Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Aktivitet av bakre laterale linje afferent nevroner under svømming i sebrafisk

Published: February 10, 2021 doi: 10.3791/62233
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biology, University of Florida, The Whitney Laboratory for Marine Bioscience

Summary

Vi beskriver en protokoll for å overvåke endringer i den afferente nevronaktiviteten under motorkommandoer i et modell virveldyrhårcellesystem.

Abstract

Sensoriske systemer samler signaler som er avgjørende for å styre atferd, men dyr må tyde hvilken informasjon som er biologisk relevant. Locomotion genererer reafferent signaler om at dyr må disentangle fra relevante sensoriske signaler i omgivelsene. For eksempel, når en fisk svømmer, oppdages strømning generert fra kroppsunduleringer av mekanoreceptive nevromasser, som består av hårceller, som komponerer sidelinjen. Hårcellene overfører deretter væskebevegelsesinformasjon fra sensoren til hjernen via de sensoriske afferente nevronene. Samtidig sendes korollær utladning av motorkommandoen til hårceller for å forhindre sensorisk overbelastning. Å ta hensyn til den hemmende effekten av prediktive motorsignaler under bevegelse er derfor kritisk når man vurderer følsomheten til sidelinjesystemet. Vi har utviklet en in vivo elektrofysiologisk tilnærming for samtidig å overvåke bakre lateral linje afferent neuron og ventral motorrotaktivitet i sebrafisk larver (4-7 dager etter befruktning) som kan vare i flere timer. Ekstracellulære opptak av afferente nevroner oppnås ved hjelp av den løse patchklemmeteknikken, som kan oppdage aktivitet fra enkle eller flere nevroner. Ventrale rotopptak utføres gjennom huden med glasselektroder for å oppdage motorisk nevronaktivitet. Vår eksperimentelle protokoll gir potensial til å overvåke endogene eller fremkalte endringer i sensorisk inngang på tvers av motorisk atferd i en intakt, oppførende virveldyr.

Introduction

Afferent nevroner av mekanosensoriske systemer overfører informasjon fra hårceller til hjernen under hørsel og balanse. Elektrofysiologi kan avsløre følsomheten til afferente nevroner gjennom direkte opptak. Selv om det kan være utfordrende å lappe hele celler fra hårceller, er det enklere å registrere fra nedstrøms afferente nevroner og tillater vurdering av handlingspotensialer som svar på kontrollerte stimuleringer1,2,3. Stimulerende hårceller fører til avbøyning, som endrer mekanosensoriske strukturer, og utløser dermed en økning i virkningspotensialer (pigger) i afferent nevroner4,5,6. I fravær av ytre stimuli øker afferente nevroner også spontant på grunn av glutamatlekkasje fra hårcellene til afferent postsynaptiske terminaler7,8, og har vist seg å bidra til å opprettholde følsomhet9,10. Patch klemme registrering av afferent aktivitet muliggjør observasjon av hårcelle følsomhet og signaldynamikk som ikke er mulig ved hjelp av teknikker med lavere temporal oppløsning, for eksempel i mikrofonikk11,12 eller funksjonell kalsiumavbildning13,14,15. Følgende protokoll vil tillate opptak av afferent aktivitet samtidig med motorkommandoer for å avsløre øyeblikkelige endringer i hårcellefølsomhet.

Sebrafisk (Danio rerio) bruker hårceller som finnes i nevromasser som komponerer laterallinjesystemet for å oppdage vannbevegelse i forhold til kroppen, som oversettes til nevrale signaler som er avgjørende fornavigasjon 16,17,18, rovdyrunngåelse, byttedyr fange19,20og skolegang21. Vannstrømmen kan også selvgenereres av bevegelsene til svømming22,23,24, åndedrett22,25,26og fôring27. Disse atferdene består av repeterende bevegelser som kan tretthet hårceller og svekke sensing. Derfor er det kritisk at sidelinjen systemet skiller mellom ekstern (exafferent) og selvgenerert (reafferent) strømning stimuli. En korollær utslipp demper selvgenererte strømningssignaler under bevegelse i sebrafisk. Dette hemmende prediktive motorsignalet videresendes via synkende nevroner til sensoriske reseptorer for å endre inngangen eller avbryte behandlingen av den reafferente tilbakemeldingen28,29. Seminalarbeid som bidro til vår tidlige forståelse av dette feedforward-systemet, stolte på in vitro-preparater der tilkoblings- og endogene aktiviteten til nevralkretsen ikke ble opprettholdt28,30,31,32,33,34,35. Denne protokollen beskriver en tilnærming til å bevare en intakt nevral krets der endogen tilbakemeldingsdynamikk opprettholdes og dermed muliggjør bedre forståelse av korollær utslipp in vivo.

Protokollen som er skissert her beskriver hvordan man overvåker bakre laterallinje afferent neuron og motorisk nevronaktivitet samtidig i larval sebrafisk. Karakterisering av afferent signaldynamikk før, under og etter motoriske kommandoer gir innsikt i sanntid, endogen tilbakemelding fra sentralnervesystemet som modulerer hårcellefølsomhet under bevegelse. Denne protokollen skisserer hvilke materialer som må utarbeides før eksperimenter, og beskriver deretter hvordan man lammer og forbereder sebrafisk larver. Protokollen vil beskrive hvordan man etablerer en stabil løs patch opptak av afferent nevroner og ekstracellulær ventral rot (VR) opptak av motoriske nevroner. Representative data som kan fås ved hjelp av denne protokollen presenteres fra en eksemplarisk person og analyse ble utført på flere replikeringer av den eksperimentelle protokollen. Forhåndsbehandling av data utføres ved hjelp av tilpassede skriftlige skript i MATLAB. Totalt sett er dette in vivo eksperimentelle paradigmet klar til å gi en bedre forståelse av sensorisk tilbakemelding under bevegelse i et modell vertebrathårcellesystem.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

All dyrepleie og eksperimenter ble utført i samsvar med protokoller godkjent av University of Floridas Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Fremstilling av materialer for elektrofysiologiske opptak

