Summary
El objetivo de este estudio fue determinar si el análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) podría detectar y cuantificar el calcio urinario que contiene nanocristales de adultos sanos. Los hallazgos del estudio actual sugieren que NTA podría ser una herramienta potencial para estimar nanocristales urinarios durante la enfermedad por cálculos renales.
Abstract
Los cálculos renales son cada vez más frecuentes en todo el mundo en adultos y niños. El tipo más común de cálculos renales se compone de cristales de oxalato de calcio (CaOx). La cristaluria ocurre cuando la orina se sobresatura con minerales (por ejemplo, calcio, oxalato, fosfato) y precede a la formación de cálculos renales. Los métodos estándar para evaluar la cristaluria en formadores de piedra incluyen microscopía, filtración y centrifugación. Sin embargo, estos métodos detectan principalmente microcristales y no nanocristales. Se ha sugerido que los nanocristales son más dañinos para las células epiteliales renales que los microcristales in vitro. Aquí, se describe la capacidad del análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) para detectar nanocristales urinarios humanos. Alimentaron a los adultos sanos una dieta controlada del oxalato antes de beber una carga del oxalato para estimular nanocrystals urinarios. La orina fue recogida por 24 horas antes y después de la carga del oxalato. Las muestras fueron procesadas y lavadas con etanol para purificar las muestras. Los nanocrystals urinarios fueron manchados con el fluoróforo obligatorio del calcio, Fluo-4. Después de la coloración, el tamaño y la cuenta de nanocristales fueron determinados usando NTA. Los hallazgos de este estudio muestran que NTA puede detectar de manera eficiente la nanocristaluria en adultos sanos. Estos hallazgos sugieren que NTA podría ser un método temprano valioso de la detección de nanocrystalluria en pacientes con enfermedad de la piedra de riñón.
Introduction
Los cristales urinarios se forman cuando la orina se sobresatura con minerales. Esto puede ocurrir en individuos sanos pero es más común en individuos con cálculos renales1. La presencia y acumulación de cristales urinarios puede aumentar el riesgo de desarrollar un cálculo renal. Específicamente, esto ocurre cuando los cristales se unen a la placa de Randall, se nuclean, se acumulan y crecen con el tiempo2,3,4. La cristaluria precede a la formación de cálculos renales y la evaluación de la cristaluria puede tener valor predictivo en formadores de cálculos renales3,5. Específicamente, se ha sugerido que la cristaluria es útil para predecir el riesgo de recurrencia de la piedra en pacientes con antecedentes de oxalato de calcio que contiene piedras6,7.
Se ha informado que los cristales tienen un impacto negativo en la función de las células inmunes renales epiteliales y circulantes8,9,10,11, 12,13. Se ha relatado previamente que los monocitos circulantes de oxalato de calcio (CaOx) formadores de cálculos renales han suprimido la bioenergética celular en comparación con los individuos sanos14. Además, los cristales de CaOx reducen la bioenergética celular e interrumpen la homeostasis redox en los monocitos8. El consumo de comidas ricas en oxalato puede causar cristaluria que podría conducir a daño renal en el túbulo y alterar la producción y función de macromoléculas urinarias que protegen contra la formación de cálculos renales15,16. Varios estudios han demostrado que los cristales urinarios pueden variar en forma y tamaño dependiendo del pH y la temperatura de la orina17,18,19. Además, se ha demostrado que las proteínas urinarias modulan el comportamiento de los cristales20. Daudon et al.19,propusieron que el análisis de cristaluria podría ser útil en el manejo de pacientes con enfermedad por cálculos renales y en la evaluación de su respuesta a las terapias. Algunos métodos convencionales actualmente disponibles para evaluar la presencia de cristales incluyen microscopía polarizada21,22,microscopía electrónica23,contadores de partículas3,filtración de orina24,evaporación3,5 o centrifugación21. Estos estudios han proporcionado la penetración valiosa al campo de la piedra de riñón con respecto a crystalluria. Sin embargo, una limitación de estos métodos ha sido la incapacidad de visualizar y cuantificar cristales de menos de 1 μm de tamaño. Cristales de este tamaño pueden influir en el crecimiento de las piedras de CaOx mediante la fijación a la placa de Randall.
