Этот протокол описывает новый анализ переходного энхансера-репортера на основе rAAV. Этот анализ может быть использован для индуцирования экспрессии in vivo, управляемой энхансерами, в мозге мыши.
Энхансеры являются связывающими платформами для разнообразного набора факторов транскрипции, которые управляют специфическими паттернами экспрессии ткане- и клеточных генов. Многочисленные средства оценки некодирующей ДНК и различных состояний хроматина оказались полезными для прогнозирования наличия энхансерных последовательностей в геноме, но проверка активности этих последовательностей и поиск органов и стадий развития, в которых они активны, является трудоемким процессом. Недавние достижения в области переносчиков аденоассоциированного вируса (AAV) позволили широко доставить трансгены в ткани мыши, что позволило проводить тестирование усилителей in vivo без необходимости трансгенного животного. Этот протокол показывает, как репортерная конструкция, которая выражает EGFP под контролем минимального промотора, который сам по себе не управляет значительным выражением, может быть использована для изучения паттернов активности последовательностей-усилителей кандидатов в мозге мыши. Упакованную AAV конструкцию репортера доставляют в мозг мыши и инкубируют в течение 1-4 недель, после чего животное приносят в жертву, а участки мозга наблюдают под микроскопом. EGFP появляется в клетках, в которых тестируемого энхансера достаточно для инициирования экспрессии генов, точно определяя местоположение и стадию развития, на которой энхансер активен в мозге. Стандартные методы клонирования, недорогая упаковка AAV и расширение серотипов AAV и методов доставки in vivo и стандартного считывания изображений делают этот подход доступным для изучения того, как экспрессия генов регулируется в мозге.
Энхансеры представляют собой геномные цис-регуляторные элементы, которые служат сайтами связывания транскрипционного фактора и могут стимулировать экспрессию гена-мишени пространственно-временнымспецифическим способом 1,2. Они дифференциально активны в различных типах клеток, тканях и стадиях развития и могут быть субстратами геномной вариации, связанной с риском заболевания 3,4. Таким образом, необходимость понимания динамики функции энхансера имеет решающее значение для прогресса как в трансляционных, так и в фундаментальных научных приложениях в геномике. In silico предсказания активности энхансера могут служить отличными ресурсами для генерации гипотез относительно способности усилителя 5,6. Такая предсказанная активность усилителя может потребовать дополнительной проверки и опроса для полного понимания функциональной активности. Анализы репортера Enhancer оказались ценными для этой цели в различных системах, от клеток до животных 7,8,9. Для расширения этих исследований в гибком и экономически эффективном переходном контексте in vivo этот протокол описывает использование методов на основе in vivo AAV для проверки предполагаемых последовательностей энхансеров на их способность управлять экспрессией эктопического репортерного гена в постнатальном мозге мыши. Это семейство методов полезно для опроса последовательностей с одним кандидатом или параллельного библиотечного скрининга и актуально для фундаментальных и трансляционных исследований.
Этот метод объединяет в одной плазмиде предполагаемую последовательность ДНК-кандидата энхансера с репортерным геном (здесь EGFP), под контролем минимального промотора, который сам по себе не управляет значимой экспрессией. Плазмида упаковывается в рекомбинантный AAV (rAAV) и вводится в животную модель. В то время как применение здесь относится к мозгу, различные серотипы rAAV позволяют инфекцию через различные типы тканей, так что этот подход может быть распространен на другие системы10. Через некоторое время мозг может быть собран и проанализирован для экспрессии репортерного гена. Сильная экспрессия, по сравнению с контрольной группой, указывает на то, что тестируемая последовательность-кандидат смогла «усилить» экспрессию гена (рисунок 1). Эта простая конструкция предлагает легкий и понятный подход к тестированию последовательности активности энхансеров in vivo в мозге.
В дополнение к тестированию на энхансерную способность последовательности, этот метод может быть объединен с методами определения активности энхансера клеточного типа. В последовательных подходах к определению дифференциальной активности энхансеров сортировка клеток по маркерам клеточного типа до секвенирования ДНК и РНК может позволить исследователям определить, проявляют ли различные типы клеток дифференциальную активность энхансеров, как было описано в Gisselbrecht et al.11. В подходах, основанных на визуализации, совместная маркировка изображений с маркерами, специфичными для клеточного типа, позволяет изучить, отображают ли клетки, проявляющие флуоресценцию, управляемую энхансером, также маркеры клеточного типа, представляющие интерес 12,13,14,15,16. Репортерные анализы энхансеров позволяют напрямую тестировать связанные с риском аллельные вариации в энхансерах на предмет воздействия на способность усилителя. Подавляющее большинство локусов риска, идентифицированных в общегеномных ассоциативных исследованиях (GWAS), лежат в некодирующих областях генома17. Исследования функциональных аннотаций этих локусов риска показывают, что большая часть, вероятно, действует как энхансеры 18,19,20. Развертывание MPRA in vivo может позволить протестировать эти связанные с риском варианты активности энхансеров в мозге 12,21. Наконец, доставка и сбор в разные моменты времени могут дать представление о стадиях развития, на которых активен энхансер.
Конструкции плазмид Энхансер-Репортер разнообразны и могут быть настроены в соответствии с экспериментальными целями. Существует несколько вариантов минимальных промоторов, которые использовались в исследованиях энхансеров, таких как минимальный промотор22 β-глобина человека и минимальный промотор23 мышиного Hsp68. Известно, что эти промоторы приводят к низким уровням экспрессии, если не сочетаются с энхансерным элементом для их активации. Напротив, конститутивные промоторные элементы стимулируют сильную экспрессию трансгена, что полезно для положительного контроля или для тестирования на функцию энхансера на фоне надежной экспрессии. Общий выбор конститутивных промоторов включает CAG, гибридный промотор, полученный из промотора куриного β-актина и цитомегаловируса немедленно-раннего энхансера24 или человеческого EF1α25. Поскольку известно, что энхансеры работают двунаправленно26, ориентация и расположение энхансера относительно минимального промотора являются гибкими (рисунок 2А). Традиционные энхансерно-репортерные анализы помещают энхансер выше по течению промотора и, в библиотечных поставках, включают последовательность штрих-кода ниже по течению от гена репортера, чтобы связать показания секвенирования с тестируемым энхансером27. Тем не менее, энхансеры также могут быть помещены в открытую рамку чтения репортерного гена и служить их собственной последовательностью штрих-кода, как это сделано в STARR-seq28. Протокол, описанный здесь, использует конструкцию анализа STARR-seq, помещая последовательность энхансера-кандидата в 3’UTR репортерного гена. Хотя ориентация STARR-seq предлагает преимущество более упорядоченного клонирования, она менее понятна, чем традиционный подход, и может вызывать переменную стабильность РНК между конструкциями. Описанные способы могут быть легко адаптированы либо к STARR-seq, либо к обычной ориентации с незначительными изменениями в процессе клонирования, которые были описаны в другом месте27,29.
Различные методы доставки AAV могут быть использованы для дальнейшей настройки этого метода в соответствии с экспериментальными целями (рисунок 2B). Прямые внутричерепные инъекции, описанные далее в этом протоколе, доставляют высокую концентрацию вируса непосредственно в мозг30. Это дает высокую эффективность трансдукции, сосредоточенной в месте инъекции, что делает ее отличной техникой для экспериментов, направленных на максимизацию плотности трансдуцированных клеток на участке ткани. Стереотаксическая инъекция может помочь стандартизировать место инъекции у животных для воспроизводимой локализованной трансдукции. Внутричерепные инъекции наиболее просты у ранних послеродовых животных. В качестве альтернативного метода системные инъекции могут доставлять трансгены с использованием AAV с серотипами, способными пересекать гематоэнцефалический барьер31. Инъекции в хвостовые вены позволяют вирусу циркулировать по всему телу, обеспечивая генерализованную доставку через многие ткани10. Ретроорбитальные инъекции являются еще одним методом системной инъекции, который доставляет вирус за глаз в ретро-орбитальный синус32. Это обеспечивает более прямой путь для AAV из венозной системы в мозг, что приводит к более высокой концентрации трансдуцированных клеток в мозге, чем инъекции в более периферические кровеносные сосуды33.
Другим гибким аспектом этой техники является метод считывания. В широком смысле варианты можно описать как основанные на репортерах или последовательности (рисунок 2C). Включение флуоресцентного репортера, такого как GFP, в открытую рамку считывания конструкции приводит к экспрессии флуоресцентного белка в любых трансдуцированных клетках, где энхансер-кандидат управлял экспрессией. Методы маркировки и визуализации, такие как иммуногистохимия, позволяют усиливать сигнал. Методы считывания на основе секвенирования включают идентификацию последовательностей из доставленной конструкции в РНК, собранной из ткани. Количественно оценивая количество вирусной ДНК, которая была первоначально доставлена, сравнение экспрессированной РНК и доставленной ДНК может быть использовано для определения степени, в которой протестированная последовательность энхансеров была способна стимулировать повышенную экспрессию трансгена, например, в контексте массово параллельного репортерного анализа (MPRA). MPRAs предлагают мощное расширение этих методов для одновременного тестирования до тысяч потенциальных энхансеров активности и были подробно описаны в исследованиях геномики 12,27,34,35,36. Более высокая пропускная способность скрининга достигается за счет выполнения этапов клонирования, упаковки, доставки и секвенирования для потенциальных усилителей в партии, а не по отдельности.
Выбор усилителя кандидата предоставляет еще одну возможность для гибкости (рисунок 2D). Например, этот анализ может быть использован для идентификации энхансеров определенного гена, для определения функции интересующих некодирующих областей ДНК или для определения конкретных типов клеток или стадий развития, во время которых активен энхансер – все это служит целям как в фундаментальной науке, так и в исследованиях заболеваний. Как правило, выбор энхансера-кандидата обусловлен in silico предсказаниями активности энхансера. Как правило, прогнозы in silico включают ChIP-seq для модификаций гистонов, которые указывают на вероятные энхансеры, такие как H3K27ac37 и картирование доступности хроматина38. Наконец, растущей областью исследований является функциональный скрининг синтетически разработанных энхансерных элементов, позволяющий изучать, как последовательность энхансеров направляет функцию39 , и дизайн усилителей с конкретными свойствами40.
Этот протокол описывает основанный на rAAV метод развертывания трансгенов, управляемых энхансерами, в постнатальном мозге мыши. В этом обобщенном протоколе энхансер-кандидат, минимальный промотор, репортерный ген и необязательная последовательность штрих-кода клонируются в плазмидну?…
The authors have nothing to disclose.
Секвенирование проводилось в UC Davis DNA Technologies Core. Мы благодарим лабораторию Лин Тяня в Калифорнийском университете в Дэвисе за обучение упаковке rAAV и щедро дарим нам помощника AAV и плазмиды rep /cap. Эта работа была поддержана NIH/NIGMS R35GM119831.
10x Citrate Buffer | Sigma-Aldrich | C9999-1000ML | |
5'-gatcactctcggcatggac-3' | Integrated DNA Technologies | N/A: Custom designed | Forward primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments. |
5'-gatggctggcaactagaagg-3' | Integrated DNA Technologies | N/A: Custom designed | Reverse primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments. |
Agarose | VWR | VWRVN605-500G | |
Aspirator tube assemblies | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | for mouth-driven delivery of rAAV |
Bacteriological petri dishes | Thermo Fisher Scientific | 08-757-100D | |
Carbenicillin | Sigma-Aldrich | C1389-5G | |
Chicken IgY anti-GFP | Thermo Fisher Scientific | A10262 | |
Confocal microscope | Zeiss | LSM900 | The images were taken on the LSM800 model, but Zeiss launched the LSM900 model in recent years to replace LSM800. |
Conical centrifuge tubes 15 mL | Thermo Fisher Scientific | 12-565-269 | |
Cryomolds | Thermo Fisher Scientific | NC9806558 | These molds are suitable for P28 mouse brain. Other sizes may be more suitable for larger or smaller tissues. |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | |
Dissecting scissors, 4.5" | VWR | 82027-578 | |
Donkey anti-chicken AlexaFlour-488 | Jackson ImmunoResearch | 703-545-155 | |
Dulbecco's PBS 1x | Thermo Fisher Scientific | MT21031CV | |
Eppendorf Microcentrifuge tubes 2.0 mL | Thermo Fisher Scientific | 22431048 | |
Falcon round-bottom tubes 14 mL | Thermo Fisher Scientific | 352059 | |
Fast Green dye | Grainger | F0099-1G | |
Fine detail paint brush set | Artbrush Tower | B014GWCLFO | |
Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611S | |
Glass capillary tubes | Drummond Scientific Company | 5-000-2005 | |
HiSpeed Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12663 | Commercial plasmid maxi prep kit |
HyClone HyPure Molecular Biology Grade Water | VWR | SH30538.03 | |
IV butterfly infusion set with 12" tubing and 25G needle | Thermo Fisher Scientific | 26708 | |
Kimwipes | Kimberly Clark | 34155 | Lint-free wipe |
LB Agar | Thermo Fisher Scientific | BP1425-500 | LB agar pre-mix for selective media |
McPherson Vannas iris scissor | Integra LifeSciences | 360-215 | |
Mineral oil | Sigma Life Science | 69794-500ML | |
NEB Stable Competent E. coli | NEB | C3040I | |
NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up | Takara | 740609.5 | Kit for enzymatic reaction cleanup and gel extraction |
OCT medium | VWR | 25608-930 | |
Orbital shaker | Cole Parmer | 60-100 | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
PCR strip tubes 0.2 mL | VWR | 490003-692 | |
Peristaltic pump | Gilson | F155005 | |
Phosphate buffered saline (PBS) 10x | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | |
Phusion Hot Start II High Fidelity DNA Polymerase | Thermo Fisher Scientific | F549L | |
Powdered milk | Sunny Select | ||
ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36934 | |
QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28106 | |
rCutSmart Buffer | NEB | B6004S | Buffer for restriction digest with PacI, AscI, and XmaI |
Restriction enzyme: AscI | NEB | R0558L | |
Restriction enzyme: PacI | NEB | R0547L | |
Restriction enzyme: XmaI | NEB | R0180L | |
SOC outgrowth medium | NEB | B0920S | Recovery medium after transformation |
Sucrose (RNase/DNase free) | Millipore Sigma | 033522.5KG | |
TAE buffer | Apex | 20-194 | |
Transfer tubing | Gilson | F1179941 | For peristaltic pump |
Triton X100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System | Thermo Fisher Scientific | A1460 | Plasmid mini prep kit |