  1. Lag en silikon elastomerbunnet opptaksfat.
    1. Dispenser et tynt lag med selvblandende silikonelastomerkomponenter (f.eks. Sylgard) i en dekselglassbunnet vevskulturrett til den nivåer med kanten av grunne brønner. Ca. 0,5 ml er tilstrekkelig.
    2. Dekk og herd retten i minst 48 timer ved romtemperatur.
  2. Lag disseksjonspinner.
    1. Gi en negativ ladning (5 V) til et 100 ml beger av etchant (3M KOH) ved hjelp av en DC strømforsyning og fest en wolframtråd (0,002 tommer; 50,8 μm diameter) til den positivt ladede utgangen.
      FORSIKTIG: Negative og positive ledninger bør ikke komme i kontakt med hverandre under denne prosedyren, da du kan risikere å produsere gnister, noe som kan utgjøre en potensiell brannfare.
    2. Ets wolframtråd ved raskt og gjentatte ganger å dyppe spissen av ledningen inn i etsebadet til spissen smalner til et skarpt punkt. Under et stereomikroskop kutter du ledningen ca. 1 mm fra spissen med et barberblad med rett kant. Gjenta tre ganger til, og sett deretter pinnene inn i herdet opptaksfat med fine tang.
  3. Forbered opptakselektroder.
    1. Trekk et borosilikatglass kapillærrør (indre diameter: 0,86 mm, ytre diameter: 1,50 mm) ved hjelp av en horisontal mikropipettetrekker med boksfilament i elektroder med en 30 μm diameterspiss med liten kon (Figur 1 Ai) som vil bli brukt til å registrere afferente nevroner fra den bakre sidelinjen.
    2. Trekk et ekstra borosilikatglass kapillærrør inn i et par elektroder med mindre spissdiametre (1-5 μm). Hold en elektrode i hver hånd, kjør forsiktig spissene over hverandre for å bryte dem til en ~ 30 ° vinkel. Bruk en mikroforge, poler skråspissen til den er glatt. Den endelige spissdiameteren skal være mellom 30-50 μm og vil bli brukt som ventralrot (VR) opptakselektrode (Figur 1 Aii).
    3. Merk siden av VR-elektroden med forkanten med permanent blekk for å hjelpe til med å orientere spissåpningen nedover når du setter elektroden inn i pipetteholderen på hodelykten (trinn 3.2).
      MERK: Mekanisk modifikasjon av VR-opptakselektroden er upresis og trinn 1.3.2 kan kreve flere forsøk til en passende spissmorfologi oppnås før polering. VR-opptakselektroden er skråstilt for å samsvare med larvens kroppskurve. Når vr-opptakselektroden er fabrikkert, kan den brukes gjentatte ganger så lenge spissen forblir klar og ren mellom eksperimenter.
  4. Generer protokollen i elektrofysiologiopptaksprogrammer.
    1. Kontroller at høyre hodelykt er koblet til Kanal 1-inngangen på baksiden av mikroelektrodestrømmen og spenningsklemmeforsterkeren for de avferente nevronopptakene, og at venstre hodelykt er koblet til Kanal 2-inngangen for VR-opptakene.
      MERK: Datamaskinspesifikasjoner for strøm- og spenningsklemmeforsterkeren krever minimalt 1 GHz eller en bedre prosessor, Windows XP Pro eller Mac OS X 10.46.6, CD-ROM-stasjon med 512 MB RAM, 500 MB harddiskplass og 2 USB-porter.
    2. Åpne den datastyrte forsterkerprogramvaren.
    3. Sett Kanal 1 og Kanal 2 til gjeldende klemmemodus ved å klikke på IC-knappen for hver kanal.
    4. Angi følgende parametere under kategoriene I-Clamp 1 og I-Clamp 2 . Primær utgang: 100x AC membranpotensial (100,000 mV / mV), Forsterkning: 1,000, Bessel: 1 kHz , AC: 300 Hz , Omfang: Bypass . Sekundær effekt: 100x AC membranpotensial (100 mV / mV) , Forsterkning: 1 , Lowpass Filter: 10 Hz.
    5. Lagre kanalparametere som Ch1_Aff og Ch2_VR.
    6. Installer og åpne patchklemmens elektrofysiologiprogramvare.
    7. Klikk på Konfigurer og velg Lab Bench for å sette opp de analoge signalene ved å legge til Ch1_Aff og Ch2_Vr til digitaliseringskanaler (f.eks. analog IN #0 og analog IN #1) som er koblet til, med BNC koaksialkabel, til de tilsvarende kanal 1- og kanal 2-skalerte utgangene til forsterkeren. Klikk OK.
      MERK: Minimumskravene til datamaskinen for digitaliseringsenheten er: en prosessor på 1 GHz eller bedre, Windows XP Pro eller Mac OS X 10.46.6, CD-ROM-stasjon 512 MB RAM, 500 MB harddiskplass og to USB-porter.
    8. Klikk Hent og velg Ny protokoll.
    9. Velg Ledig plassi kategorien Modus/hastighet . Under Anskaffelsesmodussetter du Prøvelengde til enten Bruk tilgjengelig diskplass (dvs. post til stoppet) eller ønsket angitt varighet (tt:mm:ss), og deretter setter du samplingsfrekvensen per signal (Hz) til 20 000 for å maksimere oppløsningen.
    10. Under kategorien Innganger velger du analoge IN-kanaler som tidligere var konfigurert (i trinn 1.4.6), og velger Ch1_Aff og Ch2_VR for den tilsvarende kanalen.
    11. Velg Cmd 0 og Cmd 1 for henholdsvis Kanal #0 og Kanal #1i kategorien Utganger .
      1. Koble Kanal 1-kommandoen på forsterkeren til Analog Ouput 0 på digitaliseringsenheten via BNC koaksialkabel og gjenta for Kanal 2-kommando til Analog utgang 1.
    12. De gjenværende kategoriene kan forbli under standardinnstillinger. Klikk på OK og lagre protokollen.

2. Klargjøring av oppløsning

  1. Forbered Hanks løsning: 137 mM NaCL, 5,4 mM KCl, 0,25 mM Na2HPO4,0,44 mM KH2PO4,1,3 mM CaCl2, 1,0 mM MgSO4,4,2 mM NaHCO4; pH 7.3. Fortynn til 10% Hanks løsning ved å legge til riktig volum av deionisert vann til lageret.
  2. Forbered ekstracellulær løsning: 134 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 1,2 mM MgCl2,2,1 mM CaCl2,10 mM glukose, 10 mM HEPES buffer; pH 7.8 justert med NaOH. Vakuumfilter ekstracellulær løsning gjennom filteret med 0,22 μm porestørrelse.
  3. Forbered α-bungarotoxin: Løs opp 1 mg lyofilisert α-bungarotoxin i 10 ml ekstracellulær oppløsning for å produsere 0,1% fortynning.
  4. Forbered Eutanasi-løsning: 50% (mg / L) bufret farmasøytisk MS-222 i 10% Hanks løsning.
    FORSIKTIG: α-bungarotoxin er et potent nevrotoksin som lammer musklene ved å blokkere kolinerge reseptorer. Hansker er nødvendig og øyebeskyttelse anbefales under håndtering av det lammende.