Se ha demostrado que los nanocristales causan una lesión extensa a las células renales en comparación con los microcristales más grandes25. La presencia de nanocristales se ha reportado en orina utilizando un analizador de nanopartículas26,27. Estudios recientes han utilizado sondas de bisfosfato marcados fluorescentemente (alendronato-fluoresceína/alendronato-Cy5) para examinar nanocristales utilizando citometría de flujo a nanoescala28. La limitación de este tinte es que no es específico y se unirá a casi todos los tipos de piedras excepto la cisteína. Por lo tanto, evaluar con precisión la presencia de nanocristales en individuos puede ser una herramienta eficaz para diagnosticar la cristaluria y/o predecir el riesgo de cálculos. El propósito de este estudio fue detectar y cuantificar nanocristales que contienen calcio (<1 μm de tamaño) utilizando el análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA). Para lograr esto, se utilizó la tecnología NTA en combinación con un fluoróforo de unión al calcio, Fluo-4 AM, para detectar y cuantificar nanocristales que contienen calcio en la orina de adultos sanos.
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Protocol
Todos los experimentos descritos en este trabajo fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Alabama en Birmingham (UAB). Los adultos sanos (33,6 ± 3,3 años; n=10) fueron inscritos en el estudio si tenían un panel metabólico integral de sangre normal, no consumidores de tabaco, no embarazadas, un IMC entre 20-30 kg/m2,y libres de condiciones médicas crónicas o enfermedades agudas. Los participantes sanos firmaron un formulario de consentimiento informado por escrito antes del inicio del estudio.
1. Protocolo clínico y recolección de orina
- Haga que los participantes consuman una dieta baja en oxalato preparada por el Centro de Bionutrición clínica y traslacional de la UAB durante 3 días y ayuno durante la noche antes de recoger su orina (muestra de 24 horas).
- Al día siguiente, haga que los participantes devuelvan su muestra de orina de 24 horas (pre-oxalato) antes de consumir una carga de oxalato (batido que contiene frutas y verduras, ~ 8 mM oxalato). Haga que los participantes recojan posteriormente su orina durante 24 horas (muestra posterior al oxalato) y devuelvan su orina al día siguiente.
- Mantener todas las muestras de orina a temperatura ambiente (RT) antes del procesamiento como se describe a continuación y se muestra en la Figura 1.
2. Procesamiento de orina
NOTA: Todos los materiales y equipos utilizados se enumeran en la Tabla de Materiales.
PRECAUCIÓN: Use equipo de protección personal en todo momento mientras manipula muestras clínicas y reactivos. En concreto, guantes, escudos faciales y oculares, protección respiratoria y ropa protectora.
- Mida y registre el pH y el volumen de la orina. Mezcle bien antes de agregar 50 mL de orina en un tubo cónico estéril etiquetado de 50 mL.
- Muestra de centrífuga a 1200 x g durante 10 min en RT usando una centrífuga de sobremesa.
NOTA: Mantenga la muestra en RT para evitar una mayor formación de cristales, ya que las temperaturas más frías pueden promover la cristalización. - Deseche el sobrenadante y lave y resuspend el pellet de nuevo con 5 mL de etanol al 100%. Centrifugar la muestra a 1200 x g durante 10 minutos en RT utilizando una centrífuga de sobremesa.
- Deseche el sobrenadante y resuspend el pellet en 1 mL de etanol al 100%. Almacene la muestra a -20 °C para su posterior procesamiento O manche la muestra como se describe a continuación.
NOTA: No hay diferencias significativas en los puntos de datos (es decir, tamaño de partícula/concentración) entre las muestras almacenadas o recién teñidas.
3. Análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA)
- Preparación de muestras
- Nanopartículas de oro: Utilice nanopartículas de oro para optimizar la configuración del instrumento. Diluir nanopartículas de oro de 100 nm de tamaño 1:1000 en agua ultrapura.
- Orina humana: Diluya las muestras de orina 20 veces en agua antes de la tinción con 5 mM Fluo-4 AM (un tinte de fluorescencia de calcio) durante 30 minutos en la oscuridad. Analice las muestras utilizando NTA.
- Preparar cristales de oxalato de calcio (CaOx) como se describió anteriormente29. Diluir 10 mM de solución común (14,6 mg en 10 mL de agua) a 50 μM en agua y teñir las muestras diluidas utilizando 5 mM Fluo-4 AM durante 30 min en la oscuridad antes del análisis.
- Cristales de fosfato de calcio (CaP): Diluir 10 mM de solución común (50,4 mg en 10 mL de agua) a 50 μM en agua y teñir las muestras diluidas utilizando 5 mM fluo-4 AM durante 30 min en la oscuridad antes del análisis de NTA.
- Configuración de instrumentos, configuración de la cámara y recopilación de datos
Nota : la configuración de equipo e instrumento utilizado para este método se muestran en la figura 2.- Encienda la computadora y luego el instrumento. Abra el software y encienda la cámara.
- Una vez que la ventana del software está abierta, haga clic en el icono de captura en la esquina superior izquierda de la ventana para iniciar el modo de captura. La inicialización de la cámara tarda unos segundos.
- Limpie la plataforma bombeando primero aire en ella usando una jeringa de 1 ml hasta que la plataforma parezca limpia. Agregue suavemente agua al aparato 2-3 veces usando otra jeringa de 1 ml para eliminar cualquier burbuja de aire.
NOTA: Busque cualquier burbuja de aire en la plataforma, así como en el tubo. Es importante no tener burbujas en todo el aparato antes y mientras se ejecutan las muestras. Si hay burbujas presentes, vuelva a limpiar la plataforma con aire y agua. - Una vez que la plataforma esté limpia, agregue agua para verificar si hay contaminación en la superficie viendo la cámara. A continuación, agregue nanopartículas de oro como control al inyector de la bomba de carga de muestras para configurar el instrumento.
- Ajuste el nivel de la cámara en la pantalla o en la perilla del lado derecho del instrumento hasta que la imagen comience a mostrar píxeles de colores y luego reduzca el nivel de la cámara.
- A continuación, ajuste la pantalla para optimizar la imagen. Haga clic con el botón izquierdo del ratón en la imagen de vídeo. Mantenga pulsado el botón izquierdo del ratón y arrastre la imagen hacia arriba y hacia abajo para obtener toda la vista.
NOTA: La lente y el filtro normales de la cámara se utilizan para evaluar nanopartículas de oro y muestras no manchadas. - Configure la velocidad de infusión y enfoque la cámara para que las nanopartículas de oro sean visibles en la pantalla de la cámara. Establezca la velocidad de infusión en alta (es decir, 500 μL/min) para la configuración inicial para garantizar que se detecten las nanopartículas de oro. Una vez detectado, reduzca la velocidad a 50 μL/min.
- Ajuste el nivel de la cámara para visualizar las partículas. Para muestras no manchadas, ajuste la ganancia de pantalla en el nivel 5 para lograr el enfoque de la cámara y establezca el nivel de la cámara en 8. Una vez establecido el enfoque, registre la muestra (es decir, 1 medición durante 60 segundos solamente).
NOTA: El enfoque y la velocidad de flujo continuo son importantes para obtener imágenes claras y nítidas de las partículas para contar. - Después de la optimización, limpie el aparato de nuevo con agua antes de evaluar las muestras. Vea la cámara para asegurarse de que el tubo está limpio y las partículas no están presentes.
NOTA: Lave la cámara entre cada muestra hasta que la cámara no detecte partículas. - Para analizar las muestras teñidas, ajuste la cámara a la posición del filtro que contiene el filtro fluorescente adecuado. Cargue muestras diluidas y teñidas en el inyector de la bomba de carga de la muestra y reduzca la velocidad a 20 μL/min para el análisis de la muestra.
- A continuación, ajuste la ganancia de pantalla y el nivel de la cámara, ya que estos son parámetros importantes. Para muestras teñidas (fluorescentes), establezca la ganancia de pantalla en 5 y el nivel de la cámara en el nivel 13.
Nota : estos parámetros variarán en función del tipo de muestra y cada muestra deberá optimizarse para obtener el foco. - Utilice la medición estándar para medir las muestras para 5 capturas por muestra, donde una duración de captura es de 60 segundos.
- Guarde y almacene los datos después de cada medición. El software guardará archivos de imagen y video para cada medición. El software proporciona datos de salida (por ejemplo, tamaño del cristal: 10 nM - 1000 nM y concentración) en formatos excel y pdf.
- Calcule el número promedio de nanopartículas para las 5 lecturas de cada muestra individual. Analice los datos utilizando la desviación estándar o el error estándar de la media y utilice pruebas t para el análisis emparejado.
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Representative Results
Los hallazgos de este estudio muestran que NTA puede detectar eficientemente el tamaño medio y la concentración de calcio que contiene nanocristales urinarios en la orina humana. Esto se logró mediante el uso del fluoróforo, Fluo-4 AM, y el análisis de seguimiento de nanopartículas. Fluo-4 AM fue capaz de unirse a los cristales de CaOx y CaP. Como se muestra en la Figura 3A,se determinó que los cristales de CaOx tenían un tamaño de entre 50-270 nm y una concentración media de 1,26 x 109 partículas/mL. Los cristales de CaP tenían entre 30-225 nm de tamaño y tenían una concentración media de 2,22 x 109 partículas/mL(Figura 3B). Para determinar si NTA podría evaluar nanocrystals en orina humana, pidieron los adultos sanos consumir una dieta controlada del oxalato seguida por una alta carga del oxalato. Veinticuatro muestras de orina de horas antes y después de la carga fueron recogidas para evaluar tamaño y la concentración urinarios del nanocrystal. Las muestras de orina pre-oxalato contenían algunos nanocristales urinarios (1,65 x10 8 ± 3,29 x10 7 partículas/mL) entre 110-300 nm(Figura 4). Por el contrario, hubo un aumento significativo (p<0,0001) en nanocristales urinarios presentes en muestras post-oxalato (7,05 x 108 ± 1,08 x 108 partículas/mL; 100-320 nm) (Figura 4). Para confirmar la reproducibilidad del método, las muestras se midieron tres veces y no hubo variación significativa en las réplicas técnicas (Figura 5).
Figura 1:Protocolo para aislar y teñir nanocristales urinarios humanos. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 2: Descripción del análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA). (A) Configuración de la computadora y el instrumento utilizado para estos estudios. (B) Las muestras se inyectan en un tubo de entrada utilizando una bomba de jeringa a una velocidad continua antes de llenar la superficie óptica. Las muestras son luego observadas por la lente objetivo y capturadas por la cámara a medida que las muestras fluyen a través de la plataforma antes de salir a través del tubo de salida para ser desechadas. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 3:NTA detecta cristales de oxalato de calcio (CaOx) y fosfato de calcio (CaP) marcados con Fluo-4 AM. Gráficos representativos de cristales de(A)CaOx y(B)CaP que muestran la distribución del tamaño y la concentración. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 4:NTA detecta nanocristales urinarios humanos de 24 horas marcados con Fluo-4 AM. Gráfico representativo de Fluo-4 AM etiquetado nanocristales urinarios en muestras de 24 horas de pre-oxalato y post-oxalato de un adulto sano en una dieta controlada de oxalato. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 5: Réplicas técnicas de nanocristales humanos en colecciones de orina de 24 horas utilizando NTA. Réplicas técnicas de fluo-4 AM etiquetados nanocristales urinarios en 24 horas(A)pre-oxalato y(B)post-oxalato muestras de un adulto sano en una dieta controlada de oxalato. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
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Discussion
NTA se ha utilizado en el actual estudio para evaluar nanocrystals en orina humana usando una punta de prueba obligatoria del calcio, Fluo-4 AM. No hay un método estándar disponible para detectar nanocristales en la orina. Algunos grupos de investigación han detectado nanocristales en la orina y se han basado en el uso de extensos protocolos o métodos que son limitados en su capacidad para cuantificar las muestras27,28. Este estudio muestra un método específico y sensible para detectar el calcio que contiene los nanocrystals en la orina de los seres humanos que participaron en un estudio dietético de alimentación que consistió en injerir una alta carga del oxalato. La cantidad de oxalato consumida fue equivalente al consumo en el mundo real de oxalato (por ejemplo, ensalada de espinacas de 1/2).
NTA es una herramienta de alta resolución bien caracterizada que utiliza el movimiento browniano para medir partículas en la solución30. Se ha utilizado para evaluar nanopartículas biológicas en una variedad de muestras biológicas31,32,33. Además, NTA puede predecir con precisión el tamaño y la concentración de partículas en cualquier tipo de muestra biológica. Este método no requiere ningún etiquetado; sin embargo, el etiquetado se puede utilizar para detectar partículas específicas. Fluo-4 AM se utilizó en este estudio para detectar de manera eficiente y específica nanocristales que contienen calcio en muestras de orina. Las sondas fluorescentes de calcio se utilizaron inicialmente para medir el calcio citosólico libre34. Fluo-4 es un análogo de Fluo-3 cuya fluorescencia aumenta >100 veces al unirse al calcio libre35. Además, fluo-4 se ha demostrado para evaluar las partículas de calcio en el líquido sinovial de pacientes con artritis mediante citometría de flujo36. Por lo tanto, se utilizó Fluo-4 AM para estos estudios.
Todas las muestras se inyectaron continuamente en la plataforma para una detección precisa. La determinación de la concentración y el tamaño de partícula depende del caudal, ya que un caudal alto (es decir, 50 μL/min) puede afectar a una evaluación precisa de la concentración, así como al tamaño de partícula en comparación con un entorno estático y un caudal más bajo (es decir, 20 μL/min)37. Por lo tanto, un caudal lento constante proporciona una medición precisa del número de partículas presentes en las muestras. Otros parámetros importantes que pueden afectar el número y el tamaño de las partículas incluyen el nivel de la cámara, el umbral de detección y el enfoque38,39,40. Una medición consistente de partículas en muestras (CV aprox. 20%) se observó en el presente estudio, que fue consistente con los hallazgos de otro estudio39. Por último, la presencia de nanocristales en la orina humana se ha confirmado mediante microscopía electrónica29. Esta investigación demuestra que NTA puede medir con éxito los nanocristales urinarios de los seres humanos.
Una ventaja de este protocolo es el uso de Fluo-4 AM para evaluar partículas que contienen calcio en solución. Otra ventaja es la mínima variabilidad observada en la detección de nanocristales dentro de las muestras. Una limitación de NTA en este ajuste, es la inhabilidad de distinguir la morfología de nanocrystals. Sin embargo, este método podría ser beneficioso para detectar la cristaluria para predecir el riesgo de cálculos en individuos con antecedentes de calcio que contiene cálculos renales. Este protocolo no puede substituir metodologías actuales pero puede proporcionar la nueva penetración sobre nanocrystals urinarios. El uso de NTA para evaluar el calcio urinario que contiene cristales es un acercamiento nuevo que debe destacar la importancia del nanocrystalluria más allá de microscopia y de métodos estándar mencionados arriba. Las investigaciones adicionales se autorizan para explorar la confiabilidad de este método en la población de la piedra de riñón.
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Disclosures
Los autores declaran que no hay conflictos de intereses.
Acknowledgments
Los autores agradecen a todos los participantes del estudio y al Núcleo de Bionutrición CCTS de la UAB y al Centro de Servicio de Imágenes de Alta Resolución de la UAB por sus contribuciones. Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de los NIH DK106284 y DK123542 (TM), y UL1TR003096 (Centro Nacional para el Avance de las Ciencias Traslacionales).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Benchtop Centrifuge | Jouan Centrifuge | CR3-12 | |
| Calcium Oxalate monohydrate | Synthesized in the lab as previously described29. | Store at RT; Stock 10 mM | |
| Calcium Phosphate crystals (hydroxyapatite nanopowder) | Sigma | 677418 | Store at RT; Stock 10 mM |
| Ethanol | Fischer Scientific | AC615095000 | Store at RT; Stock 100% |
| Fluo-4 AM* | AAT Bioquest, Inc. | 20550 | Store at Freezer (-20°C); Stock 5 mM |
| Gold Nanoparticles | Sigma | 742031 | Store at 2-8°C |
| NanoSight Instrument | Malvern Instruments, UK | NS300 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 98-4730 | |
| Virkon Disinfectant | LanXESS Energizing Company, Germany | LSP | |
| *Fluorescence dyes are light sensitive; stock and aliquots should be stored in the dark at -20°C. |
References
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