Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

AAV Развертывание конструктов экспрессии на основе энхансеров In Vivo в мозге мыши

Published: March 31, 2022 doi: 10.3791/62650
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2
1Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, University of California, Davis, 2Department of Neurobiology, Physiology and Behavior, University of California, Davis

Summary

Этот протокол описывает новый анализ переходного энхансера-репортера на основе rAAV. Этот анализ может быть использован для индуцирования экспрессии in vivo, управляемой энхансерами, в мозге мыши.

Abstract

Энхансеры являются связывающими платформами для разнообразного набора факторов транскрипции, которые управляют специфическими паттернами экспрессии ткане- и клеточных генов. Многочисленные средства оценки некодирующей ДНК и различных состояний хроматина оказались полезными для прогнозирования наличия энхансерных последовательностей в геноме, но проверка активности этих последовательностей и поиск органов и стадий развития, в которых они активны, является трудоемким процессом. Недавние достижения в области переносчиков аденоассоциированного вируса (AAV) позволили широко доставить трансгены в ткани мыши, что позволило проводить тестирование усилителей in vivo без необходимости трансгенного животного. Этот протокол показывает, как репортерная конструкция, которая выражает EGFP под контролем минимального промотора, который сам по себе не управляет значительным выражением, может быть использована для изучения паттернов активности последовательностей-усилителей кандидатов в мозге мыши. Упакованную AAV конструкцию репортера доставляют в мозг мыши и инкубируют в течение 1-4 недель, после чего животное приносят в жертву, а участки мозга наблюдают под микроскопом. EGFP появляется в клетках, в которых тестируемого энхансера достаточно для инициирования экспрессии генов, точно определяя местоположение и стадию развития, на которой энхансер активен в мозге. Стандартные методы клонирования, недорогая упаковка AAV и расширение серотипов AAV и методов доставки in vivo и стандартного считывания изображений делают этот подход доступным для изучения того, как экспрессия генов регулируется в мозге.

Introduction

Энхансеры представляют собой геномные цис-регуляторные элементы, которые служат сайтами связывания транскрипционного фактора и могут стимулировать экспрессию гена-мишени пространственно-временнымспецифическим способом 1,2. Они дифференциально активны в различных типах клеток, тканях и стадиях развития и могут быть субстратами геномной вариации, связанной с риском заболевания 3,4. Таким образом, необходимость понимания динамики функции энхансера имеет решающее значение для прогресса как в трансляционных, так и в фундаментальных научных приложениях в геномике. In silico предсказания активности энхансера могут служить отличными ресурсами для генерации гипотез относительно способности усилителя 5,6. Такая предсказанная активность усилителя может потребовать дополнительной проверки и опроса для полного понимания функциональной активности. Анализы репортера Enhancer оказались ценными для этой цели в различных системах, от клеток до животных 7,8,9. Для расширения этих исследований в гибком и экономически эффективном переходном контексте in vivo этот протокол описывает использование методов на основе in vivo AAV для проверки предполагаемых последовательностей энхансеров на их способность управлять экспрессией эктопического репортерного гена в постнатальном мозге мыши. Это семейство методов полезно для опроса последовательностей с одним кандидатом или параллельного библиотечного скрининга и актуально для фундаментальных и трансляционных исследований.

Этот метод объединяет в одной плазмиде предполагаемую последовательность ДНК-кандидата энхансера с репортерным геном (здесь EGFP), под контролем минимального промотора, который сам по себе не управляет значимой экспрессией. Плазмида упаковывается в рекомбинантный AAV (rAAV) и вводится в животную модель. В то время как применение здесь относится к мозгу, различные серотипы rAAV позволяют инфекцию через различные типы тканей, так что этот подход может быть распространен на другие системы10. Через некоторое время мозг может быть собран и проанализирован для экспрессии репортерного гена. Сильная экспрессия, по сравнению с контрольной группой, указывает на то, что тестируемая последовательность-кандидат смогла «усилить» экспрессию гена (рисунок 1). Эта простая конструкция предлагает легкий и понятный подход к тестированию последовательности активности энхансеров in vivo в мозге.

В дополнение к тестированию на энхансерную способность последовательности, этот метод может быть объединен с методами определения активности энхансера клеточного типа. В последовательных подходах к определению дифференциальной активности энхансеров сортировка клеток по маркерам клеточного типа до секвенирования ДНК и РНК может позволить исследователям определить, проявляют ли различные типы клеток дифференциальную активность энхансеров, как было описано в Gisselbrecht et al.11. В подходах, основанных на визуализации, совместная маркировка изображений с маркерами, специфичными для клеточного типа, позволяет изучить, отображают ли клетки, проявляющие флуоресценцию, управляемую энхансером, также маркеры клеточного типа, представляющие интерес 12,13,14,15,16. Репортерные анализы энхансеров позволяют напрямую тестировать связанные с риском аллельные вариации в энхансерах на предмет воздействия на способность усилителя. Подавляющее большинство локусов риска, идентифицированных в общегеномных ассоциативных исследованиях (GWAS), лежат в некодирующих областях генома17. Исследования функциональных аннотаций этих локусов риска показывают, что большая часть, вероятно, действует как энхансеры 18,19,20. Развертывание MPRA in vivo может позволить протестировать эти связанные с риском варианты активности энхансеров в мозге 12,21. Наконец, доставка и сбор в разные моменты времени могут дать представление о стадиях развития, на которых активен энхансер.

Конструкции плазмид Энхансер-Репортер разнообразны и могут быть настроены в соответствии с экспериментальными целями. Существует несколько вариантов минимальных промоторов, которые использовались в исследованиях энхансеров, таких как минимальный промотор22 β-глобина человека и минимальный промотор23 мышиного Hsp68. Известно, что эти промоторы приводят к низким уровням экспрессии, если не сочетаются с энхансерным элементом для их активации. Напротив, конститутивные промоторные элементы стимулируют сильную экспрессию трансгена, что полезно для положительного контроля или для тестирования на функцию энхансера на фоне надежной экспрессии. Общий выбор конститутивных промоторов включает CAG, гибридный промотор, полученный из промотора куриного β-актина и цитомегаловируса немедленно-раннего энхансера24 или человеческого EF1α25. Поскольку известно, что энхансеры работают двунаправленно26, ориентация и расположение энхансера относительно минимального промотора являются гибкими (рисунок 2А). Традиционные энхансерно-репортерные анализы помещают энхансер выше по течению промотора и, в библиотечных поставках, включают последовательность штрих-кода ниже по течению от гена репортера, чтобы связать показания секвенирования с тестируемым энхансером27. Тем не менее, энхансеры также могут быть помещены в открытую рамку чтения репортерного гена и служить их собственной последовательностью штрих-кода, как это сделано в STARR-seq28. Протокол, описанный здесь, использует конструкцию анализа STARR-seq, помещая последовательность энхансера-кандидата в 3'UTR репортерного гена. Хотя ориентация STARR-seq предлагает преимущество более упорядоченного клонирования, она менее понятна, чем традиционный подход, и может вызывать переменную стабильность РНК между конструкциями. Описанные способы могут быть легко адаптированы либо к STARR-seq, либо к обычной ориентации с незначительными изменениями в процессе клонирования, которые были описаны в другом месте27,29.

Различные методы доставки AAV могут быть использованы для дальнейшей настройки этого метода в соответствии с экспериментальными целями (рисунок 2B). Прямые внутричерепные инъекции, описанные далее в этом протоколе, доставляют высокую концентрацию вируса непосредственно в мозг30. Это дает высокую эффективность трансдукции, сосредоточенной в месте инъекции, что делает ее отличной техникой для экспериментов, направленных на максимизацию плотности трансдуцированных клеток на участке ткани. Стереотаксическая инъекция может помочь стандартизировать место инъекции у животных для воспроизводимой локализованной трансдукции. Внутричерепные инъекции наиболее просты у ранних послеродовых животных. В качестве альтернативного метода системные инъекции могут доставлять трансгены с использованием AAV с серотипами, способными пересекать гематоэнцефалический барьер31. Инъекции в хвостовые вены позволяют вирусу циркулировать по всему телу, обеспечивая генерализованную доставку через многие ткани10. Ретроорбитальные инъекции являются еще одним методом системной инъекции, который доставляет вирус за глаз в ретро-орбитальный синус32. Это обеспечивает более прямой путь для AAV из венозной системы в мозг, что приводит к более высокой концентрации трансдуцированных клеток в мозге, чем инъекции в более периферические кровеносные сосуды33.

Другим гибким аспектом этой техники является метод считывания. В широком смысле варианты можно описать как основанные на репортерах или последовательности (рисунок 2C). Включение флуоресцентного репортера, такого как GFP, в открытую рамку считывания конструкции приводит к экспрессии флуоресцентного белка в любых трансдуцированных клетках, где энхансер-кандидат управлял экспрессией. Методы маркировки и визуализации, такие как иммуногистохимия, позволяют усиливать сигнал. Методы считывания на основе секвенирования включают идентификацию последовательностей из доставленной конструкции в РНК, собранной из ткани. Количественно оценивая количество вирусной ДНК, которая была первоначально доставлена, сравнение экспрессированной РНК и доставленной ДНК может быть использовано для определения степени, в которой протестированная последовательность энхансеров была способна стимулировать повышенную экспрессию трансгена, например, в контексте массово параллельного репортерного анализа (MPRA). MPRAs предлагают мощное расширение этих методов для одновременного тестирования до тысяч потенциальных энхансеров активности и были подробно описаны в исследованиях геномики 12,27,34,35,36. Более высокая пропускная способность скрининга достигается за счет выполнения этапов клонирования, упаковки, доставки и секвенирования для потенциальных усилителей в партии, а не по отдельности.

Выбор усилителя кандидата предоставляет еще одну возможность для гибкости (рисунок 2D). Например, этот анализ может быть использован для идентификации энхансеров определенного гена, для определения функции интересующих некодирующих областей ДНК или для определения конкретных типов клеток или стадий развития, во время которых активен энхансер - все это служит целям как в фундаментальной науке, так и в исследованиях заболеваний. Как правило, выбор энхансера-кандидата обусловлен in silico предсказаниями активности энхансера. Как правило, прогнозы in silico включают ChIP-seq для модификаций гистонов, которые указывают на вероятные энхансеры, такие как H3K27ac37 и картирование доступности хроматина38. Наконец, растущей областью исследований является функциональный скрининг синтетически разработанных энхансерных элементов, позволяющий изучать, как последовательность энхансеров направляет функцию39 , и дизайн усилителей с конкретными свойствами40.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Этот протокол был одобрен Институциональным комитетом по уходу и использованию животных Калифорнийского университета в Дэвисе (Протокол No 22339) и Институциональным комитетом по биобезопасности Калифорнийского университета в Дэвисе (BUA-R1903). Этот протокол был протестирован на мышах C57BL/6J обоих полов на послеродовой день 0-1.

1. Клонируйте последовательность-кандидат энхансера в векторную плазмиду AAV.

ПРИМЕЧАНИЕ: Приводятся репрезентативные протоколы, однако стратегия клонирования обладает высокой степенью гибкости.

  1. Выберите или спроектируйте конструкцию репортера. Здесь кандидат энхансера вставляется в 3' нетранслируемую область (UTR) репортерного гена EGFP, которая экспрессируется под контролем минимального промотора Hsp68.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Многие плазмидные конструкции MPRA, подходящие для этого анализа, были депонированы в Addgene41 и доступны для исследовательского использования.
  2. Разработайте праймеры ПЦР для усиления интересующей последовательности. Добавьте к 5'-дюймовому концу праймеров соответствующий гомологический рычаг для клонирования Гибсона (~35 bp, соответствующий последовательности 5' вверх по течению от места вставки, верхняя нить для передней грунтовки и нижняя нить для обратной грунтовки).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что последовательность базовой грунтовки составляет ~18-24 bp в длину и ~50%-60% содержания GC с температурой плавления приблизительно 57-59 °C.
  3. Выполните ПЦР из образца ДНК с помощью разработанных праймеров.
    1. Соберите реакционную смесь ПЦР в ПЦР-пробирки по 0,2 мл, как описано в таблице 1.
    2. Поместите реакционную смесь (смеси) ПЦР на термоциклер и циклите в соответствии с программой, указанной в таблице 1.
    3. Подтвердите успешность ПЦР, запустив 5 мкл продукта ПЦР на 0,7%-1% агарозном геле при 100 В в течение 30-60 мин. Проверьте наличие фрагмента прогнозируемой длины.
    4. Очистите продукт ПЦР с помощью коммерческого набора колонн для очистки ферментативной реакции. Конечным элюатом является клонирующая вставка.
  4. Выполните рестрикционное переваривание, чтобы линеаризировать вектор AAV в уникальном месте клонирования, чтобы вставить усилитель в вектор.
    1. Участок клонирования в 3''UTR конструкции усилителя репортера, используемой здесь, ограничен уникальными сайтами ограничения PacI и AscI. Выполните дайджест для линеаризации плазмиды в этом месте по следующим параметрам (шаги 1.4.2-1.4.4).
    2. Переваривайте 1-10 мкг векторной ДНК с помощью PacI и AscI, в зависимости от того, сколько реакций клонирования потребуется. Подготовьте реакции, используя прилагаемый буфер в соответствии с инструкциями производителя.
    3. Инкубировать при 37 °C в течение 1-2 ч для переваривания векторной ДНК. (При переваривании более 5 мкг в реакции 50 мкл может потребоваться более длительная инкубация.)
    4. После 1-2 ч инкубации инактивируют фермент путем инкубации при 65 °C в течение 20 мин.
    5. Отделить рестрикционные фрагменты переваривания гелевым электрофорезом с помощью 0,7%-1% агарозного геля, запустить при 100 В в течение 30-60 мин.
    6. Рассейте полосу для линеаризованного вектора и очистите с помощью коммерческого набора для экстракции геля.
  5. Выполнение реакций клонирования и преобразования Гибсона
    1. Определите концентрацию очищенного вектора и клонирующей вставки с помощью спектрофотометра.
      ПРИМЕЧАНИЕ: ДНК поглощает свет при 260 нм, в то время как загрязняющие вещества поглощают свет при 230 нм и 280 нм. Высокие соотношения (>1,8) 260/230 и 260/280 указывают на высокоочищенную ДНК.
    2. Собирают реакции клонирования Гибсона в 0,2 мл ПЦР-пробирок: 5 мкл 2х мастер-микса Гибсона, 0,02-0,5 пмоль фрагментов ДНК в соотношении 3:1 вставки к вектору (оптимальная концентрация ДНК для реакции должна быть определена эмпирически) и безнуклеазной воды (доводят объем до 10 мкл).
    3. Инкубируйте реакции Гибсона при 50 °C в течение 20 мин в термоциклере.
  6. Трансформировать рекомбинационную декомбинацию недостаточной (recA-) компетентной кишечной палочкой (E. coli).
    1. Установите водяную баню на 42 °C и разморозьте коммерчески доступные компетентные ячейки на льду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап может быть выполнен до этапа 1.4, и клетки могут оттаивать во время подготовки и инкубации реакции Гибсона.
    2. Аликвота 30-50 мкл клеток в 2,0 мл микроцентрифужных пробирок. Добавьте 2 мкл реакции Гибсона к аликвоте и пометьте трубку идентичностью Гибсона. Инкубировать клетки на льду в течение 30 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте 5-10 нг непереваренного пустого вектора в качестве положительного контроля и воду в качестве отрицательного контроля.
    3. Тепловой удар по клеткам на водяной бане 42 °C в течение 30-45 с, немедленно верните трубки ко льду и дайте им восстановиться в течение 5 мин.
    4. Находясь на льду, добавьте 400-950 мкл коммерчески доступной восстановительной среды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Восстановительная среда, используемая в этих экспериментах, содержит 2% растительного пептона, 0,5% дрожжевого экстракта, 10 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 10 мМ MgCl2, 10 мМ MgSO4 и 20 мМ глюкозы.
    5. После восстановления на льду полностью восстановить клетки путем инкубации при 37 °C с мягким перемешиванием 250 об/мин в течение 30-60 мин.
    6. Гранулируют клетки центрифугированием при 5000 х г в течение 5 мин и удаляют 400 мкл супернатанта, оставляя ~50 мкл бактерий на пластине.
    7. Пластину на селективных средах и инкубируют при 37 °C в течение ночи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Селективная среда, используемая в этих экспериментах, содержит 1,0% триптона, 0,5% дрожжевого экстракта, 1,0% хлорида натрия, 1-2% агара, 96-97% воды и карбенициллина в концентрации 100 мкг/мл. Всегда используйте рекомбинационные дефицитные штаммы бактерий для клонирования вирусных плазмид, потому что вирусные инвертированные терминальные повторы (ITR) имеют соответствующие последовательности и могут подвергаться гомологичной рекомбинации. Тем не менее, recA-штаммы бактерий по-прежнему подвергаются низким уровням рекомбинации. Используемая здесь репортерная плазмида представляет собой самокомплементарный AAV, где последовательность одного из ITR была изменена и больше не полностью соответствует другому ITR. Выращивание бактерий при 30 °C также рекомендуется для дальнейшего замедления скорости гомологичной рекомбинации.
  7. Проверяйте клоны и восстанавливайте плазмиды.
    1. Подготовьте мастер-микс ПЦР с помощью прямых и обратных грунтовок (Таблица материалов), которые отжигают вектор, фланкируя место вставки. Aliquot 10 мкл объемов в 0,2 мл ПЦР ленточных пробирок.
    2. В 14 мл в трубках с круглым дном приготовьте 5 мл аликвот селективного антибиотического бульона LB, по одному на каждую колонию, тестируемую с помощью ПЦР и отрицательного контроля.
    3. Используйте стерильную зубочистку или наконечник пипетки, чтобы выбрать отдельную колонию и примерно соскоблить колонию вниз на дно одной трубки ПЦР.
    4. Когда колония диссоциирует в мастер-микс ПЦР, опустите зубочистку или наконечник в одну из аликвот LB и пометьте трубку 14 мл реакцией Гибсона и номером трубки ПЦР.
    5. Поместите колониальные реакции ПЦР на тепловой циклер и цикл с программой, описанной в таблице 2.
    6. Инкубируйте жидкие культуры объемом 5 мл, привитые зубочистками или наконечниками пипеток, в встряхивающемся инкубаторе, установленном на 37 °C и 180 об/мин.
    7. Запустите реакции колониальной ПЦР на 0,7%-1% агарозном геле при 100 В в течение 30-60 мин и визуализируйте полосы в системе визуализации gel doc.
    8. Отбросьте культуры 5 мл, которые не отображают прогнозируемый диапазон ПЦР.
    9. Для каждого успешно интегрированного клона позвольте культурам 5 мл расти в течение ночи, а затем выполните плазмидную мини-подготовку от 4,5 мл с помощью коммерческого комплекта. Зарезервируйте 0,5 мл жидкой культуры и сохраните при -80 °C в виде глицерина.
    10. Подтвердите, что трансгены, содержащиеся в плазмидах, свободны от нежелательных мутаций, используя секвенирование Сэнгера42.
    11. После того, как было подтверждено, что конструкция репортера успешно клонирована, используйте сохраненный запас глицерина для посева закваски 5 мл и расти в течение 8-16 ч в встряхивающем инкубаторе при 30 °C и 180 оборотах в минуту.
    12. Как только бульон помутнеет, разбавьте закваску в 1000 раз в 250-300 мл свежего селективного бульона LB и высиживайте, по крайней мере, на ночь в встряхивающемся инкубаторе при 30 °C и 180 об/мин. Затем очистите плазмиду с помощью коммерческого плазмидного макси-набора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Бактерии будут расти медленнее при 30 ° C по сравнению с 37 ° C, но это лучшая температура для замедления скорости спонтанной рекомбинации при выращивании больших культур.
    13. Выполните дайджест XmaI для проверки рекомбинации РМЭ, используя шаги 1.4.2-1.4.5, заменив XmaI вместо PacI и AscI. Визуализируйте полосы на системе визуализации gel doc.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Плазмида rAAV с обоими присутствующими ITR даст две полосы на геле после этого дайджеста: одна длина генома rAAV, а другая длина остальной части плазмидной основы. Если есть только одна полоса, то ИТР подверглись гомологичной рекомбинации, и плазмида rAAV не будет способна упаковывать вирусные частицы. Плазмидная основа rAAV, описанная здесь, была спроектирована таким образом, что участки XmaI встречаются только в РМЭ. Если вставка-кандидат усилителя также содержит какие-либо сайты XmaI, обновите прогнозируемые результаты диапазона и проведите соответствующий анализ.

2. Получите упакованный rAAV.

  1. Используйте упакованный rAAV (профессионально или внутри компании) для экспериментов в этом исследовании.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Существует множество вариантов упаковки rAAV. rAAV может быть профессионально упакован в компании или на базовом объекте университета. rAAV также может быть упакован собственными силами с использованием различных методов, которые варьируются по сложности и потребности в специализированном оборудовании43,44. Основной задачей является получение вектора высокого качества и того, что инфекционный титр был определен с высокой степенью достоверности. Как профессионально упакованные, так и собственные упакованные rAAV использовались для различных экспериментов, описанных в этом исследовании.

3. Интракраниально вводят плазмиду в rAAV-упаковке неонатальным мышам.

  1. Подготовьте смесь rAAV к поставке.
    1. Если цель состоит в том, чтобы сравнить паттерны экспрессии между различными вирусами-репортерами энхансеров, выровнять титры всех вирусов, подлежащих сравнению, путем разбавления всех, чтобы они соответствовали наименее концентрированному вирусу.
    2. Смешайте соотношение 2:1 или 3:1 энхансерного репортерного вируса и конститутивно экспрессированного контрольного репортерского вируса и добавьте небольшое количество (0,06% конечной концентрации) красителя Fast Green.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Fast Green - это краситель, который широко используется в инъекциях экспериментальных животных, в том числе с AAV, для визуализации места инъекции во время и сразу после процедуры 45,46,47,48. Хотя это важный шаг обеспечения качества, возможно, что добавление красителя может помешать трансдукции. Пересмотр использования инъекционного красителя может быть важен для оптимизации протокола в определенных случаях. Конститутивно управляемый контрольный вирус абсолютно важен для сравнения независимых инъекций. Инъекции вируса будут различаться по местоположению и степени трансдукции от животного к животному. Конститутивный контроль позволит исключить неудачные инъекции из анализа и обеспечит стандарт для нормализации вариаций в доставке вируса.
    3. Разбейте кончик стерильной вытянутой стеклянной пипетки, изготовленной из капиллярной трубки с градуированной мкл, аккуратно проткнув ее через нежную салфетку, стерилизовав ее в 70% этаноле и дав полностью высохнуть. Затем вставьте вытянутую стеклянную пипетку в аспираторный узел, состоящий из устройства для подачи давления, соединенного с резиновой трубкой длиной 15 дюймов, заканчивающейся резиновой прокладкой для удержания микрокапиллярной пипетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: "Устройство для оказания давления" может представлять собой шприц или мундштук. Если будет использоваться шприц, второй человек должен будет оказывать давление через шприц, в то время как экспериментатор манипулирует пипеткой в одной руке и животным в другой. При использовании мундштука, позволяющего экспериментатору точно контролировать как положение животного и пипетки, так и давление, оказываемое на шприц, требуется дополнительная осторожность, чтобы избежать заражения вирусом.
    4. Примените отрицательное давление через аспиратор в сборе, чтобы втянуть небольшой объем (~0,2-0,5 мкл) минерального масла в стеклянную пипетку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап очень важен для обеспечения барьера для предотвращения загрязнения аэрозольных вирусных частиц аспиратором.
    5. Отложите подготовленный аспиратор в сторону и держите вирус на льду до готовности к инъекции.
  2. Криоанестезируйте неонатальных мышей в сухой пластиковой посуде, частично погруженной в лед до прекращения рефлекса снятия педали (~5 мин). Убедитесь, что мыши не находятся в прямом контакте со льдом.
  3. Используйте отрицательное давление через аспиратор в сборе, чтобы втянуть вирусную смесь в вытянутую стеклянную пипетку, пока мениск не пройдет отметку 2 мкл.
  4. Извлеките мышь из холодной камеры и поместите ее на столешницу. Найдите места двусторонней инъекции на полпути между лямбдой и брегмой и на полпути между сагиттальным швом и каждым глазом. Продезинфицируйте обе области спиртовой салфеткой.
  5. Используйте вытянутую стеклянную пипетку, чтобы проткнуть череп неонатальных мышей и осторожно применить положительное давление через аспиратор, когда игла входит в мозг. Следите за смесью мениска вируса. Сопротивление приложенному давлению уменьшится, когда кончик пипетки достигнет бокового желудочка. Дозируйте 1 мкл вируса, извлеките пипетку и повторите для другого бокового желудочка.
  6. Поместите мышь на грелку или согревающую камеру для восстановления. Проснувшись и активизировавшись, верните животное в его домашнюю клетку.

4. Соберите ткани и выполните иммуногистохимию.

  1. По прошествии достаточного времени после трансдукции вируса обезболивают мышей и приносят в жертву транскардиальную перфузию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Многие эксперименты, включая репрезентативные результаты, показанные здесь, допускают период в 4 недели или более для передачи вируса. Тем не менее, самокомплементарные AAV могут проявлять сильную экспрессию уже через 7 дней12. Желаемый инкубационный период, возможно, потребуется оптимизировать в зависимости от конкретных экспериментальных методов и целей.
    1. Подготовьте перистальтический насос с внутривенной инфузионной трубкой и иглой 25 г.
    2. Приготовьте 1x PBS и 4% параформальдегида (PFA) и поместите их на лед.
    3. Поместите впускной конец трубки в ледяной 1x PBS. Установите скорость потока (2,5 мл/мин для мышей P7, 3,5 мл/мин для мышей P28) и запустите насос до тех пор, пока буфер не пройдет через трубку и не будет очищен от пузырьков. Отложите иглу в сторону до готовности к перфузии.
    4. Внутри вытяжного шкафа пипетка небольшого объема изофлурана на бумажное полотенце в нижней части камеры для капель. Поместите ранее введенную мышь на решетку над бумажным полотенцем, следя за тем, чтобы она не вступала в прямой контакт с изофлураном. Запечатайте камеру, чтобы обезболить мышь. Подождите ~ 5 минут, а затем откройте камеру и проверьте рефлекс снятия педали. Продолжайте, как только животное потеряет сознание.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На протяжении всей перфузии мышь должна поддерживаться на изофлуране с помощью носового конуса, чтобы предотвратить восстановление сознания.
    5. Используйте хирургические ножницы, чтобы открыть живот и грудную клетку мыши, удалить грудную клетку и обнажить сердце.
    6. Используйте пару микроножек радужной оболочки глаза, чтобы сделать небольшой разрез в правом предсердии мыши, вставить иглу IV в левый желудочек и активировать перистальтический насос.
    7. Перфузируйте животное ледяным 1x PBS до тех пор, пока кровь, вымывающаяся из разреза в правом предсердии, не очистится. Очистка ткани от крови очень важна, потому что красные кровяные клетки имеют автофлуоресценцию, а кровеносные сосуды могут ухудшить способность изображения репортер-экспрессирующих клеток.
    8. Приостановите перистальтический насос и переместите впускную трубку с PBS на 4% PFA. Реактивируйте насос и продуйте 1 мл /г массы тела, ~ 25 мл для взрослой мыши.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фиксация тремора должна быть наблюдаемой, а тело мыши должно застыть.
  2. Рассекайте и пост-фиксируйте мозг.
    1. Удалите голову мыши хирургическими ножницами.
    2. Используя небольшие хирургические ножницы, начните с основания черепа и сделайте разрез вдоль средней линии головы и оттяните кожу и подлежащую ткань, чтобы обнажить череп.
    3. Используя ножницы радужной оболочки, аккуратно обрежьте заднюю часть черепа, начиная с большого отверстия и продолжая вверх по направлению и вдоль сагиттального шва до тех пор, пока не пройдут обонятельные луковицы.
    4. Вставьте ножницы в череп поверх обонятельных луковиц и сделайте два горизонтальных разреза в черепе. Сделайте аналогичную пару горизонтальных разрезов в затылочной кости. Горизонтальные и средние разрезы создают пару дверных створок в верхней части черепа.
    5. Отклейте лоскуты черепа, чтобы полностью обнажить мозг. Используйте пару пинцетов, чтобы оторвать обонятельные луковицы от черепа и перерезать черепные нервы, освобождая мозг от черепа.
    6. Поместите мозг в коническую трубку объемом 15 мл с 3-5 мл 4% PFA в PBS. После исправления 6 ч до ночи. Не переусердствуйте ткани.
  3. Подготовьте мозг к криосекции.
    1. Переместите неподвижный мозг в новую коническую трубку объемом 15 мл с 12-14 мл 30% сахарозы в PBS для обезвоживания. Инкубировать при 4 °C до тех пор, пока мозг не опустится на дно трубки (2-3 дня).
    2. Погрузите неподвижный и обезвоженный мозг в соединение оптимальной температуры резания (OCT) в криомольд 15 мм x 15 мм x 5 мм. Добавьте OCT до тех пор, пока мозг не будет полностью покрыт.
    3. Поместите криомольд на глыбу сухого льда и заморозьте образец в твердом блоке OCT (~ 5 мин).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Блоки OCT могут храниться при -80 °C в течение нескольких месяцев или лет.
    4. Пометьте криомольд названием образца и ориентацией мозга.
  4. Получение корональных срезов с помощью микротома криостата.
    1. Отметьте ориентацию мозга на блоке OCT карандашом и удалите блок из криомольда внутри криостата.
    2. Расположите блок ОКТ так, чтобы мозг ориентировался обонятельными луковицами лицом к лезвию криостата, и приклейте блок к объекту-держателю криостата с некоторым свежим ОКТ.
    3. После замораживания на месте начните разрезать 50 мкм секций через блок, следуя шагам 4.4.4-4.4.6.
    4. Не используйте стабилизатор поперечной устойчивости. Секции будут сворачиваться в плотные рулоны по мере их разрезания и будут собираться либо поверх блока, либо падать вниз в лоток для сбора.
    5. Следите за формой блока в первых нескольких разрезах, которые сделаны. Сделайте вертикальные надрезы через блок, получив ровное лицо при начале разреза. При необходимости отрегулируйте угол с помощью регулировочных рычагов образца.
    6. Когда обонятельные луковицы будут видны, обратите пристальное внимание на форму секций. Если один кажется больше другого, порезы находятся под углом относительно мозга, и необходимо выпрямить ориентацию мозга против лезвия с помощью рычагов регулировки образца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если разрезать прямо, кора должна начать появляться над каждой обонятельной луковицей одновременно.
    7. После того, как обонятельная луковица была разрезана и ростральная ткань мозга видна, уменьшите толщину разреза до 30-35 мкм и начните собирать плавающие участки. Выполните шаги 4.4.8-4.4.13 для разделения мозга.
    8. Смахните все предыдущие секции с блока и держателя предмета так, чтобы они упали в лоток для сбора. Смахните их с одной стороны лотка и держите отдельно. Если куча слишком большая, то опустошите лоток.
    9. Распределите по 1 мл PBS в каждую лунку из 24 лунок. Метка 1 строки для каждого мозга.
    10. Вырежьте 6 корональных сечений. Извлеките участки с помощью холодного пинцета и расположите их на стадии криостата. Повторите этот шаг 2 или 3 раза, разделяя группы по 6 разделов.
    11. Смочите кисть размером 000 с PBS и смажьте лишнюю жидкость на безворсовое салфетка или бумажное полотенце. Используйте кисть, чтобы аккуратно подобрать каждый участок, по одному за раз, и поместить его в соответствующие колодцы плиты из 24 скважин.
    12. Поместите одну из 6 секций из группы срезов в каждую из 6 скважин в ряд из 24 плит скважин. Это гарантирует, что каждая скважина содержит репрезентативные участки, которые охватывают секционную область мозга.
    13. Продолжайте секционирование в группах по 6 человек до тех пор, пока не будет разделен каудальный конец коры головного мозга.
    14. Для хранения запечатайте 24-луночную пластину парапленкой и храните при температуре 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Секции стабильны в течение 1-2 месяцев при 4 °C. Раствор PBS с 0,1% азидом натрия может быть использован для ингибирования роста бактерий и продления срока годности срезов. Однако, если срезы должны храниться дольше 2 месяцев, их следует поместить в раствор криопротектора и заморозить при -20 °C для достижения наилучших результатов.
  5. Выполнение иммуногистохимии для амплификации сигнала репортерного гена.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы, кроме извлечения антигена, должны выполняться с использованием мягкого и умеренного перемешивания (~100 об/мин) на орбитальном шейкере. Для сохранения нативной флуоресценции контрольного репортера (mRuby3) все ступени должны быть максимально защищены от света.
    1. Подготовьте необходимые буферы, как описано в таблице 3.
    2. Подготовьте новую пластину из 24 лунок с одним рядом для каждого окрашиваемого мозга. В первой колонке скважин добавьте 1 мл PBS к каждой скважине.
    3. Используя кисть размера 000, аккуратно перенесите 1 лунку секций из оригинальной коллекционной скважины в свежую PBS в новой пластине из 24 лунок для быстрого промывки для удаления остаточного соединения OCT.
    4. Добавьте 1 мл АРБ в следующую скважину в 24 плите скважины и перенесите секции в эту скважину. Инкубировать в духовке при 60 °C в течение 1 ч.
    5. Дайте тарелке остыть при комнатной температуре (RT) в течение 20 минут.
    6. Добавьте 1 мл ПБ в следующую скважину и перенесите секции в эту скважину. Инкубировать в RT в течение 20 мин.
    7. Добавьте 500 мкл BB в следующую скважину и перенесите секции в эту скважину. Инкубировать на РТ в течение 1 ч.
    8. Добавьте 2 мл WB к BB, а затем выпейте ~2 мл раствора и выбросьте, оставив разбавленный раствор BB в лунке. Повторяйте до тех пор, пока разделы не станут хорошо видны.
    9. Разводят первичное антитело (Chicken IgY anti-GFP, 1:1000) в BB. Добавить 350-500 мкл раствора первичного антитела в следующую лунку и перенести срезы в эту лунку. Запечатайте пластину парапленкой и инкубируйте при 4 °C в течение ночи.
    10. Разбавьте BB WB, как это было сделано ранее, пока секции не будут хорошо видны.
    11. Добавьте 1 мл WB в следующую скважину и перенесите секции в эту скважину. Инкубировать в RT в течение 20 мин.
    12. Извлеките ~800-900 мкл буфера и выбросьте. Добавить 1 мл свежего ВБ и инкубировать 20 мин. Замените 1 мл WB еще 4 раза на 5 стирок по 20 мин каждая.
    13. Разбавляют вторичное антитело (Ослик против курицы Alexa Fluor 488 конъюгированный, 1:500) в ВВ. Добавьте 350-500 мкл раствора вторичного антитела в новую лунку. Инкубировать на РТ в течение 45 мин до 1 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это седьмая скважина, поэтому, если окрашивать участки из более чем 2 мозгов, в этот момент понадобится новая пластина.
    14. Разбавить ВВ ВБ, как и ранее, и перенести секции в новую скважину, заполненную 1 мл ВБ. Вымойте секции, как это было сделано ранее в течение 20 мин 3 раза.
    15. Готовят рабочий раствор ДАПИ в ПБС (конечная концентрация 0,04-0,8 мкг/мл). Защитите раствор от света.
    16. Добавьте 1 мл раствора DAPI в следующую скважину и перенесите секции в эту скважину. Инкубировать на RT в течение ~5 мин.
    17. Перенесите срезы обратно в WB и аккуратно установите на предметные стекла микроскопа с помощью кисти размера 000. Дайте слайдам высохнуть на воздухе.
    18. Нанесите крышки с соответствующим монтажным носителем. Дайте слайдам затвердеть при RT в темноте ночью.

5. Изобразите и проанализируйте участки мозговой ткани для усиления активности.

  1. Используйте объектив с низким увеличением (5x) для записи флуоресцентных изображений, которые охватывают участок мозга.
  2. Найдите место инъекции и оцените степень трансдукции вируса на основе плотности и интенсивности красных флуоресцентных клеток. Позаботьтесь о сравнении животных, которые были трансдуцированы аналогичным образом.
  3. При желании записывайте подробные флуоресцентные изображения с объективом с более высоким увеличением (≥25x).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда используйте одни и те же настройки для параметров сбора, таких как интенсивность света возбуждения, фильтры и время экспозиции между образцами, которые необходимо сравнить.
  4. Обрабатывайте изображения с помощью программного обеспечения для анализа изображений.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обработка может быть выполнена в любом программном пакете для анализа изображений. Следующие шаги являются предложениями для определения того, действует ли последовательность в качестве усилителя в контексте конструкции репортера (вопрос «да» или «нет») с использованием дистрибутива ImageJ с открытым исходным кодом FIJI. Более глубокая фотометрия может быть уместна при сравнении степеней активности между вариантами энхансеров. Изображения из разных образцов всегда должны обрабатываться последовательно, чтобы их можно было сравнивать.
    1. Применяйте фильтры для снижения уровня шума. На Фиджи выберите опцию Despeckle в меню Обработка > Шум .
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это медианный фильтр 3 x 3.
    2. Вычтите фоновую флуоресценцию на этапах 5.4.3-5.4.6.
    3. Разделите каналы многоканального изображения. На Фиджи выберите параметр «Разделить каналы» в меню «Изображение > цвет ».
    4. Инструмент выделения «Прямоугольник» или «Круг» используется для рисования небольшой фигуры в области изображения, не имеющей флуоресцентных ячеек, и измерения средней интенсивности пикселей фона с помощью функции «Анализ > измерение». Повторите для выборки нескольких областей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что в меню Анализ > Установить измерения выбрано Среднее значение серого.
    5. Усредните среднее значение серого от 5 до 8 областей фона и отбросьте десятичную запятую. Вычтите это значение из каждого пикселя изображения с помощью функции Process > Math > Subtract.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Округление до ближайшего целого числа может привести к переоценке фона для вычитания. Более консервативно просто опустить десятичную запятую. Например, 6,4 будет округлено до 6, но 6,5 также должно быть округлено до 6, чтобы избежать риска вычитания 0,5 единиц реального сигнала из каждого пикселя.
    6. При желании объедините каналы обратно в многоканальное изображение. На Фиджи используйте каналы слияния > цветов > изображений.
    7. Сшивайте все перекрывающиеся изображения вместе. На Фиджи используйте плагины > сшивания > сетки / коллекции.
    8. Отрегулируйте яркость и контрастность. На Фиджи используйте image > Adjust > Яркость/Контрастность.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда используйте одинаковые минимальные и максимальные значения для каждого сравниваемого изображения.
    9. Подсчитайте количество зеленых флуоресцентных ячеек, следуя шагам 5.4.10-5.4.12. Это клетки, в которых последовательность усилителей-кандидата смогла управлять экспрессией репортера.
    10. Начните с скрытия зеленого канала и используйте инструмент выделения свободной формы, чтобы нарисовать фигуру вокруг области мозга, которая выражает красную флуоресценцию. Используя функцию Measure на Фиджи, измерьте площадь, интегральную плотность и среднее значение серого красного канала в этой зоне.
    11. С помощью инструмента многоточечного выделения подсчитайте количество зеленых ячеек в этой зоне.
    12. Нормализуйте количество зеленых ячеек по интегральной плотности красного канала. Локальная яркость красного канала является косвенным показателем величины воздействия вируса, что позволяет сравнивать активность энхансеров между различными трансдуцированными животными.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Используя эти методы, последовательность 915 bp в связанном с психиатрическим риском третьем интроне гена CACNA1C 19,49,50 была протестирована на энхансерную активность в постнатальном мозге мыши. Эта последовательность была обнаружена в MPRA из 345 последовательностей энхансеров-кандидатов, сосредоточенных на психиатрических и неврологических рисках SNP12, и эксперименты по характеристике описаны здесь в качестве общего примера. Мышам C57BL/6 вводили P0 с помощью конструкции AAV9, упакованной в виде самокомплементарного вектора51, содержащего EGFP, под контролем минимального промотора Hsp68 и последовательности одного усилителя-кандидата (рисунок 3A). Дополнительным мышам вводили конструкции, которые содержали отрицательную контрольную последовательность, которая, как прогнозировалось, не имела регуляторной активности (рисунок 3B). Вирусные титры для этих конструкций были нормализованы до 6,85 х 1010 вг/мл. Всем введенным мышам совместно вводили конструкцию с упаковкой AAV9, содержащую mRuby3, под контролем конститутивного промотора CAG для визуализации области, которая была успешно трансдуцирована, и контроля потенциальной изменчивости в месте и распространения инфекции. Мозг был собран в послеродовой день (P)28 для иммуногистохимии и визуализации. Эти эксперименты подтвердили, что эта область-кандидат энхансера в CACNA1C управляла экспрессией EGFP в мозге мыши P28 (рисунок 3A), в то время как отрицательная контрольная последовательность этого не делала (рисунок 3B). Эти результаты демонстрируют применение энхансер-репортерных анализов в мозге мыши, что позволяет в живомвиде изучать энхансеры в условиях, которые не могут быть повторены с использованием традиционных моделей in vitro.

Эти методы также могут быть использованы для тестирования библиотек последовательностей-усилителей-кандидатов для деятельности с использованием методов доставки на основе AAV, таких как в MPRAs. Репрезентативные изображения репортерской экспрессии на основе библиотек при различных титрах демонстрируют гибкость этого анализа и влияние вирусного титра на эффективность трансдукции. Высокотитерные (Рисунок 4А) и низкотитерные (Рисунок 4В) вирусные препараты приводят к различиям в количестве трансдуцированных клеток, о чем свидетельствует как положительная контрольная экспрессия mRuby3, обусловленная промотором CAG, так и экспрессия EGFP, полученная из библиотек усилителей-кандидатов в постнатальном мозге мыши. Существуют ситуации, когда может быть предпочтительным либо высокий титр и широкая трансдукция, либо низкий титр и разреженная трансдукция.

Figure 1
Рисунок 1: Обзор протокола. Ключевые элементы этого анализа включают элемент-кандидат энхансера, минимальный промоутер, ген репортера и, в зависимости от дизайна анализа, последовательность штрих-кода для уникальной маркировки. Эти элементы клонируются в плазмидную основу AAV и упаковываются в AAV. Вирус доставляется животному и оставляется для инкубации в течение нескольких дней или недель. Наконец, ткань, представляющая интерес, собирается, и активность энхансера определяется с помощью визуализации или секвенирования. Экспрессия трансгенов, управляемая энхансером, может производить экспрессию с клеточной, региональной и временной специфичностью, в отличие от конститутивных драйверов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Гибкость в дизайне анализа. (A) Ориентация плазмиды может поместить энхансер вверх по течению от минимального промотора или вниз по течению от репортерного гена, как в STARR-seq28. Для считывания на основе последовательностей штрих-код включается ниже по течению от репортерного гена, или энхансер может служить своим собственным штрих-кодом во второй ориентации. (B) Общие методы доставки вируса в мозг включают внутричерепные инъекции, ретроорбитальные инъекции или инъекции в хвостовую вену, которые могут привести к различной плотности трансдуцированных клеток в разных тканях. (C) Считывания могут быть основаны на секвенировании или визуализации. В показаниях на основе секвенирования активность энхансеров определяется относительным увеличением последовательности РНК по сравнению с входной последовательностью ДНК (контролируя доставку AAV). При считывании изображений экспрессия репортерного гена увеличивается там, где активен энхансер. (D) Выделены потенциальные интронные энхансеры в гене CACNA1C , связанном с психическим риском. На верхнем изображении выбран широкий регион, который показывает сильные связи с проверенными GWAS признаками и взаимодействиями с промоутером CACNA1C через PLAC-seq20. Во вставке идентифицированы более мелкие области-кандидаты, которые эволюционно сохраняются на уровне последовательности, находятся в областях открытого хроматина и показывают эпигенетические метки, указывающие на энхансеры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Энхансер в CACNA1C управляет экспрессией EGFP в мозге мыши P28. (A) Мышь, вводимая интракраниально в P0 с помощью конструкции энхансер-репортер (scAAV9-Hsp68-EGFP-CACNA1C_3) и конститутивно экспрессированного контроля инъекции (AAV9-CAG-mRuby3), показывает экспрессию EGFP, управляемую энхансером, в средних нижних слоях коры при P28. (B) Мышь, введенная при P0 с отрицательной конструкцией управления (scAAV9-Hsp68-EGFP-NEG_4) и контролем впрыска, не показывает экспрессии EGFP при P28. Изображения всего мозга были сделаны с 5-кратным увеличением, а вставки показывают увеличенный вид коробочной области. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Библиотеки усилителей-репортеров различных титров, поставляемые AAV, показывают активность в мозге мыши. (A) Коммерчески упакованная библиотека усилителей-кандидатов AAV-PHP.eB с высоким титром стимулирует широкую экспрессию EGFP в мозге мыши P7. (B) Библиотека AAV9 с более низким титром усилителей-кандидатов, осажденных из кондиционированных сред упаковочных клеток, стимулирует редкую экспрессию EGFP в мозге мыши P7. Снимки были сделаны с 5-кратным увеличением. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Реакционная смесь ПЦР
5-кратный реакционный буфер 10 мкл
дНТП конечная концентрация 200 мкМ каждая
Грунтовки для клонирования конечная концентрация 0,2 мкМ каждая
ДНК шаблона 50 нг
Высококачественная полимераза конечная концентрация 0,02 ЕД/мкл
Вода без нуклеаз для достижения конечного реакционного объема 50 мкл
Условия термоциклирования
30 циклов: Примечания
Шаг Температура Время
Денатурировать 98 °С 10 с
Отжигать 60 °С 20 с Оптимальная температура может варьироваться в зависимости от грунтовки.
Вытягивать 72 °С 30 с Оптимальная температура и продолжительность могут варьироваться в зависимости от полимеразы.
Окончательное расширение 72 °С 2 мин Оптимальная температура и продолжительность могут варьироваться в зависимости от полимеразы.
Держать 4 °С

Таблица 1: Реакционная смесь ПЦР и условия термоциклирования.

Условия термоциклирования
30 циклов: Примечания
Шаг Температура Время
Лизис клеток 98 °С 5 мин
Денатурировать 98 °С 10 с
Отжигать 55 °С 15 с Оптимальная температура может варьироваться в зависимости от грунтовки.
Вытягивать 72 °С 30 с Оптимальная температура и продолжительность могут варьироваться в зависимости от полимеразы.
Держать 4 °С

Таблица 2: Условия термоциклирования для колониальной ПЦР.

Буферы для иммуногистохимии
Буфер Состав
1x PBS 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na2HPO4, 1,8 мМ KH2PO4
1x буфер извлечения цитратного антигена (ARB), pH 6,0 Проприетарные, см. таблицу материалов
Буфер пермеабилизации (ПБ) 1x PBS + 0,5% Тритон X100
Буфер мойки (WB) 1x PBS + 0.1% Тритон X100
Блокирующий буфер (BB) WB + 5% молока

Таблица 3: Буферы для иммуногистохимии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Этот протокол описывает основанный на rAAV метод развертывания трансгенов, управляемых энхансерами, в постнатальном мозге мыши. В этом обобщенном протоколе энхансер-кандидат, минимальный промотор, репортерный ген и необязательная последовательность штрих-кода клонируются в плазмидную основу AAV. Эти эксперименты могут быть проведены с одной последовательностью-кандидатом энхансера или со многими последовательностями параллельно. Плазмида упаковывается в rAAV и доставляется в постнатальный мозг мыши. Через некоторое время, чтобы обеспечить трансдукцию вируса, мозг собирается и визуализируется для экспрессии генов репортера. Конститутивно экспрессированный репортерный вирус (CAG-mRuby3) включается в качестве инъекционного контроля. Используя этот анализ, показано, что энхансерные элементы управляют транскрипцией EGFP в мозге мыши, демонстрируя активность энхансера in vivo.

Основными целями для устранения неполадок и оптимизации этого анализа являются вирусный титр, метод инъекции и временные рамки трансдукции. Различные вирусные титры могут оказывать сильное влияние на плотность трансдуцированных клеток. В то время как более высокая эффективность трансдукции, вероятно, предпочтительнее для большинства исследований, оптимальный уровень трансдукции сильно зависит от экспериментальных целей. Внутричерепные инъекции предлагают высокую плотность трансдуцированных клеток, но, вероятно, будут более очаговыми в месте инъекции, хотя распространение инфекции может зависеть от вирусного серотипа и возраста животного52 года. Ретроорбитальные инъекции могут показать более равномерное распределение трансдуцированных клеток по всему мозгу, но с меньшей вероятностью дадут какую-либо область высокой инфекции. Инъекции в хвостовую вену могут более эффективно трансдуцировать другие ткани в дополнение к мозгу, но, вероятно, дадут еще более низкую плотность трансдуцированных клеток в мозге. Точно так же различные временные рамки для трансдукции вируса в мозге могут служить различным целям. Надежная экспрессия scAAV может возникать в мозге уже через семь дней после внутричерепной инъекции, хотя периоды 28 дней или дольше чаще используются и дают сильную экспрессию. Поскольку энхансеры могут быть специфичными во времени в своей активности, важно учитывать прогнозируемую активность тестируемых энхансеров при определении дизайна исследования.

Существуют некоторые ограничения, связанные с этими методами, которые могут сделать другие варианты более подходящим выбором, в зависимости от экспериментальных целей. Поскольку AAV демонстрируют низкую интеграцию в геном, ткани наиболее эффективно трансдуцируются, когда они зрелые и существует высокая плотность постмитотических клеток, поскольку большое количество продолжающихся клеточных делений снизит плотность трансген-экспрессирующих клеток. Для вирусной доставки трансгена в менее зрелую модель, такую как ткани, которые все еще растут, лентивирусы могут быть более подходящим выбором, поскольку они интегрируются в геном и будут унаследованы всеми дочерними клетками трансдуцированной пролиферирующей клетки. Кроме того, хотя описанный здесь репортерский анализ является широко используемым методом функционального исследования цис-регуляторной деятельности, он не может дать полной картины того, как регуляторный элемент действует в своем родном контексте. Например, этот анализ не дает информации о том, какие гены могут быть нацелены регуляторным элементом в геноме. Однако, если гены-мишени энхансера известны, эта информация может быть использована для определения того, являются ли типы клеток, показывающие экспрессию в этом анализе, такими же, как те, которые, как известно, экспрессируют целевые гены энхансера, что придаст высокую биологическую обоснованность интерпретации результатов. Анализ также может не полностью повторять эффекты, которые окружающая геномная последовательность или нормальная биологическая и поведенческая активность животного могут оказывать на активность тестируемого регуляторного элемента. Наконец, этот протокол описывает конструкцию репортерного анализа STARR-seq, в которой элемент энхансера-кандидата клонируется ниже по течению от гена репортера в ORF, в отличие от верхнего течения промотора, как в обычной ориентации клонирования репортерного анализа. Включение длинных переменных последовательностей в ORF репортерного гена может привести к снижению стабильности РНК из-за таких факторов, как мотивы белка, связывающие РНК, альтернативные участки сращивания или переменное содержание GC 36,53, и статистические методы были разработаны для учета смещений на основе последовательностей при анализе данных STARR-seq 54,55. Несмотря на эти соображения, в последние годы МНО STARR-seq широко используются для успешной идентификации цис-регуляторных элементов 56,57,58,59. Методы, описанные здесь, могут быть легко адаптированы для использования с обычной ориентацией MPRA.

Специфичность энхансеров клеточного типа делает этот анализ мощным инструментом в управлении специфической для клеточного типа экспрессией генов, представляющих интерес in vivo. Современные методы клеточной экспрессии желаемого гена могут быть ограничены наличием условных конструкций экспрессии или требуют генерации новых трансгенных линий мыши. Используя систему, управляемую энхансером на основе rAAV, интересующий ген может быть экспрессирован пространственно-височным способом с использованием валидированных клеточных энхансеров или промоторов для стимулирования экспрессии 13,14,15. Последние разработки в этой технологии показали, что объединение специфических для клеточного типа энхансеров с серотипами rAAV с тропизмами для клеток или тканей, представляющих интерес, может показать такую же специфичность экспрессии трансгенов, как и в трансгенных моделяхживотных 60. Это предлагает дешевый, быстрый и потенциально высокопроизводительный метод скрининга последовательностей и специфической индукции экспрессии трансгенов in vivo на животных моделях.

Эта технология также обладает терапевтическим потенциалом. Клинические исследования показали, что доставка трансгена in vivo на основе rAAV может индуцировать экспрессию здоровых копий гена в тех случаях, когда присутствует только дефектная копия или ген не транскрибируется с достаточной скоростью 61,62,63. Выбор движущего энхансерного элемента может обеспечить обобщенную доставку, но индукцию экспрессии в зависимости от типа клетки. Наконец, доставка трансгена через rAAV также дает значительные преимущества; AAV имеют более низкую иммуногенность, чем другие вирусы, часто используемые при доставке трансгенов64, что делает его потенциально безопасным вирусным вектором для клинического использования.

Специфическое развертывание анализаторов энхансер-репортер на основе rAAV настраивается и может быть модифицировано в соответствии с целым рядом экспериментальных целей. Различные ткани и клетки могут быть нацелены путем выбора серотипов или энхансеров AAV, которые имеют тип клеток или пространственно-временную специфичность. От одной до тысяч конструкций энхансер-репортер может быть доставлено in vivo, и активность может быть проанализирована с использованием ряда показаний на основе визуализации и секвенирования, как было показано в новом наборе исследований с использованием этого подхода 15,16,65,66,67,68 . Диапазон вариантов проектирования и доставки конструкций позволяет модифицировать этот метод для различных применений как в трансляционной, так и в фундаментальной науке, что делает его мощным новым инструментом для исследований геномики и нейробиологии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Секвенирование проводилось в UC Davis DNA Technologies Core. Мы благодарим лабораторию Лин Тяня в Калифорнийском университете в Дэвисе за обучение упаковке rAAV и щедро дарим нам помощника AAV и плазмиды rep /cap. Эта работа была поддержана NIH/NIGMS R35GM119831.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x Citrate Buffer Sigma-Aldrich C9999-1000ML
5'-gatcactctcggcatggac-3' Integrated DNA Technologies N/A: Custom designed Forward primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments.
5'-gatggctggcaactagaagg-3' Integrated DNA Technologies N/A: Custom designed Reverse primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments.
Agarose VWR VWRVN605-500G
Aspirator tube assemblies Sigma-Aldrich A5177-5EA for mouth-driven delivery of rAAV
Bacteriological petri dishes Thermo Fisher Scientific 08-757-100D
Carbenicillin Sigma-Aldrich C1389-5G
Chicken IgY anti-GFP Thermo Fisher Scientific A10262
Confocal microscope Zeiss LSM900 The images were taken on the LSM800 model, but Zeiss launched the LSM900 model in recent years to replace LSM800.
Conical centrifuge tubes 15 mL Thermo Fisher Scientific 12-565-269
Cryomolds Thermo Fisher Scientific NC9806558 These molds are suitable for P28 mouse brain. Other sizes may be more suitable for larger or smaller tissues.
DAPI Sigma-Aldrich D9542-10MG
Dissecting scissors, 4.5" VWR 82027-578
Donkey anti-chicken AlexaFlour-488 Jackson ImmunoResearch 703-545-155
Dulbecco's PBS 1x Thermo Fisher Scientific MT21031CV
Eppendorf Microcentrifuge tubes 2.0 mL Thermo Fisher Scientific 22431048
Falcon round-bottom tubes 14 mL Thermo Fisher Scientific 352059
Fast Green dye Grainger F0099-1G
Fine detail paint brush set Artbrush Tower B014GWCLFO
Gibson Assembly Master Mix NEB E2611S
Glass capillary tubes Drummond Scientific Company 5-000-2005
HiSpeed Plasmid Maxi Kit QIAGEN 12663 Commercial plasmid maxi prep kit
HyClone HyPure Molecular Biology Grade Water VWR SH30538.03
IV butterfly infusion set with 12" tubing and 25G needle Thermo Fisher Scientific 26708
Kimwipes Kimberly Clark 34155 Lint-free wipe
LB Agar Thermo Fisher Scientific BP1425-500 LB agar pre-mix for selective media
McPherson Vannas iris scissor Integra LifeSciences 360-215
Mineral oil Sigma Life Science 69794-500ML
NEB Stable Competent E. coli NEB C3040I
NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Takara 740609.5 Kit for enzymatic reaction cleanup and gel extraction
OCT medium VWR 25608-930
Orbital shaker Cole Parmer 60-100
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127-500G
PCR strip tubes 0.2 mL VWR 490003-692
Peristaltic pump Gilson F155005
Phosphate buffered saline (PBS) 10x Thermo Fisher Scientific 70011044
Phusion Hot Start II High Fidelity DNA Polymerase Thermo Fisher Scientific F549L
Powdered milk Sunny Select
ProLong Gold Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific P36934
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28106
rCutSmart Buffer NEB B6004S Buffer for restriction digest with PacI, AscI, and XmaI
Restriction enzyme: AscI NEB R0558L
Restriction enzyme: PacI NEB R0547L
Restriction enzyme: XmaI NEB R0180L
SOC outgrowth medium NEB B0920S Recovery medium after transformation
Sucrose (RNase/DNase free) Millipore Sigma 033522.5KG
TAE buffer Apex 20-194
Transfer tubing Gilson F1179941 For peristaltic pump
Triton X100 Sigma-Aldrich X100-100ML
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System Thermo Fisher Scientific A1460 Plasmid mini prep kit

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pennacchio, L. A., et al. In vivo enhancer analysis of human conserved non-coding sequences. Nature. 444 (7118), 499-502 (2006).
  2. Nord, A. S., et al. Rapid and pervasive changes in genome-wide enhancer usage during mammalian development. Cell. 155 (7), 1521-1531 (2013).
  3. Finucane, H. K., et al. Partitioning heritability by functional annotation using genome-wide association summary statistics. Nature Genetics. 47 (11), 1228-1235 (2015).
  4. Nord, A. S., West, A. E. Neurobiological functions of transcriptional enhancers. Nature Neuroscience. 23 (1), 5-14 (2020).
  5. Hallikas, O., et al. Genome-wide prediction of mammalian enhancers based on analysis of transcription-factor binding affinity. Cell. 124 (1), 47-59 (2006).
  6. Su, J., Teichmann, S. A., Down, T. A. Assessing computational methods of cis-regulatory module prediction. PLoS Computational Biology. 6 (12), 1001020 (2010).
  7. Visel, A., et al. ChIP-seq accurately predicts tissue-specific activity of enhancers. Nature. 457 (7231), 854-858 (2009).
  8. Kvon, E. Z., et al. Genome-scale functional characterization of Drosophila developmental enhancers in vivo. Nature. 512 (7512), 91-95 (2014).
  9. Yáñez-Cuna, J. O., et al. Dissection of thousands of cell type-specific enhancers identifies dinucleotide repeat motifs as general enhancer features. Genome Research. 24 (7), 1147-1156 (2014).
  10. Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection. Molecular Therapy. 16 (6), 1073-1080 (2008).
  11. Gisselbrecht, S. S., et al. Highly parallel assays of tissue-specific enhancers in whole Drosophila embryos. Nature Methods. 10 (8), 774-780 (2013).
  12. Lambert, J. T., et al. Parallel functional testing identifies enhancers active in early postnatal mouse brain. eLife. 10, 69479 (2021).
  13. Chen, Y. -J. J., et al. Use of "MGE Enhancers" for labeling and selection of embryonic stem cell-derived medial ganglionic eminence (MGE) progenitors and neurons. PLoS ONE. 8, 61956 (2013).
  14. Graybuck, L. T., et al. Enhancer viruses and a transgenic platform for combinatorial cell subclass-specific labeling. bioRxiv. , 525014 (2019).
  15. Dimidschstein, J., et al. A viral strategy for targeting and manipulating interneurons across vertebrate species. Nature Neuroscience. 19 (12), 1743-1749 (2016).
  16. Rubin, A. N., et al. Regulatory elements inserted into AAVs confer preferential activity in cortical interneurons. eNeuro. 7, (2020).
  17. Hindorff, L. A., et al. Potential etiologic and functional implications of genome-wide association loci for human diseases and traits. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (23), 9362-9367 (2009).
  18. Maurano, M. T., et al. Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA. Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).
  19. Ripke, S., et al. Biological insights from 108 schizophrenia-associated genetic loci. Nature. 511 (7510), 421-427 (2014).
  20. Nott, A., et al. Brain cell type-specific enhancer-promoter interactome maps and disease-risk association. Science. 366 (6469), 1134-1139 (2019).
  21. Lagunas, T., et al. A Cre-dependent massively parallel reporter assay allows for cell-type specific assessment of the functional effects of genetic variants in vivo. bioRxiv. , (2021).
  22. DeBoer, E., Antoniou, M., Mignotte, V., Wall, L., Grosveld, F. The human beta-globin promoter; nuclear protein factors and erythroid specific induction of transcription. The EMBO journal. 7 (13), 4203-4212 (1988).
  23. Kothary, R., et al. Inducible expression of an hsp68-lacZ hybrid gene in transgenic mice. Development. 105 (4), 707-714 (1989).
  24. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108 (2), 193-199 (1991).
  25. Kim, D. W., Uetsuki, T., Kaziro, Y., Yamaguchi, N., Sugano, S. Use of the human elongation factor 1α promoter as a versatile and efficient expression system. Gene. 91 (2), 217-223 (1990).
  26. Banerji, J., Rusconi, S., Schaffner, W. Expression of a β-globin gene is enhanced by remote SV40 DNA sequences. Cell. 27 (2), 299-308 (1981).
  27. Patwardhan, R. P., et al. High-resolution analysis of DNA regulatory elements by synthetic saturation mutagenesis. Nature Biotechnology. 27 (12), 1173-1175 (2009).
  28. Arnold, C. D., et al. Genome-wide quantitative enhancer activity maps identified by STARR-seq. Science. 339 (6123), 1074-1077 (2013).
  29. Melnikov, A., et al. Systematic dissection and optimization of inducible enhancers in human cells using a massively parallel reporter assay. Nature Biotechnology. 30, 271-277 (2012).
  30. Kim, J. -Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51863 (2014).
  31. Liu, D., Zhu, M., Zhang, Y., Diao, Y. Crossing the blood-brain barrier with AAV vectors. Metabolic Brain Disease. 36 (1), 45-52 (2021).
  32. Prabhakar, S., Lule, S., Da Hora, C. C., Breakefield, X. O., Cheah, P. S. AAV9 transduction mediated by systemic delivery of vector via retro-orbital injection in newborn, neonatal and juvenile mice. Experimental Animals. , (2021).
  33. Gruntman, A. M., Su, L., Flotte, T. R. Retro-orbital venous sinus delivery of rAAV9 mediates high-level transduction of brain and retina compared with temporal vein delivery in neonatal mouse pups. Human Gene Therapy. 28 (3), 228-230 (2017).
  34. Inoue, F., Ahituv, N. Decoding enhancers using massively parallel reporter assays. Genomics. 106 (3), 159-164 (2015).
  35. Gordon, M. G., et al. lentiMPRA and MPRAflow for high-throughput functional characterization of gene regulatory elements. Nature Protocols. 15 (8), 2387-2412 (2020).
  36. Klein, J. C., et al. A systematic evaluation of the design and context dependencies of massively parallel reporter assays. Nature Methods. 17 (11), 1083-1091 (2020).
  37. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  38. Song, L., Crawford, G. E. DNase-seq: A high-resolution technique for mapping active gene regulatory elements across the genome from mammalian cells. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (2), 5384 (2010).
  39. King, D. M., et al. Synthetic and genomic regulatory elements reveal aspects of Cis-regulatory grammar in mouse embryonic stem cells. eLife. 9, 41279 (2020).
  40. Amit, R., Garcia, H. G., Phillips, R., Fraser, S. E. Building enhancers from the ground up: a synthetic biology approach. Cell. 146, 105-118 (2011).
  41. Fan, M., Tsai, J., Chen, B., Fan, K., LaBaer, J. A central repository for published plasmids. Science. 307, 1877 (2005).
  42. Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. Journal of Molecular Biology. 94, 441-448 (1975).
  43. Broussard, G. J., Unger, E. K., Liang, R., McGrew, B. P., Tian, L. L. glutamate with genetically encoded fluorescent sensors. Biochemical Approaches for Glutamatergic Neurotransmission. Parrot, S., Denoroy, L. 130, Springer. New York. 117-153 (2018).
  44. Chen, Y. H., Keiser, M. S., Davidson, B. L. Adeno-associated virus production, purification, and titering. Current Protocols in Mouse Biology. 8, 56 (2018).
  45. He, C. X., Arroyo, E. D., Cantu, D. A., Goel, A., Portera-Cailliau, C. A Versatile Method for Viral Transfection of Calcium Indicators in the Neonatal Mouse Brain. Frontiers in Neural Circuits. 12, 56 (2018).
  46. Chen, S. -Y., Kuo, H. -Y., Liu, F. -C. Stereotaxic surgery for genetic manipulation in striatal cells of neonatal mouse brains. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (137), e57270 (2018).
  47. Brenowitz, S. D., Regehr, W. G. Presynaptic imaging of projection fibers by in vivo injection of dextran-conjugated calcium indicators. Cold Spring Harbor Protocols. 2012, (2012).
  48. Bosch, D., Asede, D., Ehrlich, I. Ex vivo optogenetic dissection of fear circuits in brain slices. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (110), e53628 (2016).
  49. Green, E. K., et al. The bipolar disorder risk allele at CACNA1C also confers risk of recurrent major depression and of schizophrenia. Molecular Psychiatry. 15 (10), 1016-1022 (2010).
  50. Takahashi, S., Glatt, S. J., Uchiyama, M., Faraone, S. V., Tsuang, M. T. Meta-analysis of data from the Psychiatric Genomics Consortium and additional samples supports association of CACNA1C with risk for schizophrenia. Schizophrenia Research. 168 (1-2), 429-433 (2015).
  51. McCarty, D. M. Self-complementary AAV vectors; advances and applications. Molecular Therapy. 16 (10), 1648-1656 (2008).
  52. Haery, L., et al. Adeno-associated virus technologies and methods for targeted neuronal manipulation. Frontiers in Neuroanatomy. 13, 93 (2019).
  53. Rabani, M., Pieper, L., Chew, G. -L., Schier, A. F. A massively parallel reporter assay of 3′ UTR sequences identifies in vivo rules for mrna degradation. Molecular Cell. 68, 1083-1094 (2017).
  54. Kim, Y. -S., et al. Correcting signal biases and detecting regulatory elements in STARR-seq data. Genome Research. 31, 877-889 (2021).
  55. Lee, D., et al. STARRPeaker: uniform processing and accurate identification of STARR-seq active regions. Genome Biology. 21, 298 (2020).
  56. Doni Jayavelu, N., Jajodia, A., Mishra, A., Hawkins, R. D. Candidate silencer elements for the human and mouse genomes. Nature Communications. 11, 1061 (2020).
  57. Singh, G., et al. A flexible repertoire of transcription factor binding sites and a diversity threshold determines enhancer activity in embryonic stem cells. Genome Research. 31, 564-575 (2021).
  58. Wang, X., et al. High-resolution genome-wide functional dissection of transcriptional regulatory regions and nucleotides in human. Nature Communications. 9, 5380 (2018).
  59. Peng, T., et al. STARR-seq identifies active, chromatin-masked, and dormant enhancers in pluripotent mouse embryonic stem cells. Genome Biology. 21, 243 (2020).
  60. Nair, R. R., Blankvoort, S., Lagartos, M. J., Kentros, C. Enhancer-driven gene expression (EDGE) enables the generation of viral vectors specific to neuronal subtypes. iScience. 23, 100888 (2020).
  61. Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65 -mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. The Lancet. 390, 849-860 (2017).
  62. Gaudet, D., et al. Efficacy and long-term safety of alipogene tiparvovec (AAV1-LPLS447X) gene therapy for lipoprotein lipase deficiency: an open-label trial. Gene Therapy. 20, 361-369 (2013).
  63. Nguyen, G. N., et al. A long-term study of AAV gene therapy in dogs with hemophilia A identifies clonal expansions of transduced liver cells. Nature Biotechnology. 39, 47-55 (2021).
  64. Nayak, S., Herzog, R. W. Progress and prospects: Immune responses to viral vectors. Gene Therapy. 17 (3), 295-304 (2010).
  65. Visel, A., et al. A high-resolution enhancer atlas of the developing telencephalon. Cell. 152 (4), 895-908 (2013).
  66. Shen, S. Q., et al. Massively parallel cis-regulatory analysis in the mammalian central nervous system. Genome Research. 26 (2), 238-255 (2016).
  67. Shen, S. Q., et al. A candidate causal variant underlying both higher intelligence and increased risk of bipolar disorder. bioRxiv. , (2019).
  68. Hrvatin, S., et al. A scalable platform for the development of cell-type-specific viral drivers. eLife. 8, 48089 (2019).

Tags

Неврология выпуск 181
AAV Развертывание конструктов экспрессии на основе энхансеров <em>In Vivo</em> в мозге мыши
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Warren, T. L., Lambert, J. T., Nord, … More

Warren, T. L., Lambert, J. T., Nord, A. S. AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain. J. Vis. Exp. (181), e62650, doi:10.3791/62650 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter