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Neuroscience

AAV-Einsatz von Enhancer-basierten Expressionskonstrukten in vivo im Gehirn von Mäusen

Published: March 31, 2022 doi: 10.3791/62650
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2
1Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, University of California, Davis, 2Department of Neurobiology, Physiology and Behavior, University of California, Davis

Summary

Dieses Protokoll beschreibt einen neuartigen rAAV-basierten transienten Enhancer-Reporter-Assay. Dieser Assay kann verwendet werden, um eine enhancergesteuerte Expression in vivo im Gehirn der Maus zu induzieren.

Abstract

Enhancer sind Bindungsplattformen für eine Vielzahl von Transkriptionsfaktoren, die spezifische Expressionsmuster von gewebe- und zelltypspezifischen Genen steuern. Mehrere Methoden zur Beurteilung nicht-kodierender DNA und verschiedener Chromatinzustände haben sich bei der Vorhersage des Vorhandenseins von Enhancer-Sequenzen im Genom als nützlich erwiesen, aber die Validierung der Aktivität dieser Sequenzen und das Finden der Organe und Entwicklungsstadien, in denen sie aktiv sind, ist ein arbeitsintensiver Prozess. Jüngste Fortschritte bei Adeno-assoziierten Virusvektoren (AAV) haben die weit verbreitete Abgabe von Transgenen an Mausgewebe ermöglicht, was In-vivo-Enhancer-Tests ermöglicht, ohne dass ein transgenes Tier erforderlich ist. Dieses Protokoll zeigt, wie ein Reporterkonstrukt, das EGFP unter der Kontrolle eines minimalen Promotors exprimiert, der selbst keine signifikante Expression antreibt, verwendet werden kann, um die Aktivitätsmuster von Kandidaten-Enhancer-Sequenzen im Mausgehirn zu untersuchen. Ein AAV-verpacktes Reporterkonstrukt wird an das Mausgehirn abgegeben und für 1-4 Wochen inkubiert, danach wird das Tier geopfert und Gehirnabschnitte werden unter einem Mikroskop beobachtet. EGFP tritt in Zellen auf, in denen der getestete Enhancer ausreicht, um die Genexpression zu initiieren und den Ort und das Entwicklungsstadium zu bestimmen, in dem der Enhancer im Gehirn aktiv ist. Standard-Klonierungsmethoden, kostengünstige AAV-Verpackungen und expandierende AAV-Serotypen und Methoden für die In-vivo-Verabreichung und Standard-Bildgebungsauslesung machen dies zu einem zugänglichen Ansatz für die Untersuchung, wie die Genexpression im Gehirn reguliert wird.

Introduction

Enhancer sind genomische cis-regulatorische Elemente, die als Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen dienen und die Expression eines Zielgens räumlich spezifisch vorantreiben können 1,2. Sie sind in verschiedenen Zelltypen, Geweben und Entwicklungsstadien unterschiedlich aktiv und können Substrate krankheitsrisikobedingter genomischer Variation sein 3,4. Daher ist die Notwendigkeit, die Dynamik der Enhancer-Funktion zu verstehen, entscheidend für den Fortschritt sowohl in translationalen als auch in grundlagenwissenschaftlichen Anwendungen innerhalb der Genomik. In-silico-Vorhersagen der Enhancer-Aktivität können als hervorragende Ressourcen für die Erstellung von Hypothesen über die Enhancer-Fähigkeitdienen 5,6. Eine solche vorhergesagte Enhancer-Aktivität kann eine zusätzliche Validierung und Abfrage erfordern, um die funktionelle Aktivität vollständig zu verstehen. Enhancer-Reporter-Assays haben sich für diesen Zweck in einer Vielzahl von Systemen als wertvoll erwiesen, von Zellen bis hin zu Tieren 7,8,9. Um diese Studien in einem flexiblen und kostengünstigen transienten In-vivo-Kontext zu erweitern, beschreibt dieses Protokoll die Verwendung von in vivo AAV-basierten Methoden, um mutmaßliche Enhancer-Sequenzen auf ihre Fähigkeit zu testen, die Expression eines ektopischen Reportergens im postnatalen Mausgehirn zu steuern. Diese Methodenfamilie eignet sich für die Abfrage einzelner Kandidatensequenzen oder das parallele Bibliotheksscreening und ist für die Grundlagen- und translationale Forschung relevant.

Diese Methode kombiniert in einem einzigen Plasmid eine mutmaßliche Enhancer-Kandidaten-DNA-Sequenz mit einem Reportergen (hier EGFP), unter der Kontrolle eines minimalen Promotors, der allein keine signifikante Expression antreibt. Das Plasmid wird in rekombinante AAV (rAAV) verpackt und in ein Tiermodell injiziert. Während die Anwendung hier auf das Gehirn gerichtet ist, ermöglichen verschiedene rAAV-Serotypen eine Infektion über verschiedene Gewebetypen hinweg, so dass dieser Ansatz auf andere Systeme ausgedehnt werden kann10. Nach einiger Zeit kann das Gehirn gesammelt und auf die Expression des Reportergens untersucht werden. Die starke Expression im Vergleich zu Kontrollen deutet darauf hin, dass die getestete Kandidatensequenz die Expression des Gens "verstärken" konnte (Abbildung 1). Dieses einfache Design bietet einen einfachen und klaren Ansatz, um eine Sequenz für die Enhancer-Aktivität in vivo im Gehirn zu testen.

Zusätzlich zum Testen der Enhancer-Fähigkeit einer Sequenz kann diese Methode mit Techniken zur Bestimmung der Zelltyp-Enhancer-Aktivität kombiniert werden. In sequenzbasierten Ansätzen zur Bestimmung der differentiellen Enhancer-Aktivität kann die Sortierung von Zellen nach zelltypspezifischen Markern vor der DNA- und RNA-Sequenzierung es Forschern ermöglichen, festzustellen, ob verschiedene Zelltypen differentielle Enhancer-Aktivität zeigen, wie in Gisselbrecht et al.11 beschrieben. In bildgebenden Ansätzen ermöglicht die Co-Markierung von Bildern mit zelltypspezifischen Markern die Untersuchung, ob Zellen mit Enhancer-getriebener Fluoreszenz auch Zelltypmarker von Interesse aufweisen 12,13,14,15,16. Enhancer-Reporter-Assays ermöglichen das direkte Testen der risikoassoziierten allelischen Variation von Enhancern auf Auswirkungen auf die Enhancer-Fähigkeit. Die überwiegende Mehrheit der in genomweiten Assoziationsstudien (GWAS) identifizierten Risikoorte liegt in nicht-kodierenden Regionen des Genoms17. Funktionelle Annotationsstudien dieser Risikoorte deuten darauf hin, dass ein großer Teil wahrscheinlich als Verstärker wirkt18,19,20. Der MPRA-Einsatz in vivo kann es ermöglichen, diese risikoassoziierten Varianten auf Enhancer-Aktivität im Gehirnzu testen 12,21. Schließlich können Lieferung und Abholung zu unterschiedlichen Zeitpunkten Einblicke in die Entwicklungsphasen geben, in denen ein Enhancer aktiv ist.

Enhancer-Reporter-Plasmid-Designs sind vielfältig und können an experimentelle Ziele angepasst werden. Es gibt mehrere Optionen für minimale Promotoren, die in der Enhancer-Forschung verwendet wurden, wie der humane β-Globin-Minimalpromotor22 und der Maus-Hsp68-Minimalpromotor23. Es ist bekannt, dass diese Promotoren niedrige Expressionsniveaus antreiben, es sei denn, sie werden mit einem Enhancer-Element gekoppelt, um sie zu aktivieren. Im Gegensatz dazu treiben konstitutive Promotorelemente eine starke Expression des Transgens an, die für die Positivkontrolle oder zum Testen der Enhancer-Funktion vor dem Hintergrund einer robusten Expression nützlich ist. Übliche Optionen für konstitutive Promotoren sind CAG, ein Hybridpromotor, der aus dem Hühner-β-Aktin-Promotor und dem Cytomegalovirus-Immediate-Early Enhancer24 gewonnen wird, oder humanes EF1α25. Da bekannt ist, dass Enhancer bidirektional arbeiten26, sind die Ausrichtung und Position des Enhancers relativ zum minimalen Promotor flexibel (Abbildung 2A). Traditionelle Enhancer-Reporter-Assays platzieren den Enhancer vor dem Promotor und enthalten bei Bibliothekslieferungen eine Barcode-Sequenz stromabwärts des Reportergens, um Sequenzierungslesevorgänge mit dem getesteten Enhancer27 zu verknüpfen. Enhancer können aber auch im offenen Leserahmen des Reportergens platziert werden und als eigene Barcode-Sequenz dienen, wie es in STARR-seq28 der Fall ist. Das hier beschriebene Protokoll verwendet das STARR-seq-Assay-Design, wobei die Kandidaten-Enhancer-Sequenz in die 3'-UTR des Reportergens platziert wird. Während die STARR-seq-Orientierung den Vorteil einer schlankeren Klonierung bietet, ist sie weniger gut verstanden als der herkömmliche Ansatz und kann eine variable RNA-Stabilität zwischen Konstrukten induzieren. Die beschriebenen Methoden können leicht entweder an die STARR-seq oder die konventionelle Orientierung angepasst werden, mit geringfügigen Änderungen des Klonierungsprozesses, die an anderer Stelle27,29 beschrieben wurden.

Verschiedene Methoden der AAV-Verabreichung können verwendet werden, um diese Technik weiter an experimentelle Ziele anzupassen (Abbildung 2B). Direkte intrakranielle Injektionen, die in diesem Protokoll näher beschrieben werden, liefern eine hohe Viruskonzentration direkt an das Gehirn30. Dies ergibt eine hohe Transduktionseffizienz, die sich auf die Injektionsstelle konzentriert, was dies zu einer ausgezeichneten Technik für Experimente macht, die die Dichte transduzierter Zellen über einen Gewebebereich maximieren wollen. Stereotaktische Injektion kann dazu beitragen, die Injektionsstelle über Tiere hinweg zu standardisieren, um eine reproduzierbare lokalisierte Transduktion zu ermöglichen. Intrakranielle Injektionen sind bei frühen postnatalen Tieren am einfachsten. Als alternative Technik können systemische Injektionen Transgene unter Verwendung von AAVs mit Serotypen liefern, die in der Lage sind, die Blut-Hirn-Schrankezu überwinden 31. Schwanzveneninjektionen ermöglichen es dem Virus, im ganzen Körper zu zirkulieren, was eine generalisierte Abgabe über viele Gewebe hinweg ermöglicht10. Retroorbitale Injektionen sind eine weitere systemische Injektionstechnik, die das Virus hinter dem Auge in den retroorbitalen Sinus32 liefert. Dies bietet einen direkteren Weg für das AAV vom Venensystem zum Gehirn, was zu einer höheren Konzentration von transduzierten Zellen im Gehirn führt als Injektionen in peripherere Blutgefäße33.

Ein weiterer flexibler Aspekt dieser Technik ist die Methode des Auslesens. Im Großen und Ganzen können Optionen als reporterbasiert oder sequenzierungsbasiert beschrieben werden (Abbildung 2C). Die Integration eines fluoreszierenden Reporters wie GFP in den offenen Leserahmen des Konstrukts führt zur Expression des fluoreszierenden Proteins in allen transduzierten Zellen, in denen der Kandidatenverstärker die Expression antreibt. Markierungs- und Bildgebungsverfahren wie die Immunhistochemie ermöglichen die Signalverstärkung. Sequenzierungsbasierte Auslesetechniken beinhalten die Identifizierung von Sequenzen aus dem gelieferten Konstrukt in RNA, die aus dem Gewebe gesammelt wurde. Durch die Quantifizierung der Menge an viraler DNA, die ursprünglich abgegeben wurde, kann der Vergleich der exprimierten RNA mit der gelieferten DNA verwendet werden, um zu bestimmen, inwieweit eine getestete Enhancer-Sequenz in der Lage war, eine erhöhte Expression des Transgens zu bewirken, beispielsweise im Rahmen eines massively parallel reporter assay (MPRA). MPRAs bieten eine leistungsstarke Erweiterung dieser Techniken, um bis zu Tausende von Kandidaten-Enhancern gleichzeitig auf Aktivität zu testen und wurden in der Genomforschungausführlich beschrieben 12,27,34,35,36. Ein höheres Durchsatz-Screening wird durch die Ausführung von Klonierungs-, Verpackungs-, Liefer- und Sequenzierungsschritten für Kandidatenverstärker im Batch und nicht einzeln erreicht.

Die Auswahl von Kandidatenverstärkern bietet eine weitere Möglichkeit zur Flexibilität (Abbildung 2D). Mit diesem Assay können beispielsweise Enhancer eines bestimmten Gens identifiziert, die Funktion nicht-kodierender DNA-Regionen von Interesse ermittelt oder bestimmte Zelltypen oder Entwicklungsstadien bestimmt werden, in denen ein Enhancer aktiv ist - all dies dient Zielen sowohl in der Grundlagenforschung als auch in der Krankheitsforschung. Im Allgemeinen wird die Auswahl von Kandidatenverstärkern durch In-silico-Vorhersagen der Enhancer-Aktivität bestimmt. Im Allgemeinen beinhalten In-silico-Vorhersagen ChIP-seq für Histonmodifikationen, die auf wahrscheinliche Enhancer hinweisen, wie H3K27ac37 und Chromatin-Zugänglichkeitskartierung38. Schließlich ist ein wachsendes Forschungsgebiet das funktionsbasierte Screening synthetisch gestalteter Enhancer-Elemente, das Studien darüber ermöglicht, wie die Enhancer-Sequenz die Funktion39 steuert, und das Design von Enhancern mit spezifischen Eigenschaften40.

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Protocol

Dieses Protokoll wurde vom UC Davis Institutional Animal Care and Use Committee (Protokoll #22339) und dem UC Davis Institutional Biosafety Committee (BUA-R1903) genehmigt. Dieses Protokoll wurde an C57BL/6J-Mäusen beiderlei Geschlechts am postnatalen Tag 0-1 getestet.

1. Klonen Sie die Enhancer-Kandidatensequenz in das AAV-Vektorplasmid.

HINWEIS: Die repräsentativen Protokolle sind angegeben, aber die Klonstrategie hat ein hohes Maß an Flexibilität.

  1. Wählen Sie ein Reporterkonstrukt aus, oder entwerfen Sie es. Hier wird der Enhancer-Kandidat in die 3' untranslatierte Region (UTR) des EGFP-Reportergens eingefügt, die unter der Kontrolle des Hsp68-Minimalpromotors exprimiert wird.
    HINWEIS: Viele MPRA-Plasmidkonstrukte, die für diesen Assay geeignet sind, wurden auf Addgene41 abgeschieden und stehen für Forschungszwecke zur Verfügung.
  2. Entwerfen Sie PCR-Primer, um eine Sequenz von Interesse zu amplifizieren. Fügen Sie dem 5'-Ende der Primer den entsprechenden Homologiearm für die Gibson-Klonierung hinzu (~ 35 bp entsprechend der Sequenz 5' stromaufwärts der Einfügestelle, oberer Strang für den vorderen Primer und unterer Strang für den umgekehrten Primer).
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Basisprimersequenz ~18-24 bp lang und ~50%-60% GC-Gehalt bei einer Schmelztemperatur von ca. 57-59 °C ist.
  3. Führen Sie eine PCR aus einer DNA-Probe mit den entwickelten Primern durch.
    1. Die PCR-Reaktionsmischung wird wie in Tabelle 1 beschrieben in 0,2-ml-PCR-Röhrchen zusammengebaut.
    2. Die PCR-Reaktionsmischung(en) werden auf einen Thermocycler gegeben und gemäß dem in Tabelle 1 genannten Programm zykliert.
    3. Bestätigen Sie den Erfolg der PCR, indem Sie 5 μL PCR-Produkt auf ein 0,7%-1% Agarosegel bei 100 V für 30-60 min laufen lassen. Suchen Sie nach dem Fragment der vorhergesagten Länge.
    4. Aufreinigung des PCR-Produkts mit einem kommerziellen Säuberungskit für enzymatische Reaktionsaufreinigung. Das letzte Eluat ist der Kloneinsatz.
  4. Führen Sie einen Restriktionsaufschluss durch, um den AAV-Vektor an der eindeutigen Klonstelle zu linearisieren, um den Enhancer in den Vektor einzufügen.
    1. Die Klonstelle in der 3' UTR des hier verwendeten Enhancer-Reporter-Konstrukts ist durch eindeutige PacI- und AscI-Restriktionsstellen begrenzt. Führen Sie einen Digest durch, um das Plasmid an dieser Stelle gemäß den folgenden Parametern zu linearisieren (Schritte 1.4.2-1.4.4).
    2. Verdauen Sie 1-10 μg Vektor-DNA mit PacI und AscI, je nachdem, wie viele Klonierungsreaktionen benötigt werden. Bereiten Sie die Reaktionen mit dem mitgelieferten Puffer gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.
    3. Bei 37 °C für 1-2 h inkubieren, um die Vektor-DNA zu verdauen. (Wenn mehr als 5 μg in einer 50 μL-Reaktion verdaut werden, kann eine längere Inkubation erforderlich sein.)
    4. Nach 1-2 h Inkubation inaktivieren Sie das Enzym durch Inkubation bei 65 °C für 20 min.
    5. Die Restriktionsverdauungsfragmente werden durch Gelelektrophorese mit einem 0,7%-1% Agarosegel getrennt, das bei 100 V für 30-60 min laufen wird.
    6. Entfernen Sie das Band für den linearisierten Vektor und reinigen Sie es mit einem handelsüblichen Gelextraktionskit.
  5. Gibson-Klonreaktionen durchführen und transformieren
    1. Bestimmen Sie die Konzentration des gereinigten Vektors und des Kloneinsatzes mit einem Spektralphotometer.
      HINWEIS: DNA absorbiert Licht bei 260 nm, während Verunreinigungen Licht bei 230 nm und 280 nm absorbieren. Hohe Verhältnisse (>1,8) von 260/230 und 260/280 weisen auf hochgereinigte DNA hin.
    2. Zusammensetzen von Gibson-Klonierungsreaktionen in 0,2 mL PCR-Röhrchen: 5 μL 2x Gibson-Master-Mix, 0,02-0,5 pmol DNA-Fragmente im Verhältnis 3:1 Insert to Vector (optimale DNA-Konzentration für die Reaktion sollte empirisch bestimmt werden) und Nuklease-freies Wasser (das Volumen auf 10 μL erhöhen).
    3. Gibson-Reaktionen bei 50 °C für 20 min in einem Thermocycler inkubieren.
  6. Transform rekombinationsdefizient (recA-) kompetent Escherichia coli (E. coli).
    1. Stellen Sie ein Wasserbad auf 42 °C ein und tauen Sie die handelsüblichen kompetenten Zellen auf Eis auf.
      HINWEIS: Dieser Schritt kann vor Schritt 1.4 durchgeführt werden, und die Zellen können während der Vorbereitung und Inkubation der Gibson-Reaktion auftauen.
    2. Aliquot 30-50 μL Zellen in 2,0 mL Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie 2 μL Gibson-Reaktion zu einem Aliquot hinzu und kennzeichnen Sie das Röhrchen mit der Identität des Gibson. Inkubieren Sie die Zellen auf Eis für 30 min.
      HINWEIS: Verwenden Sie 5-10 ng unverdauten leeren Vektor als Positivkontrolle und Wasser als Negativkontrolle.
    3. Die Zellen im 42 °C warmen Wasserbad für 30-45 s hitzeschocken, die Röhrchen sofort wieder auf Eis legen und 5 min erholen lassen.
    4. Während Sie auf Eis sind, fügen Sie 400-950 μL des handelsüblichen Wiederherstellungsmediums hinzu.
      HINWEIS: Die in diesen Experimenten verwendeten Erholungsmedien enthalten 2% pflanzlichen Pepton, 0,5% Hefeextrakt, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mMMgSO4 und 20 mM Glucose.
    5. Nach der Erholung auf Eis die Zellen vollständig wiederherstellen, indem Sie bei 37 °C mit sanftem Rühren von 250 U/min für 30-60 min inkubieren.
    6. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 5.000 x g für 5 min und entfernen Sie 400 μL des Überstands, wobei ~ 50 μL Bakterien auf der Platte bleiben.
    7. Auf selektiven Medien aufprügeln und bei 37 °C über Nacht inkubieren.
      HINWEIS: Die in diesen Experimenten verwendeten selektiven Medien enthalten 1,0% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 1,0% Natriumchlorid, 1-2% Agar, 96-97% Wasser und Carbenicillin in einer Konzentration von 100 μg / ml. Verwenden Sie immer rekombinationsarme Bakterienstämme zum Klonieren viraler Plasmide, da die viralen invertierten terminalen Wiederholungen (ITRs) übereinstimmende Sequenzen aufweisen und eine homologe Rekombination durchlaufen können. RecA-Bakterienstämme durchlaufen jedoch noch eine geringe Rekombination. Das hier verwendete Reporterplasmid ist ein selbstkomplementäres AAV, bei dem die Sequenz eines der ITRs verändert wurde und nicht mehr perfekt mit dem anderen ITR übereinstimmt. Es wird auch empfohlen, die Bakterien bei 30 °C zu züchten, um die Rate der homologen Rekombination weiter zu verlangsamen.
  7. Verifizierung von Klonen und Wiederherstellung von Plasmiden.
    1. Bereiten Sie eine PCR-Mastermischung unter Verwendung von Vorwärts- und Rückwärtsprimern (Table of Materials) vor, die zum Vektor glühen und die Insertposition flankieren. Aliquot 10 μL Volumen in 0,2 mL PCR-Streifenröhrchen.
    2. Bereiten Sie in 14-ml-Rundbodenröhrchen 5 ml aliquots antibiotikaselektiver LB-Brühe vor, eines für jede Kolonie, die mittels PCR und Negativkontrolle getestet wird.
    3. Verwenden Sie einen sterilen Zahnstocher oder eine Pipettenspitze, um eine einzelne Kolonie auszuwählen und die Kolonie grob in den Boden eines PCR-Röhrchens zu kratzen.
    4. Wenn sich die Kolonie in die PCR-Mastermischung aufgelöst hat, lassen Sie den Zahnstocher oder die Zahnspitze in eines der LB-Aliquots fallen und beschriften Sie das 14-ml-Röhrchen mit der Gibson-Reaktion und der PCR-Röhrchennummer.
    5. Legen Sie die Kolonie-PCR-Reaktionen auf einen Thermocycler und führen Sie den Zyklus mit dem in Tabelle 2 beschriebenen Programm durch.
    6. Die mit Zahnstochern oder Pipettenspitzen inokulierten 5-ml-Flüssigkulturen in einem auf 37 °C und 180 U/min eingestellten Schüttelbrutschrank inkubieren.
    7. Führen Sie die Kolonie-PCR-Reaktionen auf einem 0,7%-1% Agarosegel bei 100 V für 30-60 min durch und visualisieren Sie die Banden in einem Gel-Doc-Bildgebungssystem.
    8. Verwerfen Sie die 5-ml-Kulturen, die nicht die vorhergesagte PCR-Bande anzeigen.
    9. Lassen Sie für jeden erfolgreich integrierten Klon die 5-ml-Kulturen über Nacht wachsen und führen Sie dann eine Plasmid-Mini-Vorbereitung aus 4,5 ml mit einem kommerziellen Kit durch. 0,5 mL der Flüssigkultur reservieren und bei -80 °C als Glycerinvorrat speichern.
    10. Bestätigen Sie, dass die in den Plasmiden enthaltenen Transgene frei von unerwünschten Mutationen sind, indem Sie die Sanger-Sequenzierung42 verwenden.
    11. Nachdem bestätigt wurde, dass das Reporterkonstrukt erfolgreich geklont wurde, verwenden Sie den gespeicherten Glycerinvorrat, um eine 5-ml-Starterkultur zu impfen und 8-16 h in einem Schüttelinkubator bei 30 ° C und 180 U/min zu wachsen.
    12. Sobald die Brühe trüb ist, verdünnen Sie die Starterkultur 1.000x in 250-300 ml frischer selektiver LB-Brühe und inkubieren Sie mindestens über Nacht in einem Schüttelinkubator bei 30 ° C und 180 U/min. Dann reinigen Sie das Plasmid mit einem handelsüblichen Plasmid-Maxi-Kit.
      HINWEIS: Bakterien wachsen bei 30 ° C langsamer als bei 37 ° C, aber dies ist die beste Temperatur, um die Rate der spontanen Rekombination beim Anbau großer Kulturen zu verlangsamen.
    13. Führen Sie einen XmaI-Digest durch, um die Rekombination der ITRs mit den Schritten 1.4.2-1.4.5 zu testen, wobei Sie XmaI anstelle von PacI und AscI ersetzen. Visualisieren Sie die Bänder auf einem Gel-Doc-Bildgebungssystem.
      HINWEIS: Ein rAAV-Plasmid, bei dem beide ITRs vorhanden sind, ergibt nach diesem Aufschluss zwei Banden auf einem Gel: eine die Länge des rAAV-Genoms und die andere die Länge des restlichen Plasmidrückgrats. Wenn es nur eine Bande gibt, dann haben die ITRs eine homologe Rekombination durchlaufen, und das rAAV-Plasmid wird nicht in der Lage sein, virale Partikel zu verpacken. Das hier beschriebene rAAV-Plasmid-Backbone ist so konzipiert, dass XmaI-Stellen nur in den ITRs vorkommen. Wenn das Enhancer-Kandidaten-Insert auch XmaI-Stellen enthält, aktualisieren Sie die vorhergesagten Bandenergebnisse und die Analyse entsprechend.

2. Besorgen Sie sich verpacktes rAAV.

  1. Verwenden Sie verpacktes rAAV (professionell oder intern) für die Experimente in dieser Studie.
    HINWEIS: Es gibt viele Optionen zum Verpacken eines rAAV. Ein rAAV kann professionell in einem Unternehmen oder einer universitären Kerneinrichtung verpackt werden. Das rAAV kann auch intern unter Verwendung verschiedener Techniken verpackt werden, die in Komplexität variieren und spezielle Ausrüstungerfordern 43,44. Das Hauptanliegen besteht darin, einen Vektor zu erhalten, der von hoher Qualität ist und dass der infektiöse Titer mit hoher Sicherheit bestimmt wurde. Sowohl professionell verpackte als auch intern verpackte rAAVs wurden für verschiedene in dieser Studie beschriebene Experimente verwendet.

3. Intrakranielle Injektion von rAAV-verpacktem Plasmid in neonatale Mäuse.

  1. Bereiten Sie die rAAV-Mischung für die Lieferung vor.
    1. Wenn die Absicht darin besteht, die Expressionsmuster zwischen verschiedenen Enhancer-Reporterviren zu vergleichen, gleichen Sie die Titer aller zu vergleichenden Viren aus, indem Sie alle verdünnen, um dem am wenigsten konzentrierten Virus zu entsprechen.
    2. Mischen Sie ein Verhältnis von 2: 1 oder 3: 1 von Enhancer-Reportervirus und konstitutiv exprimiertem Kontrollreportervirus und fügen Sie eine kleine Menge (0,06% Endkonzentration) Fast Green-Farbstoff hinzu.
      HINWEIS: Fast Green ist ein Farbstoff, der häufig in Injektionen von Versuchstieren, einschließlich AAV, verwendet wird, um die Injektionsstelle während und unmittelbar nach dem Eingriff zu visualisieren45,46,47,48. Obwohl dies ein wichtiger Schritt zur Qualitätssicherung ist, ist es möglich, dass die Zugabe von Farbstoff die Transduktion beeinträchtigen könnte. Die Verwendung von Injektionsfarbstoff zu überdenken, kann in bestimmten Fällen für die Protokolloptimierung wichtig sein. Das konstitutiv angetriebene Kontrollvirus ist absolut entscheidend für den Vergleich unabhängiger Injektionen. Virusinjektionen variieren in Ort und Ausmaß der Übertragung von Tier zu Tier. Die konstitutive Kontrolle wird es ermöglichen, fehlgeschlagene Injektionen von der Analyse auszuschließen und einen Standard für die Normalisierung der Variation in der Virusabgabe bereitzustellen.
    3. Brechen Sie die Spitze einer sterilen gezogenen Glaspipette aus einem μL-graduierten Kapillarrohr, indem Sie sie vorsichtig durch ein empfindliches Tuch stechen, das sterilisiert wird, indem Sie es in 70% Ethanol einweichen und vollständig trocknen lassen. Führen Sie dann die gezogene Glaspipette in die Absaugeinheit ein, die aus einer Vorrichtung zum Anlegen von Druck besteht, die mit einem 15 Zoll langen Gummischlauch verbunden ist, der mit einer Gummidichtung zur Aufnahme einer Mikrokapillarpipette endet.
      HINWEIS: Die "Vorrichtung zum Ausüben von Druck" kann eine Spritze oder ein Mundstück sein. Wenn eine Spritze verwendet werden soll, muss eine zweite Person Druck durch die Spritze ausüben, während der Experimentator die Pipette in der einen Hand und das Tier in der anderen Hand manipuliert. Bei Verwendung eines Mundstücks, das es dem Experimentator ermöglicht, sowohl die Positionen des Tieres und der Pipette als auch den Druck auf die Spritze genau zu kontrollieren, ist besondere Sorgfalt erforderlich, um eine Viruskontamination zu vermeiden.
    4. Legen Sie Unterdruck durch die Absaugeinheit an, um ein kleines Volumen (~ 0,2-0,5 μL) Mineralöl in die Glaspipette zu ziehen.
      HINWEIS: Dieser Schritt ist sehr wichtig, um eine Barriere bereitzustellen, die verhindert, dass aerosolisierte Viruspartikel die Absaugeinheit kontaminieren.
    5. Stellen Sie die vorbereitete Absaugeinheit beiseite und halten Sie das Virus auf Eis, bis es zur Injektion bereit ist.
  2. Kryo-Betäubung der neonatalen Mäuse in einer trockenen Plastikschale, die teilweise in Eis getaucht ist, bis der Pedalentzugsreflex aufhört (~ 5 min). Stellen Sie sicher, dass die Mäuse nicht in direktem Kontakt mit dem Eis stehen.
  3. Verwenden Sie Unterdruck durch die Absaugeinheit, um das Virusgemisch in die gezogene Glaspipette zu ziehen, bis der Meniskus die 2-μL-Häkungsmarke passiert.
  4. Nehmen Sie die Maus aus der Kältekammer und positionieren Sie sie auf dem Tisch. Lokalisieren Sie die bilateralen Injektionsstellen auf halbem Weg zwischen Lambda und Bregma und auf halbem Weg zwischen der sagittalen Naht und jedem Auge. Desinfizieren Sie beide Bereiche mit einem Alkoholtuch.
  5. Verwenden Sie die gezogene Glaspipette, um den Schädel der neonatalen Mäuse zu durchbohren und sanft positiven Druck durch die Absaugeinheit auszuüben, wenn die Nadel in das Gehirn eindringt. Beobachten Sie den Meniskus der Virusmischung. Der Widerstand gegen den ausgeübten Druck nimmt ab, wenn die Spitze der Pipette den lateralen Ventrikel erreicht. Geben Sie 1 μL des Virus ab, ziehen Sie die Pipette heraus und wiederholen Sie den Vorgang für den anderen lateralen Ventrikel.
  6. Legen Sie die Maus auf ein Heizkissen oder eine Wärmekammer, um sich zu erholen. Sobald Sie wach und aktiv sind, bringen Sie das Tier in seinen Heimatkäfig zurück.

4. Sammeln Sie Gewebe und führen Sie Immunhistochemie durch.

  1. Nach ausreichender Zeit nach der Virustransduktion die Mäuse betäuben und durch transkardiale Perfusion opfern.
    HINWEIS: Viele Experimente, einschließlich der hier gezeigten repräsentativen Ergebnisse, erlauben einen Zeitraum von 4 Wochen oder länger, bis das Virus transduziert werden kann. Selbstkomplementäre AAVs können jedoch bereits nach 7 Tagen12 eine starke Expression zeigen. Die gewünschte Inkubationszeit muss möglicherweise in Abhängigkeit von spezifischen experimentellen Techniken und Zielen optimiert werden.
    1. Bereiten Sie eine Schlauchpumpe mit intravenösem Infusionsschlauch und einer 25-G-Nadel vor.
    2. 1x PBS und 4% Paraformaldehyd (PFA) zubereiten und auf Eis legen.
    3. Legen Sie das Ansaugende des Schlauches in das eiskalte 1x PBS. Stellen Sie die Durchflussrate ein (2,5 ml/min für P7-Mäuse, 3,5 ml/min für P28-Mäuse) und lassen Sie die Pumpe laufen, bis der Puffer vollständig durch den Schlauch gezogen und von Blasen befreit ist. Legen Sie die Nadel beiseite, bis sie für die Durchblutung bereit ist.
    4. Pipettieren Sie in einem Abzug eine kleine Menge Isofluran auf ein Papiertuch im Boden einer Fallgefäßkammer. Legen Sie die zuvor injizierte Maus auf einen Rost über dem Papiertuch und stellen Sie sicher, dass sie nicht in direkten Kontakt mit dem Isofluran kommt. Verschließen Sie die Kammer, um die Maus zu betäuben. Warten Sie ~5 min und öffnen Sie dann die Kammer und prüfen Sie auf einen Pedalrückzugsreflex. Fahren Sie fort, sobald das Tier bewusstlos ist.
      HINWEIS: Während der gesamten Durchblutung sollte die Maus mit einem Nasenkegel auf Isofluran gehalten werden, um eine Wiedererlangung des Bewusstseins zu verhindern.
    5. Verwenden Sie eine chirurgische Schere, um den Bauch und die Brust der Maus zu öffnen, den Brustkorb zu entfernen und das Herz freizulegen.
    6. Verwenden Sie eine Iris-Mikroschere, um einen kleinen Schnitt im rechten Vorhof der Maus zu machen, führen Sie die IV-Nadel in den linken Ventrikel ein und aktivieren Sie die Peristaltikpumpe.
    7. Durchbluten Sie das Tier mit eiskaltem 1x PBS, bis das aus dem Schnitt im rechten Vorhof ausgespülte Blut klar ist. Die Reinigung des Blutgewebes ist sehr wichtig, da rote Blutkörperchen Autofluoreszenz haben und Blutgefäße die Fähigkeit beeinträchtigen können, Reporter-exprimierende Zellen abzubilden.
    8. Pausieren Sie die Schlauchpumpe und bewegen Sie den Ansaugschlauch vom PBS auf die 4% PFA. Reaktivieren Sie die Pumpe und perfusionieren Sie 1 ml / g Körpergewicht, ~ 25 ml für eine erwachsene Maus.
      HINWEIS: Fixationstremoren sollten beobachtbar sein und der Körper der Maus sollte sich versteifen.
  2. Sezieren und reparieren Sie das Gehirn.
    1. Entfernen Sie den Kopf der Maus mit einer chirurgischen Schere.
    2. Beginnen Sie mit einer kleinen chirurgischen Schere an der Schädelbasis und machen Sie einen Schnitt entlang der Mittellinie des Kopfes und ziehen Sie die Haut und das darunter liegende Gewebe zurück, um den Schädel freizulegen.
    3. Schneiden Sie mit der Irisschere vorsichtig die Rückseite des Schädels ab, beginnend am Foramen magnum und weiter in Richtung und entlang der sagittalen Naht, bis die Riechkolben passiert sind.
    4. Führen Sie die Schere in den Schädel über den Riechkolben ein und machen Sie zwei horizontale Schnitte in den Schädel. Machen Sie ein ähnliches Paar horizontaler Schnitte im Hinterhauptsknochen. Die horizontalen und mittleren Schnitte erzeugen ein Paar türartige Klappen in der Oberseite des Schädels.
    5. Ziehen Sie die Schädellappen zurück, um das Gehirn vollständig freizulegen. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Riechkolben vom Schädel zu trennen und die Hirnnerven zu schneiden, wodurch das Gehirn vom Schädel befreit wird.
    6. Lassen Sie das Gehirn in eine 15 ml konische Röhre mit 3-5 ml 4% PFA in PBS fallen. Post-Fix 6 h bis über Nacht. Überfixieren Sie das Gewebe nicht.
  3. Bereiten Sie das Gehirn auf die Kryosektion vor.
    1. Übertragen Sie das fixierte Gehirn in eine neue 15 ml konische Röhre mit 12-14 ml 30% Saccharose in PBS zur Dehydratisierung. Bei 4 °C inkubieren, bis das Gehirn auf den Boden der Röhre sinkt (2-3 Tage).
    2. Tauchen Sie das feste und dehydrierte Gehirn in eine optimale Schnitttemperatur (OCT) in eine 15 mm x 15 mm x 5 mm große Kryoform. Fügen Sie OCT hinzu, bis das Gehirn vollständig bedeckt ist.
    3. Kryomold auf einen Trockeneisblock legen und die Probe in einem festen OCT-Block einfrieren (~ 5 min).
      HINWEIS: OCT-Blöcke können monate- bis jahrelang bei -80 °C gelagert werden.
    4. Beschriften Sie das Kryomold mit dem Probennamen und der Ausrichtung des Gehirns.
  4. Erhalten Sie koronale Schnitte mit einem Kryostat-Mikrotom.
    1. Markieren Sie die Ausrichtung des Gehirns auf dem OCT-Block mit Bleistift und entfernen Sie den Block aus dem Kryofell im Kryostaten.
    2. Positionieren Sie den OCT-Block so, dass das Gehirn mit den Riechkolben ausgerichtet ist, die der Klinge des Kryostaten zugewandt sind, und kleben Sie den Block mit etwas frischem OCT am Objekthalter des Kryostaten.
    3. Nach dem Einfrieren beginnen Sie mit dem Schneiden von 50 μm-Abschnitten durch den Block gemäß den Schritten 4.4.4-4.4.6.
    4. Verwenden Sie nicht die Stabilisatorplatte. Die Abschnitte rollen sich beim Schneiden zu engen Rollen zusammen und sammeln sich entweder auf dem Block oder fallen in eine Auffangschale.
    5. Beobachten Sie die Form des Blocks in den ersten Schnitten, die gemacht werden. Machen Sie vertikale Schnitte durch den Block und erzeugen Sie eine gleichmäßige Fläche, wenn Sie mit dem Schneiden beginnen. Passen Sie den Winkel bei Bedarf mit den Probeneinstellarmen an.
    6. Wenn die Riechkolben sichtbar sind, achten Sie genau auf die Form der Abschnitte. Wenn einer größer erscheint als der andere, sind die Schnitte in einem Winkel relativ zum Gehirn, und es ist notwendig, die Ausrichtung des Gehirns gegen die Klinge mit den Probeneinstellarmen zu begradigen.
      HINWEIS: Wenn Sie gerade schneiden, sollte der Kortex gleichzeitig über jedem Riechkolben erscheinen.
    7. Sobald der Riechkolben geschnitten wurde und rostrales Hirngewebe sichtbar ist, reduzieren Sie die Schnittdicke auf 30-35 μm und beginnen Sie, die schwimmenden Abschnitte zu sammeln. Führen Sie die Schritte 4.4.8-4.4.13 aus, um das Gehirn zu schneiden.
    8. Bürsten Sie alle vorherigen Abschnitte vom Block und Objekthalter ab, so dass sie in die Auffangschale fallen. Bürsten Sie sie auf einer Seite des Fachs ab und halten Sie sie getrennt. Wenn der Stapel zu groß ist, leeren Sie das Fach.
    9. Geben Sie 1 ml PBS in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte. Beschriften Sie 1 Zeile für jedes Gehirn.
    10. Schneiden Sie 6 koronale Abschnitte. Holen Sie die Abschnitte mit einer kalten Pinzette und ordnen Sie sie auf der Kryostatbühne an. Wiederholen Sie diesen Schritt 2 oder 3 Mal, wobei die Gruppen von 6 Abschnitten getrennt bleiben.
    11. Befeuchten Sie einen Pinsel der Größe 000 mit PBS und tupfen Sie überschüssige Flüssigkeit auf einem fusselfreien Taschentuch oder Papiertuch ab. Verwenden Sie den Pinsel, um jeden Abschnitt vorsichtig einzeln aufzunehmen und in die entsprechenden Vertiefungen der 24-Well-Platte zu legen.
    12. Legen Sie einen der 6 Abschnitte aus der Gruppe der Scheiben in jede der 6 Vertiefungen in einer Reihe der 24 Vertiefungsplatten. Dies stellt sicher, dass jeder Brunnen repräsentative Abschnitte enthält, die den geschnittenen Bereich des Gehirns überspannen.
    13. Fahren Sie mit der Sektion in Gruppen von 6 Personen fort, bis das kaudale Ende der Großhirnrinde geschnitten ist.
    14. Zur Lagerung die 24-Well-Platte mit Parafilm verschließen und bei 4 °C lagern.
      HINWEIS: Die Abschnitte sind 1-2 Monate bei 4 °C stabil. Eine PBS-Lösung mit 0,1% Natriumazid kann verwendet werden, um das Bakterienwachstum zu hemmen und die Haltbarkeit der Abschnitte zu verlängern. Wenn die Abschnitte jedoch länger als 2 Monate gelagert werden sollen, sollten sie in Kryoschutzlösung gelegt und bei -20 °C eingefroren werden, um optimale Ergebnisse zu erzielen.
  5. Führen Sie Immunhistochemie zur Signalverstärkung von Reportergen durch.
    HINWEIS: Alle Schritte außer der Antigengewinnung sollten mit sanftem bis mäßigem Rühren (~ 100 U/min) auf einem Orbitalschüttler durchgeführt werden. Um die native Fluoreszenz des Kontrollreporters (mRuby3) zu erhalten, sollten alle Schritte so gut wie möglich vor Licht geschützt werden.
    1. Bereiten Sie die erforderlichen Puffer wie in Tabelle 3 beschrieben vor.
    2. Bereiten Sie eine neue 24-Well-Platte mit einer Reihe für jedes gefärbte Gehirn vor. Fügen Sie in der ersten Spalte der Vertiefungen 1 ml PBS zu jedem Bohrloch hinzu.
    3. Übertragen Sie mit einem Pinsel der Größe 000 vorsichtig 1 Vertiefung von Abschnitten aus der ursprünglichen Sammlungsmulde in die frische PBS in der neuen 24-Well-Platte, um eine schnelle Spülung durchzuführen, um die restliche OCT-Verbindung zu entfernen.
    4. Geben Sie 1 ml ARB in die nächste Vertiefung in der 24-Well-Platte und Transferabschnitte in diese Well. In einem Ofen bei 60 °C für 1 h bebrüten.
    5. Lassen Sie die Platte 20 min bei Raumtemperatur (RT) abkühlen.
    6. Geben Sie 1 ml PB in die nächste Vertiefung und übertragen Sie die Abschnitte in diese Vertiefung. Inkubieren bei RT für 20 min.
    7. Geben Sie 500 μL BB in die nächste Vertiefung und geben Sie die Abschnitte in diese Vertiefung. Inkubieren bei RT für 1 h.
    8. Fügen Sie 2 ml WB zum BB hinzu und pipetten Sie dann ~ 2 ml Lösung heraus und verwerfen Sie, wobei eine verdünnte BB-Lösung in der Vertiefung verbleibt. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis die Abschnitte deutlich sichtbar sind.
    9. Verdünnen Sie den primären Antikörper (Chicken IgY Anti-GFP, 1:1000) in BB. Geben Sie 350-500 μL primäre Antikörperlösung in die nächste Vertiefung und übertragen Sie die Abschnitte in diese Vertiefung. Die Platte mit Parafilm verschließen und über Nacht bei 4 °C inkubieren.
    10. Verdünnen Sie BB wie zuvor mit WB, bis die Abschnitte deutlich sichtbar sind.
    11. Geben Sie 1 ml WB in die nächste Vertiefung und übertragen Sie die Abschnitte in diese Vertiefung. Inkubieren bei RT für 20 min.
    12. Entfernen Sie ~ 800-900 μL Puffer und verwerfen Sie. 1 ml frisches WB hinzufügen und 20 min inkubieren. Ersetzen Sie 1 ml WB 4 weitere Male für insgesamt 5 Wäschen à 20 Minuten.
    13. Verdünnen Sie den sekundären Antikörper (Donkey Anti-Chicken Alexa Fluor 488 konjugiert, 1:500) in BB. Geben Sie 350-500 μL der sekundären Antikörperlösung in eine neue Vertiefung. Inkubieren bei RT für 45 min bis 1 h.
      HINWEIS: Dies ist die siebte Vertiefung, wenn also Abschnitte von mehr als 2 Gehirnen gefärbt werden, wird an dieser Stelle eine neue Platte benötigt.
    14. Verdünnen Sie BB wie zuvor mit WB und geben Sie die Abschnitte in eine neue Vertiefung, die mit 1 ml WB gefüllt ist. Waschen Sie die Abschnitte wie zuvor für 20 min 3 mal.
    15. Bereiten Sie eine Arbeitslösung von DAPI in PBS (Endkonzentration 0,04-0,8 μg/ml) vor. Lösung vor Licht schützen.
    16. Geben Sie 1 ml DAPI-Lösung in die nächste Vertiefung und übertragen Sie die Abschnitte in diese Vertiefung. Inkubieren bei RT für ~5 min.
    17. Übertragen Sie die Schnitte zurück zu WB und montieren Sie sie vorsichtig mit einem Pinsel der Größe 000 auf Objektträger. Lassen Sie die Objektträger an der Luft trocknen.
    18. Deckgläser mit einem geeigneten Montagemedium auftragen. Lassen Sie Dias bei RT im Dunkeln über Nacht aushärten.

5. Bilder und analysieren Sie Hirngewebeschnitte für die Enhancer-Aktivität.

  1. Verwenden Sie ein Objektiv mit geringer Vergrößerung (5x), um Fluoreszenzbilder aufzunehmen, die sich über den Gehirnabschnitt erstrecken.
  2. Lokalisieren Sie die Injektionsstelle und bewerten Sie das Ausmaß der Virustransduktion basierend auf der Dichte und Intensität der rot fluoreszierenden Zellen. Achten Sie darauf, Tiere zu vergleichen, die ähnlich übertragen wurden.
  3. Nehmen Sie bei Bedarf detaillierte fluoreszierende Bilder mit einem Objektiv mit höherer Vergrößerung (≥25x) auf.
    HINWEIS: Achten Sie immer darauf, die gleichen Einstellungen für Erfassungsparameter wie Anregungslichtintensität, Filter und Belichtungszeit zwischen den zu vergleichenden Proben zu verwenden.
  4. Verarbeiten Sie die Bilder mit einer Bildanalysesoftware.
    HINWEIS: Die Verarbeitung kann in jedem Bildanalyse-Softwarepaket erfolgen. Die folgenden Schritte sind Vorschläge zum Bestimmen, ob eine Sequenz als Enhancer im Reporterkonstruktkontext fungiert (eine Ja- oder Nein-Frage) mithilfe der Open-Source-FIJI-Distribution von ImageJ. Eine tiefergehende Photometrie kann beim Vergleich von Aktivitätsgraden zwischen Enhancer-Varianten angebracht sein. Bilder aus verschiedenen Proben sollten immer konsistent verarbeitet werden, um verglichen zu werden.
    1. Wenden Sie Filter an, um Rauschen zu reduzieren. Wählen Sie in Fidschi die Option Flecken entfernen im Menü Verarbeitung > Rauschen .
      HINWEIS: Dies ist ein 3 x 3 Medianfilter.
    2. Subtrahieren Sie die Hintergrundfluoreszenz gemäß den Schritten 5.4.3-5.4.6.
    3. Trennen Sie die Kanäle eines Mehrkanalbildes. Wählen Sie in Fidschi im Menü Bild > Farbe die Option Kanäle teilen.
    4. Verwenden Sie das Rechteck- oder Kreisauswahlwerkzeug, um eine kleine Form in einem Bereich des Bildes zu zeichnen, der keine fluoreszierenden Zellen aufweist, und messen Sie die durchschnittliche Pixelintensität des Hintergrunds mit "Analysieren > Messen". Wiederholen Sie diesen Vorgang, um mehrere Bereiche zu testen.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass im Menü "Analysieren > Messungen festlegen" die Option "Mittlerer Grauwert" ausgewählt ist.
    5. Mittelwert des mittleren Grauwerts aus 5-8 Hintergrundbereichen, und lassen Sie das Dezimalzeichen weg. Subtrahieren Sie diesen Wert von jedem Pixel im Bild mit Prozess > Mathematik > Subtrahieren.
      HINWEIS: Eine Rundung auf die nächste ganze Zahl könnte den zu subtrahierenden Hintergrund überschätzen. Es ist konservativer, das Komma einfach wegzulassen. Zum Beispiel würde 6,4 auf 6 abgerundet werden, aber 6,5 sollte auch auf 6 abgerundet werden, um das Risiko zu vermeiden, 0,5 Einheiten des realen Signals von jedem Pixel abzuziehen.
    6. Falls gewünscht, führen Sie die Kanäle wieder zu einem Mehrkanalbild zusammen. Verwenden Sie in Fidschi Bild- > Farb- > Kanäle zusammenführen.
    7. Fügen Sie alle überlappenden Bilder zusammen. Verwenden Sie in Fidschi Plugins > Stitching > Grid/Collection Stitching.
    8. Passen Sie Helligkeit und Kontrast an. Verwenden Sie in Fidschi Image > Adjust > Brightness/Contrast.
      HINWEIS: Verwenden Sie für jedes zu vergleichende Bild immer die gleichen Mindest- und Maximalwerte.
    9. Zählen Sie die Anzahl der grün fluoreszierenden Zellen gemäß den Schritten 5.4.10-5.4.12. Dies sind die Zellen, in denen die Kandidaten-Enhancer-Sequenz die Reporterexpression steuern konnte.
    10. Beginnen Sie damit, den grünen Kanal auszublenden, und verwenden Sie das Freiform-Auswahlwerkzeug, um eine Form um die Region des Gehirns zu zeichnen, die rote Fluoreszenz ausdrückt. Messen Sie mit der Measure-Funktion in Fidschi die Fläche, die integrierte Dichte und den mittleren Grauwert des roten Kanals in dieser Zone.
    11. Zählen Sie mit dem Mehrpunktauswahlwerkzeug die Anzahl der grünen Zellen in dieser Zone.
    12. Normalisieren Sie die Anzahl der grünen Zellen durch die integrierte Dichte des roten Kanals. Die lokale Rotkanalhelligkeit ist ein Proxy-Maß für das Ausmaß der Virusexposition und ermöglicht den Vergleich der Enhancer-Aktivität zwischen verschiedenen transduzierten Tieren.

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Representative Results

Mit diesen Methoden wurde eine 915 bp-Sequenz im psychiatrischen risikoassoziierten dritten Intron des Gens CACNA1C19,49,50 auf Enhancer-Aktivität im postnatalen Mausgehirn getestet. Diese Sequenz wurde in einer MPRA von 345 Kandidaten-Enhancer-Sequenzen entdeckt, die sich auf psychiatrische und neurologische Risiko-SNPs12 konzentrieren, und Charakterisierungsexperimente werden hier als allgemeines Beispiel beschrieben. C57BL/6-Mäuse wurden bei P0 mit einem AAV9-Konstrukt injiziert, das als selbstkomplementärer Vektor51 verpackt war, der EGFP unter der Kontrolle des Hsp68-Minimalpromotors und einer einzelnen Kandidaten-Enhancer-Sequenz enthielt (Abbildung 3A). Zusätzliche Mäuse wurden mit Konstrukten injiziert, die eine negative Kontrollsequenz enthielten, von der vorhergesagt wurde, dass sie keine regulatorische Aktivität hatte (Abbildung 3B). Virale Titer für diese Konstrukte wurden auf 6,85 x10 10 vg / ml normalisiert. Alle injizierten Mäuse wurden mit einem AAV9-verpackten Konstrukt injiziert, das mRuby3 unter der Kontrolle des konstitutiven CAG-Promotors enthielt, um den Bereich zu visualisieren, der erfolgreich transduziert wurde, und um die potenzielle Variabilität der Stelle und die Ausbreitung der Infektion zu kontrollieren. Gehirne wurden am postnatalen Tag (P)28 für Immunhistochemie und Bildgebung gesammelt. Diese Experimente bestätigten, dass diese Kandidaten-Enhancer-Region in CACNA1C die Expression von EGFP im P28-Mausgehirn steuerte (Abbildung 3A), während eine negative Kontrollsequenz dies nicht tat (Abbildung 3B). Diese Ergebnisse zeigen die Anwendung von Enhancer-Reporter-Assays im Gehirn der Maus, die eine lebendigeUntersuchung von Enhancern unter Bedingungen ermöglichen, die mit herkömmlichen In-vitro-Modellen nicht rekapituliert werden können.

Diese Methoden können auch verwendet werden, um Bibliotheken von Kandidaten-Enhancer-Sequenzen auf Aktivität mit AAV-basierten Übermittlungsmethoden zu testen, z. B. in MPRAs. Repräsentative Bilder der bibliotheksbasierten Reporterexpression an verschiedenen Titern zeigen die Flexibilität dieses Assays und die Wirkung des Virustiters auf die Transduktionseffizienz. Virenpräparate mit hohem Titer (Abbildung 4A) und niedrigem Titer (Abbildung 4B) führen zu Unterschieden in der Menge der transduzierten Zellen, was sowohl durch die positive mRuby3-Expression der Kontrolle durch einen CAG-Promotor als auch durch die EGFP-Expression aus den Kandidaten-Enhancer-Bibliotheken im postnatalen Mausgehirn belegt wird. Es gibt Situationen, in denen entweder hoher Titer und breite Transduktion oder niedriger Titer und spärliche Transduktion bevorzugt werden können.

Figure 1
Abbildung 1: Übersicht über das Protokoll. Zu den Schlüsselelementen dieses Assays gehören ein Kandidaten-Enhancer-Element, ein minimaler Promotor, ein Reportergen und, je nach Assay-Design, eine Barcode-Sequenz für ein eindeutiges Tagging. Diese Elemente werden in ein AAV-Plasmid-Backbone kloniert und in AAV verpackt. Das Virus wird an das Tier abgegeben und für einige Tage oder Wochen inkubiert. Schließlich wird das interessierende Gewebe gesammelt und die Enhancer-Aktivität mittels Bildgebung oder Sequenzierung ermittelt. Die Enhancer-getriebene Transgenexpression kann im Gegensatz zu konstitutiven Treibern eine Expression mit zelltypischer, regionaler und zeitlicher Spezifität erzeugen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Flexibilität beim Assay-Design . (A) Die Plasmidorientierung kann den Enhancer vor dem minimalen Promotor oder stromabwärts des Reportergens platzieren, wie in STARR-seq28. Für sequenzbasierte Auslesungen wird ein Barcode dem Reportergen nachgeschaltet, oder der Enhancer kann als eigener Barcode in der zweiten Orientierung dienen. (B) Übliche virale Verabreichungstechniken an das Gehirn umfassen intrakranielle Injektionen, retroorbitale Injektionen oder Schwanzveneninjektionen, die zu unterschiedlichen Dichten transduzierter Zellen in verschiedenen Geweben führen können. (C) Die Auslesungen können sequenzierungsbasiert oder bildgebend sein. In sequenzierungsbasierten Auslesungen wird die Enhancer-Aktivität durch einen relativen Anstieg der RNA-Sequenz gegenüber der Eingangs-DNA-Sequenz definiert (Kontrolle der AAV-Abgabe). Bei bildgebenden Auslesungen ist die Expression des Reportergens dort erhöht, wo der Enhancer aktiv ist. (D) Potenzielle intronische Enhancer im psychiatrischen risikoassoziierten Gen CACNA1C werden hervorgehoben. Im oberen Bild wird eine breite Region ausgewählt, die starke Assoziationen zu GWAS-getesteten Merkmalen und Interaktionen mit dem CACNA1C-Promotor über PLAC-seq20 aufweist. Im Inset werden kleinere Kandidatenregionen identifiziert, die auf Sequenzebene evolutionär konserviert sind, sich in Bereichen mit offenem Chromatin befinden und epigenetische Markierungen aufweisen, die auf Enhancer hinweisen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Enhancer in CACNA1C treibt die EGFP-Expression im P28-Mausgehirn an . (A) Eine Maus, die intrakraniell bei P0 mit einem Enhancer-Reporter-Konstrukt (scAAV9-Hsp68-EGFP-CACNA1C_3) und konstitutiv exprimierter Injektionskontrolle (AAV9-CAG-mRuby3) injiziert wurde, zeigt eine enhancergetriebene EGFP-Expression in den mittleren bis unteren Schichten des Kortex bei P28. (B) Eine bei P0 injizierte Maus mit einem Negativkontrollkonstrukt (scAAV9-Hsp68-EGFP-NEG_4) und Injektionskontrolle zeigt keine Expression von EGFP bei P28. Ganzhirnbilder wurden mit 5-facher Vergrößerung aufgenommen und Einschübe zeigen eine vergrößerte Ansicht des Box-Region. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: AAV-gelieferte Enhancer-Reporter-Bibliotheken verschiedener Titer zeigen Aktivität im Gehirn der Maus. (A) Die kommerziell verpackte High-Titer-AAV-PHP.eB-Bibliothek von Kandidatenverstärkern fördert die breite EGFP-Expression im P7-Mausgehirn. (B) Eine AAV9-Bibliothek mit niedrigerem Titer von Kandidatenverstärkern, die aus konditionierten Medien der Verpackungszellen ausfällt, treibt die spärliche EGFP-Expression im P7-Mausgehirn an. Die Bilder wurden mit 5-facher Vergrößerung aufgenommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

PCR-Reaktionsmischung
5x Reaktionspuffer 10 μL
dNTPs Endkonzentration von je 200 μM
Klon-Primer Endkonzentration von je 0,2 μM
Template-DNA 50 ng
High-Fidelity-Polymerase Endkonzentration von 0,02 U/μL
Nukleasefreies Wasser um ein endgültiges Reaktionsvolumen von 50 μL zu erreichen
Thermocycling-Bedingungen
30 Zyklen der folgenden: Notizen
Schritt Temperatur Zeit
Vergällen 98 °C 10 s
Ausglühen 60 °C 20 s Die optimale Temperatur kann je nach Primer variieren.
Ausdehnen 72 °C 30 s Die optimale Temperatur und Dauer kann je nach Polymerase variieren.
Endgültige Verlängerung 72 °C 2 Minuten Die optimale Temperatur und Dauer kann je nach Polymerase variieren.
Halten 4 °C

Tabelle 1: PCR-Reaktionsmischung und Thermocycling-Bedingungen.

Thermocycling-Bedingungen
30 Zyklen der folgenden: Notizen
Schritt Temperatur Zeit
Zelllyse 98 °C 5 Minuten
Vergällen 98 °C 10 s
Ausglühen 55 °C 15 s Die optimale Temperatur kann je nach Primer variieren.
Ausdehnen 72 °C 30 s Die optimale Temperatur und Dauer kann je nach Polymerase variieren.
Halten 4 °C

Tabelle 2: Thermocycling-Bedingungen für die Kolonie-PCR.

Puffer für die Immunhistochemie
Puffer Zusammensetzung
1x PBS 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4
1x Citrat-Antigen-Retrieval-Puffer (ARB), pH 6,0 Proprietär, siehe Materialtabelle
Permeabilisierungspuffer (PB) 1x PBS + 0,5% Triton X100
Waschpuffer (WB) 1x PBS + 0,1% Triton X100
Sperrpuffer (BB) WB + 5% Milch

Tabelle 3: Puffer für die Immunhistochemie.

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Discussion

Dieses Protokoll beschreibt eine rAAV-basierte Methode für den Einsatz von Enhancer-getriebenen Transgenen im postnatalen Mausgehirn. In diesem verallgemeinerten Protokoll werden ein Kandidatenverstärker, ein minimaler Promotor, ein Reportergen und eine optionale Barcode-Sequenz in ein AAV-Plasmid-Rückgrat kloniert. Diese Experimente können mit einer einzelnen Kandidaten-Enhancer-Sequenz oder mit vielen parallelen Sequenzen durchgeführt werden. Das Plasmid wird in ein rAAV verpackt und an das postnatale Mausgehirn abgegeben. Nach einer gewissen Zeit, um die Virustransduktion zu ermöglichen, wird das Gehirn gesammelt und für die Reportergenexpression abgebildet. Ein konstitutiv exprimiertes Reportervirus (CAG-mRuby3) ist als Injektionskontrolle enthalten. Mit diesem Assay wird gezeigt, dass Enhancer-Elemente die Transkription von EGFP im Gehirn der Maus vorantreiben und die Enhancer-Aktivität in vivo demonstrieren.

Die primären Ziele für die Fehlerbehebung und Optimierung dieses Assays umfassen den Virustiter, die Injektionstechnik und den Transduktionszeitrahmen. Verschiedene Virustiter können einen starken Einfluss auf die Dichte der transduzierten Zellen haben. Während eine höhere Transduktionseffizienz für die meisten Forschungen wahrscheinlich vorzuziehen ist, hängt das optimale Transduktionsniveau stark von experimentellen Zielen ab. Intrakranielle Injektionen bieten eine hohe Dichte an transduzierten Zellen, sind aber wahrscheinlich an der Injektionsstelle fokaler, obwohl die Ausbreitung der Infektion vom viralen Serotyp und dem Alter des Tieres abhängenkann 52. Retroorbitale Injektionen können eine gleichmäßigere Verteilung der transduzierten Zellen im gesamten Gehirn zeigen, sind jedoch weniger wahrscheinlich, dass sie einen Bereich mit hoher Infektion verursachen. Schwanzveneninjektionen können neben dem Gehirn auch andere Gewebe effektiver transduzieren, werden aber wahrscheinlich noch geringere Dichten von transduzierten Zellen im Gehirn ergeben. In ähnlicher Weise kann eine Vielzahl von Zeitrahmen für die Virustransduktion im Gehirn verschiedenen Zwecken dienen. Eine robuste scAAV-Expression kann bereits sieben Tage nach intrakranieller Injektion im Gehirn auftreten, obwohl Perioden von 28 Tagen oder länger häufiger verwendet werden und eine starke Expression ergeben. Da Enhancer zeitlich spezifisch in ihrer Aktivität sein können, ist es wichtig, die vorhergesagte Aktivität der getesteten Enhancer bei der Festlegung des Studiendesigns zu berücksichtigen.

Es gibt einige Einschränkungen, die mit diesen Methoden verbunden sind, die andere Optionen je nach experimentellen Zielen zu einer geeigneteren Wahl machen könnten. Da AAVs eine geringe Integration in das Genom aufweisen, werden Gewebe am effektivsten transduziert, wenn sie reif sind und es eine hohe Dichte an postmitotischen Zellen gibt, da eine große Menge fortgesetzter Zellteilungen die Dichte transgenexprimierender Zellen verringert. Für die virale Abgabe eines Transgens an ein weniger ausgereiftes Modell, wie z. B. Gewebe, die noch wachsen, können Lentiviren eine geeignetere Wahl sein, da sie sich in das Genom integrieren und von allen Tochterzellen einer transduzierten proliferierenden Zelle vererbt werden. Obwohl der hier beschriebene Reporter-Assay eine weit verbreitete Technik für die funktionelle Untersuchung der cis-regulatorischen Aktivität ist, kann er kein vollständiges Bild davon liefern, wie das regulatorische Element in seinem nativen Kontext wirkt. Zum Beispiel liefert dieser Assay keine Informationen darüber, welche Gene vom regulatorischen Element im Genom angegriffen werden können. Wenn jedoch die Zielgene des Enhancers bekannt sind, können diese Informationen genutzt werden, um festzustellen, ob die Zelltypen, die in diesem Assay eine Expression zeigen, mit denen übereinstimmen, von denen bekannt ist, dass sie die Zielgene des Enhancers exprimieren, was der Interpretation der Ergebnisse eine hohe biologische Gültigkeit verleihen würde. Der Assay rekapituliert möglicherweise auch nicht vollständig die Auswirkungen, die die umgebende genomische Sequenz oder die normale biologische und Verhaltensaktivität des Tieres auf die Aktivität des getesteten regulatorischen Elements haben kann. Schließlich beschreibt dieses Protokoll das STARR-seq-Reporter-Assay-Design, bei dem das Kandidaten-Enhancer-Element stromabwärts des Reportergens im ORF kloniert wird, im Gegensatz zum Upstream des Promotors, wie bei der konventionellen Reporter-Assay-Klonierungsorientierung. Die Einbeziehung langer variabler Sequenzen in den ORF des Reportergens kann aufgrund von Faktoren wie RNA-bindenden Proteinmotiven, alternativen Spleißstellen oder variablem GC-Gehalt zu einer verminderten RNA-Stabilität führen 36,53, und statistische Methoden wurden entwickelt, um sequenzbasierte Verzerrungen bei der Analyse von STARR-seq-Datenzu berücksichtigen 54,55. Trotz dieser Überlegungen wurden STARR-seq MPRAs in den letzten Jahren häufig verwendet, um cis-regulatorische Elemente erfolgreich zu identifizieren56,57,58,59. Die hier beschriebenen Methoden können leicht für den Einsatz mit der konventionellen MPRA-Orientierung angepasst werden.

Die Zelltypspezifität von Enhancern macht diesen Assay zu einem leistungsstarken Werkzeug, um die zelltypspezifische Expression von interessierenden Genen in vivo voranzutreiben. Aktuelle Techniken zur zelltypspezifischen Expression eines gewünschten Gens können durch die Verfügbarkeit bedingter Expressionskonstrukte eingeschränkt sein oder die Erzeugung neuer transgener Mauslinien erfordern. Unter Verwendung eines rAAV-basierten Enhancer-gesteuerten Systems kann ein interessierendes Gen räumlich spezifisch exprimiert werden, indem validierte zelltypspezifische Enhancer oder Promotoren verwendet werden, um die Expression 13,14,15 voranzutreiben. Neuere Entwicklungen in dieser Technologie haben gezeigt, dass die Kombination von zelltypspezifischen Enhancern mit rAAV-Serotypen mit Tropismen für Zellen oder Gewebe von Interesse eine ähnliche Spezifität der Transgenexpression aufweisen kann wie in transgenenTiermodellen 60. Dies bietet eine kostengünstige, schnelle und potenziell hochdurchsatzfähige Methode für das Sequenzscreening und die spezifische Induktion der Transgenexpression in vivo in Tiermodellen.

Diese Technologie hat auch therapeutisches Potenzial. Klinische Studien haben gezeigt, dass die rAAV-basierte Abgabe eines Transgens in vivo die Expression gesunder Kopien eines Gens induzieren kann, wenn nur eine defekte Kopie vorhanden ist oder das Gen nicht mit ausreichender Rate transkribiert wird61,62,63. Die Auswahl eines treibenden Enhancer-Elements hat das Potenzial, eine generalisierte Abgabe, aber Expressionsinduktion in einer zelltypspezifischen Weise zu ermöglichen. Schließlich bringt die Abgabe des Transgens über rAAV auch erhebliche Vorteile; AAVs haben eine geringere Immunogenität als andere Viren, die häufig bei der Transgenabgabe verwendet werden64, was sie zu einem potenziell sicheren viralen Vektor für den klinischen Einsatz macht.

Der spezifische Einsatz von In-vivo-rAAV-basierten Enhancer-Reporter-Assays ist anpassbar und kann an eine Reihe von experimentellen Zielen angepasst werden. Verschiedene Gewebe und Zellen können durch die Auswahl von AAV-Serotypen oder -Verstärkern mit Zelltyp oder raumzeitlicher Spezifität gezielt anvisiert werden. Zwischen einem und Tausenden von Enhancer-Reporter-Konstrukten können in vivo geliefert werden, und die Aktivität kann mit einer Reihe von bildgebenden und sequenzierungsbasierten Auslesungen untersucht werden, wie in einer neuen Reihe von Studien mit diesem Ansatz gezeigt wurde 15,16,65,66,67,68 . Die Bandbreite der Optionen für das Design und die Bereitstellung von Konstrukten ermöglicht es, diese Technik für eine Vielzahl von Anwendungen sowohl in der translationalen als auch in der Grundlagenforschung zu modifizieren, was sie zu einem leistungsstarken neuen Werkzeug für die Genomik und neurowissenschaftliche Forschung macht.

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Disclosures

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Acknowledgments

Die Sequenzierung wurde am UC Davis DNA Technologies Core durchgeführt. Wir danken dem Labor von Lin Tian an der UC Davis für die Schulung zu rAAV-Verpackungen und die großzügige Schenkung von AAV-Helfer- und Rep/Cap-Plasmiden. Diese Arbeit wurde von NIH/NIGMS R35GM119831 unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x Citrate Buffer Sigma-Aldrich C9999-1000ML
5'-gatcactctcggcatggac-3' Integrated DNA Technologies N/A: Custom designed Forward primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments.
5'-gatggctggcaactagaagg-3' Integrated DNA Technologies N/A: Custom designed Reverse primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments.
Agarose VWR VWRVN605-500G
Aspirator tube assemblies Sigma-Aldrich A5177-5EA for mouth-driven delivery of rAAV
Bacteriological petri dishes Thermo Fisher Scientific 08-757-100D
Carbenicillin Sigma-Aldrich C1389-5G
Chicken IgY anti-GFP Thermo Fisher Scientific A10262
Confocal microscope Zeiss LSM900 The images were taken on the LSM800 model, but Zeiss launched the LSM900 model in recent years to replace LSM800.
Conical centrifuge tubes 15 mL Thermo Fisher Scientific 12-565-269
Cryomolds Thermo Fisher Scientific NC9806558 These molds are suitable for P28 mouse brain. Other sizes may be more suitable for larger or smaller tissues.
DAPI Sigma-Aldrich D9542-10MG
Dissecting scissors, 4.5" VWR 82027-578
Donkey anti-chicken AlexaFlour-488 Jackson ImmunoResearch 703-545-155
Dulbecco's PBS 1x Thermo Fisher Scientific MT21031CV
Eppendorf Microcentrifuge tubes 2.0 mL Thermo Fisher Scientific 22431048
Falcon round-bottom tubes 14 mL Thermo Fisher Scientific 352059
Fast Green dye Grainger F0099-1G
Fine detail paint brush set Artbrush Tower B014GWCLFO
Gibson Assembly Master Mix NEB E2611S
Glass capillary tubes Drummond Scientific Company 5-000-2005
HiSpeed Plasmid Maxi Kit QIAGEN 12663 Commercial plasmid maxi prep kit
HyClone HyPure Molecular Biology Grade Water VWR SH30538.03
IV butterfly infusion set with 12" tubing and 25G needle Thermo Fisher Scientific 26708
Kimwipes Kimberly Clark 34155 Lint-free wipe
LB Agar Thermo Fisher Scientific BP1425-500 LB agar pre-mix for selective media
McPherson Vannas iris scissor Integra LifeSciences 360-215
Mineral oil Sigma Life Science 69794-500ML
NEB Stable Competent E. coli NEB C3040I
NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Takara 740609.5 Kit for enzymatic reaction cleanup and gel extraction
OCT medium VWR 25608-930
Orbital shaker Cole Parmer 60-100
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127-500G
PCR strip tubes 0.2 mL VWR 490003-692
Peristaltic pump Gilson F155005
Phosphate buffered saline (PBS) 10x Thermo Fisher Scientific 70011044
Phusion Hot Start II High Fidelity DNA Polymerase Thermo Fisher Scientific F549L
Powdered milk Sunny Select
ProLong Gold Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific P36934
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28106
rCutSmart Buffer NEB B6004S Buffer for restriction digest with PacI, AscI, and XmaI
Restriction enzyme: AscI NEB R0558L
Restriction enzyme: PacI NEB R0547L
Restriction enzyme: XmaI NEB R0180L
SOC outgrowth medium NEB B0920S Recovery medium after transformation
Sucrose (RNase/DNase free) Millipore Sigma 033522.5KG
TAE buffer Apex 20-194
Transfer tubing Gilson F1179941 For peristaltic pump
Triton X100 Sigma-Aldrich X100-100ML
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System Thermo Fisher Scientific A1460 Plasmid mini prep kit

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Neuroscience Ausgabe 181
AAV-Einsatz von Enhancer-basierten Expressionskonstrukten <em>in vivo</em> im Gehirn von Mäusen
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Warren, T. L., Lambert, J. T., Nord, … More

Warren, T. L., Lambert, J. T., Nord, A. S. AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain. J. Vis. Exp. (181), e62650, doi:10.3791/62650 (2022).

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