Summary
该协议详细介绍了从全血，黄褐色涂层或白细胞分离膜中性粒细胞的方法，从而实现良好的产量，高纯度和最小的细胞活化。我们利用梯度纯化，红细胞（RBC）沉降和红细胞裂解来获得高质量/纯度的中性粒细胞制剂。
Abstract
中性粒细胞（PMN）是人体循环中最丰富的白细胞，占血液白细胞总量的40%至70%。它们是通过血管快速外渗在炎症部位招募的第一批细胞。在那里，嗜中性粒细胞执行一系列功能，以杀死入侵的病原体并介导免疫信号传导。从人体血液中新鲜纯化的中性粒细胞是研究的首选模型，因为没有细胞系完全复制PMN功能和生物学。然而，嗜中性粒细胞是短寿命的末端分化细胞，并且非常容易受到物理（温度，离心速度）和生物（内毒素，化学和细胞因子）刺激的激活。因此，遵循标准化，可靠和快速的方法获得纯和非活化的细胞至关重要。该方案提出了一种更新的方案，结合了密度梯度离心，红细胞（RBC）沉降和红细胞裂解，以获得高PMN纯度并最大限度地减少细胞活化。此外，还讨论了评估中性粒细胞分离质量、活力和纯度的方法。
Introduction
先天免疫系统由许多细胞类型组成，这些细胞类型维持免疫稳态和病原体清除以及许多其他生理功能。中性粒细胞是人体循环中最大的白细胞库1。大多数成熟的嗜中性粒细胞储存在骨髓中，骨髓是新中性粒细胞的产生部位，也称为造粒。在骨髓中，粒细胞祖细胞退出细胞周期并终末分化，获得其特征性的分段细胞核和颗粒2。在炎症条件下，作为对趋化因子、细胞因子以及损伤相关和病原体相关分子模式的反应，嗜中性粒细胞从血液中和骨髓中动员出来以执行多种功能。这些包括细胞因子分泌，病原体的直接吞噬作用，活性氧的释放，抗菌蛋白的脱颗粒以及中性粒细胞细胞外陷阱的形成。
嗜中性粒细胞用来对抗感染的分子对微生物和宿主有毒。因此，寿命和老化/垂死嗜中性粒细胞的适当去除受到高度调节，并且它们在循环中的寿命有限（<48小时）3。由于这种短暂的生存期，人体平均每天产生1000亿个新的嗜中性粒细胞来维持人口稳态4。紧急造粒术可以进一步增加炎症和感染期间血液中嗜中性粒细胞的释放，包括成熟和未成熟5。中性粒细胞在先天免疫反应中的重要性由获得性或先天性中性粒细胞减少症患者强调，他们容易受到细菌和真菌感染6。
在研究中性粒细胞生物学及其在免疫反应中的作用时，由于其性质，包括其生存期短和细胞毒性含量，会出现许多挑战。中性粒细胞样细胞系通常与人早幼粒细胞白血病HL-60细胞和PLB-985细胞7、8区分开来。虽然它们可以显示中性粒细胞样形态并执行趋化性，但这些细胞系不能完全概括中性粒细胞的生物学。使用这些细胞系的体外测定也无法概括体内实验。此外，这些细胞的分化需要诱导，并且在分化之前可能会受到基因操作的不利影响。
最近，已经开发出通过使用诱导启动子来调节HL-60细胞中基因表达后分化来规避这些问题的方法9。即使使用此类工具，也需要使用药物学方法验证目标的主要人类PMN。因此，必须获得从血液中分离出的纯中性粒细胞和灭活的嗜中性粒细胞，以验证细胞系和动物模型的发现。本文提出了一种修订后的PMN隔离协议，其中评估了当前方法的优缺点10。设计了一种组合，包括梯度离心以将PMN与其他免疫细胞分离，短葡聚糖基沉降以除去大部分红细胞，通过渗透压快速残留红细胞裂解，以及低速离心以除去血小板污染。
Protocol
注意：从波士顿儿童医院血库实验室获得的废弃白细胞过滤器的静脉血液中分离出人类嗜中性粒细胞。献血者无法识别，并且与活着的个人没有互动，也没有可识别的个人信息的知识。因此，根据HHS人类受试者法规（45 CFR第46部分），这项工作不被归类为人类受试者研究。波士顿儿童医院机构审查委员会（IRB）批准了该协议。
1. 对渐变进行分层
- 对白粉外套或全血包装和层流罩进行灭菌后，将血液分成50 mL管，每管中含有10 mL血液。
- 用5%胎牛血清（FBS）/Hank's平衡盐溶液（HBSS）将体积调至35毫升，以稀释血液以获得更清洁的梯度。