3. Forberedelse av larver for elektrofysiologiske opptak

  1. Immobilisere sebrafisk larver.
    1. Bruk larver fra den laboratorieoppdrettede populasjonen av sebrafisk (Danio rerio; 4-7 dager etter befruktning) og hus i embryooppløsning (10% Hanks løsning) ved 27 °C.
    2. Overfør larven fra huset til en liten Petri-tallerken (35 mm) ved hjelp av en stor tippet overføringspipette og fjern så mye av den omkringliggende løsningen som mulig.
      MERK: Fjerning av embryooppløsningen forhindrer fortynning av det lammende og øker effekten. Hjørnet av en oppgaveserviett kan brukes til å transportere bort den gjenværende embryoløsningen, og det er viktig å ikke kontakte larver eller la larver bli utsatt for luft.
    3. Fordyp larver i 10 μL 0,1% α-bungarotoxin i ca. 5 min.
      MERK: Tiden som er nødvendig for å immobilisere larver varierer mellom preparatene. Et sunt preparat avhenger av nøye overvåking av vedvarende rask blodstrøm og reduserte motoriske responser. Kort overeksponering til det paralytiske kan føre til en langsom nedgang i den generelle helsen til preparatet selv etter en grundig utvasking. Det er best å bruke en vask før larven er helt immobilisert mens den fortsatt viser tegn på subtile muskelvibrasjoner.
    4. Vask lammet larve med ekstracellulær løsning og bad i 10 min.
      MERK: Utvaskingen gjør det mulig for larven å gå over fra subtile muskelvibrasjoner for å fullføre lammelse. Også α-bungarotoxin er en antagonist av den nikotinske acetylkolinreseptoren (nAChR) α9-underenhet, som er en kritisk komponent i den endogene tilbakemeldingskretsen denne protokollen observerer; Denne effekten har imidlertid vist seg å være reversibel i Xenopus og sebrafisk hårceller etter en 10 min utvasking36,29.
  2. Pin fisk i opptaksfatet.
    MERK: Anestesi (f.eks. MS-222, Trikain) er ikke nødvendig når du forbereder larval sebrafisk (4-7 dpf) da det forstyrrer dyrehelsen. Faktisk er larval sebrafisk unntatt fra visse virveldyrprotokoller.
    1. Bruk overføringspipetten, flytt larven fra det ekstracellulære løsningsbadet til silikonbunnet opptaksfat. Fyll resten av parabolen med ekstracellulær løsning.
    2. Under et stereomikroskop plasserer du forsiktig larvene med finspissede tang over midten av silikonmatten, sidesiden opp, med kroppens fremre og bakre ender som går fra venstre til høyre. Ta deretter tak i en etset pinne fra silikonmatten ved hjelp av finspissede tang og sett pinnen, ortogonalt til silikonet, gjennom larvens dorsale notokord direkte dorsal til anus. Sett den andre pinnen gjennom hakkeordet nær enden av halen og sett den tredje pinnen gjennom notokorddorsalen til gassblæren (Figur 1B).
      MERK: Når du setter inn pinner, er det viktig å målrette midten av notokordbredden for å forhindre å hindre blodstrøm eller skade rundt muskulaturen. Notokordet er dorsalt til den bakre laterale linjenerven, så med riktig pinning forventes ingen skade på sidelinjen sensoriske nevroner. Sett inn etter første kontakt for ikke å forstyrre det omkringliggende vevet. Ideelt sett er diameteren på pinnen mindre enn halvparten av bredden på notokordet for å sikre ren innsetting. Hvis pinnene overskrider denne bredden, gjentar du trinn 1.2 til ønsket flaggbredde er oppnådd. Hvis blodstrømmen avtar etter festing, gjenta fra trinn 1.3 og fremover med en ny prøve.
    3. Sett den fjerde pinnen gjennom den otiske vesicleen samtidig som den gir liten rotasjon mot fremre når pinnen settes inn i innkapslingen (figur 1B). Når en liten rotasjon påføres, se etter vevet mellom cleithrum og otic vesicle for å avsløre klyngen av afferent somata.
      MERK: Vinklet innsetting av den fjerde pinnen er å sikre eksponering av den bakre laterale linjen afferent ganglion, som ellers er blokkert av den store otic vesicle.

4. Ventral rotopptak

  1. Plasser festet larve under 10x vann nedsenking mål på en fast stadium differensial interferens kontrast (DIC) oppreist mikroskop og orientere myseptale kløfter av muskel blokker parallelt med venstre headstage tilnærming vektor (Figur 1B).
    1. Et DIC-mikroskop med fast stadium som flyter på et optisk luftbord, fungerer best for å forhindre at vibrasjoner forstyrrer opptakene. Ved hjelp av en motorisert posisjonering kan mikroskopet bevege seg fritt rundt det faste stadiet der preparatet og hodetagene er montert (Figur 1C).
    2. Plasser jordledningen i badeløsningen og sørg for at den er koblet til venstre hodelykt.
  2. Fyll VR-opptakselektroden med 30 μL ekstracellulær oppløsning ved hjelp av en fleksibel pipettespiss med gellasting og sett den inn i venstre pipetteholder for hodelykt.
  3. Senk opptakspipetten ned i tallerkenløsningen med en mikromanipulator mens du påfører positivt trykk (1-2 mmHg) produsert av en pneumatisk svinger. Under 10x forstørrelse, bekreft retningen på spissåpningen vender nedover.
    1. Den pneumatiske svingeren skal kobles til pipetteholderporten via silikonrør.
  4. Plasser VR-elektroden på myoseptumet
    1. Bruk mikromanipulatoren igjen, senk VR-elektrodespissen til den holder posisjonen over larven. Øk forstørrelsen til 40x nedsenking.
    2. Før elektrodespissen over et myoseptum mellom to myomerer ventral til sidelinjen til spalten er sentrert i VR-elektrodespissåpningen (Figur 1D).
    3. Senk pipetten til den etterslepende kanten av spissåpningen forsiktig kommer i kontakt med epitelet. Etter første kontakt manøvrerer du pipetten diagonalt for å sikre at forkanten kommer i kontakt og kan generere en forsegling.
    4. Påfør negativt trykk (~100 mm Hg) med den pneumatiske svingeren og hold.
      MERK: Riktig orientering av VR-pipetten i forhold til myoseptum og kontinuerlig negativt trykk optimaliserer detekterende motorisk nevronaktivitet med høyt signal-til-støy-forhold gjennom huden.
  5. Oppdag motorisk nevronaktivitet.
    1. Venstre hodelykt skal kobles til forsterkeren, som sender det forsterkede signalet til en digitaliseringsenhet som sender det nevnte signalet inn i patchklemmens elektrofysiologiprogramvare som skal overvåkes på en tilstøtende datamaskin (se avsnitt 1.4).
    2. I programvaren for patchklemmen klikker du på Spill av -knappen på verktøylinjen for å overvåke VR-signalet (Figur 1E).
    3. Kontroller at VR-opptaket oppnås når motorisk nevronaktivitet med godt stereotypt burst-signaldynamikk er observert29,37 (Figur 1E).
      MERK: Fiktive svømmekamper er aktivitetsmønstrene til VR-motornevronene som fortsetter å overføre til tross for at preparatet er lammet. Derfor er fiktive svømmer et tilgjengelig middel for å bestemme dyrets atferdstilstand og måle lokomotoriske parametere samtidig som de utfører afferente nevronopptak som krever et immobilisert preparat. I våre hender, når et VR-opptak er oppnådd, vil et sunt preparat fremkalle frivillige fiktive svømmekamper med noen få sekunders mellomrom. Husk at et sunt preparat har opprettholdt rask blodstrøm. Vær oppmerksom på at det kan ta flere minutter å få et tilstrekkelig VR-signal, og signal-til-støy-forholdet kan forbedres etter første deteksjon. Av hensyn til tid er det akseptabelt å gå videre til § 5.
    4. Hvis et VR-opptak fortsatt ikke oppnås etter å ha fullført avsnitt 5, frigjør du negativt trykk, øker elektroden og gjentar fra trinn 4.4.2 og fremover på et annet myoseptum hvis larvehelsen fortsatt er optimal.

