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Neuroscience

마우스 뇌 에서 생체 내 인핸서 기반 발현 구조체의 AAV 배포

Published: March 31, 2022 doi: 10.3791/62650
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2
1Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, University of California, Davis, 2Department of Neurobiology, Physiology and Behavior, University of California, Davis

Summary

이 프로토콜은 새로운 rAAV 기반 과도 인핸서-리포터 분석을 설명합니다. 이 분석은 마우스 뇌 에서 생체내에서 인핸서 구동 발현을 유도하는데 사용될 수 있다.

Abstract

인핸서는 조직 및 세포 유형 특이적 유전자의 특정 발현 패턴을 유도하는 다양한 전사 인자에 대한 결합 플랫폼입니다. 비코딩 DNA 및 다양한 염색질 상태를 평가하는 여러 수단은 게놈에서 인핸서 서열의 존재를 예측하는 데 유용한 것으로 입증되었지만 이러한 서열의 활성을 검증하고 이들이 활동하는 장기 및 발달 단계를 찾는 것은 노동 집약적인 과정입니다. 최근 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터의 발전으로 이식유전자를 마우스 조직에 광범위하게 전달할 수 있게 되어 형질전환 동물 없이도 생체 내 인핸 서 테스트가 가능합니다. 이 프로토콜은 그 자체로 유의한 발현을 유도하지 않는, 최소 프로모터의 제어 하에 EGFP를 발현하는 리포터 작제물이 마우스 뇌에서 후보 인핸서 서열의 활성 패턴을 연구하는데 어떻게 사용될 수 있는지를 보여준다. AAV 패키지 리포터 작제물을 마우스 뇌에 전달하고 1-4주 동안 배양한 후 동물을 희생시키고 뇌 절편을 현미경으로 관찰합니다. EGFP는 테스트 된 인핸서가 유전자 발현을 시작하기에 충분한 세포에서 나타나며, 인핸서가 뇌에서 활성화되는 위치와 발달 단계를 정확히 지적합니다. 표준 클로닝 방법, 저비용 AAV 패키징, AAV 혈청형 확장 및 생체 내 전달 및 표준 영상 판독을 위한 방법은 뇌에서 유전자 발현이 조절되는 방식에 대한 연구에 접근 가능한 접근 방식을 만듭니다.

Introduction

인핸서는 전사 인자 결합 부위 역할을하는 게놈 시스 조절 요소이며 시공간적으로 특이적인 방식으로 표적 유전자의 발현을 유도 할 수 있습니다 1,2. 이들은 다양한 세포 유형, 조직 및 발달 단계에서 차별적으로 활성이며 질병 위험 관련 게놈 변이 3,4의 기질이 될 수 있습니다. 따라서 인핸서 기능의 역학을 이해해야 할 필요성은 유전체학 내에서 번역 및 기초 과학 응용 프로그램 모두에서 발전하는 데 중요합니다. 인핸서 활성의 인실리코 예측은 인핸서 능력 5,6에 대한 가설을 생성하기 위한 훌륭한 자원으로 작용할 수 있다. 이러한 예측된 인핸서 활성은 기능적 활성의 완전한 이해를 위해 추가적인 검증 및 질의를 필요로 할 수 있다. 인핸서 리포터 분석은 세포에서 동물에 이르기까지 다양한 시스템에서 이러한 목적에 가치가 있음이 입증되었습니다 7,8,9. 유연하고 비용 효율적인 과도 생체 내 맥락에서 이러한 연구를 확장하기 위해 이 프로토콜은 출생 후 마우스 뇌에서 이소성 리포터 유전자의 발현을 유도하는 능력에 대해 추정 인핸서 서열을 테스트하기 위해 생체 내 AAV 기반 방법의 사용을 설명합니다. 이 방법 계열은 단일 후보 서열 또는 병렬 라이브러리 스크리닝을 조사하는 데 유용하며 기본 및 중개 연구와 관련이 있습니다.

이 방법은 단일 플라스미드에서 추정 인핸서 후보 DNA 서열을 리포터 유전자 (여기서는 EGFP)와 결합시키고, 단독으로 유의한 발현을 유도하지 않는 최소 프로모터의 제어 하에 있다. 플라스미드는 재조합 AAV(rAAV)로 패키징되고 동물 모델에 주입됩니다. 여기에서의 적용이 뇌에 있는 반면, 다양한 rAAV 혈청형은 상이한 조직 유형에 걸친 감염을 가능하게 하여, 이러한 접근법이 다른 시스템(10)으로 확장될 수 있다. 일정 기간 후, 뇌를 수집하여 리포터 유전자의 발현을 분석할 수 있다. 대조군과 비교하여 강한 발현은 시험된 후보 서열이 유전자의 발현을 "향상"시킬 수 있었음을 나타냅니다(그림 1). 이 단순한 디자인은 뇌에서 생체 내에서 인핸서 활성에 대한 서열을 테스트하는 쉽고 명확한 접근 방식을 제공합니다.

서열의 인핸서 능력에 대한 시험 이외에, 이 방법은 세포형 인핸서 활성을 결정하기 위한 기술과 조합될 수 있다. 차등 인핸서 활성을 결정하기 위한 서열 기반 접근법에서, DNA 및 RNA 시퀀싱 전에 세포 유형-특이적 마커 상의 세포를 분류함으로써 연구자들은 Gisselbrecht et al.11에 기술된 바와 같이 상이한 세포 유형이 차등 인핸서 활성을 나타내는지 여부를 결정할 수 있다. 이미징 기반 접근법에서, 세포 유형 특이적 마커를 갖는 공동 표지 이미지는 인핸서 구동 형광을 나타내는 세포가 관심 있는 세포 유형 마커12,13,14,15,16도 표시하는지 여부를 검사할 수 있게 한다. 인핸서 리포터 분석은 인핸서 능력에 미치는 영향에 대해 인핸서의 위험 관련 대립 유전자 변이를 직접 테스트 할 수 있습니다. 게놈 전체 연관 연구 (GWAS)에서 확인 된 대부분의 위험 유전자좌는 게놈17의 비 코딩 영역에 있습니다. 이러한 위험 유전자좌의 기능적 주석 연구는 많은 부분이 인핸서18,19,20으로 작용할 가능성이 있음을 나타냅니다. 생체내 MPRA 배치는 뇌12,21에서 인핸서 활성에 대한 이러한 위험 관련 변이체의 테스트를 허용할 수 있다. 마지막으로, 서로 다른 시점에서의 전달 및 수집은 인핸서가 활성화되는 발달 단계에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다.

인핸서-리포터 플라스미드 디자인은 다양하며 실험 목표에 맞게 맞춤화할 수 있습니다. 인핸서 연구에 사용되어 온 최소 프로모터에 대한 몇 가지 옵션이 있는데, 예를 들어 인간 β글로빈 최소 프로모터22 및 마우스 Hsp68 최소 프로모터23. 이들 프로모터는 이를 활성화시키는 인핸서 요소와 결합되지 않는 한 낮은 수준의 발현을 유도하는 것으로 알려져 있다. 대조적으로, 구성적 프로모터 요소는 도입유전자의 강한 발현을 유도하여, 양성 대조군 또는 강건한 발현의 배경에 대한 인핸서 기능을 시험하는데 유용하다. 구성적 프로모터에 대한 일반적인 선택은 CAG, 닭 β-액틴 프로모터 및 사이토메갈로바이러스 즉시-초기 인핸서24, 또는 인간 EF1α25로부터 유래된 하이브리드 프로모터를 포함한다. 인핸서가 양방향성으로 작용하는 것으로 알려져 있기 때문에(26), 최소 프로모터에 대한 인핸서의 배향 및 위치는 가요성이다(도 2A). 전통적인 인핸서-리포터 분석은 인핸서를 프로모터의 상류에 배치하고, 라이브러리 전달에서, 시퀀싱 판독을 시험된 인핸서27과 연관시키기 위해 리포터 유전자의 하류에 바코드 서열을 포함한다. 그러나, 인핸서는 또한 리포터 유전자의 개방 판독 프레임에 배치될 수 있고, STARR-seq28에서 행해지는 바와 같이, 그들 자신의 바코드 서열로서 기능할 수 있다. 여기에 기술된 프로토콜은 STARR-seq 분석 설계를 이용하여, 후보 인핸서 서열을 리포터 유전자의 3' UTR 내로 배치한다. STARR-seq 배향은 보다 간소화된 클로닝의 이점을 제공하지만 기존 접근 방식보다 잘 이해되지 않으며 구축물 간에 다양한 RNA 안정성을 유도할 수 있습니다. 설명된 방법은 STARR-seq 또는 종래의 배향에 용이하게 적응될 수 있으며, 다른 곳(27,29)에 기술된 클로닝 공정에 대한 약간의 변경이 있을 수 있다.

다양한 AAV 전달 방법을 사용하여 실험 목표에 맞게 이 기술을 추가로 맞춤화할 수 있습니다(그림 2B). 이 프로토콜에서 추가로 설명되는 직접 두개내 주사는 고농도의 바이러스를 뇌(30)에 직접 전달한다. 이것은 주사 부위를 중심으로 높은 형질 도입 효율을 제공하므로 조직 영역에서 형질 도입 된 세포의 밀도를 최대화하려는 실험에 탁월한 기술입니다. 정위 주사는 재현 가능한 국소 형질 도입을 위해 동물 전반에 걸쳐 주사 부위를 표준화하는 데 도움이 될 수 있습니다. 두개 내 주사는 출생 후 초기 동물에서 가장 간단합니다. 대안적인 기술로서, 전신 주사는 혈액-뇌 장벽(31)을 통과할 수 있는 혈청형을 갖는 AAV를 사용하여 전이유전자를 전달할 수 있다. 꼬리-정맥 주사는 바이러스가 몸 전체를 순환하도록 하여 많은 조직에 걸쳐 일반화된 전달을 가능하게 합니다10. 역-안와 주사는 눈 뒤의 바이러스를 후-안와 부비동32로 전달하는 또 다른 전신 주사 기술이다. 이것은 정맥계로부터 뇌로의 AAV에 대한보다 직접적인 경로를 제공하며, 그 결과 더 많은 말초 혈관(33)으로의 주사보다 뇌 내의 형질 도입 된 세포의 농도가 더 높다.

이 기술의 또 다른 유연한 측면은 판독 방법입니다. 대체로 옵션은 리포터 기반 또는 시퀀싱 기반으로 설명할 수 있습니다(그림 2C). GFP와 같은 형광 리포터를 작제물의 개방 판독 프레임에 통합하면 후보 인핸서가 발현을 유도하는 임의의 형질도입된 세포에서 형광 단백질이 발현됩니다. 면역조직화학과 같은 라벨링 및 이미징 기술은 신호 증폭을 가능하게 합니다. 시퀀싱 기반 판독 기술은 조직으로부터 수집된 RNA에서 전달된 구축물로부터 서열을 식별하는 것을 포함한다. 초기에 전달된 바이러스 DNA의 양을 정량화함으로써, 발현된 RNA 대 전달된 DNA의 비교는 예를 들어 대규모 병렬 리포터 분석(MPRA)의 맥락에서 시험된 인핸서 서열이 전이유전자의 발현 증가를 유도할 수 있는 정도를 결정하는 데 사용될 수 있다. MPRA는 동시에 활동에 대해 최대 수천 개의 후보 인핸서를 테스트하기 위해 이러한 기술의 강력한 확장을 제공하며 유전체학 연구 12,27,34,35,36에서 광범위하게 설명되었습니다. 더 높은 처리량 스크리닝은 후보 인핸서에 대한 클로닝, 패키징, 전달 및 시퀀싱 단계를 개별적으로가 아닌 배치로 실행하여 달성됩니다.

후보 인핸서 선택은 유연성을 위한 또 다른 기회를 제공합니다(그림 2D). 예를 들어, 이 분석은 특정 유전자의 인핸서를 식별하거나, 관심 있는 비코딩 DNA 영역의 기능을 확인하거나, 인핸서가 활성화되는 특정 세포 유형 또는 발달 단계를 결정하는 데 사용될 수 있으며, 이들 모두는 기초 과학 및 질병 연구 모두에서 목표를 달성한다. 일반적으로, 후보 인핸서 선택은 인핸서 활성의 인실리코 예측에 의해 주도된다. 일반적으로, 인실리코 예측은 H3K27ac(37 ) 및 염색질 접근성 맵핑(38)과 같은 가능성 있는 인핸서를 나타내는 히스톤 변형에 대한 ChIP-seq를 포함한다. 마지막으로, 성장하는 연구 분야는 합성적으로 설계된 인핸서 요소의 기능 기반 스크리닝으로, 인핸서 서열이 기능을 지시하는 방법(39 ) 및 특정 특성(40)을 갖는 인핸서의 설계에 대한 연구를 가능하게 한다.

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Protocol

이 프로토콜은 UC Davis 기관 동물 관리 및 사용 위원회(프로토콜 #22339) 및 UC Davis 기관 생물안전 위원회(BUA-R1903)의 승인을 받았습니다. 이 프로토콜은 출생 후 0-1일에 남녀의 C57BL/6J 마우스에서 테스트되었습니다.

1. 인핸서 후보 서열을 AAV 벡터 플라스미드에 클로닝합니다.

참고: 대표적인 프로토콜이 제공되지만 복제 전략은 높은 수준의 유연성을 가지고 있습니다.

  1. 리포터 구성을 선택하거나 설계합니다. 여기서, 인핸서 후보는 EGFP 리포터 유전자의 3' 비번역 영역 (UTR) 내로 삽입되고, 이는 Hsp68 최소 프로모터의 조절하에 발현된다.
    참고: 이 분석에 적합한 많은 MPRA 플라스미드 구축물이 Addgene41 에 기탁되었으며 연구 용도로 사용할 수 있습니다.
  2. 관심 서열을 증폭하기 위해 PCR 프라이머를 설계합니다. 프라이머의 5' 말단에 깁슨 클로닝을 위한 적절한 상동성 암(삽입 위치의 서열 5' 상류에 해당하는 ~35bp, 정방향 프라이머의 경우 상단 가닥, 역방향 프라이머의 경우 하단 가닥)을 추가합니다.
    참고: 기본 프라이머 서열이 약 57-59°C의 용융 온도에서 ~18-24bp 길이이고 ~50%-60% GC 함량인지 확인하십시오.
  3. 설계된 프라이머를 사용하여 DNA 샘플로부터 PCR을 수행합니다.
    1. PCR 반응 혼합물을 표 1에 설명된 대로 0.2mL PCR 튜브에 조립합니다.
    2. PCR 반응 혼합물을 열 순환기에 놓고 표 1에 언급된 프로그램에 따라 순환합니다.
    3. 100V에서 30-60분 동안 0.7%-1% 아가로스 겔에서 5μL의 PCR 산물을 실행하여 PCR의 성공을 확인합니다. 예상 길이의 조각을 확인합니다.
    4. 상용 효소 반응 정화 컬럼 키트를 사용하여 PCR 생성물을 정화합니다. 최종 용출액은 클로닝 삽입물입니다.
  4. 제한 분해를 수행하여 고유한 클로닝 부위에서 AAV 벡터를 선형화하여 인핸서를 벡터에 삽입합니다.
    1. 여기에 사용된 인핸서 리포터 작제물의 3' UTR 내의 클로닝 부위는 독특한 PacI 및 AscI 제한 부위에 의해 경계가 지정된다. 다음 파라미터에 따라 이 위치에서 플라스미드를 선형화하기 위해 다이제스트를 수행합니다(단계 1.4.2-1.4.4).
    2. 얼마나 많은 클로닝 반응이 필요한지에 따라 PacI 및 AscI를 사용하여 1-10 μg의 벡터 DNA를 분해합니다. 제조업체의 지침에 따라 제공된 버퍼를 사용하여 반응을 준비합니다.
    3. 벡터 DNA를 분해하기 위해 37°C에서 1-2시간 동안 배양합니다. (50μL 반응에서 5μg 이상을 소화하는 경우 더 긴 배양이 필요할 수 있습니다.)
    4. 1-2시간 배양 후 65°C에서 20분 동안 배양하여 효소를 비활성화합니다.
    5. 제한 분해물 단편을 0.7%-1% 아가로스 겔을 사용하여 겔 전기영동으로 분리하고 100V에서 30-60분 동안 실행합니다.
    6. 선형화된 벡터에 대한 밴드를 절제하고 상용 겔 추출 키트를 사용하여 정제한다.
  5. 깁슨 클로닝 반응 수행 및 변환
    1. 정제된 벡터의 농도를 분광광도계를 사용하여 클로닝 삽입물을 결정한다.
      참고: DNA는 260nm에서 빛을 흡수하고 오염 물질은 230nm 및 280nm에서 빛을 흡수합니다. 260/230 및 260/280의 높은 비율(>1.8)은 고도로 정제된 DNA를 나타냅니다.
    2. 깁슨 클로닝 반응을 0.2mL PCR 튜브에 조립합니다: 5μL의 2x Gibson 마스터 믹스, 0.02-0.5pmol DNA 단편을 벡터에 3:1 비율로 삽입(반응을 위한 최적의 DNA 농도는 경험적으로 결정되어야 함) 및 뉴클레아제가 없는 물(부피를 10μL로 끌어올림).
    3. Gibson 반응을 열 순환기에서 50°C에서 20분 동안 배양합니다.
  6. 형질전환 재조합 결핍 (recA-) 유능한 대장균 (E. coli).
    1. 수조를 42°C로 설정하고, 시판되는 적격 세포를 얼음 상에서 해동시킨다.
      참고: 이 단계는 1.4단계 이전에 수행할 수 있으며 Gibson 반응을 준비하고 배양하는 동안 세포를 해동할 수 있습니다.
    2. 30-50 μL의 세포를 2.0 mL 마이크로 원심분리 튜브에 분취합니다. 분취량에 2μL의 Gibson 반응을 추가하고 Gibson의 ID로 튜브에 라벨을 붙입니다. 세포를 얼음 위에서 30 분 동안 배양하십시오.
      참고: 소화되지 않은 빈 벡터 5-10ng를 양성 대조군으로 사용하고 물을 음성 대조군으로 사용하십시오.
    3. 42°C 수조에서 30-45초 동안 셀을 열충격하고 즉시 튜브를 얼음으로 되돌리고 5분 동안 회복시킵니다.
    4. 얼음 위에 있는 동안 시중에서 판매되는 회수 배지 400-950μL를 추가합니다.
      참고: 이러한 실험에 사용된 회수 배지는 2% 식물성 펩톤, 0.5% 효모 추출물, 10mM NaCl, 2.5mM KCl, 10mMMgCl2, 10mM MgSO4 및 20mM 포도당을 함유한다.
    5. 얼음 상에서 회복한 후, 30-60분 동안 250RPM의 부드러운 교반과 함께 37°C에서 배양하여 세포를 완전히 회수한다.
    6. 5,000 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠릿화하고 400μL의 상청액을 제거하여 ~50μL의 박테리아를 플레이트에 남깁니다.
    7. 선택적 배지에 플레이트하고 37°C에서 밤새 배양한다.
      참고: 이 실험에 사용된 선택적 배지에는 100μg/mL 농도의 트립톤 1.0%, 효모 추출물 0.5%, 염화나트륨 1.0%, 한천 1-2%, 물 96-97%, 카베니실린이 포함되어 있습니다. 바이러스 역전 말단 반복(ITR)이 일치하는 서열을 가지며 상동 재조합을 겪을 수 있기 때문에 바이러스 플라스미드 클로닝을 위해 항상 재조합 결핍 박테리아 균주를 사용하십시오. 그러나, 박테리아의 recA- 균주는 여전히 낮은 수준의 재조합을 겪는다. 여기에 사용된 리포터 플라스미드는 ITR 중 하나의 서열이 변경되어 더 이상 다른 ITR과 완벽하게 일치하지 않는 자가 보완 AAV입니다. 30°C에서 박테리아를 성장시키는 것은 또한 상동 재조합의 속도를 더욱 늦추기 위해 권장됩니다.
  7. 클론을 확인하고 플라스미드를 복구합니다.
    1. 벡터에 어닐링하는 정방향 및 역방향 프라이머(재료 표)를 사용하여 PCR 마스터 믹스를 준비하고 삽입 위치의 측면을 지정합니다. 10 μL 부피를 0.2 mL PCR 스트립 튜브에 분취합니다.
    2. 14mL 둥근 바닥 튜브에 PCR 및 음성 대조군을 통해 검사되는 각 콜로니에 대해 하나씩 항생제 선택적 LB 브로스 5mL 분취량을 준비합니다.
    3. 멸균 이쑤시개 또는 피펫 팁을 사용하여 개별 콜로니를 선택하고 콜로니를 하나의 PCR 튜브 바닥으로 대략적으로 긁어냅니다.
    4. 콜로니가 PCR 마스터 믹스로 해리되면 이쑤시개 또는 팁을 LB 분취량 중 하나에 떨어뜨리고 14mL 튜브에 Gibson 반응 및 PCR 튜브 번호를 표시합니다.
    5. 콜로니 PCR 반응을 열 순환기에 놓고 표 2에 설명된 프로그램으로 순환합니다.
    6. 이쑤시개 또는 피펫 팁으로 접종된 5mL 액체 배양액을 37°C 및 180RPM으로 설정된 진탕 배양기에서 배양합니다.
    7. 100V의 0.7%-1% 아가로스 겔에서 30-60분 동안 콜로니 PCR 반응을 실행하고 겔 doc 이미징 시스템에서 밴드를 시각화합니다.
    8. 예측된 PCR 밴드를 표시하지 않는 5mL 배양물을 폐기합니다.
    9. 성공적으로 통합된 각 클론에 대해 5mL 배양물을 밤새 성장시킨 다음 상용 키트를 사용하여 4.5mL에서 플라스미드 미니 준비를 수행합니다. 액체 배양액 0.5mL를 예약하고 -80°C에서 글리세롤 스톡으로 저장합니다.
    10. 플라스미드 내에 포함된 전이유전자가 Sanger 시퀀싱42를 사용하여 바람직하지 않은 돌연변이가 없는지 확인합니다.
    11. 리포터 구축물이 성공적으로 클로닝된 것으로 확인된 후, 저장된 글리세롤 스톡을 사용하여 5mL 스타터 배양물을 접종하고 30°C 및 180RPM의 진탕 인큐베이터에서 8-16시간 동안 성장시킵니다.
    12. 액체배지가 흐려지면 스타터 배양액을 250-300mL의 신선한 선택적 LB 배지에 1,000배 희석하고 30°C 및 180RPM의 진탕 인큐베이터에서 최소 밤새 배양합니다. 그런 다음 상용 플라스미드 맥시 키트를 사용하여 플라스미드를 정제합니다.
      알림: 박테리아는 37 ° C에 비해 30 ° C에서 더 느리게 성장하지만 대규모 배양을 성장시킬 때 자발적인 재조합 속도를 늦추는 데 가장 적합한 온도입니다.
    13. XmaI 다이제스트를 수행하여 1.4.2-1.4.5단계를 사용하여 ITR의 재조합을 테스트하고 PacI 및 AscI 대신 XmaI를 대체합니다. 젤 doc 이미징 시스템에서 밴드를 시각화합니다.
      참고: 두 ITR이 모두 존재하는 rAAV 플라스미드는 이 다이제스트에 따라 젤에 두 개의 밴드를 생성합니다: 하나는 rAAV 게놈의 길이이고 다른 하나는 나머지 플라스미드 백본의 길이입니다. 밴드가 하나만 있으면 ITR은 상동 재조합을 거친 것이며 rAAV 플라스미드는 바이러스 입자를 패키징 할 수 없습니다. 여기에 설명된 rAAV 플라스미드 백본은 XmaI 부위가 ITR에서만 발생하도록 설계되었습니다. 인핸서 후보 삽입물에 XmaI 부위도 포함되어 있으면 예측된 밴드 결과 및 분석을 적절하게 업데이트합니다.

2. 패키지 rAAV를 얻습니다.

  1. 이 연구의 실험에는 패키지 rAAV (전문 또는 사내)를 사용하십시오.
    참고: rAAV를 패키징하는 방법에는 여러 가지가 있습니다. rAAV는 회사 또는 대학 핵심 시설에서 전문적으로 포장할 수 있습니다. rAAV는 또한 복잡성 및 특수 장비(43, 44)에 대한 필요성에 있어서 다양한 기술을 사용하여 사내에서 패키징될 수 있다. 주요 관심사는 고품질의 벡터를 얻는 것이며 감염성 역가가 높은 수준의 확실성으로 결정되었습니다. 전문적으로 포장된 rAAV와 사내 포장된 rAAV는 모두 이 연구에서 설명된 다양한 실험에 사용되었습니다.

3. rAAV 패키지 플라스미드를 신생아 마우스에 두개내 주사합니다.

  1. 배송을 위해 rAAV 혼합물을 준비합니다.
    1. 상이한 인핸서 리포터 바이러스 간의 발현 패턴을 비교하려는 의도라면, 비교하고자 하는 모든 바이러스의 역가를 가장 적게 농축된 바이러스와 일치하도록 모두 희석함으로써 균등화한다.
    2. 인핸서 리포터 바이러스와 구성적으로 발현된 대조군 리포터 바이러스의 2:1 또는 3:1 비율을 함께 혼합하고 소량의 패스트 그린 염료(최종 농도 0.06%)를 첨가합니다.
      참고: Fast Green은 AAV를 포함한 실험 동물의 주사에 널리 사용되는 염료로, 절차45,46,47,48 중 및 직후에 주사 부위를 시각화합니다. 이것은 중요한 품질 보증 단계이지만 염료를 첨가하면 형질도입을 방해할 수 있습니다. 주입 염료의 사용을 재고하는 것은 특정 경우에 프로토콜 최적화에 중요할 수 있습니다. 구성 구동 제어 바이러스는 독립적 인 주사를 비교하는 데 절대적으로 중요합니다. 바이러스 주사는 동물에서 동물로의 형질 도입 위치와 정도에 따라 다릅니다. 구성적 제어는 실패한 주사를 분석에서 제외할 수 있게 하고 바이러스 전달의 변이의 정상화를 위한 표준을 제공합니다.
    3. μL 눈금이 매겨진 모세관으로 만든 멸균 뽑은 유리 피펫의 끝을 70% 에탄올에 담가 멸균된 섬세한 물티슈로 부드럽게 뚫고 완전히 건조시킵니다. 그런 다음 당겨진 유리 피펫을 마이크로 모세관 피펫을 고정하기위한 고무 가스켓으로 끝나는 15 인치 길이의 고무 튜브에 연결된 압력을 가하는 장치로 구성된 흡인기 어셈블리에 삽입합니다.
      알림: "압력을 가하는 장치"는 주사기 또는 마우스피스일 수 있습니다. 주사기를 사용하는 경우 실험자가 한 손에는 피펫을, 다른 한 손에는 동물을 조작하는 동안 두 번째 사람이 주사기를 통해 압력을 가해야 합니다. 마우스피스를 사용하는 경우 실험자가 동물과 피펫의 위치와 주사기에 가해지는 압력을 모두 미세하게 제어할 수 있으므로 바이러스 오염을 방지하기 위해 각별한 주의가 필요합니다.
    4. 흡인기 어셈블리를 통해 음압을 가하여 소량의 미네랄 오일(~0.2-0.5μL)을 유리 피펫으로 끌어들입니다.
      알림: 이 단계는 에어로졸화된 바이러스 입자가 흡인기 어셈블리를 오염시키는 것을 방지하기 위한 장벽을 제공하는 데 매우 중요합니다.
    5. 준비된 흡인기 어셈블리를 옆에 두고 주사할 준비가 될 때까지 바이러스를 얼음 위에 보관하십시오.
  2. 페달 철수 반사가 멈출 때까지 얼음에 부분적으로 잠긴 마른 플라스틱 접시에 신생아 마우스를 냉동 마취합니다(~5분). 마우스가 얼음과 직접 접촉하지 않도록하십시오.
  3. 메니스커스가 2μL 눈금 표시를 통과할 때까지 흡인기 어셈블리를 통해 음압을 사용하여 바이러스 혼합물을 당겨진 유리 피펫으로 끌어들입니다.
  4. 차가운 챔버에서 마우스를 꺼내 벤치 탑에 놓습니다. 람다와 브레그마 사이의 중간과 시상 봉합사와 각 눈 사이의 중간에 양측 주사 부위를 찾습니다. 알코올 물티슈로 두 부위를 모두 소독하십시오.
  5. 당겨진 유리 피펫을 사용하여 신생아 마우스의 두개골을 뚫고 바늘이 뇌에 들어갈 때 흡인기 어셈블리를 통해 양압을 부드럽게 가합니다. 바이러스 혼합물의 반월 상 연골을보십시오. 적용된 압력에 대한 저항은 피펫의 끝이 측심실에 도달하면 감소합니다. 1μL의 바이러스를 분주하고 피펫을 빼낸 다음 다른 측심실에 대해 반복합니다.
  6. 마우스를 가열 패드 또는 온난화 챔버에 올려 복구하십시오. 깨어 있고 활성화되면 동물을 집 케이지로 되돌립니다.

4. 조직을 수집하고 면역 조직 화학을 수행합니다.

  1. 바이러스 형질도입 후 충분한 시간이 지난 후, 마우스를 마취시키고 심근 관류에 의해 희생시킨다.
    참고: 여기에 표시된 대표적인 결과를 포함한 많은 실험에서 바이러스가 형질도입되는 데 4주 이상의 기간을 허용합니다. 그러나 자기 보완 AAV는 빠르면 7 일12에 강한 발현을 보일 수 있습니다. 원하는 잠복기는 특정 실험 기술 및 목표에 따라 최적화해야 할 수도 있습니다.
    1. 정맥 주입 튜브와 25G 바늘이있는 연동 펌프를 준비하십시오.
    2. 1x PBS와 4% 파라포름알데히드(PFA)를 준비하고 얼음 위에 놓습니다.
    3. 튜브의 흡입 끝을 얼음처럼 차가운 1x PBS에 놓습니다. 유속(P7 마우스의 경우 2.5mL/분, P28 마우스의 경우 3.5mL/분)을 설정하고 버퍼가 튜브를 통해 완전히 당겨지고 기포가 제거될 때까지 펌프를 실행합니다. 관류 준비가 될 때까지 바늘을 따로 보관하십시오.
    4. 흄 후드 내부에서 소량의 이소플루란을 드롭 용기 챔버 바닥에 있는 종이 타월에 피펫팅합니다. 이전에 주사한 마우스를 종이 타월 위의 화격자에 놓고 이소플루란과 직접 접촉하지 않도록 합니다. 마우스를 마취하기 위해 챔버를 밀봉하십시오. ~5분 동안 기다린 다음 챔버를 열고 페달 철수 반사를 확인합니다. 동물이 의식을 잃으면 진행하십시오.
      알림: 관류 전반에 걸쳐 마우스는 의식 회복을 방지하기 위해 코 콘이 있는 이소플루란에 유지되어야 합니다.
    5. 수술 용 가위를 사용하여 마우스의 복부와 가슴을 열고 흉곽을 제거하고 심장을 노출시킵니다.
    6. 한 쌍의 홍채 마이크로 가위를 사용하여 마우스의 우심방에 작은 절개를하고 IV 바늘을 좌심실에 삽입하고 연동 펌프를 활성화합니다.
    7. 우심방의 절개 부위에서 흘러 나오는 혈액이 깨끗해질 때까지 얼음처럼 차가운 1x PBS로 동물을 관류하십시오. 적혈구가자가 형광을 가지고 있고 혈관이 리포터 발현 세포를 이미지화하는 능력을 손상시킬 수 있기 때문에 혈액 조직을 깨끗이하는 것이 매우 중요합니다.
    8. 연동 펌프를 일시 중지하고 흡기 튜브를 PBS에서 4% PFA로 옮깁니다. 펌프를 다시 활성화하고 체중 1mL/g(성인 마우스의 경우 ~25mL)을 관류합니다.
      알림: 고정 떨림이 관찰 가능해야 하며 마우스 본체가 뻣뻣해져야 합니다.
  2. 뇌를 해부하고 사후 수정합니다.
    1. 수술 용 가위로 마우스 머리를 제거하십시오.
    2. 작은 수술 용 가위를 사용하여 두개골 바닥에서 시작하여 머리 정중선을 따라 절개를하고 피부와 밑 조직을 뒤로 당겨 두개골을 노출시킵니다.
    3. 홍채 가위를 사용하여 구멍 매그넘에서 시작하여 후각 구근이 통과 할 때까지 시상 봉합사를 따라 계속해서 두개골의 뒤쪽을 조심스럽게 자릅니다.
    4. 후각 구근 위의 두개골에 가위를 삽입하고 두개골을 두 번 수평으로 자릅니다. 후두골에서 비슷한 수평 절단 쌍을 만드십시오. 수평 및 정중선 절단은 두개골 상단에 한 쌍의 문 모양의 플랩을 만듭니다.
    5. 두개골의 플랩을 벗겨 뇌를 완전히 노출시킵니다. 한 쌍의 핀셋을 사용하여 두개골에서 후각 구근을 절단하고 뇌신경을 절단하여 두개골에서 뇌를 자유롭게하십시오.
    6. PBS에 3-5mL의 4% PFA가 포함된 15mL 원추형 튜브에 뇌를 떨어뜨립니다. 수정 후 6 시간에서 밤새도록. 티슈를 과도하게 고정하지 마십시오.
  3. 냉동 절제를 위해 뇌를 준비하십시오.
    1. 탈수를 위해 고정된 뇌를 PBS에 12-14mL의 30% 자당이 있는 새로운 15mL 원추형 튜브로 옮깁니다. 뇌가 튜브 바닥으로 가라앉을 때까지 4°C에서 배양합니다(2-3일).
    2. 고정 및 탈수된 뇌를 15mm x 15mm x 5mm 냉동 몰드의 최적 절단 온도(OCT) 화합물에 담그십시오. 뇌가 완전히 덮일 때까지 OCT를 추가하십시오.
    3. 드라이 아이스 블록에 저온을 놓고 샘플을 OCT의 고체 블록에서 동결시킵니다 (~ 5 분).
      참고: OCT 블록은 -80°C에서 수개월에서 몇 년 동안 보관할 수 있습니다.
    4. cryomold에 샘플 이름과 뇌의 방향을 표시하십시오.
  4. 저온 유지 장치 마이크로톰을 사용하여 관상 동맥 절편을 얻습니다.
    1. 연필로 OCT 블록에 뇌의 방향을 표시하고 저온 유지 장치 내부의 저온에서 블록을 제거합니다.
    2. 뇌가 저온 유지 장치의 블레이드를 향하도록 후각 구근을 향하도록 OCT 블록을 배치하고 블록을 신선한 OCT로 저온 유지 장치의 물체 홀더에 부착합니다.
    3. 제자리에 고정되면 50-4.4.4단계에 따라 블록을 통해 4.4.4.6μm 섹션 절단을 시작합니다.
    4. 안티롤 플레이트를 사용하지 마십시오. 섹션은 절단될 때 단단한 롤로 말려서 블록 위에 수집되거나 수집 트레이 아래로 떨어집니다.
    5. 처음 몇 컷에서 블록의 모양을 관찰하십시오. 블록을 수직으로 절단하여 절단을 시작할 때 균일한 면을 만듭니다. 필요한 경우 샘플 조정 암을 사용하여 각도를 조정합니다.
    6. 후각 구근이 보이면 섹션의 모양에 세심한주의를 기울이십시오. 하나가 다른 것보다 크게 보이면 절단이 뇌에 대해 비스듬히 기울어 지므로 샘플 조정 암을 사용하여 블레이드에 대한 뇌의 방향을 곧게 펴야합니다.
      알림: 똑바로 자르면 피질이 각 후각 전구 위에 동시에 나타나기 시작해야합니다.
    7. 후각 구근이 절편화되고 뇌 조직이 보이면 절단 두께를 30-35 μm로 줄이고 부유 섹션을 수집하기 시작합니다. 뇌를 절단하기 위해 4.4.8-4.4.13 단계를 따르십시오.
    8. 블록 및 객체 홀더에서 모든 이전 섹션을 브러시하여 수집 트레이에 떨어지도록 합니다. 트레이의 한쪽으로 털어내고 따로 보관하십시오. 더미가 너무 크면 트레이를 비우십시오.
    9. 1mL의 PBS를 24웰 플레이트의 각 웰에 분주합니다. 각 브레인에 대해 1개의 행에 레이블을 지정합니다.
    10. 6 개의 관상 동맥 섹션을 자릅니다. 차가운 핀셋을 사용하여 섹션을 검색하고 저온 유지 장치에 배열합니다. 이 단계를 2 또는 3 번 반복하여 6 개 섹션의 그룹을 분리합니다.
    11. 크기 000 페인트 브러시를 PBS로 적시고 보푸라기가없는 티슈 나 종이 타월에 과도한 액체를 닦아냅니다. 붓을 사용하여 각 섹션을 한 번에 하나씩 부드럽게 들어 올려 24 웰 플레이트의 적절한 우물에 놓습니다.
    12. 슬라이스 그룹의 6개 섹션 중 하나를 24웰 플레이트의 행에 있는 6개의 웰 각각에 놓습니다. 이것은 각 우물이 뇌의 단면 영역에 걸쳐 있는 대표적인 섹션을 포함하도록 합니다.
    13. 대뇌 피질의 꼬리 끝이 절개 될 때까지 6 개의 그룹으로 계속 절단하십시오.
    14. 보관을 위해, 24웰 플레이트를 파라필름으로 밀봉하고 4°C에서 보관한다.
      알림: 섹션은 4 ° C에서 1-2 개월 동안 안정적입니다. 0.1% 아지드화나트륨이 포함된 PBS 용액을 사용하여 박테리아 성장을 억제하고 섹션의 저장 수명을 연장할 수 있습니다. 그러나 섹션을 2 개월 이상 보관할 경우 최상의 결과를 얻으려면 동결 방지제 용액에 넣고 -20 ° C에서 냉동해야합니다.
  5. 리포터 유전자 신호 증폭을 위한 면역조직화학을 수행한다.
    알림: 항원 검색을 제외한 모든 단계는 궤도 셰이커에서 온화한 교반(~100RPM)을 사용하여 수행해야 합니다. 대조군 리포터(mRuby3)의 천연 형광을 보존하려면 모든 단계를 가능한 한 빛으로부터 보호해야 합니다.
    1. 표 3에 설명된 대로 필요한 버퍼를 준비합니다.
    2. 염색되는 각 뇌에 대해 한 줄씩 있는 새로운 24웰 플레이트를 준비합니다. 웰의 첫 번째 열에 각 웰에 1mL의 PBS를 추가합니다.
    3. 크기 000 페인트 브러시를 사용하여 원래 수집 웰에서 새 24웰 플레이트의 새 PBS로 섹션 1웰을 부드럽게 옮겨 빠르게 헹구어 잔류 OCT 화합물을 제거합니다.
    4. 24웰 플레이트의 다음 웰에 1mL의 ARB를 추가하고 이 웰로 섹션을 옮깁니다. 60°C의 오븐에서 1시간 동안 배양합니다.
    5. 플레이트를 실온(RT)에서 20분 동안 식힙니다.
    6. 다음 웰에 PB 1mL를 추가하고 섹션을 이 웰로 옮깁니다. RT에서 20 분 동안 배양하십시오.
    7. 500 μL의 BB를 다음 웰에 추가하고 섹션을 이 웰로 옮깁니다. RT에서 1 시간 동안 배양하십시오.
    8. BB에 2mL의 WB를 추가한 다음 ~2mL의 용액을 피펫팅하고 버리고 희석된 BB 용액을 웰에 남겨 둡니다. 섹션이 명확하게 보일 때까지 반복하십시오.
    9. 1차 항체(치킨 IgY 항-GFP, 1:1000)를 BB로 희석합니다. 350-500 μL의 1차 항체 용액을 다음 웰에 추가하고 섹션을 이 웰로 옮깁니다. 플레이트를 파라필름으로 밀봉하고 4°C에서 밤새 배양한다.
    10. 섹션이 명확하게 보일 때까지 이전에 수행한 것처럼 BB를 WB로 희석합니다.
    11. 다음 웰에 1mL의 WB를 추가하고 섹션을 이 웰로 옮깁니다. RT에서 20 분 동안 배양하십시오.
    12. ~800-900 μL의 버퍼를 제거하고 폐기합니다. 신선한 WB 1mL를 넣고 20분 동안 배양합니다. WB 1mL를 4회 더 교체하여 각각 20분씩 총 5회 세척합니다.
    13. 2차 항체(당나귀 항-닭 알렉사 플루어 488 접합, 1:500)를 BB로 희석한다. 350-500 μL의 2차 항체 용액을 새 웰에 추가합니다. RT에서 45 분에서 1 시간 동안 배양하십시오.
      참고: 이것은 일곱 번째 우물이므로 2개 이상의 뇌에서 섹션을 염색하는 경우 이 시점에서 새 플레이트가 필요합니다.
    14. 이전과 같이 BB를 WB로 희석하고 1mL의 WB로 채워진 새로운 웰로 섹션을 옮깁니다. 이전에 20 분 동안 3 번 한 것처럼 섹션을 씻으십시오.
    15. PBS (최종 농도 0.04-0.8 μg / mL)에서 DAPI의 작업 용액을 준비하십시오. 빛으로부터 용액을 보호하십시오.
    16. 1mL DAPI 용액을 다음 웰에 추가하고 섹션을 이 웰로 옮깁니다. RT에서 ~ 5 분 동안 배양하십시오.
    17. 섹션을 다시 WB로 옮기고 크기 000 페인트 브러시를 사용하여 현미경 슬라이드에 부드럽게 장착합니다. 슬라이드를 자연 건조시킵니다.
    18. 적절한 장착 미디어로 커버슬립을 적용합니다. 밤새 어둠 속에서 RT에서 슬라이드가 경화되도록 합니다.

5. 인핸서 활동에 대한 뇌 조직 절편을 이미지화하고 분석합니다.

  1. 저배율(5x) 대물 렌즈를 사용하여 뇌 부분에 걸쳐 있는 형광 이미지를 기록합니다.
  2. 주사 부위를 찾고 적색 형광 세포의 밀도와 강도를 기반으로 바이러스 형질도입 정도를 평가합니다. 유사하게 형질 도입 된 동물을 비교하도록주의하십시오.
  3. 원하는 경우 고배율 대물 렌즈(≥25x)로 상세한 형광 이미지를 기록합니다.
    알림: 여기광 강도, 필터 및 비교할 샘플 간 노출 시간과 같은 획득 매개변수에 대해 항상 동일한 설정을 사용해야 합니다.
  4. 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 이미지를 처리합니다.
    참고: 처리는 모든 이미지 분석 소프트웨어 패키지에서 수행할 수 있습니다. 다음 단계는 시퀀스가 ImageJ의 오픈 소스 FIJI 배포를 사용하여 리포터 구성 컨텍스트(예 또는 아니오 질문)에서 인핸서 역할을 하는지 여부를 결정하기 위한 제안입니다. 보다 심층적인 측광법은 인핸서 변이체 간의 활성 정도를 비교할 때 적절할 수 있습니다. 서로 다른 샘플의 이미지는 비교하기 위해 항상 일관되게 처리되어야 합니다.
    1. 필터를 적용하여 노이즈를 줄입니다. 피지에서는 노이즈 처리 메뉴에서 얼룩 제거 옵션을 선택합니다>.
      참고: 이것은 3 x 3 중앙값 필터입니다.
    2. 5.4.3-5.4.6단계에 따라 배경 형광을 뺍니다.
    3. 다중 채널 이미지의 채널을 분리합니다. 피지에서는 이미지 > 색상 메뉴에서 채널 분할 옵션을 선택합니다.
    4. 사각형 또는 원 선택 도구를 사용하여 형광 셀이 없는 이미지 영역에 작은 모양을 그리고 [ 측정 분석]을 사용하여 배경의 평균 픽셀 강도를 측정> 있습니다. 여러 영역을 샘플링하려면 반복합니다.
      참고: 측정 분석 > 설정 메뉴에서 평균 회색 값이 선택되어 있는지 확인하십시오.
    5. 배경의 5-8개 영역에서 평균 회색 값을 평균하고 소수점을 삭제합니다. >수학 처리 > 빼기를 사용하여 이미지의 각 픽셀에서 이 값을 뺍니다.
      참고: 가장 가까운 정수로 반올림하면 뺄 배경을 과대 평가할 수 있습니다. 단순히 소수점을 삭제하는 것이 더 보수적입니다. 예를 들어 6.4는 6으로 내림되지만 각 픽셀에서 실제 신호의 0.5단위를 뺄 위험을 방지하기 위해 6.5도 6으로 내림해야 합니다.
    6. 원하는 경우 채널을 다중 채널 이미지로 다시 병합합니다. 피지에서는 이미지 > 색상 > 병합 채널을 사용합니다.
    7. 겹치는 이미지를 함께 연결합니다. 피지에서는 플러그인 > 스티칭 > 그리드/컬렉션 스티칭을 사용합니다.
    8. 밝기와 대비를 조정합니다. 피지에서는 이미지를 사용하여 밝기/대비> 조정> 사용합니다.
      참고: 비교할 각 이미지에 대해 항상 동일한 최소값과 최대값을 사용하십시오.
    9. 5.4.10-5.4.12단계에 따라 녹색 형광 세포의 수를 세십시오. 이들은 후보 인핸서 서열이 리포터 발현을 구동할 수 있었던 세포들이다.
    10. 녹색 채널을 숨기고 자유형 선택 도구를 사용하여 빨간색 형광을 표현하는 뇌 영역 주위에 모양을 그립니다. 피지에서 측정 기능을 사용하여 이 구역에 있는 빨간색 채널의 면적, 통합 밀도 및 평균 회색 값을 측정 합니다.
    11. 다중 점 선택 도구를 사용하여이 영역의 녹색 셀 수를 세십시오.
    12. 빨간색 채널의 통합 밀도로 녹색 셀 수를 표준화합니다. 국소 적색 채널 밝기는 바이러스 노출 정도에 대한 프록시 측정으로, 서로 다른 형질 도입 된 동물 간의 인핸서 활성을 비교할 수 있습니다.

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Representative Results

이러한 방법을 사용하여, CACNA1C19,49,50 유전자의 정신과적 위험-관련 제3 인트론에서의 915 bp 서열을 출생 후 마우스 뇌에서 인핸서 활성에 대해 시험하였다. 이 서열은 정신과 및 신경학적 위험 SNPs12를 중심으로 한 345개의 후보 인핸서 서열의 MPRA에서 발견되었으며, 특성화 실험은 일반적인 예로서 여기에 기술되어 있다. C57BL/6 마우스를 Hsp68 최소 프로모터 및 단일 후보 인핸서 서열의 제어 하에 EGFP를 함유하는 자가-상보적 벡터51로서 패키징된 AAV9 구축물과 함께 P0에 주입하였다(도 3A). 추가 마우스에 조절 활성이 없는 것으로 예측되는 음성 대조군 서열을 포함하는 작제물을 주입하였다(도 3B). 이들 작제물에 대한 바이러스 역가는 6.85 x 1010 vg/mL로 정규화되었다. 모든 주입된 마우스는 성공적으로 형질도입된 영역을 시각화하고 감염의 부위 및 확산의 잠재적 변동성을 제어하기 위해 구성적 CAG 프로모터의 제어 하에 mRuby3를 포함하는 AAV9 패키지 구축물과 함께 공동 주입되었습니다. 뇌는 면역 조직 화학 및 영상을 위해 출생 후 일 (P) 28에 수집되었습니다. 이들 실험은 CACNA1C의 후보 인핸서 영역이 P28 마우스 뇌에서 EGFP의 발현을 유도하는 반면(도 3A), 음성 대조군 서열은 그렇지 않다는 것을 확인하였다(도 3B). 이러한 결과는 마우스 뇌에서 인핸서-리포터 분석의 적용을 입증하여 기존의 in vitro 모델을 사용하여 요약할 수 없는 조건에서 인핸서의 in vivo 연구를 가능하게 합니다.

이들 방법은 또한 MPRA에서와 같이 AAV 기반 전달 방법을 사용하여 활성에 대한 후보 인핸서 서열의 라이브러리를 테스트하는 데 사용될 수 있다. 상이한 역가에서의 라이브러리 기반 리포터 발현의 대표적인 이미지는 이 분석의 유연성과 형질도입 효율에 대한 바이러스 역가의 효과를 입증한다. 높은 역가(도 4A) 대 저역가(도 4B) 바이러스 제제는 CAG 프로모터에 의해 구동되는 양성 대조군 mRuby3 발현 및 출생 후 마우스 뇌의 후보 인핸서 라이브러리로부터 생성된 EGFP 발현 모두에 의해 입증되는 바와 같이 형질도입된 세포의 양의 차이를 초래한다. 높은 역가와 넓은 형질도입 또는 낮은 역가와 희박한 형질도입이 선호될 수 있는 상황이 있습니다.

Figure 1
그림 1: 프로토콜 개요. 이 분석의 핵심 요소에는 후보 인핸서 요소, 최소 프로모터, 리포터 유전자 및 분석 설계에 따라 고유한 태깅을 위한 바코드 서열이 포함됩니다. 이러한 요소는 AAV 플라스미드 백본에 클로닝되고 AAV로 패키징됩니다. 바이러스는 동물에게 전달되어 며칠 또는 몇 주 동안 배양됩니다. 마지막으로, 관심 조직을 수집하고 이미징 또는 시퀀싱을 통해 인핸서 활성을 확인합니다. 인핸서 구동 전이유전자 발현은 구성적 동인과 달리 세포 유형, 국소 및 시간적 특이성을 갖는 발현을 생성할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 분석 설계의 유연성. (A) 플라스미드 배향은 STARR-seq28에서와 같이 인핸서를 최소 프로모터 또는 리포터 유전자의 하류의 상류에 배치할 수 있다. 서열 기반 판독의 경우 바코드가 리포터 유전자의 다운스트림에 포함되거나 인핸서가 두 번째 배향에서 자체 바코드 역할을 할 수 있습니다. (B) 뇌에 대한 일반적인 바이러스 전달 기술은 두개내 주사, 역-궤도 주사 또는 꼬리-정맥 주사를 포함하며, 이는 상이한 조직에서 형질도입된 세포의 상이한 밀도를 초래할 수 있다. (C) 판독값은 시퀀싱 기반 또는 이미징 기반일 수 있습니다. 시퀀싱 기반 판독에서 인핸서 활성은 입력 DNA 서열 대 RNA 서열의 상대적 증가(AAV 전달 제어)로 정의됩니다. 영상화 판독에서, 리포터 유전자의 발현은 인핸서가 활성인 곳에서 증가된다. (D) 정신과적 위험 관련 유전자 CACNA1C에서 잠재적인 인트론 인핸서가 강조됩니다. 상단 이미지에서 GWAS 테스트 형질에 대한 강한 연관성 및 PLAC-seq20을 통한 CACNA1C 프로모터와의 상호 작용을 보여주는 광범위한 영역이 선택됩니다. 삽입물에서, 서열 수준에서 진화 적으로 보존되고, 개방 염색질 영역에 있으며, 인핸서를 나타내는 후성 유전 학적 표시를 나타내는 더 작은 후보 영역이 확인된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: CACNA1C의 인핸서는 P28 마우스 뇌에서 EGFP 발현을 유도합니다. (A) 인핸서-리포터 구축물 (scAAV9-Hsp68-EGFP-CACNA1C_3)과 구성 적으로 발현 된 주사 대조군 (AAV9-CAG-mRuby3)으로 P0에 두개 내 주사 된 마우스는 P28에서 피질의 중간 하층에서 인핸서 구동 EGFP 발현을 나타낸다. (b) 음성 대조군 작제물 (scAAV9-Hsp68-EGFP-NEG_4)과 함께 P0에 주사된 마우스와 주사 대조군은 P28에서 EGFP의 발현을 나타내지 않는다. 전체 뇌 이미지는 5x 배율로 촬영되었으며 삽입물은 박스형 영역의 확대 보기를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: AAV 전달 인핸서-리포터 라이브러리는 다양한 역가의 마우스 뇌에서의 활동을 보여줍니다. (A) 상업적으로 패키징 된 고 역가 AAV-PHP.eB 후보 인핸서 라이브러리는 P7 마우스 뇌에서 광범위한 EGFP 발현을 유도합니다. (b) 패키징 세포의 조절된 배지로부터 침전된 후보 인핸서의 저역가 AAV9 라이브러리는 P7 마우스 뇌에서 희박한 EGFP 발현을 유도한다. 이미지는 5배 배율로 촬영되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

PCR 반응 믹스
5x 반응 버퍼 10 μL
dNTP 각각 200μM의 최종 농도
클로닝 프라이머 각각 0.2μM의 최종 농도
템플릿 DNA 50 응엔
고 충실도 중합 효소 최종 농도 0.02 U/μL
뉴클레아제가 없는 물 최종 반응 부피 50 μL에 도달
열순환 조건
다음의 30 사이클 : 노트
걸음 온도 시간
변성 98 °C 10초
어닐링 60 °C 20초 최적 온도는 프라이머에 따라 다를 수 있습니다.
뻗치다 72 °C 30초 최적의 온도와 지속 시간은 중합효소에 따라 다를 수 있습니다.
최종 확장 72 °C 2 분 최적의 온도와 지속 시간은 중합효소에 따라 다를 수 있습니다.
들다 4 °C

표 1: PCR 반응 혼합 및 열순환 조건.

열순환 조건
다음의 30 사이클 : 노트
걸음 온도 시간
세포 용해 98 °C 5 분
변성 98 °C 10초
어닐링 55 °C 15초 최적 온도는 프라이머에 따라 다를 수 있습니다.
뻗치다 72 °C 30초 최적의 온도와 지속 시간은 중합 효소에 따라 다를 수 있습니다.
들다 4 °C

표 2: 콜로니 PCR에 대한 열순환 조건.

면역조직화학을 위한 완충액
완충기 구성
1x PBS 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4
1x 구연산염 항원 검색 버퍼 (ARB), pH 6.0 독점, 자료 표 참조
투과화 버퍼 (PB) 1x PBS + 0.5 % 트리톤 X100
워시 버퍼 (WB) 1x PBS + 0.1 % 트리톤 X100
블로킹 버퍼 (BB) WB + 5 % 우유

표 3: 면역조직화학을 위한 완충액.

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Discussion

이 프로토콜은 출생 후 마우스 뇌에 인핸서 구동 전이유전자를 배치하기 위한 rAAV 기반 방법을 설명합니다. 이 일반화된 프로토콜에서, 후보 인핸서, 최소 프로모터, 리포터 유전자 및 선택적 바코드 서열이 AAV 플라스미드 백본으로 클로닝된다. 이러한 실험은 단일 후보 인핸서 서열 또는 병렬로 많은 서열로 수행할 수 있습니다. 플라스미드는 rAAV로 포장되어 출생 후 마우스 뇌로 전달됩니다. 바이러스 형질도입을 허용하기 위한 일정 기간 후에, 뇌는 리포터 유전자 발현을 위해 수집되고 이미지화된다. 구성적으로 발현된 리포터 바이러스(CAG-mRuby3)가 주사 대조군으로서 포함된다. 이 분석을 사용하여 인핸서 요소는 마우스 뇌에서 EGFP의 전사를 유도하여 생체 내에서 인핸서 활성을 입증하는 것으로 나타났습니다.

이 분석의 문제 해결 및 최적화를 위한 주요 목표에는 바이러스 역가, 주입 기술 및 형질도입 시간 프레임이 포함됩니다. 상이한 바이러스 역가는 형질도입된 세포의 밀도에 강한 영향을 미칠 수 있다. 대부분의 연구에서 더 높은 형질 도입 효율이 바람직 할 수 있지만, 최적의 형질 도입 수준은 실험 목표에 크게 의존합니다. 두개내 주사는 형질도입된 세포의 고밀도를 제공하지만, 감염의 확산은 바이러스 혈청형 및 동물의 연령에 의존할 수 있지만, 주사 부위에서 더 집중적일 가능성이 있다(52). 역-안와 주사는 뇌 전체에 형질도입된 세포의 더 고르게 분포를 보일 수 있지만 감염이 많은 영역을 제공할 가능성은 적습니다. 꼬리 정맥 주사는 뇌 외에 다른 조직을보다 효과적으로 형질 도입 할 수 있지만 뇌에서 형질 도입 된 세포의 밀도를 여전히 낮출 수 있습니다. 유사하게, 뇌에서 바이러스 형질도입을 위한 다양한 시간 프레임이 다른 목적을 수행할 수 있습니다. 강력한 scAAV 발현은 두개내 주사 후 빠르면 7일 이내에 뇌에서 발생할 수 있지만 28일 이상의 기간이 더 일반적으로 사용되며 강한 발현을 산출합니다. 인핸서는 그의 활성에서 시간적으로 특이적일 수 있으므로, 연구 설계를 결정할 때 시험된 인핸서의 예측된 활성을 고려하는 것이 중요하다.

실험 목표에 따라 다른 옵션을 더 적합한 선택으로 만들 수 있는 이러한 방법과 관련된 몇 가지 제한 사항이 있습니다. AAV는 게놈으로의 낮은 통합을 나타내기 때문에 조직은 성숙할 때 가장 효과적으로 형질도입되고 많은 양의 지속적인 세포 분열이 전이유전자 발현 세포의 밀도를 낮추기 때문에 유사분열 후 세포의 밀도가 높습니다. 아직 성장하고 있는 조직과 같이 덜 성숙한 모델에 전이유전자를 바이러스로 전달하는 경우, 렌티바이러스는 게놈에 통합되고 형질도입된 증식 세포의 모든 딸 세포에 의해 유전되기 때문에 더 적절한 선택일 수 있습니다. 또한 여기에 설명 된 리포터 분석은 cis- 조절 활동의 기능적 연구에 널리 사용되는 기술이지만 규제 요소가 고유 한 컨텍스트 내에서 어떻게 작용하는지에 대한 완전한 그림을 제공 할 수는 없습니다. 예를 들어, 이 분석은 게놈 내의 조절 요소에 의해 표적화될 수 있는 유전자에 대한 정보를 제공하지 않는다. 그러나, 인핸서의 표적 유전자가 알려진 경우, 이 정보를 활용하여 이 분석에서 발현을 나타내는 세포 유형이 인핸서의 표적 유전자를 발현하는 것으로 알려진 세포 유형과 동일한지 여부를 결정할 수 있으며, 이는 결과의 해석에 높은 생물학적 타당성을 제공할 것이다. 상기 분석은 또한 주변 게놈 서열 또는 동물의 정상적인 생물학적 및 행동적 활성이 시험된 조절 요소의 활성에 미칠 수 있는 효과를 완전히 요약하지 못할 수 있다. 마지막으로, 이 프로토콜은 STARR-seq 리포터 분석 설계를 설명하며, 여기서 후보 인핸서 요소는 종래의 리포터 분석 클로닝 방향에서와 같이, 프로모터의 상류와 대조적으로, ORF에서 리포터 유전자의 하류로 클로닝된다. 리포터 유전자의 ORF에 긴 가변 서열을 포함하면 RNA 결합 단백질 모티프, 대체 스플라이스 부위 또는 가변 GC 함량(36,53)과 같은 요인으로 인해 RNA 안정성이 감소할 수 있으며, STARR-seq 데이터(54,55)를 분석할 때 서열 기반 편향을 설명하기 위한 통계적 방법이 개발되었습니다. 이러한 고려사항에도 불구하고, STARR-seq MPRA는 최근 몇 년 동안 시스-조절 요소56,57,58,59를 성공적으로 식별하기 위해 널리 사용되어 왔다. 여기에 설명된 방법은 종래의 MPRA 배향과 함께 사용하도록 쉽게 적응될 수 있다.

인핸서의 세포 유형 특이성은 이 분석을 생체 내에서 관심 유전자의 세포 유형 특이적 발현을 유도하는 강력한 도구로 만듭니다. 원하는 유전자의 세포 유형 특이적 발현을 위한 현재의 기술은 조건부 발현 작제물의 이용가능성에 의해 제한되거나 새로운 트랜스제닉 마우스 라인의 생성을 필요로 할 수 있다. rAAV 기반 인핸서-구동 시스템을 이용하여, 관심 유전자는 발현13,14,15를 구동하기 위해 검증된 세포-유형-특이적 인핸서 또는 프로모터를 사용함으로써 시공간적으로 특이적인 방식으로 발현될 수 있다. 이 기술의 최근 개발은 관심 세포 또는 조직에 대한 향성을 갖는 rAAV 혈청형과 함께 세포 유형-특이적 인핸서를 조합하는 것이 트랜스제닉 동물 모델에서와 같이 전이유전자 발현의 유사한 특이성을 나타낼 수 있음을 보여주었다60. 이는 동물 모델에서 생체 내에서 전이유전자 발현의 서열 스크리닝 및 특이적 유도를 위한 저렴하고 빠르며 잠재적으로 높은 처리량 방법을 제공합니다.

이 기술은 또한 치료 잠재력을 가지고 있습니다. 임상 연구에 따르면 생체 내에서 도입 유전자의 rAAV 기반 전달은 결함이있는 사본 만 존재하거나 유전자가 충분한 속도로 전사되지 않는 경우 유전자의 건강한 사본의 발현을 유도 할 수 있습니다61,62,63. 구동 인핸서 요소의 선택은 일반화된 전달을 가능하게 하지만 세포 유형 특이적 방식으로 발현 유도를 가능하게 할 잠재력을 갖는다. 마지막으로, rAAV를 통해 전이 유전자를 전달하는 것은 또한 상당한 이점을 제공합니다. AAV는 전이유전자 전달에 자주 사용되는 다른 바이러스보다 면역원성이 낮기 때문에64 임상용으로 사용할 수 있는 잠재적으로 안전한 바이러스 벡터입니다.

생체 내 rAAV 기반 인핸서-리포터 분석의 특정 배포는 사용자 정의가 가능하며 다양한 실험 목표에 맞게 수정할 수 있습니다. 상이한 조직 및 세포는 세포 유형 또는 시공간 특이성을 갖는 AAV 혈청형 또는 인핸서를 선택함으로써 표적화될 수 있다. 어느 곳에서나 하나 내지 수천 개의 인핸서-리포터 구축물이 생체내에서 전달될 수 있고, 활성은 이러한 접근법을 사용하는 새로운 일련의 연구에서 보여진 바와 같이, 다수의 이미징- 및 시퀀싱-기반 판독을 사용하여 분석될 수 있다 15,16,65,66,67,68 . 구성 설계 및 전달을 위한 다양한 옵션을 통해 이 기술을 번역 및 기초 과학 모두에서 다양한 용도로 수정할 수 있으므로 유전체학 및 신경과학 연구를 위한 강력한 새 도구가 됩니다.

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Disclosures

저자는 경쟁하는 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

Acknowledgments

시퀀싱은 UC Davis DNA Technologies Core에서 수행되었습니다. 우리는 rAAV 포장에 대한 교육을 제공하고 AAV 도우미 및 반복/캡 플라스미드를 아낌없이 선물해 준 UC Davis의 Lin Tian의 실험실에 감사드립니다. 이 작업은 NIH / NIGMS R35GM119831의 지원을 받았습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x Citrate Buffer Sigma-Aldrich C9999-1000ML
5'-gatcactctcggcatggac-3' Integrated DNA Technologies N/A: Custom designed Forward primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments.
5'-gatggctggcaactagaagg-3' Integrated DNA Technologies N/A: Custom designed Reverse primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments.
Agarose VWR VWRVN605-500G
Aspirator tube assemblies Sigma-Aldrich A5177-5EA for mouth-driven delivery of rAAV
Bacteriological petri dishes Thermo Fisher Scientific 08-757-100D
Carbenicillin Sigma-Aldrich C1389-5G
Chicken IgY anti-GFP Thermo Fisher Scientific A10262
Confocal microscope Zeiss LSM900 The images were taken on the LSM800 model, but Zeiss launched the LSM900 model in recent years to replace LSM800.
Conical centrifuge tubes 15 mL Thermo Fisher Scientific 12-565-269
Cryomolds Thermo Fisher Scientific NC9806558 These molds are suitable for P28 mouse brain. Other sizes may be more suitable for larger or smaller tissues.
DAPI Sigma-Aldrich D9542-10MG
Dissecting scissors, 4.5" VWR 82027-578
Donkey anti-chicken AlexaFlour-488 Jackson ImmunoResearch 703-545-155
Dulbecco's PBS 1x Thermo Fisher Scientific MT21031CV
Eppendorf Microcentrifuge tubes 2.0 mL Thermo Fisher Scientific 22431048
Falcon round-bottom tubes 14 mL Thermo Fisher Scientific 352059
Fast Green dye Grainger F0099-1G
Fine detail paint brush set Artbrush Tower B014GWCLFO
Gibson Assembly Master Mix NEB E2611S
Glass capillary tubes Drummond Scientific Company 5-000-2005
HiSpeed Plasmid Maxi Kit QIAGEN 12663 Commercial plasmid maxi prep kit
HyClone HyPure Molecular Biology Grade Water VWR SH30538.03
IV butterfly infusion set with 12" tubing and 25G needle Thermo Fisher Scientific 26708
Kimwipes Kimberly Clark 34155 Lint-free wipe
LB Agar Thermo Fisher Scientific BP1425-500 LB agar pre-mix for selective media
McPherson Vannas iris scissor Integra LifeSciences 360-215
Mineral oil Sigma Life Science 69794-500ML
NEB Stable Competent E. coli NEB C3040I
NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Takara 740609.5 Kit for enzymatic reaction cleanup and gel extraction
OCT medium VWR 25608-930
Orbital shaker Cole Parmer 60-100
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127-500G
PCR strip tubes 0.2 mL VWR 490003-692
Peristaltic pump Gilson F155005
Phosphate buffered saline (PBS) 10x Thermo Fisher Scientific 70011044
Phusion Hot Start II High Fidelity DNA Polymerase Thermo Fisher Scientific F549L
Powdered milk Sunny Select
ProLong Gold Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific P36934
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28106
rCutSmart Buffer NEB B6004S Buffer for restriction digest with PacI, AscI, and XmaI
Restriction enzyme: AscI NEB R0558L
Restriction enzyme: PacI NEB R0547L
Restriction enzyme: XmaI NEB R0180L
SOC outgrowth medium NEB B0920S Recovery medium after transformation
Sucrose (RNase/DNase free) Millipore Sigma 033522.5KG
TAE buffer Apex 20-194
Transfer tubing Gilson F1179941 For peristaltic pump
Triton X100 Sigma-Aldrich X100-100ML
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System Thermo Fisher Scientific A1460 Plasmid mini prep kit

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References

  1. Pennacchio, L. A., et al. In vivo enhancer analysis of human conserved non-coding sequences. Nature. 444 (7118), 499-502 (2006).
  2. Nord, A. S., et al. Rapid and pervasive changes in genome-wide enhancer usage during mammalian development. Cell. 155 (7), 1521-1531 (2013).
  3. Finucane, H. K., et al. Partitioning heritability by functional annotation using genome-wide association summary statistics. Nature Genetics. 47 (11), 1228-1235 (2015).
  4. Nord, A. S., West, A. E. Neurobiological functions of transcriptional enhancers. Nature Neuroscience. 23 (1), 5-14 (2020).
  5. Hallikas, O., et al. Genome-wide prediction of mammalian enhancers based on analysis of transcription-factor binding affinity. Cell. 124 (1), 47-59 (2006).
  6. Su, J., Teichmann, S. A., Down, T. A. Assessing computational methods of cis-regulatory module prediction. PLoS Computational Biology. 6 (12), 1001020 (2010).
  7. Visel, A., et al. ChIP-seq accurately predicts tissue-specific activity of enhancers. Nature. 457 (7231), 854-858 (2009).
  8. Kvon, E. Z., et al. Genome-scale functional characterization of Drosophila developmental enhancers in vivo. Nature. 512 (7512), 91-95 (2014).
  9. Yáñez-Cuna, J. O., et al. Dissection of thousands of cell type-specific enhancers identifies dinucleotide repeat motifs as general enhancer features. Genome Research. 24 (7), 1147-1156 (2014).
  10. Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection. Molecular Therapy. 16 (6), 1073-1080 (2008).
  11. Gisselbrecht, S. S., et al. Highly parallel assays of tissue-specific enhancers in whole Drosophila embryos. Nature Methods. 10 (8), 774-780 (2013).
  12. Lambert, J. T., et al. Parallel functional testing identifies enhancers active in early postnatal mouse brain. eLife. 10, 69479 (2021).
  13. Chen, Y. -J. J., et al. Use of "MGE Enhancers" for labeling and selection of embryonic stem cell-derived medial ganglionic eminence (MGE) progenitors and neurons. PLoS ONE. 8, 61956 (2013).
  14. Graybuck, L. T., et al. Enhancer viruses and a transgenic platform for combinatorial cell subclass-specific labeling. bioRxiv. , 525014 (2019).
  15. Dimidschstein, J., et al. A viral strategy for targeting and manipulating interneurons across vertebrate species. Nature Neuroscience. 19 (12), 1743-1749 (2016).
  16. Rubin, A. N., et al. Regulatory elements inserted into AAVs confer preferential activity in cortical interneurons. eNeuro. 7, (2020).
  17. Hindorff, L. A., et al. Potential etiologic and functional implications of genome-wide association loci for human diseases and traits. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (23), 9362-9367 (2009).
  18. Maurano, M. T., et al. Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA. Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).
  19. Ripke, S., et al. Biological insights from 108 schizophrenia-associated genetic loci. Nature. 511 (7510), 421-427 (2014).
  20. Nott, A., et al. Brain cell type-specific enhancer-promoter interactome maps and disease-risk association. Science. 366 (6469), 1134-1139 (2019).
  21. Lagunas, T., et al. A Cre-dependent massively parallel reporter assay allows for cell-type specific assessment of the functional effects of genetic variants in vivo. bioRxiv. , (2021).
  22. DeBoer, E., Antoniou, M., Mignotte, V., Wall, L., Grosveld, F. The human beta-globin promoter; nuclear protein factors and erythroid specific induction of transcription. The EMBO journal. 7 (13), 4203-4212 (1988).
  23. Kothary, R., et al. Inducible expression of an hsp68-lacZ hybrid gene in transgenic mice. Development. 105 (4), 707-714 (1989).
  24. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108 (2), 193-199 (1991).
  25. Kim, D. W., Uetsuki, T., Kaziro, Y., Yamaguchi, N., Sugano, S. Use of the human elongation factor 1α promoter as a versatile and efficient expression system. Gene. 91 (2), 217-223 (1990).
  26. Banerji, J., Rusconi, S., Schaffner, W. Expression of a β-globin gene is enhanced by remote SV40 DNA sequences. Cell. 27 (2), 299-308 (1981).
  27. Patwardhan, R. P., et al. High-resolution analysis of DNA regulatory elements by synthetic saturation mutagenesis. Nature Biotechnology. 27 (12), 1173-1175 (2009).
  28. Arnold, C. D., et al. Genome-wide quantitative enhancer activity maps identified by STARR-seq. Science. 339 (6123), 1074-1077 (2013).
  29. Melnikov, A., et al. Systematic dissection and optimization of inducible enhancers in human cells using a massively parallel reporter assay. Nature Biotechnology. 30, 271-277 (2012).
  30. Kim, J. -Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51863 (2014).
  31. Liu, D., Zhu, M., Zhang, Y., Diao, Y. Crossing the blood-brain barrier with AAV vectors. Metabolic Brain Disease. 36 (1), 45-52 (2021).
  32. Prabhakar, S., Lule, S., Da Hora, C. C., Breakefield, X. O., Cheah, P. S. AAV9 transduction mediated by systemic delivery of vector via retro-orbital injection in newborn, neonatal and juvenile mice. Experimental Animals. , (2021).
  33. Gruntman, A. M., Su, L., Flotte, T. R. Retro-orbital venous sinus delivery of rAAV9 mediates high-level transduction of brain and retina compared with temporal vein delivery in neonatal mouse pups. Human Gene Therapy. 28 (3), 228-230 (2017).
  34. Inoue, F., Ahituv, N. Decoding enhancers using massively parallel reporter assays. Genomics. 106 (3), 159-164 (2015).
  35. Gordon, M. G., et al. lentiMPRA and MPRAflow for high-throughput functional characterization of gene regulatory elements. Nature Protocols. 15 (8), 2387-2412 (2020).
  36. Klein, J. C., et al. A systematic evaluation of the design and context dependencies of massively parallel reporter assays. Nature Methods. 17 (11), 1083-1091 (2020).
  37. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  38. Song, L., Crawford, G. E. DNase-seq: A high-resolution technique for mapping active gene regulatory elements across the genome from mammalian cells. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (2), 5384 (2010).
  39. King, D. M., et al. Synthetic and genomic regulatory elements reveal aspects of Cis-regulatory grammar in mouse embryonic stem cells. eLife. 9, 41279 (2020).
  40. Amit, R., Garcia, H. G., Phillips, R., Fraser, S. E. Building enhancers from the ground up: a synthetic biology approach. Cell. 146, 105-118 (2011).
  41. Fan, M., Tsai, J., Chen, B., Fan, K., LaBaer, J. A central repository for published plasmids. Science. 307, 1877 (2005).
  42. Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. Journal of Molecular Biology. 94, 441-448 (1975).
  43. Broussard, G. J., Unger, E. K., Liang, R., McGrew, B. P., Tian, L. L. glutamate with genetically encoded fluorescent sensors. Biochemical Approaches for Glutamatergic Neurotransmission. Parrot, S., Denoroy, L. 130, Springer. New York. 117-153 (2018).
  44. Chen, Y. H., Keiser, M. S., Davidson, B. L. Adeno-associated virus production, purification, and titering. Current Protocols in Mouse Biology. 8, 56 (2018).
  45. He, C. X., Arroyo, E. D., Cantu, D. A., Goel, A., Portera-Cailliau, C. A Versatile Method for Viral Transfection of Calcium Indicators in the Neonatal Mouse Brain. Frontiers in Neural Circuits. 12, 56 (2018).
  46. Chen, S. -Y., Kuo, H. -Y., Liu, F. -C. Stereotaxic surgery for genetic manipulation in striatal cells of neonatal mouse brains. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (137), e57270 (2018).
  47. Brenowitz, S. D., Regehr, W. G. Presynaptic imaging of projection fibers by in vivo injection of dextran-conjugated calcium indicators. Cold Spring Harbor Protocols. 2012, (2012).
  48. Bosch, D., Asede, D., Ehrlich, I. Ex vivo optogenetic dissection of fear circuits in brain slices. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (110), e53628 (2016).
  49. Green, E. K., et al. The bipolar disorder risk allele at CACNA1C also confers risk of recurrent major depression and of schizophrenia. Molecular Psychiatry. 15 (10), 1016-1022 (2010).
  50. Takahashi, S., Glatt, S. J., Uchiyama, M., Faraone, S. V., Tsuang, M. T. Meta-analysis of data from the Psychiatric Genomics Consortium and additional samples supports association of CACNA1C with risk for schizophrenia. Schizophrenia Research. 168 (1-2), 429-433 (2015).
  51. McCarty, D. M. Self-complementary AAV vectors; advances and applications. Molecular Therapy. 16 (10), 1648-1656 (2008).
  52. Haery, L., et al. Adeno-associated virus technologies and methods for targeted neuronal manipulation. Frontiers in Neuroanatomy. 13, 93 (2019).
  53. Rabani, M., Pieper, L., Chew, G. -L., Schier, A. F. A massively parallel reporter assay of 3′ UTR sequences identifies in vivo rules for mrna degradation. Molecular Cell. 68, 1083-1094 (2017).
  54. Kim, Y. -S., et al. Correcting signal biases and detecting regulatory elements in STARR-seq data. Genome Research. 31, 877-889 (2021).
  55. Lee, D., et al. STARRPeaker: uniform processing and accurate identification of STARR-seq active regions. Genome Biology. 21, 298 (2020).
  56. Doni Jayavelu, N., Jajodia, A., Mishra, A., Hawkins, R. D. Candidate silencer elements for the human and mouse genomes. Nature Communications. 11, 1061 (2020).
  57. Singh, G., et al. A flexible repertoire of transcription factor binding sites and a diversity threshold determines enhancer activity in embryonic stem cells. Genome Research. 31, 564-575 (2021).
  58. Wang, X., et al. High-resolution genome-wide functional dissection of transcriptional regulatory regions and nucleotides in human. Nature Communications. 9, 5380 (2018).
  59. Peng, T., et al. STARR-seq identifies active, chromatin-masked, and dormant enhancers in pluripotent mouse embryonic stem cells. Genome Biology. 21, 243 (2020).
  60. Nair, R. R., Blankvoort, S., Lagartos, M. J., Kentros, C. Enhancer-driven gene expression (EDGE) enables the generation of viral vectors specific to neuronal subtypes. iScience. 23, 100888 (2020).
  61. Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65 -mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. The Lancet. 390, 849-860 (2017).
  62. Gaudet, D., et al. Efficacy and long-term safety of alipogene tiparvovec (AAV1-LPLS447X) gene therapy for lipoprotein lipase deficiency: an open-label trial. Gene Therapy. 20, 361-369 (2013).
  63. Nguyen, G. N., et al. A long-term study of AAV gene therapy in dogs with hemophilia A identifies clonal expansions of transduced liver cells. Nature Biotechnology. 39, 47-55 (2021).
  64. Nayak, S., Herzog, R. W. Progress and prospects: Immune responses to viral vectors. Gene Therapy. 17 (3), 295-304 (2010).
  65. Visel, A., et al. A high-resolution enhancer atlas of the developing telencephalon. Cell. 152 (4), 895-908 (2013).
  66. Shen, S. Q., et al. Massively parallel cis-regulatory analysis in the mammalian central nervous system. Genome Research. 26 (2), 238-255 (2016).
  67. Shen, S. Q., et al. A candidate causal variant underlying both higher intelligence and increased risk of bipolar disorder. bioRxiv. , (2019).
  68. Hrvatin, S., et al. A scalable platform for the development of cell-type-specific viral drivers. eLife. 8, 48089 (2019).

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신경 과학 181 호
마우스 뇌 <em>에서 생체 내</em> 인핸서 기반 발현 구조체의 AAV 배포
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Warren, T. L., Lambert, J. T., Nord, … More

Warren, T. L., Lambert, J. T., Nord, A. S. AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain. J. Vis. Exp. (181), e62650, doi:10.3791/62650 (2022).

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