注意：当使用白细胞分离膜时，可以使用每个过滤器使用60 mL注射器和30 mL 5% FBS / HBSS冲洗细胞。使用新鲜抽取的全血时，无需稀释。 - 合上 50 mL 试管盖，倒置搅拌几次，并保持倒置，使底部没有红细胞。
- 在血液正下方加入10mL密度梯度培养基（见材料表）。确保培养基和血液不混合，界面清晰（图1A）。
注意：此步骤至关重要。确保密度梯度溶液在室温（RT）下并在每个梯度之前充分混合。密度梯度介质的第一毫升需要尽可能缓慢地仔细和稳定地分层。建议将电动移液器速度设置为低速。 - 将管子轻轻放入离心机中，不要干扰梯度，并在室温下以400×g旋转30分钟，确保禁用制动器。观察纺纱梯度如何分离成顶部血清/血浆层，外周血单核细胞（PBMC）的中间白环，浑浊的密度梯度培养基层以及由红细胞顶部的白色薄中性粒细胞带组成的底部沉淀（图1B）。
注意：离心后管的浑浊或不透明一侧可能表明细胞（嗜中性粒细胞）被激活，可能不适合使用。 - 首先将吸液器直接插入PBMC层，以除去PBMC。确保完全吸出它，而血清/血浆层随着环的去除而减少。刮擦用吸液器沉淀细胞的管子的一侧，以最大限度地去除PMBC。小心地除去PBMC环和嗜中性粒细胞/红细胞沉淀之间的混浊密度梯度培养基层。
注意：刮擦管侧面的沉淀细胞可显着提高分离的纯度。注意不要吸出沉淀，因为大多数嗜中性粒细胞直接位于红细胞的顶部。
2. 红细胞沉降
- 使用10 mL移液器，将中性粒细胞/红细胞沉淀转移到干净的管中。不要上下移液。将 5% 的 FBS/HBSS 加入到 25 mL 的最终体积中。倒置轻轻混合。
注意：在PBMC去除后进行红细胞沉淀可提高产量并降低活化率10。 - 直接加入25mL预热（37°C）3%葡聚糖/ 0.9%NaCl / H2O到含有稀释的嗜中性粒细胞/ RBC沉淀的管中，并通过倒置轻轻混合。将管子放在水平，不振动的表面上15分钟（图1C）。
注意：较长的沉淀时间可减少红细胞污染，但也会降低产量。此外，长时间的葡聚糖暴露可能导致中性粒细胞活化或细胞死亡11。 - 轻轻地将管子带回罩中（用于无菌隔离）。只需将移液器稍微浸入液体中，即可在液体表面之后向下收集顶层（约30 mL）。
注意：如果沉淀在培养基和红细胞之间产生尖锐的界面，则红细胞沉淀较小，或者如果需要更高的产量，则收集高达35 mL。 - 旋转管（400×g，10分钟，RT，使用低制动（3）），产生红色颗粒，没有颗粒漂浮在介质中。
3. 残留红细胞的裂解
- 轻轻吸出上清液而不破坏沉淀。
- 将25毫升无菌超纯水直接加入试管中，并通过倒置28秒轻轻混合以裂解红细胞。不要使用移液器重悬沉沉淀。
注意：不要超过30秒，因为长期的低渗条件可以激活并导致中性粒细胞死亡12。 - 立即将25 mL无菌1.8%NaCl / H2O加入管中，并通过倒置轻轻混合，使溶液恢复到等渗条件。
注意：溶液应为红色，但无浑浊。 - 在200×g下旋转3-5分钟，低制动（3级），以尽量减少红细胞和血小板与嗜中性粒细胞一起沉淀（图1D和图2）13，14。
注意：沉淀物应为白色，顶部有最小的红细胞层，可以在吸入上清液时轻轻除去。 - 通过将培养基（10% FBS / RPMI1640）直接移液在沉淀上重悬中性粒细胞，但不要上下移液。从一侧到另一侧水平摇摆管子，以最大限度地减少细胞活化。
注意：细胞应保持在~2×106 个细胞/ mL的浓度，因为较高的密度将导致细胞活化/死亡增加15。出于同样的原因，细胞沉淀应尽快重悬。 - 如果观察到细胞聚集或聚集，则使用70μm网格过滤细胞悬浮液以丢弃聚集的嗜中性粒细胞。
4. 确定中性粒细胞分离质量
- 用中性粒细胞特异性标记物（CD66b，CD11b），嗜酸性粒细胞（CD193）（图3）和激活标记物（如CD62L）染色细胞（图4）。通过流式细胞术获取20，000个细胞。使用 图3和图 4中提出的门控策略分析细胞纯度和活 化。
注意：可以使用3%乙酸 - 亚甲蓝溶液评估中性粒细胞制剂的质量，以可视化中性粒细胞独特的叶状细胞核。 - 使用膜联蛋白V/碘化丙啶（PI）测定细胞活力（图5）。
注意：台盼蓝染色可用于评估细胞活力。
Representative Results
当使用密度梯度纯化嗜中性粒细胞时，血液和密度梯度培养基之间的界面尽可能锋利，并且在离心后保持明显的层分离至关重要（步骤1.4）。红细胞裂解后，缓冲液应为红色且不浑浊（步骤3.3）。如果制剂浑浊，可能需要第二轮裂解（步骤3），尽管这可能会影响中性粒细胞的存活率（图1）。裂解后，当纯度优先时，建议使用低速离心（200×g），因为它可以大大减少血小板污染。 然而，高速离心（400×g）以牺牲纯度为代价提高了产量（步骤3.4，图2）。中性粒细胞分离后，荧光激活的细胞分选可用于评估分离纯度（步骤4.1），并且应选择显微镜检查。虽然仅细胞的FSC/SSC分布提供了细胞分离质量的估计（图3A），但使用特定的细胞标志物应该是首选。在这种情况下，最常见的污染细胞群用特异性抗体和CD66b染色，特异性地在粒细胞上表达。CD45染色用于区分白细胞（CD45 +）和红细胞和血小板（CD45-）。
其他污染物包括淋巴细胞（CD3 +或CD19 +，图3F），单核细胞（CD14 +，图3D）和嗜酸性粒细胞（CD193 +，图3G）。CD11b是在骨髓谱系上表达的整合素;嗜中性粒细胞和单核细胞是CD11b +，而淋巴细胞是CD11b-（图3C）。由于中性粒细胞活化会影响下游实验，因此应评估CD62L的表达;中性粒细胞一旦被激活就会变成CD62L-（步骤4.1）。肽fMLP可用作CD62L脱落的阳性对照（图4）。在进行测定之前评估嗜中性粒细胞的健康状况也很重要;中性粒细胞的半衰期相对较短，活化可以进一步缩短它（步骤4.2）。标准的膜联蛋白V和PI染色可以在指定时间提供有关嗜中性粒细胞培养物的活/死状态的信息（图5）。
图1：基于密度梯度介质的粒细胞分离（A）离心前和离心后（B）。注意血液和密度梯度介质层之间的尖锐界面。（C） 沉淀物在B重悬（1：1）在5%FBS / HBSS和3%葡聚糖-0.9%NaCl中沉淀。（D）PMN沉淀在（C）的上清液中与H2O裂解后的残留红细胞。PMN = 嗜中性粒细胞;红细胞=红细胞;FBS = 胎牛血清;HBSS = 汉克平衡盐溶液。请点击此处查看此图的放大版本。
图2：红细胞裂解后以较低速度纺丝，血小板污染减少。用H2O裂解红细胞后，细胞以200×g（A）或400×g（B）旋转。 对中性粒细胞进行染色，并进行流式细胞术分析，如图3所示，加入抗CD41标记血小板。缩写： 红细胞 = 红细胞;CD41 = 分化簇 41;SSC-A = 侧散射面积。请点击此处查看此图的放大版本。
图3：从黄褐色外套中分离出的嗜中性粒细胞的评估。按照标准方案，用抗CD66b，抗CD11b，抗CD14和抗CD193染色分离的中性粒细胞。单细胞（B）从总细胞（A）中门控。（C）CD11b+细胞从单个细胞中门控。（D）点图显示中性粒细胞（CD66b +，CD14低/-）和非常低的单核细胞污染（CD66b-，CD14+，Q1）。（E）CD66b-和CD66b+细胞被门禁。 （F）CD66b-细胞淋巴细胞标志物（CD3，CD19）阳性。（G）CD11b和CD193在CD66b+细胞中的表达，显示出不同的中性粒细胞（CD66b+，CD11b+，CD193-）和嗜酸性粒细胞（CD66b+，CD11b-，CD193+）群体。在这里显示的代表性结果中，嗜中性粒细胞纯度为~93%，淋巴细胞污染约为3.7%，嗜酸性粒细胞污染约为3.7%。（H）纯化后中性粒细胞纯度的定量。数据来自5项单独的试验，并以SD±平均值表示。SSC-A = SSC-A = 侧散射面积;FSC-A = 前向散射面积。请点击此处查看此图的放大版本。
（A -B）对照（A）或fMLP刺激的嗜中性粒细胞（B）（1mMfMLP在37°C下15分钟）用中性粒细胞标志物和CD62L染色。（C）在fMLP处理的细胞中CD62L的荧光平均强度降低，表明CD62L脱落和中性粒细胞活化。缩写： CD26L = L-选择素;fMLP = N-甲酰基甲硫酰基-亮氨酸-苯丙氨酸;SSC-A = SSC-A = 侧散射面积;FSC-A = 前向散射面积;PE = 藻红素。请点击此处查看此图的放大版本。
图5：通过密度梯度或中性粒细胞分离试剂盒纯化的嗜中性粒细胞的自发死亡。 中性粒细胞用密度梯度（A 和 B）或商业微珠（C 和 D）纯化，并在RPMI-10%FCS中培养0小时（A 和 C）或24小时（B 和 D）。按照标准方案在各自的时间点使用膜联蛋白V和PI对细胞进行染色。（E）纯化中性粒细胞自发死亡的定量。n=5，均值±SD.缩写：SSC-A = SSC-A = 侧散射面积;FSC-A = 前向散射面积;PI = 碘化丙啶;食品接触物质=胎儿小牛血清;FITC = 荧光素异硫氰酸酯;AV5 = 膜联蛋白 V. 请单击此处查看此图的放大版本。
Discussion
由于中性粒细胞的寿命短，末端分化状态和溶解含量，研究这些细胞一直是一个挑战。除了利用小鼠模型或来自患者队列的细胞外，细胞系是帮助研究嗜中性粒细胞生物学的有用工具16。然而，中性粒细胞样细胞系不能完全重申中性粒细胞生物学的所有方面，这为研究这些细胞增加了额外的困难。最常用的体外模型是HL-60细胞系，可以通过用二甲基亚砜或视黄酸17，18处理来分化成中性粒细胞样细胞。虽然这些细胞在研究迁移和呼吸爆发方面很有用，但它们不适合研究嗜中性粒细胞的杀菌活性。存在其他细胞系（PLB-98，NB4），它们也与其限制集19相关。
用小鼠疾病模型和细胞系进行的原发性人类嗜中性粒细胞观察来验证至关重要。中性粒细胞不能有效地冷冻保存，因此通常从从供体获得的全血或浅黄色外套中新鲜分离出来并立即处理。一旦分离，细胞开始经历一种复杂的自发死亡形式，由氧化，细胞质半胱天冬酶和中性粒细胞颗粒中发现的蛋白酶20，21调节。不正确的分离方法或技术可导致嗜中性粒细胞的活化，只会加速细胞死亡。必须有一种可靠和一致的方法，从供体获得纯净和高质量的嗜中性粒细胞。
已经发表了许多关于人类中性粒细胞分离的方法10，22。它们主要分为两类，有一些共同的战略。第一类是基于抗体的，通过阳性或阴性选择。阳性选择将直接标记嗜中性粒细胞，因此提供高纯度的细胞群，尽管它也会导致快速细胞活化，细胞死亡以及嗜中性粒细胞23的不需要标记。阴性选择，尽管使细胞未标记并给出非常纯净的群体，但加速了中性粒细胞死亡，尽管确切的机制尚不清楚（图5）。基因或蛋白质表达在阳性或阴性选择后是否也改变需要进一步研究。此外，由于消耗其他类型的细胞所需的抗体量，这些方法不能输出大量的嗜中性粒细胞。然而，基于抗体的测定仍然可以用于短期培养和较小规模的实验，并且是需要非常高细胞纯度的实验的首选方法，例如基因和蛋白质表达研究。
第二种类型的隔离方法是基于梯度和密度的。它通常涉及Percoll，Ficoll-Paque或其他多糖/聚乙烯吡咯烷酮组分，并利用离心力根据细胞密度分离不同类型的血细胞。这些方法通常与葡聚糖沉淀红细胞相辅相成。这些方法可以处理更大规模的起始材料，也可以实现高纯度。基于密度的分离的一个警告是将其他远不那么丰富的粒细胞（主要是嗜酸性粒细胞）与嗜中性粒细胞分离效率低下，因此，这是所提出的方案的主要局限性，因为即使存在小细胞污染也会影响中性粒细胞反应24。
这里介绍的是一种基于梯度隔离的总结方法，对先前的方法10、22进行细化。我们利用目前对中性粒细胞特异性的低估来可靠地分离具有有限残留血小板和红细胞的纯人嗜中性粒细胞，从而防止中性粒细胞活化和加速死亡。最关键的步骤是梯度的分层，通过在血液下方添加密度梯度介质以获得尖锐的界面，可以更有效地获得梯度。快速检查PBMC环和离心后的梯度可以揭示可能的污染，活化和低产量。当使用白细胞分离膜或白蛋白涂层时，稀释血液很重要，因为过多的细胞密度会导致细胞聚集，导致杂质和细胞活化。
该方案应在2小时内完成以确保细胞新鲜度，并且涉及密度梯度培养基，葡聚糖和裂解的步骤应立即完成，因为暴露于这些溶液可以改变嗜中性粒细胞。使用该协议，嗜中性粒细胞的预期产率至少为约1000万/ 10mL全血和至少约6000万/ 10 mL的黄褐色外套。分离质量的评估应如下：活化的中性粒细胞应小于10%，淋巴细胞污染应低于5%，嗜酸性粒细胞最小（同侧散射但前向散射群体较低），细胞活力应大于90%。较低的纯度可能是由于密度梯度培养基的分层或储存不当或由于起始血液产品的质量和新鲜度造成的。
Disclosures
作者声明，这项研究是在没有任何利益冲突的情况下进行的。
Acknowledgments
该项目由P01HL095489支持。A.Y.H 由 T32HL066987 支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3% Acetic Acid with Methylene Blue | Stemcell technologies | #07060 | |
| Attune NxT | invitrogen | A24858 | FACS analyzer |
| Cd11b-PE | biolegend | 301305 | |
| CD14-BV421 | biolegend | 367144 | |
| CD193-BV605 | biolegend | 310716 | |
| CD19-PerCP | biolegend | 302228 | |
| CD3-PerCP | biolegend | 300326 | |
| CD41-APC | biolegend | 303710 | |
| Cd45-APC | biolegend | 103111 | |
| CD62L-PE | biolegend | 304802 | |
| CD66b-FITC | biolegend | 305103 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | 22625101 | Centrifuge |
| Dextran | Fisher | BP1580 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | R&D systems | S11150H | complement inactivation of FBS is recommended |
| FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I | BD | 556547 | |
| Hanks balanced salt solution (-CaCl2), (-MgCl2) (-MgSO4) | Gibco | 14175-095 | HBSS without Ca2+/Mg2+ is advised as they have been shown to lead to neutrohpil activation |
| Lymphoprep | Stemcell technologies | #07801 | density gradient medium |
| MACSxpress Whole Blood Neutrophil Isolation Kit, human | Miltenyi | 130-104-434 | |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875093 | |
| Sodium chloride | sigma | 71376 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermofisher | 15250061 | |
| ultrapure water | KD medical | RGF-3410 |
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