Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Geliştirici Tabanlı İfade Yapılarının AAV Dağıtımı In Vivo in Mouse Brain

Published: March 31, 2022 doi: 10.3791/62650
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2
1Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, University of California, Davis, 2Department of Neurobiology, Physiology and Behavior, University of California, Davis

Summary

Bu protokol, yeni bir rAAV tabanlı geçici arttırıcı-muhabir analizini açıklamaktadır. Bu tahlil, fare beyninde in vivo olarak arttırıcı güdümlü ifadeyi indüklemek için kullanılabilir.

Abstract

Arttırıcılar, doku ve hücre tipine özgü genlerin spesifik ekspresyon modellerini yönlendiren çeşitli transkripsiyon faktörleri dizisi için bağlayıcı platformlardır. Kodlamayan DNA'yı ve çeşitli kromatin durumlarını değerlendirmenin birçok yolunun, genomdaki arttırıcı dizilerin varlığını tahmin etmede yararlı olduğu kanıtlanmıştır, ancak bu dizilerin aktivitesini doğrulamak ve aktif oldukları organları ve gelişim aşamalarını bulmak emek yoğun bir süreçtir. Adeno ilişkili virüs (AAV) vektörlerindeki son gelişmeler, transgenlerin fare dokularına yaygın olarak verilmesini sağlamış ve transgenik bir hayvana ihtiyaç duymadan in vivo arttırıcı testi mümkün kılmıştır. Bu protokol, EGFP'yi minimal bir promotörün kontrolü altında ifade eden, kendi başına önemli bir ifadeyi yönlendirmeyen bir muhabir yapısının, fare beynindeki aday geliştirici dizilerinin aktivite kalıplarını incelemek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. AAV paketlenmiş bir muhabir yapısı fare beynine teslim edilir ve 1-4 hafta boyunca inkübe edilir, daha sonra hayvan kurban edilir ve beyin bölümleri mikroskop altında gözlemlenir. EGFP, test edilen arttırıcının gen ekspresyonunu başlatmak için yeterli olduğu hücrelerde ortaya çıkar ve arttırıcının beyinde aktif olduğu yeri ve gelişim aşamasını belirler. Standart klonlama yöntemleri, düşük maliyetli AAV paketlemesi ve genişleyen AAV serotipleri ve in vivo dağıtım yöntemleri ve standart görüntüleme okuması, bunu gen ekspresyonunun beyinde nasıl düzenlendiğinin incelenmesi için erişilebilir bir yaklaşım haline getirmektedir.

Introduction

Arttırıcılar, transkripsiyon faktörü bağlanma bölgeleri olarak hizmet eden genomik cis-düzenleyici elemanlardır ve bir hedef genin ekspresyonunu mekansal olarak zamansal olarak spesifik bir şekilde yönlendirebilir 1,2. Farklı hücre tiplerinde, dokularda ve gelişim aşamalarında farklı şekilde aktiftirler ve hastalık riskine bağlı genomik varyasyonun substratları olabilirler 3,4. Bu nedenle, arttırıcı fonksiyonun dinamiklerini anlama ihtiyacı, genomik içindeki hem translasyonel hem de temel bilim uygulamalarında ilerleme için kritik öneme sahiptir. Arttırıcı aktivitenin In silico tahminleri, arttırıcı yetenek 5,6 ile ilgili hipotezler üretmek için mükemmel kaynaklar olarak hizmet edebilir. Bu tür öngörülen arttırıcı aktivite, fonksiyonel aktivitenin tam olarak anlaşılması için ek doğrulama ve sorgulama gerektirebilir. Enhancer muhabir tahlilleri, hücrelerden hayvanlara kadar çeşitli sistemlerde bu amaç için değerli olduğunu kanıtlamıştır 7,8,9. Bu çalışmaları esnek ve uygun maliyetli bir in vivo bağlamda genişletmeye yönelik olarak, bu protokol, doğum sonrası fare beyninde ektopik bir muhabir geninin ekspresyonunu sürme yetenekleri için varsayılan arttırıcı dizileri test etmek için in vivo AAV tabanlı yöntemlerin kullanımını açıklamaktadır. Bu yöntem ailesi, tek aday dizileri veya paralel kütüphane taramasını sorgulamak için faydalıdır ve temel ve translasyonel araştırmalarla ilgilidir.

Bu yöntem, tek bir plazmidde, varsayılan bir arttırıcı aday DNA dizisini, tek başına önemli bir ifadeyi yönlendirmeyen minimal bir promotörün kontrolü altında, bir muhabir geni (burada EGFP) ile birleştirir. Plazmid, rekombinant AAV'ye (rAAV) paketlenir ve bir hayvan modeline enjekte edilir. Buradaki uygulama beyne yapılırken, çeşitli rAAV serotipleri farklı doku tiplerinde enfeksiyona olanak tanır, böylece bu yaklaşım diğer sistemlere genişletilebilir10. Bir süre sonra, beyin toplanabilir ve muhabir geninin ifadesi için test edilebilir. Güçlü ifade, kontrollerle karşılaştırıldığında, test edilen aday dizisinin genin ekspresyonunu "geliştirebildiğini" gösterir (Şekil 1). Bu basit tasarım, beyindeki arttırıcı aktivite için bir diziyi test etmek için kolay ve net bir yaklaşım sunar.

Bir dizinin arttırıcı kabiliyetinin test edilmesine ek olarak, bu yöntem hücre tipi arttırıcı aktivitesini belirlemek için tekniklerle birleştirilebilir. Diferansiyel arttırıcı aktivitesini belirlemeye yönelik sekans tabanlı yaklaşımlarda, DNA ve RNA diziliminden önce hücreleri hücre tipine özgü belirteçler üzerinde sıralamak, araştırmacıların Gisselbrecht ve ark.11'de açıklandığı gibi, farklı hücre tiplerinin diferansiyel arttırıcı aktivite gösterip göstermediğini belirlemelerine izin verebilir. Görüntüleme tabanlı yaklaşımlarda, görüntülerin hücre tipine özgü belirteçlerle birlikte etiketlenmesi, arttırıcı güdümlü floresan sergileyen hücrelerin aynı zamanda ilgilenilen hücre tipi belirteçleri de gösterip göstermediğinin incelenmesine olanak tanır 12,13,14,15,16. Enhancer muhabir testleri, arttırıcılardaki riskle ilişkili allelik varyasyonun, arttırıcı kapasitesi üzerindeki etkileri açısından doğrudan test edilmesini sağlar. Genom çapında ilişkilendirme çalışmalarında (GWAS) tanımlanan risk lokuslarının büyük çoğunluğu, genomun kodlamayan bölgelerinde yatmaktadır17. Bu risk lokuslarının fonksiyonel ek açıklama çalışmaları, büyük bir kısmının muhtemelen arttırıcı olarak hareket ettiğini göstermektedir18,19,20. In vivo MPRA dağıtımı, beyindeki arttırıcı aktivite için bu riskle ilişkili varyantların test edilmesine izin verebilir12,21. Son olarak, farklı zaman noktalarında teslimat ve toplama, bir geliştiricinin aktif olduğu gelişim aşamaları hakkında içgörüler sunabilir.

Geliştirici-muhabir plazmid tasarımları çeşitlidir ve deneysel hedeflere uyacak şekilde özelleştirilebilir. Geliştirici araştırmalarında kullanılan minimal promotörler için insan β-globin minimal promotör22 ve fare Hsp68 minimal promoter23 gibi çeşitli seçenekler vardır. Bu destekleyicilerin, onları etkinleştirmek için bir geliştirici unsurla birleştirilmediği sürece düşük ifade seviyelerini yönlendirdiği bilinmektedir. Buna karşılık, kurucu promotör elemanlar, transgenin güçlü ekspresyonunu yönlendirir, pozitif kontrol için veya güçlendirici fonksiyonu sağlam bir ifadenin arka planına karşı test etmek için kullanışlıdır. Kurucu destekleyiciler için yaygın seçenekler arasında tavuk β aktin promotöründen türetilen hibrit bir promotör olan CAG ve sitomegalovirüs hemen-erken arttırıcı24 veya insan EF1α25 bulunur. Arttırıcıların çift yönlü olarak çalıştığı bilindiğinden26, arttırıcının minimum promotöre göre oryantasyonu ve konumu esnektir (Şekil 2A). Geleneksel geliştirici-muhabir analizleri, geliştiriciyi destekleyicinin yukarı akışını yerleştirir ve kütüphane teslimatlarında, sıralama okumalarını test edilen geliştirici27 ile ilişkilendirmek için muhabir geninin aşağı yönünde bir barkod dizisi içerir. Bununla birlikte, arttırıcılar muhabir geninin açık okuma çerçevesine de yerleştirilebilir ve STARR-seq28'de yapıldığı gibi kendi barkod dizileri olarak hizmet edebilir. Burada açıklanan protokol, STARR-seq tahlil tasarımını kullanır ve aday arttırıcı dizisini muhabir geninin 3' UTR'sine yerleştirir. STARR-seq oryantasyonu daha akıcı klonlamanın faydasını sunarken, geleneksel yaklaşımdan daha az anlaşılmıştır ve yapılar arasında değişken RNA stabilitesini indükleyebilir. Tarif edilen yöntemler, başka bir yerde tarif edilen klonlama işleminde küçük değişikliklerle STARR-seq veya konvansiyonel yönelime kolayca uyarlanabilir27,29.

Bu tekniği deneysel hedeflere uyacak şekilde daha da özelleştirmek için farklı AAV dağıtım yöntemleri kullanılabilir (Şekil 2B). Bu protokolde daha ayrıntılı olarak açıklanan doğrudan kafa içi enjeksiyonlar, doğrudan beyne yüksek konsantrasyonda virüs verir30. Bu, enjeksiyon bölgesinde merkezlenmiş yüksek bir transdüksiyon verimliliği sağlar, bu da bunu, bir doku alanı üzerinde dönüştürülmüş hücrelerin yoğunluğunu en üst düzeye çıkarmak isteyen deneyler için mükemmel bir teknik haline getirir. Stereotaktik enjeksiyon, tekrarlanabilir lokalize transdüksiyon için hayvanlar arasında enjeksiyon bölgesini standartlaştırmaya yardımcı olabilir. İntrakraniyal enjeksiyonlar erken postnatal hayvanlarda en basittir. Alternatif bir teknik olarak, sistemik enjeksiyonlar, kan-beyin bariyerini geçebilen serotiplere sahip AAV'leri kullanarak transgenler verebilir31. Kuyruk damarı enjeksiyonları, virüsün vücutta dolaşmasına izin vererek birçok dokuda genelleştirilmiş doğum sağlar10. Retro-orbital enjeksiyonlar, gözün arkasındaki virüsü retro-orbital sinüs32'ye ileten başka bir sistemik enjeksiyon tekniğidir. Bu, AAV için venöz sistemden beyne daha doğrudan bir yol sunar ve beyinde daha periferik kan damarlarına yapılan enjeksiyonlardan daha yüksek bir transdüke hücresi konsantrasyonu ile sonuçlanır33.

