, Fluo-4 ha dimostrato di valutare le particelle di calcio nel fluido sinoviale dei pazienti con artrite usando citometria a flusso36. Pertanto, abbiamo usato Fluo-4 AM per questi studi.
Tutti i campioni sono stati continuamente iniettati nella piattaforma per un rilevamento accurato. La determinazione della concentrazione e della dimensione delle particelle dipende dalla portata, in quanto una portata elevata (cioè 50 μL/min) può influire su una valutazione accurata della concentrazione, nonché sulla dimensione delle particelle rispetto a un'impostazione statica e a una portata inferiore (cioè 20 μL/min)37. Pertanto, una portata lenta costante fornisce una misurazione accurata del numero di particelle presenti nei campioni. Altri parametri importanti che potrebbero influire sul conteggio e sulle dimensioni delle particelle includono il livello della fotocamera, la soglia di rilevamento e lostato attivo 38,39,40. Una misurazione costante delle particelle nei campioni (CV circa il 20%) è stato osservato nello studio attuale, che è stato coerente con i risultati di un altrostudio 39. Infine, la presenza di nanocristalli nelle urine umane è stata confermata utilizzando la microscopia elettronica29. Questa ricerca dimostra che l'NTA può misurare con successo i nanocristalli urinari dall'uomo.
Un vantaggio di questo protocollo è l'uso di Fluo-4 AM per valutare le particelle contenenti calcio in soluzione. Un altro vantaggio è la variabilità minima osservata nel rilevamento dei nanocristalli all'interno dei campioni. Una limitazione dell'NTA in questo contesto, è l'incapacità di distinguere la morfologia dei nanocristalli. Tuttavia, questo metodo potrebbe essere utile per rilevare i cristalli per prevedere il rischio di pietra in individui con una storia di calcoli renali contenenti calcio. Questo protocollo non può sostituire le metodologie attuali, ma può fornire nuove informazioni sui nanocristalli urinari. L'uso dell'NTA per valutare i cristalli contenenti calcio urinario è un nuovo approccio che dovrebbe evidenziare l'importanza della nanocristalluria oltre la microscopia standard e i metodi sopra menzionati. Ulteriori indagini sono necessarie per esplorare l'affidabilità di questo metodo nella popolazione di calcoli renali.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano tutti i partecipanti allo studio e l'UAB CCTS Bionutrition Core e uab High Resolution Imaging Service Center per i loro contributi. Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni NIH DK106284 e DK123542 (TM) e UL1TR003096 (Centro nazionale per l'avanzamento delle scienze traslazionali).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Benchtop Centrifuge | Jouan Centrifuge | CR3-12 | |
| Calcium Oxalate monohydrate | Synthesized in the lab as previously described29. | Store at RT; Stock 10 mM | |
| Calcium Phosphate crystals (hydroxyapatite nanopowder) | Sigma | 677418 | Store at RT; Stock 10 mM |
| Ethanol | Fischer Scientific | AC615095000 | Store at RT; Stock 100% |
| Fluo-4 AM* | AAT Bioquest, Inc. | 20550 | Store at Freezer (-20°C); Stock 5 mM |
| Gold Nanoparticles | Sigma | 742031 | Store at 2-8°C |
| NanoSight Instrument | Malvern Instruments, UK | NS300 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 98-4730 | |
| Virkon Disinfectant | LanXESS Energizing Company, Germany | LSP | |
| *Fluorescence dyes are light sensitive; stock and aliquots should be stored in the dark at -20°C. |
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