5. Afferent neuron opptak

  1. Fyll den afferente opptakselektroden med 30 μL ekstracellulær løsning; settes inn i høyre pipetteholder for hode (Figur 1B,C), og senk den ned i tallerkenløsningen mens du påfører positivt trykk (1-2 mm Hg) produsert av en pneumatisk svinger.
  2. Lokaliser og fest løst til bakre laterallinje afferent ganglion.
    1. Bruk en mikromanipulator til å senke den afferente elektrodespissen til den holder posisjonen over cleithrum.
    2. Øk forstørrelsen til 40x nedsenking og finn skjæringspunktet mellom bakre lateral linjenerve og cleithrum. Følg sidelinjenerven fremre fra cleithrum til der fibrene innervate bakre lateral linje afferent ganglion, preget av diskret klynge av soma (Figur 1F).
    3. Før elektrodespissen over den sprudlende ganglionen og senk pipetten til spissen kommer i kontakt med epitelet. Manøvrer elektroden forsiktig slik at hele spissomkretsen kommer i kontakt med den afferente ganglionen.
    4. Påfør negativt trykk (20-50 mm Hg) med den pneumatiske svingeren og hold.
      MERK: Det negative trykket som påføres den sprudlende ganglionen er mildere enn sugekraften som ble påført under ventralrotopptaket. Økende negativt trykk kan forbedre signal-til-støy, men afferent nevron helse avtar under vedvarende aggressiv sug, noe som reduserer sannsynligheten for en vellykket registrering.
  3. Registrer afferent nevronaktivitet.
    1. Kontroller at høyre hodelengde er koblet til i en lignende rekkefølge som beskrevet i trinn 4.5.1.
    2. I pClamp10 klikker du på Spill av-knappen på verktøylinjen for å overvåke afferent neuron og VR-signal samtidig.
    3. Forsikre deg om at hele cellen, løs patchopptak av afferent nevroner oppnås når pigger oppstår spontant, omtrent hver 100-200 ms1,29 (Figur 1E).
    4. Gradvis øker du det afferente nevronopptakselektrodetrykket tilbake til atmosfærisk (0 mm Hg) og holder for resten av opptaket.

6. Datainnsamling

  1. Samtidig opptak.
    1. Når både afferent neuron- og motorisk nevronaktivitet er oppdaget, klikker du på Record-knappen på verktøylinjen i pClamp10 for å fange samtidige gapfrie opptak i begge kanalene.
    2. Registrer ønsket varighet (figur 1E).
      MERK: Et opptak i et sunt preparat kan vare i mange timer og forbli lydhør overfor ytre stimuli.
    3. Lagre innspillingen som en støttet filtype (ABF, pClamp10) for å beholde metadata som anskaffelsesparametere.

7. Eutanasi

  1. Påfør positivt trykk (10 mm Hg) på både avferente og VR-opptakselektroder ved hjelp av pneumatiske transdusere og hev elektrodene fra opptaksfatet ved hjelp av mikromanipulatorene.
  2. Overfør opptaksfatet fra DIC-mikroskopet med fast stadium til disseksjonssteremkroskopet.
  3. Bruk fine spisse tang, fjern wolframpinner fra notokord og otic kapsel, og overfør larvene ved hjelp av en overføringspipette til en Petri-tallerken (35 mm) som inneholder 5 ml eutanasioppløsning i minst 5 min.

8. Forbehandling og dataanalyse

MERK: Forhåndsbehandling og analyse av data vil kreve en grunnleggende forståelse av kommandolinjekoding.

  1. Konverter innspillingsfilen for forhåndsbehandling.
    1. Installer Matlab-programvaren.
    2. Last ned det egendefinerte skrevne skriptet, abfload.m38 og lagre filen i samme mappe som lagrer RAW-innspillingsfilen.
    3. Åpne abfload i Matlab Editor-vinduet.m og klikk på Kjør på verktøylinjen. Velg Endre mappehvis du blir bedt om det.
    4. Utfør funksjonen i kommandovinduet med råopptaksfilen som inndata,
      > [d,si,h] = abfload('[raw-filnavn].abf')
      og lagre utdataarbeidsområdet med et filnavn som inkluderer larvebetegnelse, alder og eksperimentell dato, for eksempel [prøvenummer]_[alder i dpf]_[råopptaksfilnavn (inkluderer eksperimentell dato som standard)].
      MERK: Det konverterte filnavnet bør bare inneholde heltall som er avgrenset.
  2. Utfør forhåndsbehandling av data.
    1. Last ned Matlab skript AffVR_preprocess.m og tilhørende funksjoner, tilpasset skrevet av forfatterne.
    2. Åpne AffVR_preprocess.m i Redigering-vinduet.
    3. Under Variablerjusterer du nedre grenseverdier for toppregistrering for både afferent- og VR-opptak ( henholdsvisspk_detect_lb og vr_detect_lb, linje 8 og 14), avhengig av opptaket av signal-til-støy-forholdet.
      MERK: Spike-deteksjon er avhengig av manuell terskelverdi for å sortere og isolere signaler fra mer enn én afferent neuron ved amplitude. Baseline støy og aktivitet fra andre enheter filtreres ut ved å terge for å bare inkludere spike amplituder innenfor en prosent (f.eks. spk_detect_lb) av maksimumet (f.eks. spk_detect_ub). Terring sikrer også nøyaktig binning av motoriske aktivitetstopper i eksplosjoner og kollektive fiktive svømmekamper. Vanligvis starter du med en terskel nedre grense på 0,5, og reduseres gradvis til nøyaktig deteksjon er oppnådd. Hvis du for eksempel angir spk_detect_lb som 0,5 og spk_detect_ub som 1,0, vil alle pigger som er lik eller større enn 50 % av toppamplitude maksimumsverdien og utelate støy eller ekstra nevroner med lavere piggamplituder (figur 2A). Alternativt kan man også senke spk_detect_ub fra 1,0 for å utelukke nevroner med høyere piggamplituder for å isolere nevronene med lavere piggamplituder. Forhåndsbehandle figurutganger (se trinn 7.2.6) vil informere om justeringer og gjentakelse fra trinn 7.2.2 er nødvendig.
    4. I redigeringsvinduet klikker du på Kjør for å utføre AffVR_preprocess.m.
    5. Gå til den tidligere konverterte .mat-datafilen (se trinn 7.1.3); velg og klikk åpne for å starte automatisk forhåndsbehandling.
      MERK: Mens det egendefinerte skriptet kjører, vises utdata i kommandovinduet som informerer fremdriften gjennom behandlingstrinn som "filtrering av data ...", "oppdage ventral rotaktivitet ...", og "generere figurer ...".
    6. Tall generert av AffVR_preprocess.m vil visualisere afferent spike og VR-deteksjon og angi om noen analysevariabler skal justeres (Figur 2).
    7. Skriv inn "Y" på tastaturet for å lagre forhåndsbehandlede metadata i en preprocess_output mappe.
    8. Forhåndsbehandlede data skrives automatisk ut som data_out.xls.
  3. Analyser de forhåndsbehandlede dataene etter ønske.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Etter at sebrafisk larver er riktig immobilisert og bakre lateral linje afferent ganglion og VR-opptak oppnås, kan aktivitet i både afferent og motoriske nevroner måles samtidig. Opptakskanaler vises ved hjelp av gapfrie opptaksprotokoller (trinn 1.4) for kontinuerlig overvåking av avferente og VR-aktivitet. I sanntid kan reduksjoner i spontan afferent pigghastighet observeres samtidig med VR-aktivitet som indikerer fiktive svømmekamper (Figur 1E). Vi fant ut at de beste resultatene og nøyaktig toppdeteksjon var produkter av opptak som oppnådde et signal-til-støy-forhold på minst 0,5. Tilpassede skriftlige forhåndsbehandlingsskript genererer plott for å hjelpe til med visualisering av afferent og VR-toppdeteksjon. Spontane afferent pigger identifiseres ved hjelp av en kombinasjon av spikeparametere som terskel, minimum varighet (0,01 ms) og minimum inter-spike intervall (ISI; 1 ms). Å øke negativt trykk mens du etablerer opptaket gir ofte signaldeteksjon fra flere afferent enheter samtidig. Filtrering ved amplitude gjør det mulig å skille mellom signaldynamikk av uavhengige afferenter. Du kan oppnå isolerende signaler ved å justere de nedre og øvre grenseoverskårne deteksjonsvariablene i forhåndsbehandlingsskriptet (figur 2A). Aggressiv sug for å oppnå flerenhetsopptak kan føre til ustabile opptak, mekanisk støy, nedbrytning av avferente helse og til slutt tap av signal. Derfor er det viktig å sakte slå tilbake sug til atmosfærisk trykk når ønsket signal er oppnådd. Ventral root spike deteksjon følger identiske parametere til afferent spike deteksjon, men krever ekstra innganger for å definere distinkte fiktive svømmekamper. Bursts i en motorkommando er definert av VR-aktivitet med minst to pigger innen 0,1 ms fra hverandre og varte minst 5 ms. Alle svømmekamper avgrenses deretter med minst tre utbrudd med intervaller mellom <200 ms (figur 2B).

Afferent aktivitet er vanskelig å tolke når man ser på et opptak i sin helhet. Forhåndsbehandlingsskript vil legge over deler av afferent aktivitet sentrert på en veldefinert interesseperiode, i dette tilfellet utbruddet av en svømmekamp (n = 33, figur 2C) for å hjelpe til med å visualisere trender i signaldynamikk. Øyeblikkelig afferent aktivitet beregnes ved hjelp av et glidende gjennomsnittsfilter og et prøvevindu på 100 ms. Gjennomsnittlig spontan aktivitet viser dramatiske endringer som svar på utbruddet av motoraktivitet (Figur 2C). For bedre å dissekere og analysere afferent aktivitet, er perioder før og etter svømmingen satt til å matche tidsintervallet for den tilsvarende svømmekampen. I forhåndsbehandlingsskriptet og representative analyserte resultater kalles disse periodene "pre-swim" og "post-swim". Økningen før svømming, svømming og etter svømming ble beregnet ved å ta antall pigger i løpet av den respektive perioden i løpet av varigheten. Presisjonen av estimater for hvert individ er delvis en funksjon av antall svømmer, så vi analyserte variable relasjoner ved hjelp av vektede regresjoner, med individuelle vekter lik kvadratroten av antall svømmer.

Forskjeller i afferent spike rater på tvers av de ulike renteperiodene (pre-swim, swim, og post-swim) ble testet av en toveis analyse av varians (ANOVA). Tukeys post-hoc-test oppdaget signifikante forskjeller i pigghastigheter mellom svømmehastigheter og pigghastigheter for både pre-swim (8,94 ± 0,2 Hz, relativ nedgang 57%) og ettersvømming (5,34 ± 0,2 Hz, relativ reduksjon 40 %) Perioder. Pigghastigheten kom ikke umiddelbart tilbake til grunnlinjen gitt at vi også fant ut at økningen etter svømming var lavere enn økningen før svømming (Tukey post-hoc tester på tvers av grupper, p < 0,001; Figur 3A). Lineære modeller ble brukt til å oppdage sammenhenger mellom relativ pigghastighet og fiktive svømmeparametere. Relativ økningshastighet ble beregnet ved å ta svømmespissen over økningen før svømming. Fiktive svømmeparametere inkluderte svømmevarighet, svømmefrekvens (dvs. antall brister i en svømmekamp i løpet av svømmekampens varighet) og driftssyklus (dvs. summen av svømmeutbruddets varigheter over svømmekampens totale varighet). I våre hender var gjennomsnittet og variansen for relativ pigghastighet korrelert, så det var nødvendig at dataene ble loggført for analyse. Afferent spike rate var negativt korrelert med svømmevarighet, noe som betyr at sidelinjen opplever større hemming under svømmer med lengre varighet (r2 = 0,186, F2,26 = 2,971, p = 0,045; Figur 3B). Det ble ikke påvist noen korrelasjon mellom relativ topphastighet og verken svømmefrekvens eller driftssyklus ((r2 = 0,099, F2,26 = 1,431, p = 0,231 og r2 = 0,047, F2,26 = 0,645, p = 0,932, henholdsvis; Figur 3C;D). Alle analyser av variable relasjoner ble vektet av antall svømmer per person, og alle variablene ble deretter gjennomsnittet av hver enkelt person (n = 29).

Figure 1
Figur 1: Samtidig elektrofysiologisk registrering av bakre laterallinje avferente nevron- og ventralmotorrotaktivitet. (A). Eksempel på en løs patch afferent (i) og ventral motorrot (ii) som registrerer elektroder. Skalastenger representerer 50 μm. (B) Larval sebrafisk er lammet og festet på fire steder (krysssymboler) til en Sylgard-tallerken for å registrere stabilitet. Fete kryss representerer innsettingspunkt for pinner. (C) Elektrofysiologiriggen er montert på et vibrasjonsisolasjonsbord og består av et oppreist fasttrinnsmikroskop på en motorisert kontroller som er i stand til 40x forstørrelse. Doble strømklemme- og spenningsklemmehodetrinn er montert på mikromanipulatorer. (D) Myomerene i kroppsmuskulaturen er skilt av myosepta som tjener som opptak landemerker for motor neuron arborizations. Den ventrale motorrotelektroden nærmer seg ventralkroppen (venstre) og er sentrert og senket på toppen av et myoseptum (pilspiss). Skalastang representerer 50 μm. (E) Skjermfangst av elektrofysiologisk opptak i sanntid som tillater visualisering av spontan afferent aktivitet (kanal 1) og sprengende ventral rotaktivitet som indikerer fiktiv svømmekamp (kanal 2). Spill inn- og Avspilling-knappene er merket med røde piler. (F) Den bakre laterale linjen afferent ganglion (stiplet linje) ligger like under huden og kan identifiseres av en tett klynge av afferent soma. Ganglion kan være plassert ved å følge sidelinjen nerve forbi cleithrum bein (pilspiss) til hvor den kobles til ganglion. Skalalinjen representerer 30 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Forhåndsbehandlingstallutganger visualiserer nøyaktig spikerdeteksjon. (A) Ekstracellulær, løs-patch opptak av bakre lateral linje afferent nevroner. Atskilte topper (merket med røde prikker) oppdages med et minimum intervall mellom pigger på 1 ms. Baseline støy og aktivitet fra andre enheter filtreres ut ved å terke for å bare inkludere spike amplituder innen 50% av maksimum. (B) Ventral motorrotopptak (VR) av fiktive svømmekamper avslører frivillige motorkommandoer gjennom hele opptakets varighet. VR-topper (røde prikker) oppdages ved hjelp av et lignende terskelfilter og deretter plasseres i en enkelt svømmekamp (grønn) ved å oppdage et utbrudd av aktivitet innen 200 ms fra hverandre (se innsats; skalalinjen representerer 200 ms). Pigger som oppdages utenfor den definerte svømmekampen, forekommer ikke innenfor intervallet mellom pigger for stereotyp burst-aktivitet og utelukkes derfor. (C) Bety spontan afferent spike rate sentrert på utbruddet av hver svømmekamp (tid = 0 s) illustrerer spikerhastighet før, under og etter svømming. Feilfelt representerer ± SEM. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Kvantifisering av afferent aktivitet før, under og etter fiktiv svømming. (A) Afferent spike rate er betydelig redusert under svømming og denne effekten vedvarer selv etterpå. Statistisk lignende grupperinger er betegnet med a og b. (B) Lengre svømmevarighet er korrelert med redusert afferent spike rate. (C-D) Svømmefrekvens og svømmesyklus viser ingen sammenheng med afferent spike rate. Alle verdier representerer gjennomsnittlig ± SEM. Outlying individer med lav statistisk vekt ble utelatt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den eksperimentelle protokollen som er beskrevet, gir potensial til å overvåke endogene endringer i sensorisk inngang på tvers av motorisk atferd i en intakt, oppførende virveldyr. Spesielt beskriver den en in vivo-tilnærming til å utføre samtidige ekstracellulære opptak av laterale linje afferent nevroner og ventrale motorrøtter i larval sebrafisk. Spontan afferent aktivitet har tidligere vært preget av sebrafisk uten hensyn til potensiell samtidig motoraktivitet1,2,39,40,41. Uten å overvåke tilstedeværelsen av motoraktivitet med ventrale rotopptak, vil dechiffrering av avferente aktivitet sannsynligvis bli undervurdert på grunn av påvirkning av sprudlende inhibering under og til og med etter spontan svømming.

In vivo elektrofysiologiske opptak er iboende utfordrende. Vår erfaring er det å opprettholde et sunt preparat den største faktoren for å oppnå vellykkede, langvarige opptak for afferente nevroner og ventrale motorrøtter. For å gjøre dette er det viktig å ikke bare identifisere og overvåke rask blodstrøm, men også gjenkjenne tekstur av huden og underliggende muskulatur. Vi anbefaler å observere flere lammede larver under et mikroskop før du videre håndterer for å bli kjent med den indre blodstrømmen og hudtilstanden til sunne larver. En vellykket ventral rotopptak gjennom huden krever en jevn, sunn hudoverflate for at opptakselektroden skal generere en tett forsegling. Denne tilnærmingen omgår tradisjonelle protokoller37,42 som er invasive og tidkrevende, som krever dissekering av epitelet for å eksponere den underliggende muskulaturen. En ulempe med å registrere gjennom huden er den potensielle variasjonen i tid før signaler realiseres. Optimalisering av størrelsen og varigheten av anvendt negativt trykk vil redusere tiden som kreves for å etablere et signal og potensielt forbedre signal-til-støy-forholdet. Opptak fra et sunt, aktivt preparat bør gi spontane afferent pigghastigheter mellom 5-10 Hz med fiktive svømmekamper som oppstår med noen få sekunder.

I tillegg til å avdekke motoraktivitetstilstand, kan ventrale rotopptak fungere som en proxy for overvåking av sprudlende aktivitet som slipper ut parallelt med motorkommandoer for å dempe lateral linjeaktivitet30,31,32 samt aktivitet i homologe hårcellesystemer (f.eks. det hørbare og vestibulære systemet35,43,44,45). Sprudlende nevroner ligger dypt i bakbrainen, noe som gjør elektrofysiologiske opptak av dem svært utfordrende. Sebrafisk er et modellgenetiske system, og vår elektrofysiologiprotokoll kan suppleres med transgene linjer for å kraftig undersøke aspekter ved korollær utslipp, hårcellefølsomhet, eksitotoksisitet og utover.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Vi anerkjenner takknemlig støtte fra National Institute of Health (DC010809), National Science Foundation (IOS1257150, 1856237) og Whitney Laboratory for Marine Biosciences til J.C.L. Vi vil takke tidligere og nåværende medlemmer av Liao Lab for å stimulere til diskusjoner.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mL beaker PYREX 1000 resceptacle for etchant
10x water immersion objective Olympus UMPLFLN10xW low magnification for positioning larvae and recording electrode
40x water immersion objective Olympus LUMPLFLN40XW higher magnification for position electrode tip and establishing patch-clamp
abfload.m supplemental coding file custom written MATLAB script for converting raw electrophysiology recordings to .mat files
AffVR_preprocess.m supplemental coding file custom written MATLAB script for preprocessing recording data
BNC coaxial cables ThorLabs 2249-C-12 connecting amplifier and digitizer channels; require 4
borosilicate glass capillaries w/ filament Warner Instruments G150F-3 inner diameter: 0.86, outer diameter: 1.50; capillary glass used to form recording electrodes
burst_detect supplemental coding file custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m
computer N/A N/A any computer should work
DC Power Supply Tenma 72-420 used for electrically etching dissection pins
electrophysiology digitizer Axon Instruments, Molecular Devices Axon DigiData 1440A enables acquisition of patch-clamp data
filament Sutter Instrument Company FB255B 2.5 mm box filament used in micropipette puller
fine forceps Fine Science Tools Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10 used to manipulate larvae and insert pins
fixed stage DIC microscope Olympus BX51WI microscope used to visualize and establish patch-clamp recordings
flexible, tapered pipette tip Fisher Scientific 02-707-169 flexible tips enable insertion into recording electrode to dispense extracellular solution at the tip
FluoroDish World Precision Instruments Inc. FD3510-100 cover glass bottomed dish recording dish
KimWipe KimTech 34155 task wipe used for wicking away excess fluid from larvae
Kwik-Gard World Precision Instruments Inc. 710172 self-mixing sylgard elastomer
MATLAB MathWorks R2020b command line software for preprocessing data
microelectrode amplifier Axon Instruments, Molecular Devices MultiClamp 700B patch clamp amplifier for dual channel recordings
microforge Narishige MF-830 microforge to polish recording electrode
micromanipulator control unit Siskiyou MC1000-eR/T 4-axis dial coordinator for controlling micromanipulator
micropipette puller Sutter Instrument Company Flaming/Brown P-97 for pulling capillary glass into recording electrodes
microscope control unit Siskiyou MC1000e positions the microscope around the fixed stage and preparation
motorized micromanipulator Siskiyou MX7600 positions the headstage and attached recording electrode for patch-clamp recording
MultiClamp Commander Molecular Devices 2.2.2 downloadable from Axon MultiClamp 700B Commander download page
optical air table Newport Corporation VH3036W-OPT breadboard isolation table to float microscope and minimize vibrations during recordings
pCLAMP Molecular Devices 10.7.0 downloadable from Axon pCLAMP 10 Electrophysiology Data Acquisition & Analysis Software Download page
permanent ink marker Sharpie order from amazon.com for marking the leading edge side of the VR electrode to ensure proper orientation when inserting into pipette holder
petri-dish Falcon 35-3001 used to immerse larvae in paralytic
pipette holder Molecular Devices 1-HL-U hold recording electrode and connect to the headstage
pneumatic transducer Fluke Biomedical Instruments DPM1B for controlling recording electrode internal pressure
potassium hydroxide Sigma-Aldrich 221473-25G etchant for etching dissection pins
silicone tubing Tygon 14-169-1A tubing to connect pneumatic transducer to pipette holder
spike_detect supplemental coding file custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m
stereomicroscope Carl Zeiss Stemi 2000-C used to visualize pin tips and during preparation of larvae
straight edge razor blade Canopus order from amazon.com cuts the tungsten wire while making dissection pins
swimbout_detect supplemental coding file custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m
syringe Becton Dickinson Compoany 309602 filled with extracellular solution to inject into recording electrodes
transfer pipette Sigma-Aldrich Z135003-500EA single use, non-sterile pipette for transfering larvae
tricaine methanesulfonate Syndel 12854 pharmaceutical aneasthetic used to euthanize larvae with high dosage.
tungsten wire World Precision Instruments Inc. 715500 0.002 inch, 50.8 μm diameter; used to make dissection pins
vacuum filtration unit Sigma-Aldrich SCGVU11RE single use, sterile, vacuum filtration units used to sterilize extracellular solution used for electrophysiology electrode ringer
voltage-clamp current-clamp headstage Molecular Devices CV-7B supplied with MultiClamp 700B amplifier used as left and right headstages
α-bungarotoxin ThermoFisher B1601 for immobilizing the larvae prior to recording

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Trapani, J. G., Nicolson, T. Mechanism of spontaneous activity in afferent neurons of the zebrafish lateral-line organ. The Journal of Neuroscience. 31 (5), 1614-1623 (2011).
  2. Haehnel-Taguchi, M., Akanyeti, O., Liao, J. C. Afferent and motorneuron activity in response to single neuromast stimulation in the posterior lateral line of larval zebrafish. Journal of Neurophysiology. 112 (6), 1329-1339 (2014).
  3. Levi, R., Akanyeti, O., Ballo, A., Liao, J. C. Frequency response properties of primary afferent neurons in the posterior lateral line system of larval zebrafish. Journal of Neurophysiology. 113 (2), 657-668 (2015).
  4. Harris, G. G., Fishkopf, L. S., Flock, A. Receptor potentials from hair cells of the lateral line. Science. 167 (3914), 76-79 (1970).
  5. Dow, E., Jacobo, A., Hossain, S., Siletti, K., Hudspeth, A. J. Connectomics of the zebrafish's lateral line neuromast reveals wiring and miswiring in a simple microcircuit. eLife. 7, 33988 (2018).
  6. Obholzer, N., et al. Vesicular glutamate transporter 3 is required for synaptic transmission in zebrafish hair cells. The Journal of Neuroscience. 28 (9), 2110-2118 (2008).
  7. Keen, E. C., Hudspeth, A. J. Transfer characteristics of the hair cell's afferent synapse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (14), 5537-5542 (2006).
  8. Li, G., Keen, E., Andor-Ardó, D., Hudspeth, A. J., von Gersdorff, H. The unitary event underlying multiquantal EPSCs at a hair cell's ribbon synapse. The Journal of Neuroscience. 29 (23), 7558-7568 (2009).
  9. Manley, G. A., Robertson, D. Analysis of spontaneous activity of auditory neurons in the spiral ganglion of the guinea-pig cochlea. The Journal of Physiology. 258 (2), 323-336 (1976).
  10. Kiang, N. Y. S., Watanabe, T., Thomas, E., Clark, L. Discharge patterns of single fibers in the cat's auditory nerve. , MIT Press. Cambridge MA. (1965).
  11. Corey, D. P., Hudspeth, A. J. Ionic basis of the receptor potential in a vertebrate hair cell. Nature. 281 (5733), 675-677 (1979).
  12. Trapani, J. G., Nicolson, T. Physiological recordings from zebrafish lateral-line hair cells and afferent neurons. Methods in Cell Biology. 100, 219-231 (2010).
  13. Reinig, S., Driever, W., Arrenberg, A. B. The descending diencephalic dopamine system is tuned to sensory stimuli. Current Biology. 27 (3), 318-333 (2017).
  14. Zhang, Q., et al. Synaptically silent sensory hair cells in zebrafish are recruited after damage. Nature Communications. 9 (1), 1388 (2018).
  15. Pichler, P., Lagnado, L. Motor behavior selectively inhibits hair cells activated forward motion in the lateral line of zebrafish. Current Biology. 30 (1), 150-157 (2020).
  16. Olszewski, J., Haehnel, M., Taguchi, M., Liao, J. C. Zebrafish larvae exhibit rheotaxis and can escape a continuous suction source using their lateral line. PloS One. 7 (5), 36661 (2012).
  17. Suli, A., Watson, G. M., Rubel, E. W., Raible, D. W. Rheotaxis in larval zebrafish is mediated by lateral line mechanosensory hair cells. PLoS One. 7 (2), 29727 (2012).
  18. Oteiza, P., Odstcil, I., Lauder, G., Portugues, R., Engert, F. A novel mechanism for mechanosensory-based rheotaxis in larval zebrafish. Nature. 547 (7664), 445-448 (2017).
  19. McHenry, M. J., Feitl, K. E., Strother, J. A. Larval zebrafish rapidly sense the water flow of a predator's strike. Biology Letters. 5 (4), 477-479 (2009).
  20. Stewart, W. J., Cardenas, G. S., McHenry, M. J. Zebrafish larvae evade predators by sensing water flow. The Journal of Experimental Biology. 216, Pt 3 388-398 (2013).
  21. Mekdara, P. J., Schwalbe, M. A. B., Coughlin, L. L., Tytell, E. D. The effects of lateral line ablation and regeneration in schooling giant danios. The Journal of Experimental Biology. 221, Pt 8 175166 (2018).
  22. Palmer, L. M., Giuffrida, B. A., Mensinger, A. F. Neural recordings from the lateral line in free-swimming toadfish, Opsanus tau. The Biological Bulletin. 205 (2), 216-218 (2003).
  23. Ayali, A., Gelman, S., Tytell, E. D., Cohen, A. H. Lateral line activity during undulatory body motions suggests a feedback link in closed-loop control of sea lamprey swimming. Canadian Journal of Zoology. 87 (8), 671-683 (2009).
  24. Mensinger, A. F., Van Wert, J. C., Rogers, L. S. Lateral line sensitivity in free-swimming toad fish Opsanus tau. The Journal of Experimental Biology. 222, Pt 2 190587 (2019).
  25. Montgomery, J., Bodznick, D., Halstead, M. Hindbrain signal processing in the lateral line system of the dwarf scorpionfish Scopeana papillosus. The Journal of Experimental Biology. 199, Pt 4 893-899 (1996).
  26. Montgomery, J. C., Bodznick, D. An adaptive filter that cancels self-induced noise in the electrosensory and lateral line mechanosensory systems of fish. Neuroscience Letters. 174 (2), 145-148 (1994).
  27. Palmer, L. M., Deffenbaugh, M., Mensinger, A. F. Sensitivity of the anterior lateral line to natural stimuli in the oyster toadfish, Opsanus tau (Linnaeus). The Journal of Experimental Biology. 208, Pt 18 3441-3450 (2005).
  28. Russell, I. J., Roberts, B. L. Inhibition of spontaneous lateral-line activity of efferent nerve stimulation. The Journal of Experimental Biology. 57, 77-82 (1972).
  29. Lunsford, E. T., Skandalis, D. A., Liao, J. C. Efferent modulation of spontaneous lateral line activity during and after zebrafish motor commands. Journal of Neurophysiology. 122 (6), 2438-2448 (2019).
  30. Russell, I. J. The pharmacology of efferent synapses in the lateral-line system of Xenopus laevis. The Journal of Experimental Biology. 54 (3), 643-659 (1971).
  31. Roberts, B. L., Russell, I. J. The activity of lateral-line efferent neurons in stationary and swimming dogfish. The Journal of Experimental Biology. 57 (2), 435-448 (1972).
  32. Flock, A., Russell, I. J. The post-synaptic action of efferent fibres in the lateral line organ of the burbot Lota lota. The Journal of Physiology. 235 (3), 591-605 (1973).
  33. Montgomery, J. C. Noise cancellation in the electrosensory system of the thornback ray; common mode rejection of input produced by the animal's own ventilatory movement. Journal of Comparative Physiology. 155, 103-111 (1984).
  34. Tricas, T. C., Highstein, S. M. Action of the octavolateralis efferent system upon the lateral line of free-swimming toadfish, Opsanus tau. Journal of Comparative Physiology. 169 (1), 25-37 (1991).
  35. Weeg, M. S., Land, B. R., Bass, A. H. Vocal pathways modulate efferent neurons to the inner ear and lateral line. The Journal of Neuroscience. 25 (25), 5967-5974 (2005).
  36. Elgoyhen, A. B., Johnson, D. S., Boulter, J., Vetter, D. E., Heinemann, S. α9: an acetylcholine receptor with novel pharmacological properties expressed in rat cochlear hair cells. Cell. 79 (4), 705-715 (1994).
  37. Masino, M. A., Fetcho, J. R. Fictive swimming motor patterns in wild type and mutant larval zebrafish. Journal of Neurophysiology. 93 (6), 3177-3188 (2005).
  38. Hentschke, H. abfload. 1.4.0.0. MATLAB Central File Exchange. , (2020).
  39. Harris, G. G., Milne, D. C. Input-output characteristics of the lateral-line sense organs of Xenopus laevis. The Journal of the Acoustical Society of America. 40 (1), 32-42 (1966).
  40. Liao, J. C., Haehnel, M. Physiology of afferent neurons in larval zebrafish provides a functional framework for lateral line somatotopy. Journal of Neurophysiology. 107 (10), 2615-2623 (2012).
  41. Song, S., et al. Mathematical modeling and analyses of interspike-intervals of spontaneous activity in afferent neurons of the zebrafish lateral line. Nature Science Reports. 8, 14851 (2018).
  42. Liao, J. C., Fetcho, J. R. Shared versus specialized glycinergic spinal interneurons in axial motor circuits of larval zebrafish. The Journal of Neuroscience. 28 (48), 12982-12992 (2008).
  43. von Holst, E., Mittelstaedt, H. The principle of reafference: interactions between the central nervous system and the peripheral organs. Die Naturwissenschften. 37, 463 (1950).
  44. Crapse, T. B., Sommer, M. A. Corollary discharge across the animal kingdom. Nature Reviews. Neuroscience. 9 (8), 587-600 (2008).
  45. Brichta, A. M., Goldberg, J. M. Responses to efferent activation and excitatory response-intensity relations of turtle posterior-crista afferents. Journal of Neurophysiology. 83 (3), 1224-1242 (2000).

Tags

Nevrovitenskap Utgave 168 hårcelle elektrofysiologi ventral rot sprudlende kopi korollær utslipp
Aktivitet av bakre laterale linje afferent nevroner under svømming i sebrafisk
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lunsford, E. T., Liao, J. C.… More

Lunsford, E. T., Liao, J. C. Activity of Posterior Lateral Line Afferent Neurons during Swimming in Zebrafish. J. Vis. Exp. (168), e62233, doi:10.3791/62233 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter