Summary
Detta protokoll beskriver en metod för isolering av neutrofiler från helblod, buffy coats eller leukapheresis membran, uppnå god avkastning, hög renhet och minimal cellaktivering. Vi använder gradientrening, röda blodkroppar (RBC) sedimentering och RBC lys för att erhålla en högkvalitativ / renhet neutrophil beredning.
Abstract
Neutrofiler (PMN) är de mest rikliga leukocyterna i mänsklig cirkulation, från 40 till 70% av de totala blodleukocyterna. De är de första cellerna som rekryteras på inflammationsplatsen via snabb extravasation genom kärl. Där utför neutrofiler en rad funktioner för att döda invaderande patogener och förmedla immunsignalering. Nyrenade neutrofiler från humant blod är den modell som valts för studier, eftersom ingen cellinje helt replikerar PMN-funktioner och biologi. Neutrofiler är dock kortlivade, terminalt differentierade celler och är mycket mottagliga för aktivering som svar på fysiska (temperatur, centrifugeringshastighet) och biologiska (endotoxin, kemo- och cytokiner) stimuli. Därför är det viktigt att följa en standardiserad, pålitlig och snabb metod för att få rena och icke-aktiverade celler. Detta protokoll presenterar ett uppdaterat protokoll som kombinerar densitet gradient centrifugering, röda blodkroppar (RBC) sedimentering och RBC lys för att erhålla hög PMN renhet och minimera cell aktivering. Dessutom diskuteras metoder för att bedöma neutrophil isolering kvalitet, livskraft och renhet också.
Introduction
Det medfödda immunsystemet består av många celltyper som upprätthåller immunhomeostas och patogenfrigång tillsammans med många andra fysiologiska funktioner. Neutrofiler utgör den största poolen av vita blodkroppar i mänsklig cirkulation1. De flesta mogna neutrofiler lagras i benmärgen, som är platsen för generation för nya neutrofiler, även kallad granulopoiesis. I benmärgen lämnar granulocytprogenitorer cellcykeln och skiljer sig terminalt och förvärvar sina karakteristiska segmenterade kärnor och granulat2. Under inflammatoriska förhållanden, som svar på kemokiner, cytokiner och skadeassocierade och patogenassocierade molekylära mönster, mobiliseras neutrofiler från blodomloppet och ut ur benmärgen för att utföra ett brett spektrum av funktioner. Dessa inkluderar cytokinutsöndring, direkt fagocytos av patogenen, frisättning av reaktiva syrearter, avdämpning av antimikrobiella proteiner och bildandet av neutrophil extracellulära fällor.
De molekyler som används av neutrofiler för att bekämpa infektion är giftiga för mikroberna och värden. Således är livslängden och korrekt avlägsnande av åldrande / döende neutrofiler starkt reglerade, och de har en begränsad livslängd i omlopp (<48 h)3. På grund av denna korta överlevnad producerar människokroppen i genomsnitt 100 miljarder nya neutrofiler varje dag för att upprätthålla befolkningens homeostas4. Akut granulopoiesis kan ytterligare öka frisättningen av neutrofiler, både mogna och omogna, i blodet under inflammation och infektion5. Betydelsen av neutrofiler i det medfödda immunsvaret betonas av patienter med förvärvad eller medfödd neutropeni, som är mottagliga för bakterie- och svampinfektioner6.
Många utmaningar uppstår när man studerar neutrofilbiologi och deras roller i immunsvaret på grund av deras natur, inklusive deras korta överlevnad och cytotoxiska innehåll. Neutrofilliknande cellinjer har ofta differentierats från mänskliga promyelocytisk leukemi HL-60 celler och PLB-985 celler7,8. Även om de kan visa neutrofil-liknande morfologi och utföra chemotaxis, kan dessa cellinjer inte helt rekapitulera neutrofilers biologi. In vitro-analyser som använder dessa cellinjer kan inte heller rekapitulera in vivo-experiment. Dessutom måste differentieringen av dessa celler induceras och kan påverkas negativt av genmanipulation före differentiering.
Nyligen har metoder utvecklats för att kringgå dessa problem genom att använda inducible promotors för att modulera genuttryck post differentiering i HL-60 celler9. Även med sådana verktyg krävs primära mänskliga PN att validera mål med hjälp av farmakologiska metoder. Således är det absolut nödvändigt att erhålla rena och inaktiverade neutrofiler isolerade från blod för att validera resultaten av cellinje- och djurmodeller. Detta dokument presenterar ett reviderat PMN isoleringsprotokoll där för- och nackdelarna med nuvarande metoder utvärderades10. En kombination utformades bestående av gradient centrifugering för att separera PMNs från andra immunceller, kort dextran-baserade sedimentering för att ta bort huvuddelen av RBC lys via osmotic tryck och låg hastighet centrifugering för att ta bort trombocyt förorening.
Protocol
OBS: Mänskliga neutrofiler isolerades från venöst blod från kasserade vita blodkroppar filter som erhållits från Blood Bank Lab på Boston Children's Hospital. Blodgivare var oidentifierbara, och det fanns ingen interaktion med levande individer eller kunskap om identifierbar personlig information. Därför klassificeras detta arbete inte som humanpersonsforskning enligt HHS human subjects regulations (45 CFR Part 46). Boston Children's Hospital Institutional Review Board (IRB) godkände protokollet.
1. Skikta övertoningen
- Efter sterilisering av buffy coat eller helblodsförpackning och laminär huva, dela blodet i 50 ml rör med 10 ml blod i varje rör.
- Ta upp volymen till 35 ml med 5% fetalt bovinserum (FBS)/Hanks balanserade saltlösning (HBSS) för att späda blodet för en renare lutning.
OBS: Vid användning av ett leukaferesmembran kan cellerna spolas ut med en 60 ml spruta och 30 ml 5% FBS/HBSS per filter. Utspädning är onödigt vid arbete med nydraget helblod. - Stäng 50 ml-rörlocket, blanda det flera gånger genom inversion och håll det upp och ner för att ha botten utan RBC.
- Tillsätt 10 ml densitetsgradientmedium (se materialregistret) direkt under blodet. Se till att mediet och blodet inte blandas och att gränssnittet är vasst (figur 1A).
OBS: Det här steget är avgörande. Se till att densitets gradientlösningen är vid rumstemperatur (RT) och väl blandad före varje lutning. Den första milliliter av densitetsgradientmediet måste noggrant och stadigt skiktas så långsamt som möjligt. Vi rekommenderar att den elektroniska pipetthastigheten är inställd på låg. - Placera försiktigt röret i en centrifug utan att störa lutningen och snurra vid 400 × g i 30 min vid RT, se till att bromsa. Observera hur den spunna gradienten separeras i ett övre serum/plasmaskikt, en mittvit ring av perifera blodmononukleära celler (PBBC), ett grumligt densitetsgradientmedellager och en bottenpellet bestående av ett vitt, tunt neutrofilband ovanpå RBC :erna (figur 1B).
OBS: En grumlig eller ogenomskinlig sida av röret efter centrifugering kan tyda på att cellerna (neutrofiler) är aktiverade och kanske inte är lämpliga att använda. - Ta först bort PBMC:erna genom att dyka upp sugpipetten direkt i PBMC-skiktet. Var noga med att aspirera det helt medan serum/plasmaskiktet minskar när ringen tas bort. Skrapa sidan av röret där celler pelleterade med sugpipetten för att maximera avlägsnandet av PMBC. Ta försiktigt bort det grumliga densitetsgradientens mellanlager mellan PBMC-ringen och neutrophil/RBC-pelleten.
OBS: Att skrapa de pelleterade cellerna på sidan av röret ökar isoleringens renhet avsevärt. Var försiktig så att du inte aspirerar pelleten, eftersom de flesta neutrofiler sitter direkt ovanpå RBC: erna.
2. Sedimentering av erytrocyter
- Överför neutrophil/RBC-pelleten med hjälp av en 10 ml-pipett till ett rent rör. Pipettera inte upp och ner. Tillsätt 5% FBS/HBSS till en slutlig volym på 25 ml. Blanda försiktigt genom inversion.
OBS: Att utföra RBC-sedimenteringen efter PBMC-borttagningen förbättrar avkastningen och minskaraktiveringen 10. - Tillsätt direkt 25 ml förvarnad (37 °C) 3% Dextran/0,9% NaCl/H2O i röret som innehåller den utspädda neutrofil/RBC-pelleten och blanda försiktigt genom inversion. Placera röret på en jämn, icke-vibrerande yta i 15 min (figur 1C).
OBS: Längre sedimentering minskar RBC-föroreningen men minskar också utbytet. Dessutom kan långvarig dextranexponering leda till neutrofilaktivering eller celldöd11. - Ta försiktigt tillbaka röret i huven (för steril isolering). Genom att endast nedsänka pipetten något i vätskan samlar du upp det övre lagret (~ 30 ml) efter vätskeytan nedåt.
OBS: Om sedimenteringen ger ett skarpt gränssnitt mellan mediet och RBC är RBC-pelleten mindre, eller om ett högre utbyte önskas, samla upp till 35 ml. - Snurra röret (400 × g, 10 min, RT, med låg broms (3)), vilket resulterar i en röd pellet utan partiklar som flyter i mediet.
3. Lys av de återstående RBC
- Aspirera försiktigt supernatanten utan att störa pelleten.
- Tillsätt 25 ml sterilt ultrapurvatten direkt i röret och blanda försiktigt genom att vända i 28 s för att lysa RBC: erna. Använd inte en pipa för att återanvända pelleten.
OBS: Överskrid inte 30 s eftersom långvariga hypotona tillstånd kan aktiveras och leda till neutrofil död12. - Tillsätt omedelbart 25 ml steril 1,8% NaCl/H2O i röret och blanda försiktigt genom att vända för att återföra lösningen till isotoniska förhållanden.
OBS: Lösningen ska vara röd men utan grumlighet. - Snurra ner vid 200 × g i 3-5 min med låg broms (nivå 3) för att minimera RBC och trombocyt sedimentering tillsammans med neutrofilerna (figur 1D och figur 2)13,14.
OBS: Pelleten ska vara vit med ett minimalt RBC-skikt på toppen, som försiktigt kan avlägsnas medan supernatanten är insugen. - Återanvänd neutrofiler genom pipettering av odlingsmediet (10% FBS/RPMI1640) direkt på pelleten, men rör inte upp och ner. Gunga röret horisontellt från sida till sida för att minimera cellaktiveringen.
OBS: Cellerna bör hållas i en koncentration av ~2 × 106 celler/ml, eftersom högre densitet leder till ökad cellaktivering/död15. Av samma anledning bör cellpelleten återanvändas så snart som möjligt. - Om cellaggregering eller klumpning observeras filtrerar du cellavstängningen med ett 70 μm nät för att kassera klumpade neutrofiler.
4. Bestämma neutrofil isoleringskvalitet
- Färga cellerna med markörer som är specifika för neutrofiler (CD66b, CD11b), eosinofiler (CD193) (figur 3) och en aktiveringsmarkör som CD62L (figur 4). Skaffa 20 000 celler genom flödescytometri. Analysera cellens renhet och aktivering med hjälp av de gatingstrategier som föreslås i figur 3 och figur 4.
OBS: Kvaliteten på neutrophil preparatet kan bedömas med hjälp av en 3% ättiksyra-metylenblå lösning för att visualisera den unika lobed kärnan av neutrofiler. - Bestäm cellens livskraft med hjälp av Annexin V/propidiumjodid (PI)(figur 5).
OBS: Trypan blå färgning kan användas för att utvärdera cellens livskraft.
Representative Results
Vid användning av densitetsgradient för att rena neutrofiler är det viktigt att gränssnittet mellan blodet och densitetsgradientmediet blir så skarpt som möjligt och att en distinkt skiktseparation kvarstår efter centrifugering (steg 1.4). Efter RBC-lys ska bufferten vara klarröd och inte grumlig (steg 3.3). Om preparatet är grumligt kan en andra omgång lys (steg 3) krävas, även om detta kan påverka neutrofil överlevnad (figur 1). Efter lys rekommenderas låghastighetscentrifugering (200 × g) när renhet prioriteras, eftersom det minskar trombocytföroreningen avsevärt. Höghastighetscentrifugering (400 × g) ökar dock avkastningen på bekostnad av renheten (steg 3.4, figur 2). Efter neutrofil isolering kan fluorescensaktiverad cellsortering användas för att bedöma isoleringsrenhet (steg 4.1) och bör väljas framför mikroskopi. Även om FSC/SSC-fördelningen av celler ensam ger en uppskattning av cellisoleringskvaliteten(figur 3A),bör användningen av specifika cellmarkörer föredras. I detta fall färgas de vanligaste kontaminerande cellpopulationerna med specifika antikroppar tillsammans med CD66b, särskilt uttryckta på granulocyter. CD45 färgning används för att skilja leukocyter (CD45 +) och röda blodkroppar och trombocyter (CD45-).
Andra föroreningar är lymfocyter (CD3+ eller CD19+, figur 3F),monocyter (CD14+, figur 3D)och eosinofiler (CD193+, figur 3G). CD11b är en integrin uttryckt på myeloisk härstamning; neutrofiler och monocyter är CD11b+, medan lymfocyter är CD11b-(figur 3C). Eftersom neutrofil aktivering kan påverka nedströms experiment, bör uttrycket av CD62L bedömas. neutrofiler blir CD62L- när de har aktiverats (steg 4.1). Peptiden fMLP kan användas som en positiv kontroll för CD62L-utsöndring (figur 4). Det är också viktigt att utvärdera neutrofilers hälsa innan man utför analyser; neutrofiler har en relativt kort halveringstid, och aktivering kan ytterligare förkorta den (steg 4.2). En standardfärgning av Annexin V och PI kan ge information om neutrofilkulturens levande/döda status vid bestämda tidpunkter(figur 5).
Figur 1: Densitetsgradient medelbaserad separation av granulocyter. (A) Före och (B) efter centrifugering. Observera det skarpa gränssnittet mellan blodet och densitetsgradientens medelstora lager. C)Sedimentering av pelleten i B-återsuspenderad (1:1) i 5% FBS/HBSS och 3% Dextran-0,9% NaCl. ( D) PMN-pellet efter lys av de återstående RBC:erna i supernatanten av (C) med H2O. Förkortningar: PBMC = perifer blodmononukleär cell; PMN = neutrofil; RBC = röda blodkroppar; FBS = fetalt bovinserum; HBSS = Hanks balanserade saltlösning. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Spinning vid lägre hastigheter efter RBC lysis minskade trombocytförorening. Efter lys av RBC med H2O snurrades cellerna ner vid 200 × g (A) eller 400 × g (B). Neutrofiler färgades, och flöde cytometri analys utfördes, som beskrivs i figur 3, med tillägg av anti-CD41 för att märka trombocyter. Förkortningar: RBC = röd blodkropp; CD41 = differentieringskluster 41; SSC-A = sidaspridningsområde. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Bedömning av neutrofiler som isolerats från buffy coat. Isolerade neutrofiler var färgade med anti-CD66b, anti-CD11b, anti-CD14 och anti-CD193 efter ett standardprotokoll. Enstaka celler (B) portades från totala celler (A). (C) CD11b+ celler var gated från enstaka celler. (D) Punktdiagram som visar neutrofiler (CD66b+, CD14 låg/-) och en mycket låg monocytförorening (CD66b-, CD14+, Q1). (E) CD66b- och CD66b+ celler var gated. (F) CD66b- cellerna var positiva för lymfocytmarkörer (CD3, CD19). G) Uttryck av CD11b och CD193 i CD66b+ celler, som visar distinkt neutrofil (CD66b+, CD11b+, CD193-) och eosinofil (CD66b+, CD11b-, CD193+) populationer. I det representativa resultatet som visas här är neutrofil renhet ~ 93% med ~ 3,7% lymfocyt och ~ 3,7% eosinofil förorening. h)Kvantifiering av neutrofil renhet efter rening. Data sammanställs från 5 enskilda försök och presenteras som medelvärde ± SD. Förkortningar: CD = differentieringskluster; SSC-A = SSC-A = sidospridningsområde; FSC-A = framåtspridare. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4: Gradientrening orsakade inte CD62L-utsöndring. C) Fluorescerande medelintensitet för CD62L minskar i fMLP-behandlade celler, vilket indikerar CD62L-utsöndring och neutrofilaktivering. Förkortningar: CD26L = L-selectin; fMLP = N-Formylmethionyl-leucyl-fenylalanin; SSC-A = SSC-A = sidospridningsområde; FSC-A = främre spridningsområde; PE = fycoerythrin. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 5: Spontan död av neutrofiler renad genom densitetsgradient eller neutrofil isoleringssats. Neutrofiler renades med densitetsgradient (A och B) eller kommersiella mikrober (C och D) och odlades i 0 h (A och C) eller 24 h (B och D) i RPMI-10% FCS. Cellerna färgades med hjälp av Annexin V och PI vid respektive tidpunkter efter ett standardprotokoll. (E)Kvantifiering av renad neutrofil spontan död. n=5, medelvärde ± SD. Förkortningar: SSC-A = SSC-A = sidospridningsområde; FSC-A = främre spridningsområde; PI = propidiumjodid; FCS = fetala kalvserum; FITC = fluorescein isotiiocyanate; AV5 = Annexin V. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
På grund av den korta livslängden, terminal differentieringsstatus och lytiskt innehåll av neutrofiler har det alltid varit en utmaning att studera dessa celler. Förutom att använda musmodeller eller celler från patientkohorter är cellinjer användbara verktyg för att studera neutrofilbiologi16. Neutrofilliknande cellinjer kan dock inte helt upprepa alla aspekter av neutrofilbiologi, vilket lägger till ett extra lager av svårigheter att studera dessa celler. Den vanligaste in vitro-modellen är HL-60-cellinjen, som kan differentieras till neutrofilliknande celler genom behandling med dimetylsulfoxid eller retinsyra17,18. Även om dessa celler är användbara i studien av migration och andningssprängning, är de inte lämpliga för att studera neutrofilers mikrobiocida aktivitet. Andra cellinjer finns (PLB-98, NB4), och de är också associerade med deras uppsättning begränsningar19.
Det är avgörande att validera med primära mänskliga neutrophils observationer gjorda med mussjukdom modeller och cellinjer. Neutrofiler kan inte kryopreserveras effektivt och är därför ofta nyisolerade från helblod eller buffy coats som erhållits från givare och omedelbart bearbetas. När cellerna väl isolerats börjar de genomgå en komplex form av spontan död, reglerad av oxidation, cytoplasmiska caspaser och proteaser som finns i neutrofilgranulat20,21. Felaktiga isoleringsmetoder eller tekniker kan leda till aktivering av neutrofiler, vilket bara påskyndar celldöden. Det är absolut nödvändigt att ha en tillförlitlig och konsekvent metod för att få rena och högkvalitativa neutrofiler från givare.
Det har publicerats många metoder på mänsklig neutrofilisolering10,22. De delas huvudsakligen in i två kategorier, med vissa gemensamma strategier. Den första kategorin är antikroppsbaserad, antingen genom positivt eller negativt urval. Positivt urval skulle märka neutrofiler direkt, vilket ger en mycket ren cellpopulation, även om det också leder till snabb cellaktivering, celldöd samt oönskad taggning av neutrofiler23. Negativt urval, även om cellerna lämnas omärkta och ger en mycket ren population, accelererad neutrofil död, även om den exakta mekanismen är okänd (figur 5). Huruvida gen- eller proteinuttryck också ändras efter positivt eller negativt urval behöver undersökas ytterligare. På grund av den mängd antikroppar som behövs för att tömma de andra typerna av celler kan dessa metoder inte heller producera stora mängder neutrofiler. Antikroppsbaserade analyser kan dock fortfarande användas för korttidskultur och experiment i mindre skala och är metoder för experiment som kräver mycket hög cellrenhet, såsom gen- och proteinuttrycksstudier.
Den andra typen av isoleringsmetod är gradient- och densitetsbaserad. Det involverar vanligtvis Percoll, Ficoll-Paque eller andra polysackarrid/polyvinylpyrrolidonkomponenter och använder centrifugeringskraft för att separera olika typer av blodkroppar baserat på celltäthet. Dessa metoder kompletteras ofta med sedimentering av röda blodkroppar genom dextran. Dessa metoder kan hantera större skalor av utgångsmaterial och kan också uppnå hög renhet. En varning för densitetsbaserad isolering är den ineffektiva separationen av andra mycket mindre rikliga granulocyter (mestadels eosinofiler) från neutrofiler, och det är därför den största begränsningen av protokollet som presenteras, eftersom även närvaron av små cellföroreningar kan påverka neutrofilsvar24.
Presenteras här är en sammanfattad metod baserad på gradientisolering, raffinering av tidigare metoder10,22. Vi använder den nuvarande underutstaten av neutrofil specificiteter för att tillförlitligt isolera rena mänskliga neutrofiler med begränsad kvarvarande trombocyt och RBC, förhindra neutrophil aktivering och accelererad död. Det viktigaste steget är skiktningen av gradienten, som erhålls mycket mer effektivt genom att lägga till densitetsgradientmediet under blodet för att få ett skarpt gränssnitt. En snabb undersökning av PBMC-ringen och gradienten efter centrifugering kan avslöja eventuell förorening, aktivering och låga utbyten. Vid arbete med ett leukaferesmembran eller buffy coat är utspädning av blodet viktigt eftersom överdriven celltäthet skulle leda till cellaggregering, vilket leder till föroreningar och cellaktivering.
Detta protokoll bör slutföras inom 2 timmar för att säkerställa cellens färskhet, och steg som involverar densitet gradient medium, dextran och lys görs omedelbart, eftersom exponering för dessa lösningar kan förändra neutrofiler. Med detta protokoll är den förväntade avkastningen av neutrofiler minst ~ 10 miljoner / 10 ml helblod och minst ~ 60 miljoner / 10 ml buffy coat. Utvärdering av isoleringskvaliteten bör göras på följande sätt: aktiverade neutrofiler bör vara mindre än 10%, lymfocytförorening lägre än 5%, minimal eosinofil (samma sida spridning men lägre framåt spridning population) och cell livskraft bör vara över 90%. Lägre renhet kan bero på felaktig skiktning eller lagring av densitetsgradientmediet eller på grund av kvaliteten och färskheten hos startblodprodukten.
Disclosures
Författarna förklarar att forskningen utfördes i avsaknad av någon intressekonflikt.
Acknowledgments
Detta projekt stöddes av P01HL095489. A.Y.H stöddes av T32HL066987.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3% Acetic Acid with Methylene Blue | Stemcell technologies | #07060 | |
| Attune NxT | invitrogen | A24858 | FACS analyzer |
| Cd11b-PE | biolegend | 301305 | |
| CD14-BV421 | biolegend | 367144 | |
| CD193-BV605 | biolegend | 310716 | |
| CD19-PerCP | biolegend | 302228 | |
| CD3-PerCP | biolegend | 300326 | |
| CD41-APC | biolegend | 303710 | |
| Cd45-APC | biolegend | 103111 | |
| CD62L-PE | biolegend | 304802 | |
| CD66b-FITC | biolegend | 305103 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | 22625101 | Centrifuge |
| Dextran | Fisher | BP1580 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | R&D systems | S11150H | complement inactivation of FBS is recommended |
| FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I | BD | 556547 | |
| Hanks balanced salt solution (-CaCl2), (-MgCl2) (-MgSO4) | Gibco | 14175-095 | HBSS without Ca2+/Mg2+ is advised as they have been shown to lead to neutrohpil activation |
| Lymphoprep | Stemcell technologies | #07801 | density gradient medium |
| MACSxpress Whole Blood Neutrophil Isolation Kit, human | Miltenyi | 130-104-434 | |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875093 | |
| Sodium chloride | sigma | 71376 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermofisher | 15250061 | |
| ultrapure water | KD medical | RGF-3410 |
References
- Rosales, C. Neutrophil: A cell with many roles in inflammation or several cell types. Frontiers in Physiology. 9, 113 (2018).
- Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. Neutrophil function: from mechanisms to disease. Annual Review of Immunology. 30, 459-489 (2012).
- Stoller, J. K. Murray & Nadel's textbook of respiratory medicine, 6th edition. Annals of the American Thoracic Society. 12 (8), 1257-1258 (2015).
- Dancey, J. T., Deubelbeiss, K. A., Harker, L. A., Finch, C. A.
- Manz, M. G., Boettcher, S.
- Summers, C., et al. Neutrophil kinetics in health and disease. Trends in Immunology. 31 (8), 318-324 (2010).
- Pedruzzi, E., Fay, M., Elbim, C., Gaudry, M., Gougerot-Pocidalo, M. A. Differentiation of PLB-985 myeloid cells into mature neutrophils, shown by degranulation of terminally differentiated compartments in response to N-formyl peptide and priming of superoxide anion production by granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. British Journal of Haematology. 117 (3), 719-726 (2002).
- Tucker, K. A., Lilly, M. B., Heck, L., Rado, T. A. Characterization of a new human-diploid myeloid-leukemia cell-line (Plb-985) with granulocytic and monocytic differentiating capacity. Blood. 70 (2), 372-378 (1987).
- Hsu, A. Y., et al. Inducible overexpression of zebrafish microRNA-722 suppresses chemotaxis of human neutrophil like cells. Molecular Immunology. 112, 206-214 (2019).
- Kremserova, S., Nauseef, W. M. Isolation of human neutrophils from venous blood. Methods in Molecular Biology. 2087, 33-42 (2020).
- Quach, A., Ferrante, A. The application of dextran sedimentation as an initial step in neutrophil purification promotes their stimulation, due to the presence of monocytes. Journal of Immunological Research. 2017, 1254792 (2017).
- Thorson, L. M., Turkalj, A., Hung, J. C. In vitro evaluation of neutrophil viability after exposure to a hypotonic medium. Nuclear Medicine Communications. 16 (7), 615-620 (1995).
- Dhurat, R., Sukesh, M. Principles and methods of preparation of platelet-rich plasma: a review and author's perspective. Journal of Cutaneous and Aesthetetic Surgery. 7 (4), 189-197 (2014).
- Etulain, J., et al. An optimised protocol for platelet-rich plasma preparation to improve its angiogenic and regenerative properties. Scientific Reports. 8 (1), 1513 (2018).
- Hannah, S., et al. Constitutive neutrophil apoptosis in culture is modulated by cell density independently of beta2 integrin-mediated adhesion. FEBS Letters. 421 (2), 141-146 (1998).
- Hsu, A. Y., et al. Phenotypical microRNA screen reveals a noncanonical role of CDK2 in regulating neutrophil migration. Proceedings of the National Acadermy of Sciences of the United States of America. 116 (37), 18561-18570 (2019).
- Martin, S. J., Bradley, J. G., Cotter, T. G. HL-60 cells induced to differentiate towards neutrophils subsequently die via apoptosis. Clinical and Experimental Immunology. 79 (3), 448-453 (1990).
- Hauert, A. B., Martinelli, S., Marone, C., Niggli, V. Differentiated HL-60 cells are a valid model system for the analysis of human neutrophil migration and chemotaxis. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 34 (7), 838-854 (2002).
- Blanter, M., Gouwy, M., Struyf, S. Studying neutrophil function in vitro: Cell models and environmental factors. Journal of Inflammation Research. 14, 141-162 (2021).
- Kambara, H., et al. Gasdermin D exerts anti-inflammatory effects by promoting neutrophil death. Cell Reports. 22 (11), 2924-2936 (2018).
- Loison, F., et al. Proteinase 3-dependent caspase-3 cleavage modulates neutrophil death and inflammation. Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4445-4458 (2014).
- Siemsen, D. W., et al. Neutrophil isolation from nonhuman species. Methods in Molecular Biology. 1124, 19-37 (2014).
- Hasenberg, M., et al. Rapid immunomagnetic negative enrichment of neutrophil granulocytes from murine bone marrow for functional studies in vitro and in vivo. PLoS One. 6 (2), 17314 (2011).
- Calzetti, F., Tamassia, N., Arruda-Silva, F., Gasperini, S., Cassatella, M. A. The importance of being "pure" neutrophils. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (1), 352-355 (2017).