Bu tekniğin bir başka esnek yönü de okuma yöntemidir. Genel olarak, seçenekler muhabir tabanlı veya sıralama tabanlı olarak tanımlanabilir (Şekil 2C). GFP gibi bir floresan muhabirini yapının açık okuma çerçevesine dahil etmek, aday arttırıcının ifadeyi sürdüğü herhangi bir dönüştürülmüş hücrede floresan proteininin ekspresyonuyla sonuçlanır. İmmünohistokimya gibi etiketleme ve görüntüleme teknikleri sinyal amplifikasyonunu mümkün kılar. Dizileme tabanlı okuma teknikleri, dokudan toplanan RNA'da verilen yapıdan dizileri tanımlamayı içerir. Başlangıçta teslim edilen viral DNA miktarını ölçerek, eksprese edilen RNA ile verilen DNA'nın karşılaştırılması, test edilmiş bir arttırıcı dizisinin, örneğin kitlesel olarak paralel bir muhabir testi (MPRA) bağlamında, transgenin artan ekspresyonunu ne derece yönlendirebildiğini belirlemek için kullanılabilir. MPRA'lar, aynı anda aktivite için binlerce aday arttırıcıyı test etmek için bu tekniklerin güçlü bir genişlemesini sunar ve genomik araştırmalarda 12,27,34,35,36 kapsamlı bir şekilde tanımlanmıştır. Aday arttırıcılar için klonlama, paketleme, teslimat ve sıralama adımlarının tek tek değil, toplu olarak gerçekleştirilmesiyle daha yüksek verim taraması elde edilir.

Aday geliştirici seçimi, esneklik için başka bir fırsat sağlar (Şekil 2D). Örneğin, bu tahlil, belirli bir genin arttırıcılarını tanımlamak, ilgilenilen kodlamayan DNA bölgelerinin işlevini belirlemek veya bir arttırıcının aktif olduğu spesifik hücre tiplerini veya gelişim aşamalarını belirlemek için kullanılabilir - bunların hepsi hem temel bilimde hem de hastalık araştırmalarında hedeflere hizmet eder. Genel olarak, aday arttırıcı seçimi, arttırıcı aktivitenin in silico tahminleri tarafından yönlendirilir. Yaygın olarak, in silico tahminleri, H3K27ac37 ve kromatin erişilebilirlik haritalaması38 gibi olası arttırıcıları gösteren histon modifikasyonları için ChIP-seq'i içerir. Son olarak, büyüyen bir araştırma alanı, sentetik olarak tasarlanmış arttırıcı elemanların fonksiyon tabanlı taranmasıdır, bu da arttırıcı dizinin fonksiyon39'u nasıl yönlendirdiğine ve belirli özelliklere sahip arttırıcıların tasarımına dair çalışmalara olanak tanır40.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bu protokol, UC Davis Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (Protokol #22339) ve UC Davis Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi (BUA-R1903) tarafından onaylanmıştır. Bu protokol, doğum sonrası 0-1. günde her iki cinsiyetten C57BL / 6J fareleri üzerinde test edilmiştir.

1. Arttırıcı aday dizisini AAV vektör plazmidine klonlayın.

NOT: Temsili protokoller verilmiştir, ancak klonlama stratejisi yüksek derecede esnekliğe sahiptir.

  1. Bir reporter yapısı seçin veya tasarlayın. Burada, geliştirici adayı, Hsp68 minimal promotörünün kontrolü altında ifade edilen EGFP muhabir geninin 3' çevrilmemiş bölgesine (UTR) yerleştirilir.
    NOT: Bu tahlil için uygun birçok MPRA plazmid yapısı Addgene41'e yatırılmıştır ve araştırma kullanımı için mevcuttur.
  2. İlgilenilen bir diziyi güçlendirmek için PCR astarları tasarlayın. Priserlerin 5' ucuna Gibson klonlaması için uygun homoloji kolunu ekleyin (yerleştirme yerinin 5' yukarı akış dizisine karşılık gelen ~ 35 bp, ileri astar için üst iplik ve ters astar için alt iplikçik).
    NOT: Baz astar dizisinin ~18-24 bp uzunluğunda ve ~%50-%60 GC içerikli olduğundan ve erime sıcaklığının yaklaşık 57-59 °C olduğundan emin olun.
  3. Tasarlanan primerleri kullanarak bir DNA örneğinden PCR gerçekleştirin.
    1. PCR reaksiyon karışımını Tablo 1'de açıklandığı gibi 0,2 mL PCR tüplerinde monte edin.
    2. PCR reaksiyon karışımlarını bir termal döngü üzerine yerleştirin ve Tablo 1'de belirtilen programa göre çevrime alın.
    3. PCR'nin başarısını, 5 μL PCR ürününü 100 V'ta 30-60 dakika boyunca% 0.7 -% 1'lik bir agaroz jeli üzerinde çalıştırarak doğrulayın. Tahmin edilen uzunluktaki parçayı kontrol edin.
    4. PCR ürününü ticari bir enzimatik reaksiyon temizleme kolonu kiti kullanarak temizleyin. Son elüat klonlama ekidir.
  4. Geliştiriciyi vektöre eklemek üzere benzersiz klonlama bölgesinde AAV vektörünü doğrusallaştırmak için kısıtlama sindirimi gerçekleştirin.
    1. Burada kullanılan geliştirici muhabir yapısının 3' UTR'sindeki klonlama sitesi, benzersiz PacI ve AscI kısıtlama siteleri ile sınırlıdır. Bu konumdaki plazmidi aşağıdaki parametrelere göre doğrusallaştırmak için bir özet gerçekleştirin (adım 1.4.2-1.4.4).
    2. Kaç klonlama reaksiyonuna ihtiyaç duyulacağına bağlı olarak PacI ve AscI kullanarak 1-10 μg vektör DNA'sını sindirin. Birlikte verilen tamponu kullanarak reaksiyonları üreticinin talimatlarına göre hazırlayın.
    3. Vektör DNA'sını sindirmek için 1-2 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin. (50 μL'lik bir reaksiyonda 5 μg'dan fazla sindirilirse, daha uzun inkübasyon gerekli olabilir.)
    4. 1-2 saatlik inkübasyondan sonra, 20 dakika boyunca 65 ° C'de inkübe ederek enzimi inaktive edin.
    5. Kısıtlama sindirimi fragmanlarını% 0.7 -% 1'lik bir agaroz jeli kullanarak jel elektroforezi ile ayırın, 30-60 dakika boyunca 100 V'ta çalıştırın.
    6. Doğrusallaştırılmış vektör için bandı tüketin ve ticari bir jel ekstraksiyon kiti kullanarak saflaştırın.
  5. Gibson klonlama reaksiyonlarını gerçekleştirin ve dönüştürün
    1. Bir spektrofotometre kullanarak saflaştırılmış vektörün ve klonlama ekinin konsantrasyonunu belirleyin.
      NOT: DNA ışığı 260 nm'de emerken, kirleticiler 230 nm ve 280 nm'de ışığı emer. 260/230 ve 260/280'lik yüksek oranlar (>1.8) yüksek oranda saflaşmış DNA'yı gösterir.
    2. Gibson klonlama reaksiyonlarını 0.2 mL PCR tüplerinde birleştirin: 5 μL 2x Gibson ana karışımı, vektöre 3: 1 ekleme oranında 0.02-0.5 pmol DNA fragmanı (Reaksiyon için optimal DNA konsantrasyonu ampirik olarak belirlenmelidir) ve Nükleaz içermeyen su (hacmi 10 μL'ye getirin).
    3. Gibson reaksiyonlarını termal bir döngüde 20 dakika boyunca 50 ° C'de inkübe edin.
  6. Rekombinasyon eksikliği (recA-) yetkin Escherichia coli'yi (E. coli) dönüştürün.
    1. Bir su banyosunu 42 ° C'ye ayarlayın ve piyasada bulunan yetkin hücreleri buz üzerinde çözün.
      NOT: Bu adım adım 1.4'ten önce yapılabilir ve Gibson reaksiyonunu hazırlarken ve inkübe ederken hücreler çözülebilir.
    2. Aliquot 30-50 μL hücreler 2.0 mL mikrosantrifüj tüplerine dönüşür. Bir aliquot'a 2 μL Gibson reaksiyonu ekleyin ve tüpü Gibson'un kimliğiyle etiketleyin. Hücreleri 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
      NOT: Pozitif kontrol olarak 5-10 ng sindirilmemiş boş vektör ve negatif kontrol olarak su kullanın.
    3. 42 °C su banyosundaki hücreleri 30-45 s ısıl şoklayın, tüpleri hemen buza döndürün ve 5 dakika boyunca iyileşmelerine izin verin.
    4. Buz üzerindeyken, piyasada satılan kurtarma ortamının 400-950 μL'sini ekleyin.
      NOT: Bu deneylerde kullanılan geri kazanım ortamı %2 bitkisel pepton, %0,5 maya ekstresi, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4 ve 20 mM glikoz içerir.
    5. Buz üzerinde iyileşmeden sonra, 30-60 dakika boyunca 250 RPM'lik nazik ajitasyonla 37 ° C'de inkübe ederek hücreleri tamamen geri kazanın.
    6. Hücreleri 5 dakika boyunca 5.000 x g'de santrifüjleme ile toplayın ve süpernatanın 400 μL'sini çıkarın ve ~ 50 μL bakteriyi plakaya bırakın.
    7. Seçici ortamlara plakalayın ve gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
      NOT: Bu deneylerde kullanılan seçici ortam, 100 μg / mL konsantrasyonunda% 1.0 tripton,% 0.5 maya özüt,% 1.0 sodyum klorür,% 1-2 agar,% 96-97 su ve karbenikilin içerir. Viral plazmidleri klonlamak için her zaman rekombinasyon eksikliği olan bakteri suşlarını kullanın, çünkü viral ters çevrilmiş terminal tekrarları (ITR'ler) eşleşen sekanslara sahiptir ve homolog rekombinasyona uğrayabilir. Bununla birlikte, bakteri suşları hala düşük rekombinasyon seviyelerine maruz kalmaktadır. Burada kullanılan muhabir plazmid, ITR'lerden birinin dizisinin değiştirildiği ve artık diğer ITR'yle mükemmel bir şekilde eşleşmediği, kendi kendini tamamlayan bir AAV'dir. Bakterilerin 30 ° C'de yetiştirilmesi, homolog rekombinasyon hızını daha da yavaşlatmak için de önerilir.
  7. Klonları doğrulayın ve plazmidleri kurtarın.
    1. Kesici uç konumunu çevreleyen, vektöre tav veren ileri ve geri astarları (Malzeme Tablosu) kullanarak bir PCR ana karışımı hazırlayın. Aliquot 10 μL hacimleri 0,2 mL PCR şerit tüplere yerleştirin.
    2. 14 mL yuvarlak tabanlı tüplerde, PCR ve negatif kontrol yoluyla test edilen her koloni için bir tane olmak üzere 5 mL antibiyotik seçici LB suyu alikotu hazırlayın.
    3. Tek bir koloni seçmek için steril bir kürdan veya pipet ucu kullanın ve koloniyi kabaca bir PCR tüpünün dibine kazıyın.
    4. Koloni PCR ana karışımına ayrıştığında, kürdanı veya ucu LB alikotlarından birine bırakın ve 14 mL tüpü Gibson reaksiyonu ve PCR tüp numarası ile etiketleyin.
    5. Koloni PCR reaksiyonlarını bir termal döngü üzerine yerleştirin ve Tablo 2'de açıklanan programla döngüleyin.
    6. Kürdan veya pipet uçlarıyla aşılanmış 5 mL sıvı kültürleri 37 °C ve 180 RPM'ye ayarlanmış sallanan bir inkübatörde inkübe edin.
    7. Koloni PCR reaksiyonlarını 100 V'ta 30-60 dakika boyunca% 0.7 -% 1'lik bir agaroz jeli üzerinde çalıştırın ve bantları bir jel doc görüntüleme sisteminde görselleştirin.
    8. Tahmin edilen PCR bandını görüntülemeyen 5 mL kültürleri atın.
    9. Başarılı bir şekilde entegre edilen her klon için, 5 mL kültürlerin bir gecede büyümesine izin verin ve ardından ticari bir kit kullanarak 4,5 mL'den bir plazmid mini hazırlığı gerçekleştirin. Sıvı kültürün 0,5 mL'sini ayırın ve gliserol stoğu olarak -80 ° C'de tasarruf edin.
    10. Plazmidlerde bulunan transgenlerin, Sanger dizilimi42'yi kullanarak istenmeyen mutasyonlardan arındırılmış olduğunu doğrulayın.
    11. Muhabir yapısının başarılı bir şekilde klonlandığı doğrulandıktan sonra, 5 mL'lik bir başlangıç kültürünü aşılamak ve 30 ° C ve 180 RPM'de sallanan bir inkübatörde 8-16 saat büyümek için kaydedilmiş gliserol stoğunu kullanın.
    12. Et suyu bulanıklaştığında, başlangıç kültürünü 250-300 mL taze seçici LB suyunda 1.000 kat seyreltin ve en az gece boyunca 30 ° C ve 180 RPM'de sallanan bir inkübatörde inkübe edin. Daha sonra ticari bir plazmid maxi kiti kullanarak plazmidi saflaştırın.
      NOT: Bakteriler 37 ° C'ye kıyasla 30 ° C'de daha yavaş büyür, ancak bu, büyük kültürleri büyütürken kendiliğinden rekombinasyon hızını yavaşlatmak için en iyi sıcaklıktır.
    13. 1.4.2-1.4.5 adımlarını kullanarak ITR'lerin rekombinasyonunu test etmek için bir XmaI özeti gerçekleştirin ve PacI ve AscI yerine XmaI kullanın. Bantları bir jel doc görüntüleme sistemi üzerinde görselleştirin.
      NOT: Her iki ITR'nin de mevcut olduğu bir rAAV plazmid, bu sindirimi takiben bir jel üzerinde iki bant verecektir: biri rAAV genomunun uzunluğu, diğeri plazmid omurgasının geri kalanının uzunluğu. Sadece bir bant varsa, ITR'ler homolog rekombinasyona tabi tutulmuştur ve rAAV plazmidi viral parçacıkları paketleyemeyecektir. Burada tarif edilen rAAV plazmid omurgası, XmaI bölgelerinin yalnızca ITR'lerde meydana gelmesi için tasarlanmıştır. Geliştirici adayı eki ayrıca herhangi bir XmaI sitesi içeriyorsa, tahmin edilen bant sonuçlarını ve analizini buna göre güncelleyin.

2. Paketlenmiş rAAV'yi edinin.

  1. Bu çalışmadaki deneyler için paketlenmiş rAAV (profesyonel veya kurum içi) kullanın.
    NOT: Bir rAAV'yi paketlemek için birçok seçenek vardır. Bir rAAV, bir şirkette veya bir üniversite çekirdek tesisinde profesyonel olarak paketlenebilir. rAAV ayrıca, karmaşıklık ve özel ekipman ihtiyacı43,44 arasında değişen farklı teknikler kullanılarak şirket içinde paketlenebilir. Birincil endişe, yüksek kalitede bir vektör elde etmek ve enfeksiyöz titrenin yüksek derecede kesinlik derecesine kadar belirlenmesidir. Bu çalışmada açıklanan farklı deneyler için hem profesyonel olarak paketlenmiş hem de şirket içi paketlenmiş rAAV'ler kullanılmıştır.

3. İntrakraniyal olarak rAAV paketlenmiş plazmidi yenidoğan farelere enjekte edin.

  1. Teslimat için rAAV karışımını hazırlayın.
    1. Amaç, farklı geliştirici muhabir virüsleri arasındaki ifade kalıplarını karşılaştırmaksa, hepsini en az konsantre virüsle eşleşecek şekilde seyrelterek karşılaştırılacak tüm virüslerin titrelerini eşitleyin.
    2. Arttırıcı muhabir virüsünün 2: 1 veya 3: 1 oranını ve yapısal olarak ifade edilen kontrol muhabiri virüsünü karıştırın ve az miktarda (% 0.06 nihai konsantrasyon) Hızlı Yeşil boya ekleyin.
      NOT: Hızlı Yeşil,45,46,47,48 prosedürü sırasında ve hemen sonrasında enjeksiyon bölgesini görselleştirmek için AAV de dahil olmak üzere deney hayvanlarının enjeksiyonlarında yaygın olarak kullanılan bir boyadır. Bu önemli bir kalite güvence adımı olsa da, boya ilavesinin transdüksiyona müdahale etmesi mümkündür. Enjeksiyon boyasının kullanımını yeniden gözden geçirmek, bazı durumlarda protokol optimizasyonu için önemli olabilir. Yapısal olarak yönlendirilen kontrol virüsü, bağımsız enjeksiyonları karşılaştırmak için kesinlikle kritik öneme sahiptir. Virüs enjeksiyonları, hayvandan hayvana transdüksiyonun yeri ve derecesine göre değişecektir. Yapısal kontrol, başarısız enjeksiyonların analizden dışlanmasını sağlayacak ve virüs dağıtımındaki varyasyonun normalleştirilmesi için bir standart sağlayacaktır.
    3. μL dereceli kılcal borudan yapılmış steril çekilmiş cam pipetin ucunu, %70 etanol içine batırılarak sterilize edilmiş ve tamamen kurumaya bırakılarak sterilize edilmiş hassas bir mendilden hafifçe delerek kırın. Ardından, çekilen cam pipeti, mikro kılcal pipeti tutmak için kauçuk bir conta ile biten 15 inç uzunluğundaki kauçuk boruya bağlı basınç uygulamak için bir cihazdan oluşan aspiratör tertibatına yerleştirin.
      NOT: "Basınç uygulama cihazı" bir şırınga veya ağızlık olabilir. Bir şırınga kullanılacaksa, deneyci bir elindeki pipeti ve diğer elindeki hayvanı manipüle ederken, ikinci bir kişinin şırıngadan basınç uygulaması gerekecektir. Bir ağızlık kullanılıyorsa, deneycinin hem hayvanın hem de pipetin pozisyonları ve şırıngaya uygulanan basınç üzerinde hassas bir kontrol sağlaması durumunda, virüs kontaminasyonunu önlemek için ekstra özen gösterilmesi gerekir.
    4. Cam pipete küçük hacimli (~0,2-0,5 μL) mineral yağ çekmek için aspiratör tertibatından negatif basınç uygulayın.
      NOT: Bu adım, aerosolize viral partiküllerin aspiratör tertibatını kirletmesini önlemek için bir bariyer sağlamak açısından çok önemlidir.
    5. Hazırlanan aspiratör tertibatını bir kenara koyun ve enjekte edilmeye hazır olana kadar virüsü buz üzerinde tutun.
  2. Kriyo-anestezik, yenidoğan fareleri, pedal çekilme refleksinin (~ 5 dakika) durmasına kadar kısmen buza batırılmış kuru plastik bir kapta uyuşturun. Farelerin buzla doğrudan temas halinde olmadığından emin olun.
  3. Menisküs 2 μL onay işaretini geçene kadar virüs karışımını çekilen cam pipete çekmek için aspiratör tertibatından negatif basınç kullanın.
  4. Fareyi soğuk odadan çıkarın ve tezgahın üzerine yerleştirin. İki taraflı enjeksiyon bölgelerini lambda ve bregma arasında ve sagital sütür ile her göz arasında orta yol olarak bulun. Her iki bölgeyi de alkollü mendille sterilize edin.
  5. Yenidoğan farelerinin kafatasını delmek için çekilmiş cam pipeti kullanın ve iğne beyne girerken aspiratör tertibatından yavaşça pozitif basınç uygulayın. Virüs karışımının menisküsünü izleyin. Pipetin ucu lateral ventriküle ulaştığında uygulanan basınca karşı direnç azalacaktır. Virüsün 1 μL'sini dağıtın, pipeti geri çekin ve diğer lateral ventrikül için tekrarlayın.
  6. Kurtarmak için fareyi bir ısıtma yastığına veya bir ısıtma odasına yerleştirin. Uyanık ve aktif olduktan sonra, hayvanı ev kafesine geri getirin.

4. Doku toplayın ve immünohistokimya yapın.

  1. Virüs transdüksiyonunu takiben yeterli süre sonra, fareleri anestezi altına alın ve transkardiyal perfüzyon ile kurban edin.
    NOT: Burada gösterilen temsili sonuçlar da dahil olmak üzere birçok deney, virüsün geçmesi için 4 hafta veya daha uzun bir süreye izin verir. Bununla birlikte, kendi kendini tamamlayan AAV'ler 7 gün12 gibi erken bir sürede güçlü bir ifade gösterebilir. İstenilen kuluçka süresinin, belirli deneysel tekniklere ve hedeflere bağlı olarak optimize edilmesi gerekebilir.
    1. İntravenöz infüzyon tüpü ve 25 G iğne ile peristaltik bir pompa hazırlayın.
    2. 1x PBS ve% 4 paraformaldehit (PFA) hazırlayın ve buz üzerine yerleştirin.
    3. Borunun giriş ucunu buz gibi soğuk 1x PBS'ye yerleştirin. Akış hızını ayarlayın (P7 fareler için 2,5 mL/dak, P28 fareler için 3,5 mL/dak) ve tampon borunun içinden tamamen çekilene ve kabarcıklardan arındırılana kadar pompayı çalıştırın. Perfüzyon için hazır olana kadar iğneyi bir kenara koyun.
    4. Bir duman davlumbazının içinde, bir damla kavanoz odasının altındaki bir kağıt havluya az miktarda izofluran pipetin. Önceden enjekte edilen fareyi kağıt havlunun üzerindeki bir ızgaraya yerleştirin ve izofluran ile doğrudan temas etmemesini sağlayın. Fareyi uyuşturmak için odayı kapatın. ~ 5 dakika bekleyin ve ardından odayı açın ve pedal çekme refleksini kontrol edin. Hayvan bilinçsiz olduğunda devam edin.
      NOT: Perfüzyon boyunca, bilincin yeniden kazanılmasını önlemek için fare bir burun konisi ile izofluran üzerinde tutulmalıdır.
    5. Farenin karnını ve göğsünü açmak, göğüs kafesini çıkarmak ve kalbi açığa çıkarmak için cerrahi makas kullanın.
    6. Farenin sağ atriyumunda küçük bir kesi yapmak için bir çift iris mikro makası kullanın, IV iğnesini sol ventriküle yerleştirin ve peristaltik pompayı etkinleştirin.
    7. Sağ atriyumdaki kesiden akan kan temizlenene kadar hayvanı buz gibi soğuk 1x PBS ile perfüze edin. Kan dokusunu temizlemek çok önemlidir, çünkü kırmızı kan hücreleri otofloresana sahiptir ve kan damarları muhabir eksprese eden hücreleri görüntüleme yeteneğini bozabilir.
    8. Peristaltik pompayı duraklatın ve giriş borusunu PBS'den %4 PFA'ya taşıyın. Pompayı yeniden etkinleştirin ve yetişkin bir fare için 1 mL / g vücut ağırlığı, ~ 25 mL perfüze edin.
      NOT: Fiksasyon titremeleri gözlemlenebilir olmalı ve farenin gövdesi sertleşmelidir.
  2. Beyni disseke edin ve düzeltin.
    1. Farenin kafasını cerrahi makasla çıkarın.
    2. Küçük cerrahi makas kullanarak, kafatasının tabanından başlayın ve başın orta çizgisi boyunca bir kesi yapın ve kafatasını ortaya çıkarmak için cildi ve altta yatan dokuyu geri çekin.
    3. İris makası kullanarak, kafatasının arkasını dikkatlice kesin, foramen magnumundan başlayarak ve koku alma ampulleri geçene kadar sagital sütüre doğru ve boyunca devam edin.
    4. Makası koku alma ampullerinin üzerine kafatasına yerleştirin ve kafatasında iki yatay kesim yapın. Oksipital kemikte benzer bir çift yatay kesim yapın. Yatay ve orta çizgi kesimleri, kafatasının üst kısmında bir çift kapı benzeri kanat oluşturur.
    5. Beyni tamamen açığa çıkarmak için kafatasının kanatlarını geri soyun. Koku alma ampullerini kafatasından koparmak ve kafatası sinirlerini kesmek için bir çift cımbız kullanın, beyni kafatasından kurtarın.
    6. Beyni PBS'de 3-5 mL% 4 PFA ile 15 mL'lik bir konik tüpe bırakın. Düzeltme sonrası 6 saat ila bir gecede. Dokuyu aşırı sabitlemeyin.
  3. Beyinleri kriyoseksiyon için hazırlayın.
    1. Sabit beyni, dehidrasyon için PBS'de 12-14 mL% 30 sakkaroz içeren yeni bir 15 mL konik tüpe aktarın. Beyin tüpün dibine batana kadar (2-3 gün) 4 ° C'de inkübe edin.
    2. Sabit ve kurutulmuş beyni 15 mm x 15 mm x 5 mm kriyomoldda optimum kesme sıcaklığı (OCT) bileşiğine batırın. Beyin tamamen kaplanana kadar OCT ekleyin.
    3. Cryomold'u bir kuru buz bloğuna yerleştirin ve numuneyi katı bir OCT bloğunda (~ 5 dakika) dondurun.
      NOT: OCT blokları -80 °C'de aylarca veya yıllarca saklanabilir.
    4. Cryomold'u örnek adı ve beynin oryantasyonu ile etiketleyin.
  4. Bir kriyostat mikrotomu kullanarak koronal kesitler elde edin.
    1. Beynin OCT bloğu üzerindeki yönünü kurşun kalemle işaretleyin ve bloğu kriyostatın içindeki kriyomolddan çıkarın.
    2. OCT bloğunu, beynin kriyostatın bıçağına bakan koku ampulleriyle yönlendirilmesi için konumlandırın ve bloğu kriyostatın nesne tutucusuna taze OCT ile yapıştırın.
    3. Yerinde dondurulduktan sonra, 4.4.4-4.4.6 adımlarını izleyerek bloktan 50 μm kesitleri kesmeye başlayın.
    4. Rulo önleyici plakayı kullanmayın. Bölümler kesildikçe sıkı rulolar halinde kıvrılır ve bloğun üstünde toplanır veya bir toplama tepsisine düşer.
    5. Yapılan ilk birkaç kesimde bloğun şeklini izleyin. Blok boyunca dikey kesimler yapın, kesmeye başlarken eşit bir yüz oluşturun. Gerekirse numune ayar kollarını kullanarak açıyı ayarlayın.
    6. Koku alma ampulleri göründüğünde, bölümlerin şekline çok dikkat edin. Biri diğerinden daha büyük görünüyorsa, kesikler beyne göre bir açıdadır ve örnek ayar kollarını kullanarak beynin bıçağa karşı yönünü düzeltmek gerekir.
      NOT: Düz kesim yapılırsa, korteks aynı anda her koku alma ampulünün üzerinde görünmeye başlamalıdır.
    7. Koku alma ampulü kesitlendikten ve rostral beyin dokusu görünür olduktan sonra, kesme kalınlığını 30-35 μm'ye düşürün ve yüzen bölümleri toplamaya başlayın. Beyni bölümlere ayırmak için 4.4.8-4.4.13 adımlarını izleyin.
    8. Bloğun ve nesne tutucunun önceki tüm bölümlerini toplama tepsisine düşecek şekilde fırçalayın. Onları tepsinin bir tarafına doğru fırçalayın ve ayrı tutun. Yığın çok büyükse, tepsiyi boşaltın.
    9. 24 kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna 1 mL PBS dağıtın. Her beyin için 1 satır etiketleyin.
    10. 6 koronal bölüm kesin. Soğuk cımbız kullanarak bölümleri alın ve kriyostat aşamasında düzenleyin. 6 bölümden oluşan grupları ayrı tutarak bu adımı 2 veya 3 kez yineleyin.
    11. 000 boyutunda bir boya fırçasını PBS ile ıslatın ve tüy bırakmayan bir mendil veya kağıt havlu üzerindeki fazla sıvıyı temizleyin. Her bölümü birer birer nazikçe almak için boya fırçasını kullanın ve 24 kuyucuk plakasının uygun kuyucuklarına yerleştirin.
    12. Dilim grubundaki 6 bölümden birini, 24 kuyu plakasının üst üste 6 kuyusunun her birine yerleştirin. Bu, her kuyucuğun beynin kesitli alanını kapsayan temsili bölümler içermesini sağlar.
    13. Serebral korteksin kaudal ucu kesitlenene kadar 6'lı gruplar halinde seksiyonlamaya devam edin.
    14. Depolama için, 24 kuyucuklu plakayı parafilm ile kapatın ve 4 ° C'de saklayın.
      NOT: Bölümler 4 °C'de 1-2 ay boyunca stabildir. % 0.1 Sodyum azid içeren bir PBS çözeltisi, bakteri üremesini inhibe etmek ve bölümlerin raf ömrünü uzatmak için kullanılabilir. Bununla birlikte, kesitler 2 aydan daha uzun süre saklanacaksa, kriyoprotektan çözeltisine yerleştirilmeli ve en iyi sonuç için -20 ° C'de dondurulmalıdır.
  5. Muhabir gen sinyal amplifikasyonu için immünohistokimya yapın.
    NOT: Antijen alımı dışındaki tüm adımlar, yörüngesel bir çalkalayıcı üzerinde nazik-orta derecede ajitasyon (~ 100 RPM) kullanılarak gerçekleştirilmelidir. Kontrol raporlayıcısının (mRuby3) doğal floresansını korumak için, tüm adımlar mümkün olduğunca ışıktan korunmalıdır.
    1. Gerekli tamponları Tablo 3'te açıklandığı gibi hazırlayın.
    2. Lekelenen her beyin için bir sıra ile yeni bir 24 kuyu plakası hazırlayın. Kuyuların ilk sütununda, her bir kuyucuğa 1 mL PBS ekleyin.
    3. 000 boyutunda bir boya fırçası kullanarak, orijinal koleksiyon kutusundan 1 kuyucuklu bölümü, artık OCT bileşiğini çıkarmak üzere hızlı bir durulama için yeni 24 kuyucuklu plakadaki taze PBS'ye nazikçe aktarın.
    4. 24 kuyu plakasındaki bir sonraki kuyuya 1 mL ARB ekleyin ve bölümleri bu kuyuya aktarın. 60 °C'de bir fırında 1 saat boyunca inkübe edin.
    5. Plakanın oda sıcaklığında (RT) 20 dakika soğumasını bekleyin.
    6. Bir sonraki kuyucuğa 1 mL PB ekleyin ve bölümleri bu kuyuya aktarın. RT'de 20 dakika boyunca inkübe edin.
    7. Bir sonraki kuyucuğa 500 μL BB ekleyin ve bölümleri bu kuyuya aktarın. RT'de 1 saat boyunca inkübe edin.
    8. BB'ye 2 mL WB ekleyin ve ardından ~2 mL çözeltiyi pipetle çıkarın ve kuyucukta seyreltilmiş bir BB çözeltisi bırakarak atın. Bölümler açıkça görünene kadar tekrarlayın.
    9. Primer antikoru (Chicken IgY anti-GFP, 1:1000) BB'de seyreltin. Bir sonraki kuyucuğa 350-500 μL birincil antikor çözeltisi ekleyin ve bölümleri bu kuyucuğa aktarın. Plakayı parafilm ile kapatın ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
    10. BB'yi, bölümler açıkça görülebilene kadar daha önce yapıldığı gibi WB ile seyreltin.
    11. Bir sonraki kuyucuğa 1 mL WB ekleyin ve bölümleri bu kuyuya aktarın. RT'de 20 dakika boyunca inkübe edin.
    12. ~800-900 μL tamponu çıkarın ve atın. 1 mL taze WB ekleyin ve 20 dakika kuluçkaya yatırın. Her biri 20 dakika olmak üzere toplam 5 yıkama için 1 mL WB 4 kez daha değiştirin.
    13. İkincil antikoru (Eşek anti-tavuk Alexa Fluor 488 konjugated, 1:500) BB'de seyreltin. Sekonder antikor çözeltisinin 350-500 μL'sini yeni bir kuyucuğa ekleyin. RT'de 45 dakika ila 1 saat arasında inkübe edin.
      NOT: Bu yedinci kuyudur, bu nedenle 2'den fazla beyinden lekeler boyanırsa, bu noktada yeni bir plakaya ihtiyaç duyulacaktır.
    14. BB'yi WB ile daha önce olduğu gibi seyreltin ve bölümleri 1 mL WB ile doldurulmuş yeni bir kuyuya aktarın. Bölümleri daha önce yapıldığı gibi 20 dakika 3 kez yıkayın.
    15. PBS'de çalışan bir DAPI çözeltisi hazırlayın (son konsantrasyon 0.04-0.8 μg / mL). Çözümü ışıktan koruyun.
    16. Bir sonraki kuyucuğa 1 mL DAPI çözeltisi ekleyin ve bölümleri bu kuyuya aktarın. RT'de ~ 5 dakika boyunca inkübe edin.
    17. Bölümleri Dünya Bankası'na geri aktarın ve 000 boyutunda bir boya fırçası kullanarak mikroskop slaytlarına nazikçe monte edin. Kızakların hava ile kurumasını bekleyin.
    18. Kapak fişlerini uygun bir montaj ortamıyla uygulayın. Slaytların gece boyunca karanlıkta RT'de iyileşmesine izin verin.

5. Arttırıcı aktivite için beyin dokusu bölümlerini görüntüleyin ve analiz edin.

  1. Beyin bölümünü kapsayan floresan görüntüleri kaydetmek için düşük büyütmeli (5x) objektif bir lens kullanın.
  2. Enjeksiyon bölgesini bulun ve kırmızı floresan hücrelerin yoğunluğuna ve yoğunluğuna bağlı olarak virüs iletiminin derecesini değerlendirin. Benzer şekilde dönüştürülmüş hayvanları karşılaştırmaya özen gösterin.
  3. İsterseniz daha yüksek büyütmeli objektif lensle (≥25x) ayrıntılı floresan görüntüler kaydedin.
    NOT: Karşılaştırılacak numuneler arasındaki uyarma ışık yoğunluğu, filtreler ve pozlama süresi gibi alma parametreleri için her zaman aynı ayarları kullandığınızdan emin olun.
  4. Görüntü analiz yazılımını kullanarak görüntüleri işleyin.
    NOT: İşleme, herhangi bir görüntü analizi yazılım paketinde yapılabilir. Aşağıdaki adımlar, ImageJ'nin açık kaynaklı FIJI dağıtımını kullanarak bir dizinin muhabir yapı bağlamında (evet veya hayır sorusu) bir geliştirici görevi görüp görmediğini belirlemeye yönelik önerilerdir. Arttırıcı varyantlar arasındaki aktivite derecelerini karşılaştırırken daha derinlemesine fotometri uygun olabilir. Farklı örneklerden gelen görüntüler karşılaştırılmak için her zaman tutarlı bir şekilde işlenmelidir.
    1. Gürültüyü azaltmak için filtreler uygulayın. Fiji'de, Gürültüyü İşle menüsünün altındaki Benek > seçeneğini belirleyin.
      NOT: Bu 3 x 3 medyan filtredir.
    2. 5.4.3-5.4.6 adımlarını izleyerek arka plan floresansını çıkarın.
    3. Çok kanallı bir görüntünün kanallarını ayırın. Fiji'de, Görüntü > Renk menüsünün altındaki Kanalları Böl seçeneğini belirleyin.
    4. Görüntünün floresan hücresi olmayan bir alanında küçük bir şekil çizmek ve Analiz > Ölçü'yü kullanarak arka planın ortalama piksel yoğunluğunu ölçmek için dikdörtgen veya daire seçim aracını kullanın. Birden fazla alanı örneklemek için bu işlemi tekrarlayın.
      NOT: Ölçüleri Analiz Et > Ayarla menüsünde Ortalama Gri Değer'in seçili olduğundan emin olun.
    5. Ortalama gri değerin 5-8 arka plan alanından ortalaması alınır ve ondalık noktayı bırakın. İşlem > Math > Subtract'i kullanarak görüntüdeki her pikselden bu değeri çıkarın.
      NOT: En yakın tam sayıya yuvarlamak, çıkarılacak arka planı fazla tahmin edebilir. Ondalık noktayı basitçe düşürmek daha muhafazakardır. Örneğin, 6,4 6'ya yuvarlanır, ancak her pikselden 0,5 birim gerçek sinyal çıkarma riskini önlemek için 6,5 de 6'ya yuvarlanmalıdır.
    6. İsterseniz, kanalları tekrar çok kanallı bir görüntüde birleştirin. Fiji'de Kanalları Birleştir > Görüntü > Renk'i kullanın.
    7. Çakışan görüntüleri bir araya getirin. Fiji'de, Dikiş > Izgara/Koleksiyon dikişleri > Eklentileri kullanın.
    8. Parlaklığı ve kontrastı ayarlayın. Fiji'de, Parlaklığı/Kontrastı Ayarla > Görüntü > kullanın.
      NOT: Karşılaştırılacak her görüntü için her zaman aynı minimum ve maksimum değerleri kullanın.
    9. 5.4.10-5.4.12 adımlarını izleyerek yeşil floresan hücrelerin sayısını sayın. Bunlar, aday geliştirici dizisinin muhabir ifadesini yönlendirebildiği hücrelerdir.
    10. Yeşil kanalı gizleyerek başlayın ve beynin kırmızı floresan ifade eden bölgesinin etrafına bir şekil çizmek için serbest biçimli seçim aracını kullanın. Fiji'deki Ölçü işlevini kullanarak bu bölgedeki kırmızı kanalın alanını, entegre yoğunluğunu ve ortalama gri değerini ölçün.
    11. Çok noktalı seçim aracını kullanarak, bu bölgedeki yeşil hücrelerin sayısını sayın.
    12. Yeşil hücrelerin sayısını kırmızı kanalın entegre yoğunluğuna göre normalleştirin. Yerel kırmızı kanal parlaklığı, virüse maruz kalmanın büyüklüğü için bir proxy ölçüsüdür ve farklı dönüştürülmüş hayvanlar arasındaki arttırıcı aktivitenin karşılaştırılmasını sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu yöntemler kullanılarak, CACNA1C 19,49,50 geninin psikiyatrik riskle ilişkili üçüncü intronunda 915 bp dizisi, doğum sonrası fare beyninde arttırıcı aktivite açısından test edildi. Bu sekans, psikiyatrik ve nörolojik risk SNP'leri12'ye odaklanan 345 aday arttırıcı sekanstan oluşan bir MPRA'da keşfedilmiştir ve karakterizasyon deneyleri burada genel bir örnek olarak açıklanmıştır. C57BL/6 fareleri, Hsp68 minimal promotörünün kontrolü altında EGFP içeren kendi kendini tamamlayan vektör51 olarak paketlenmiş bir AAV68 yapısı ve tek bir aday arttırıcı dizisi ile P0'a enjekte edildi (Şekil 3A). Ek farelere, düzenleyici aktiviteye sahip olmadığı tahmin edilen negatif bir kontrol dizisi içeren yapılar enjekte edildi (Şekil 3B). Bu yapılar için viral titreler 6.85 x 10 10vg / mL'ye normalleştirildi. Enjekte edilen tüm farelere, başarılı bir şekilde dönüştürülen alanı görselleştirmek ve bölgedeki potansiyel değişkenliği ve enfeksiyonun yayılmasını kontrol etmek için kurucu CAG promotörünün kontrolü altında mRuby3 içeren AAV9 paketlenmiş bir yapı ile birlikte enjekte edildi. Beyinler postnatal günde (P)28 immünohistokimya ve görüntüleme amacıyla toplandı. Bu deneyler, CACNA1C'deki bu aday arttırıcı bölgenin P28 fare beyninde EGFP ekspresyonunu sürdüğünü (Şekil 3A), negatif bir kontrol dizisinin ise olmadığını doğruladı (Şekil 3B). Bu sonuçlar, fare beyninde arttırıcı-muhabir tahlillerinin uygulandığını göstererek, geleneksel in vitro modeller kullanılarak özetlenemeyen koşullar sırasında arttırıcıların in vivo çalışmasını sağlar.

Bu yöntemler, MPRA'larda olduğu gibi AAV tabanlı teslim yöntemlerini kullanarak etkinlik için aday geliştirici dizilerinin kitaplıklarını test etmek için de kullanılabilir. Farklı titrelerdeki kütüphane tabanlı muhabir ekspresyonunun temsili görüntüleri, bu tahlilin esnekliğini ve viral titrenin transdüksiyon verimliliği üzerindeki etkisini göstermektedir. Yüksek titreli (Şekil 4A) ve düşük titreli (Şekil 4B) viral preparatlar, hem bir CAG promotörü tarafından yönlendirilen pozitif kontrol mRuby3 ekspresyonu hem de doğum sonrası fare beynindeki aday arttırıcı kütüphanelerden üretilen EGFP ekspresyonu ile kanıtlandığı gibi, dönüştürülmüş hücrelerin miktarında farklılıklara neden olur. Yüksek titreli ve geniş transdüksiyon veya düşük titreli ve seyrek transdüksiyonun tercih edilebileceği durumlar vardır.

Figure 1
Şekil 1: Protokole genel bakış. Bu tahlilin temel unsurları arasında bir aday geliştirici elemanı, minimum bir destekleyici, bir muhabir geni ve tahlil tasarımına bağlı olarak, benzersiz etiketleme için bir barkod dizisi bulunur. Bu elementler bir AAV plazmid omurgasına klonlanır ve AAV içine paketlenir. Virüs hayvana teslim edilir ve birkaç gün veya hafta boyunca kuluçkaya bırakılır. Son olarak, ilgilenilen doku toplanır ve görüntüleme veya dizileme yoluyla arttırıcı aktivite tespit edilir. Arttırıcı güdümlü transgen ekspresyonu, kurucu sürücülerin aksine, hücre tipi, bölgesel ve zamansal özgüllük ile ekspresyon üretebilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Tahlil tasarımında esneklik. (A) Plazmid oryantasyonu, STARR-seq28'de olduğu gibi, arttırıcıyı minimal promotörün yukarı veya muhabir geninin aşağı akışını yerleştirebilir. Dizi tabanlı okumalar için, muhabir geninin aşağı akışına bir barkod eklenir veya geliştirici ikinci yönde kendi barkodu olarak işlev görebilir. (B) Beyne yaygın viral dağıtım teknikleri, farklı dokularda transdüke hücrelerin farklı yoğunluklarına neden olabilecek intrakraniyal enjeksiyonları, retro-orbital enjeksiyonları veya kuyruk-ven enjeksiyonlarını içerir. (C) Okumalar sıralama tabanlı veya görüntüleme tabanlı olabilir. Dizileme tabanlı okumalarda, arttırıcı aktivite, RNA dizisinin giriş DNA dizisine karşı göreceli bir artışı ile tanımlanır (AAV dağıtımını kontrol eder). Görüntüleme okumalarında, arttırıcının aktif olduğu yerlerde muhabir geninin ekspresyonu arttırılır. (D) Psikiyatrik riskle ilişkili gen CACNA1C'deki potansiyel intronik arttırıcılar vurgulanmıştır. Üst resimde, GWAS-test edilmiş özelliklerle güçlü ilişkiler ve PLAC-seq20 aracılığıyla CACNA1C promotörü ile etkileşimler gösteren geniş bir bölge seçilmiştir. Girişte, sekans düzeyinde evrimsel olarak korunan, açık kromatin alanlarında bulunan ve arttırıcıların göstergesi olan epigenetik işaretler gösteren daha küçük aday bölgeler tanımlanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: CACNA1C'deki Arttırıcı , P28 fare beyninde EGFP ekspresyonunu yönlendirir. (A) P0'da intrakraniyal olarak enjekte edilen bir fare, bir arttırıcı-muhabir yapısı (scAAV9-Hsp68-EGFP-CACNA1C_3) ve yapısal olarak ifade edilen enjeksiyon kontrolü (AAV9-CAG-mRuby3), P28'deki korteksin orta-alt katmanlarında arttırıcı güdümlü EGFP ekspresyonunu gösterir. (B) P0'a negatif kontrol yapısı (scAAV9-Hsp68-EGFP-NEG_4) ve enjeksiyon kontrolü ile enjekte edilen bir fare, P28'de EGFP ekspresyonunu göstermez. Tüm beyin görüntüleri 5x büyütmede çekildi ve iç kısımlar kutulu bölgenin yakınlaştırılmış görünümünü gösteriyor. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Farklı titrelere sahip AAV tarafından verilen geliştirici-muhabir kütüphaneleri fare beynindeki aktiviteyi göstermektedir. (A) Ticari olarak paketlenmiş, yüksek titreli AAV-PHP.eB aday arttırıcı kütüphanesi, P7 fare beyninde geniş EGFP ekspresyonunu yönlendirir. (B) Ambalaj hücrelerinin şartlandırılmış ortamından çökeltilen alt titreli AAV9 aday arttırıcı kütüphanesi, P7 fare beyninde seyrek EGFP ekspresyonunu yönlendirir. Görüntüler 5x büyütmede çekildi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

PCR Reaksiyon Karışımı
5x reaksiyon tamponu 10 μL
dNTP'ler Her biri 200 μM'lik nihai konsantrasyon
Klonlama primerleri Her biri 0,2 μM'lik nihai konsantrasyon
Şablon DNA 50 ng
Yüksek doğrulukta polimeraz 0.02 U/μL nihai konsantrasyon
Nükleaz içermeyen su 50 μL nihai reaksiyon hacmine ulaşmak için
Termosiklet koşulları
Aşağıdakilerin 30 döngüsü: Notlar
Adım Sıcaklık Saat
Denatüre 98 °C 10 Saniye
Tavlama 60 °C 20 Saniye Optimum sıcaklık, astarlara bağlı olarak değişebilir.
Uzatmak 72 °C 30 Saniye Optimum sıcaklık ve süre polimeraza bağlı olarak değişebilir.
Son Uzatma 72 °C 2 dk Optimum sıcaklık ve süre polimeraza bağlı olarak değişebilir.
Tutmak 4 °C

Tablo 1: PCR reaksiyon karışımı ve termosiklet koşulları.

Termosiklet koşulları
Aşağıdakilerin 30 döngüsü: Notlar
Adım Sıcaklık Saat
Hücre Lizisi 98 °C 5 dk
Denatüre 98 °C 10 Saniye
Tavlama 55 °C 15 Saniye Optimum sıcaklık, astarlara bağlı olarak değişebilir.
Uzatmak 72 °C 30 Saniye Optimal sıcaklık ve süre polimeraza bağlı olarak değişebilir.
Tutmak 4 °C

Tablo 2: Koloni PCR için termosiklet koşulları.

İmmünohistokimya için tamponlar
Arabellek Kompozisyon
1x PBS 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4
1x Sitrat Antijen Geri Alma Tamponu (ARB), pH 6.0 Tescilli, bkz. malzeme tablosu
Geçirgenlik Arabelleği (PB) 1x PBS + %0,5 Triton X100
Yıkama Tamponu (WB) 1x PBS + %0,1 Triton X100
Engelleme Arabelleği (BB) Dünya Bankası + %5 süt

Tablo 3: İmmünohistokimya için tamponlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu protokol, doğum sonrası fare beyninde arttırıcı güdümlü transgenlerin konuşlandırılması için rAAV tabanlı bir yöntemi açıklar. Bu genelleştirilmiş protokolde, bir aday arttırıcı, bir minimal destekleyici, bir muhabir geni ve isteğe bağlı bir barkod dizisi bir AAV plazmid omurgasına klonlanır. Bu deneyler tek bir aday arttırıcı dizisi ile veya paralel olarak birçok dizi ile yapılabilir. Plazmid bir rAAV içine paketlenir ve doğum sonrası fare beynine verilir. Virüs transdüksiyonuna izin vermek için bir süre sonra, beyin toplanır ve muhabir gen ekspresyonu için görüntülenir. Yapısal olarak ifade edilen bir muhabir virüsü (CAG-mRuby3) enjeksiyon kontrolü olarak dahil edilir. Bu testi kullanarak, arttırıcı elementlerin fare beyninde EGFP'nin transkripsiyonunu yönlendirdiği ve in vivo olarak arttırıcı aktiviteyi gösterdiği gösterilmiştir.

Bu tahlilin sorun giderme ve optimizasyonu için birincil hedefler viral titre, enjeksiyon tekniği ve transdüksiyon zaman dilimini içerir. Farklı viral titreler, dönüştürülmüş hücrelerin yoğunluğu üzerinde güçlü bir etkiye sahip olabilir. Çoğu araştırma için daha yüksek bir transdüksiyon verimliliği tercih edilebilirken, optimal transdüksiyon seviyesi deneysel hedeflere büyük ölçüde bağlıdır. İntrakraniyal enjeksiyonlar, transdüktif hücrelerin yüksek yoğunluğunu sunar, ancak enfeksiyonun yayılması viral serotipe ve hayvanın yaşına bağlı olabilir52. Retro-orbital enjeksiyonlar, dönüştürülmüş hücrelerin beyin boyunca daha eşit dağılımını gösterebilir, ancak herhangi bir yüksek enfeksiyon alanı verme olasılığı daha düşüktür. Kuyruk damarı enjeksiyonları, beyne ek olarak diğer dokuları daha etkili bir şekilde dönüştürebilir, ancak muhtemelen beyindeki dönüştürülmüş hücrelerin daha düşük yoğunluklarını verecektir. Benzer şekilde, beyindeki virüs iletimi için çeşitli zaman dilimleri farklı amaçlara hizmet edebilir. Sağlam scAAV ekspresyonu, intrakraniyal enjeksiyondan yedi gün sonra beyinde ortaya çıkabilir, ancak 28 gün veya daha uzun süreler daha tipik olarak kullanılır ve güçlü ekspresyon verir. Arttırıcılar faaliyetlerinde geçici olarak spesifik olabileceğinden, çalışma tasarımını belirlerken test edilen arttırıcıların öngörülen aktivitesini dikkate almak önemlidir.

Bu yöntemlerle ilişkili, deneysel hedeflere bağlı olarak diğer seçenekleri daha uygun bir seçim haline getirebilecek bazı sınırlamalar vardır. AAV'ler genoma düşük entegrasyon sergilediğinden, dokular olgunlaştıklarında en etkili şekilde dönüştürülür ve yüksek miktarda postmitotik hücre yoğunluğu vardır, çünkü büyük miktarda devam eden hücre bölünmesi transgen eksprese eden hücrelerin yoğunluğunu azaltacaktır. Bir transgenin hala büyümekte olan dokular gibi daha az olgun bir modele viral olarak verilmesi için, lentivirüsler genoma entegre oldukları ve dönüştürülmüş çoğalan bir hücrenin tüm yavru hücreleri tarafından miras alınacakları için daha uygun bir seçim olabilir. Ek olarak, burada açıklanan muhabir tahlili, cis-düzenleyici faaliyetin işlevsel çalışması için yaygın olarak kullanılan bir teknik olsa da, düzenleyici unsurun kendi doğal bağlamında nasıl davrandığına dair tam bir resim sağlayamaz. Örneğin, bu tahlil, genomdaki düzenleyici unsur tarafından hangi genlerin hedeflenebileceği hakkında bilgi sağlamaz. Bununla birlikte, eğer arttırıcının hedef genleri biliniyorsa, bu bilgi, bu tahlilde ekspresyon gösteren hücre tiplerinin, arttırıcının hedeflenen genlerini ifade ettiği bilinenlerle aynı olup olmadığını belirlemek için kullanılabilir; bu, sonuçların yorumlanmasına yüksek biyolojik geçerlilik kazandırır. Tahlil ayrıca, çevredeki genomik dizinin veya hayvanın normal biyolojik ve davranışsal aktivitesinin, test edilen düzenleyici elementin aktivitesi üzerindeki etkilerini tamamen özetlemeyebilir. Son olarak, bu protokol, STARR-seq muhabir tahlil tasarımını, aday geliştirici elemanının, geleneksel muhabir tahlili klonlama oryantasyonunda olduğu gibi, promotörün yukarı akışının aksine, ORF'deki muhabir geninin aşağı yönünde klonlandığı tasarımı açıklar. Muhabir genin ORF'sine uzun değişken dizilerin dahil edilmesi, RNA bağlayıcı protein motifleri, alternatif ekleme bölgeleri veya değişken GC içeriği 36,53 gibi faktörler nedeniyle RNA stabilitesinin azalmasına neden olabilir ve STARR-seq verilerini analiz ederken dizi tabanlı önyargıları hesaba katmak için istatistiksel yöntemler geliştirilmiştir 54,55. Bu hususlara rağmen, STARR-seq MPRA'lar son yıllarda cis-düzenleyici unsurları56,57,58,59'u başarılı bir şekilde tanımlamak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Burada açıklanan yöntemler, geleneksel MPRA oryantasyonu ile kullanım için kolayca uyarlanabilir.

Arttırıcıların hücre tipi özgüllüğü, bu tahlili in vivo olarak ilgilenilen genlerin hücre tipine özgü ekspresyonunu yönlendirmede güçlü bir araç haline getirir. İstenilen bir genin hücre tipine özgü ekspresyonu için mevcut teknikler, koşullu ekspresyon yapılarının mevcudiyeti ile sınırlandırılabilir veya yeni transgenik fare çizgilerinin oluşturulmasını gerektirebilir. rAAV tabanlı bir arttırıcı güdümlü sistem kullanarak, ilgilenilen bir gen,13,14,15 ekspresyonunu yönlendirmek için doğrulanmış hücre tipine özgü arttırıcılar veya destekleyiciler kullanılarak mekansal olarak spesifik bir şekilde ifade edilebilir. Bu teknolojideki son gelişmeler, hücre tipine özgü arttırıcıların rAAV serotipleri ile ilgilenilen hücreler veya dokular için tropizmlerle birleştirilmesinin transgenik hayvan modellerinde olduğu gibi transgen ekspresyonunun benzer özgüllüğünü gösterebileceğini göstermiştir60. Bu, hayvan modellerinde transgen ekspresyonunun in vivo olarak sekans taraması ve spesifik indüksiyonu için ucuz, hızlı ve potansiyel olarak yüksek verimli bir yöntem sunar.

Bu teknoloji aynı zamanda terapötik potansiyele de sahiptir. Klinik çalışmalar, bir transgenin in vivo olarak rAAV tabanlı verilmesinin, yalnızca kusurlu bir kopyanın mevcut olduğu veya genin yeterli bir oranda transkribe edilmediği durumlarda bir genin sağlıklı kopyalarının ekspresyonunu indükleyebileceğini bulmuştur61,62,63. Bir tahrik arttırıcı elemanın seçimi, genelleştirilmiş teslimatı ancak hücre tipine özgü bir şekilde ekspresyon indüksiyonunu sağlama potansiyeline sahiptir. Son olarak, transgenin rAAV yoluyla verilmesi de önemli faydalar sağlar; AAV'ler, transgen dağıtımında sıklıkla kullanılan diğer virüslerden daha düşük immünojenisiteye sahiptir64, bu da bunu klinik kullanım için kullanılacak potansiyel olarak güvenli bir viral vektör haline getirir.

İn vivo rAAV tabanlı geliştirici-muhabir analizlerinin spesifik dağıtımı özelleştirilebilir ve bir dizi deneysel hedefe uyacak şekilde değiştirilebilir. AAV serotipleri veya hücre tipi veya mekansal zamansal özgüllüğe sahip arttırıcılar seçilerek farklı dokular ve hücreler hedeflenebilir. Bir ila binlerce geliştirici-muhabir yapısı in vivo olarak teslim edilebilir ve aktivite, bu yaklaşımı kullanan yeni bir dizi çalışmada gösterildiği gibi, bir dizi görüntüleme ve sıralama tabanlı okuma kullanılarak analiz edilebilir 15,16,65,66,67,68 . Yapı tasarımı ve sunumu için seçenekler yelpazesi, bu tekniğin hem çeviri hem de temel bilimde çeşitli kullanımlar için değiştirilmesini sağlar ve bu da onu genomik ve sinirbilim araştırmaları için güçlü ve yeni bir araç haline getirir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar rakip finansal çıkarlar olmadığını beyan ederler.

Acknowledgments

UC Davis DNA Technologies Core'da dizileme yapıldı. UC Davis'teki Lin Tian laboratuvarına, rAAV ambalajı konusunda eğitim aldıkları ve bize AAV yardımcısı ve rep / cap plazmidlerini cömertçe hediye ettikleri için teşekkür ederiz. Bu çalışma NIH/NIGMS R35GM119831 tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x Citrate Buffer Sigma-Aldrich C9999-1000ML
5'-gatcactctcggcatggac-3' Integrated DNA Technologies N/A: Custom designed Forward primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments.
5'-gatggctggcaactagaagg-3' Integrated DNA Technologies N/A: Custom designed Reverse primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments.
Agarose VWR VWRVN605-500G
Aspirator tube assemblies Sigma-Aldrich A5177-5EA for mouth-driven delivery of rAAV
Bacteriological petri dishes Thermo Fisher Scientific 08-757-100D
Carbenicillin Sigma-Aldrich C1389-5G
Chicken IgY anti-GFP Thermo Fisher Scientific A10262
Confocal microscope Zeiss LSM900 The images were taken on the LSM800 model, but Zeiss launched the LSM900 model in recent years to replace LSM800.
Conical centrifuge tubes 15 mL Thermo Fisher Scientific 12-565-269
Cryomolds Thermo Fisher Scientific NC9806558 These molds are suitable for P28 mouse brain. Other sizes may be more suitable for larger or smaller tissues.
DAPI Sigma-Aldrich D9542-10MG
Dissecting scissors, 4.5" VWR 82027-578
Donkey anti-chicken AlexaFlour-488 Jackson ImmunoResearch 703-545-155
Dulbecco's PBS 1x Thermo Fisher Scientific MT21031CV
Eppendorf Microcentrifuge tubes 2.0 mL Thermo Fisher Scientific 22431048
Falcon round-bottom tubes 14 mL Thermo Fisher Scientific 352059
Fast Green dye Grainger F0099-1G
Fine detail paint brush set Artbrush Tower B014GWCLFO
Gibson Assembly Master Mix NEB E2611S
Glass capillary tubes Drummond Scientific Company 5-000-2005
HiSpeed Plasmid Maxi Kit QIAGEN 12663 Commercial plasmid maxi prep kit
HyClone HyPure Molecular Biology Grade Water VWR SH30538.03
IV butterfly infusion set with 12" tubing and 25G needle Thermo Fisher Scientific 26708
Kimwipes Kimberly Clark 34155 Lint-free wipe
LB Agar Thermo Fisher Scientific BP1425-500 LB agar pre-mix for selective media
McPherson Vannas iris scissor Integra LifeSciences 360-215
Mineral oil Sigma Life Science 69794-500ML
NEB Stable Competent E. coli NEB C3040I
NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Takara 740609.5 Kit for enzymatic reaction cleanup and gel extraction
OCT medium VWR 25608-930
Orbital shaker Cole Parmer 60-100
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127-500G
PCR strip tubes 0.2 mL VWR 490003-692
Peristaltic pump Gilson F155005
Phosphate buffered saline (PBS) 10x Thermo Fisher Scientific 70011044
Phusion Hot Start II High Fidelity DNA Polymerase Thermo Fisher Scientific F549L
Powdered milk Sunny Select
ProLong Gold Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific P36934
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28106
rCutSmart Buffer NEB B6004S Buffer for restriction digest with PacI, AscI, and XmaI
Restriction enzyme: AscI NEB R0558L
Restriction enzyme: PacI NEB R0547L
Restriction enzyme: XmaI NEB R0180L
SOC outgrowth medium NEB B0920S Recovery medium after transformation
Sucrose (RNase/DNase free) Millipore Sigma 033522.5KG
TAE buffer Apex 20-194
Transfer tubing Gilson F1179941 For peristaltic pump
Triton X100 Sigma-Aldrich X100-100ML
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System Thermo Fisher Scientific A1460 Plasmid mini prep kit

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pennacchio, L. A., et al. In vivo enhancer analysis of human conserved non-coding sequences. Nature. 444 (7118), 499-502 (2006).
  2. Nord, A. S., et al. Rapid and pervasive changes in genome-wide enhancer usage during mammalian development. Cell. 155 (7), 1521-1531 (2013).
  3. Finucane, H. K., et al. Partitioning heritability by functional annotation using genome-wide association summary statistics. Nature Genetics. 47 (11), 1228-1235 (2015).
  4. Nord, A. S., West, A. E. Neurobiological functions of transcriptional enhancers. Nature Neuroscience. 23 (1), 5-14 (2020).
  5. Hallikas, O., et al. Genome-wide prediction of mammalian enhancers based on analysis of transcription-factor binding affinity. Cell. 124 (1), 47-59 (2006).
  6. Su, J., Teichmann, S. A., Down, T. A. Assessing computational methods of cis-regulatory module prediction. PLoS Computational Biology. 6 (12), 1001020 (2010).
  7. Visel, A., et al. ChIP-seq accurately predicts tissue-specific activity of enhancers. Nature. 457 (7231), 854-858 (2009).
  8. Kvon, E. Z., et al. Genome-scale functional characterization of Drosophila developmental enhancers in vivo. Nature. 512 (7512), 91-95 (2014).
  9. Yáñez-Cuna, J. O., et al. Dissection of thousands of cell type-specific enhancers identifies dinucleotide repeat motifs as general enhancer features. Genome Research. 24 (7), 1147-1156 (2014).
  10. Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection. Molecular Therapy. 16 (6), 1073-1080 (2008).
  11. Gisselbrecht, S. S., et al. Highly parallel assays of tissue-specific enhancers in whole Drosophila embryos. Nature Methods. 10 (8), 774-780 (2013).
  12. Lambert, J. T., et al. Parallel functional testing identifies enhancers active in early postnatal mouse brain. eLife. 10, 69479 (2021).
  13. Chen, Y. -J. J., et al. Use of "MGE Enhancers" for labeling and selection of embryonic stem cell-derived medial ganglionic eminence (MGE) progenitors and neurons. PLoS ONE. 8, 61956 (2013).
  14. Graybuck, L. T., et al. Enhancer viruses and a transgenic platform for combinatorial cell subclass-specific labeling. bioRxiv. , 525014 (2019).
  15. Dimidschstein, J., et al. A viral strategy for targeting and manipulating interneurons across vertebrate species. Nature Neuroscience. 19 (12), 1743-1749 (2016).
  16. Rubin, A. N., et al. Regulatory elements inserted into AAVs confer preferential activity in cortical interneurons. eNeuro. 7, (2020).
  17. Hindorff, L. A., et al. Potential etiologic and functional implications of genome-wide association loci for human diseases and traits. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (23), 9362-9367 (2009).
  18. Maurano, M. T., et al. Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA. Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).
  19. Ripke, S., et al. Biological insights from 108 schizophrenia-associated genetic loci. Nature. 511 (7510), 421-427 (2014).
  20. Nott, A., et al. Brain cell type-specific enhancer-promoter interactome maps and disease-risk association. Science. 366 (6469), 1134-1139 (2019).
  21. Lagunas, T., et al. A Cre-dependent massively parallel reporter assay allows for cell-type specific assessment of the functional effects of genetic variants in vivo. bioRxiv. , (2021).
  22. DeBoer, E., Antoniou, M., Mignotte, V., Wall, L., Grosveld, F. The human beta-globin promoter; nuclear protein factors and erythroid specific induction of transcription. The EMBO journal. 7 (13), 4203-4212 (1988).
  23. Kothary, R., et al. Inducible expression of an hsp68-lacZ hybrid gene in transgenic mice. Development. 105 (4), 707-714 (1989).
  24. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108 (2), 193-199 (1991).
  25. Kim, D. W., Uetsuki, T., Kaziro, Y., Yamaguchi, N., Sugano, S. Use of the human elongation factor 1α promoter as a versatile and efficient expression system. Gene. 91 (2), 217-223 (1990).
  26. Banerji, J., Rusconi, S., Schaffner, W. Expression of a β-globin gene is enhanced by remote SV40 DNA sequences. Cell. 27 (2), 299-308 (1981).
  27. Patwardhan, R. P., et al. High-resolution analysis of DNA regulatory elements by synthetic saturation mutagenesis. Nature Biotechnology. 27 (12), 1173-1175 (2009).
  28. Arnold, C. D., et al. Genome-wide quantitative enhancer activity maps identified by STARR-seq. Science. 339 (6123), 1074-1077 (2013).
  29. Melnikov, A., et al. Systematic dissection and optimization of inducible enhancers in human cells using a massively parallel reporter assay. Nature Biotechnology. 30, 271-277 (2012).
  30. Kim, J. -Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51863 (2014).
  31. Liu, D., Zhu, M., Zhang, Y., Diao, Y. Crossing the blood-brain barrier with AAV vectors. Metabolic Brain Disease. 36 (1), 45-52 (2021).
  32. Prabhakar, S., Lule, S., Da Hora, C. C., Breakefield, X. O., Cheah, P. S. AAV9 transduction mediated by systemic delivery of vector via retro-orbital injection in newborn, neonatal and juvenile mice. Experimental Animals. , (2021).
  33. Gruntman, A. M., Su, L., Flotte, T. R. Retro-orbital venous sinus delivery of rAAV9 mediates high-level transduction of brain and retina compared with temporal vein delivery in neonatal mouse pups. Human Gene Therapy. 28 (3), 228-230 (2017).
  34. Inoue, F., Ahituv, N. Decoding enhancers using massively parallel reporter assays. Genomics. 106 (3), 159-164 (2015).
  35. Gordon, M. G., et al. lentiMPRA and MPRAflow for high-throughput functional characterization of gene regulatory elements. Nature Protocols. 15 (8), 2387-2412 (2020).
  36. Klein, J. C., et al. A systematic evaluation of the design and context dependencies of massively parallel reporter assays. Nature Methods. 17 (11), 1083-1091 (2020).
  37. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  38. Song, L., Crawford, G. E. DNase-seq: A high-resolution technique for mapping active gene regulatory elements across the genome from mammalian cells. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (2), 5384 (2010).
  39. King, D. M., et al. Synthetic and genomic regulatory elements reveal aspects of Cis-regulatory grammar in mouse embryonic stem cells. eLife. 9, 41279 (2020).
  40. Amit, R., Garcia, H. G., Phillips, R., Fraser, S. E. Building enhancers from the ground up: a synthetic biology approach. Cell. 146, 105-118 (2011).
  41. Fan, M., Tsai, J., Chen, B., Fan, K., LaBaer, J. A central repository for published plasmids. Science. 307, 1877 (2005).
  42. Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. Journal of Molecular Biology. 94, 441-448 (1975).
  43. Broussard, G. J., Unger, E. K., Liang, R., McGrew, B. P., Tian, L. L. glutamate with genetically encoded fluorescent sensors. Biochemical Approaches for Glutamatergic Neurotransmission. Parrot, S., Denoroy, L. 130, Springer. New York. 117-153 (2018).
  44. Chen, Y. H., Keiser, M. S., Davidson, B. L. Adeno-associated virus production, purification, and titering. Current Protocols in Mouse Biology. 8, 56 (2018).
  45. He, C. X., Arroyo, E. D., Cantu, D. A., Goel, A., Portera-Cailliau, C. A Versatile Method for Viral Transfection of Calcium Indicators in the Neonatal Mouse Brain. Frontiers in Neural Circuits. 12, 56 (2018).
  46. Chen, S. -Y., Kuo, H. -Y., Liu, F. -C. Stereotaxic surgery for genetic manipulation in striatal cells of neonatal mouse brains. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (137), e57270 (2018).
  47. Brenowitz, S. D., Regehr, W. G. Presynaptic imaging of projection fibers by in vivo injection of dextran-conjugated calcium indicators. Cold Spring Harbor Protocols. 2012, (2012).
  48. Bosch, D., Asede, D., Ehrlich, I. Ex vivo optogenetic dissection of fear circuits in brain slices. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (110), e53628 (2016).
  49. Green, E. K., et al. The bipolar disorder risk allele at CACNA1C also confers risk of recurrent major depression and of schizophrenia. Molecular Psychiatry. 15 (10), 1016-1022 (2010).
  50. Takahashi, S., Glatt, S. J., Uchiyama, M., Faraone, S. V., Tsuang, M. T. Meta-analysis of data from the Psychiatric Genomics Consortium and additional samples supports association of CACNA1C with risk for schizophrenia. Schizophrenia Research. 168 (1-2), 429-433 (2015).
  51. McCarty, D. M. Self-complementary AAV vectors; advances and applications. Molecular Therapy. 16 (10), 1648-1656 (2008).
  52. Haery, L., et al. Adeno-associated virus technologies and methods for targeted neuronal manipulation. Frontiers in Neuroanatomy. 13, 93 (2019).
  53. Rabani, M., Pieper, L., Chew, G. -L., Schier, A. F. A massively parallel reporter assay of 3′ UTR sequences identifies in vivo rules for mrna degradation. Molecular Cell. 68, 1083-1094 (2017).
  54. Kim, Y. -S., et al. Correcting signal biases and detecting regulatory elements in STARR-seq data. Genome Research. 31, 877-889 (2021).
  55. Lee, D., et al. STARRPeaker: uniform processing and accurate identification of STARR-seq active regions. Genome Biology. 21, 298 (2020).
  56. Doni Jayavelu, N., Jajodia, A., Mishra, A., Hawkins, R. D. Candidate silencer elements for the human and mouse genomes. Nature Communications. 11, 1061 (2020).
  57. Singh, G., et al. A flexible repertoire of transcription factor binding sites and a diversity threshold determines enhancer activity in embryonic stem cells. Genome Research. 31, 564-575 (2021).
  58. Wang, X., et al. High-resolution genome-wide functional dissection of transcriptional regulatory regions and nucleotides in human. Nature Communications. 9, 5380 (2018).
  59. Peng, T., et al. STARR-seq identifies active, chromatin-masked, and dormant enhancers in pluripotent mouse embryonic stem cells. Genome Biology. 21, 243 (2020).
  60. Nair, R. R., Blankvoort, S., Lagartos, M. J., Kentros, C. Enhancer-driven gene expression (EDGE) enables the generation of viral vectors specific to neuronal subtypes. iScience. 23, 100888 (2020).
  61. Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65 -mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. The Lancet. 390, 849-860 (2017).
  62. Gaudet, D., et al. Efficacy and long-term safety of alipogene tiparvovec (AAV1-LPLS447X) gene therapy for lipoprotein lipase deficiency: an open-label trial. Gene Therapy. 20, 361-369 (2013).
  63. Nguyen, G. N., et al. A long-term study of AAV gene therapy in dogs with hemophilia A identifies clonal expansions of transduced liver cells. Nature Biotechnology. 39, 47-55 (2021).
  64. Nayak, S., Herzog, R. W. Progress and prospects: Immune responses to viral vectors. Gene Therapy. 17 (3), 295-304 (2010).
  65. Visel, A., et al. A high-resolution enhancer atlas of the developing telencephalon. Cell. 152 (4), 895-908 (2013).
  66. Shen, S. Q., et al. Massively parallel cis-regulatory analysis in the mammalian central nervous system. Genome Research. 26 (2), 238-255 (2016).
  67. Shen, S. Q., et al. A candidate causal variant underlying both higher intelligence and increased risk of bipolar disorder. bioRxiv. , (2019).
  68. Hrvatin, S., et al. A scalable platform for the development of cell-type-specific viral drivers. eLife. 8, 48089 (2019).

Tags

Nörobilim Sayı 181
Geliştirici Tabanlı İfade Yapılarının AAV Dağıtımı <em>In Vivo</em> in Mouse Brain
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Warren, T. L., Lambert, J. T., Nord, … More

Warren, T. L., Lambert, J. T., Nord, A. S. AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain. J. Vis. Exp. (181), e62650, doi:10.3791/62650 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter