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Behavior

चूहों में लाइट एवर्शन का उपयोग करके माइग्रेन जैसे व्यवहार की जांच करना

Published: August 11, 2021 doi: 10.3791/62839
Automatic Translation
1, 2, 3,4, 4, 3,4, 3,4,5
1Department of Neuroscience and Pharmacology, University of Iowa, 2School of Behavioral and Brain Sciences, University of Texas at Dallas, 3Center for the Prevention and Treatment of Visual Loss, Veterans Administration Health Center, Iowa City, IA, 4Department of Molecular Physiology and Biophysics, University of Iowa, 5Department of Neurology, University of Iowa

Summary

कृन्तक माइग्रेन के लक्षणों की रिपोर्ट करने में सक्षम नहीं हैं। यहां, हम एक प्रबंधनीय परीक्षण प्रतिमान (प्रकाश / अंधेरे और खुले क्षेत्र assays) का वर्णन करते हैं ताकि प्रकाश घृणा को मापा जा सके, जो माइग्रेन वाले रोगियों में सबसे आम और परेशान लक्षणों में से एक है।

Abstract

माइग्रेन एक जटिल न्यूरोलॉजिकल विकार है जो सिरदर्द और संवेदी असामान्यताओं की विशेषता है, जैसे कि प्रकाश के लिए अतिसंवेदनशीलता, फोटोफोबिया के रूप में मनाया जाता है। जबकि यह पुष्टि करना असंभव है कि एक माउस माइग्रेन का अनुभव कर रहा है, प्रकाश घृणा का उपयोग फोटोफोबिया के माइग्रेन लक्षण के लिए एक व्यवहार सरोगेट के रूप में किया जा सकता है। प्रकाश घृणा के लिए परीक्षण करने के लिए, हम प्रकाश / अंधेरे परख का उपयोग करने के लिए समय चूहों स्वतंत्र रूप से या तो एक प्रकाश या अंधेरे वातावरण में खर्च करने के लिए चुनते हैं मापने के लिए। परख दो महत्वपूर्ण संशोधनों को पेश करके परिष्कृत किया गया है: परीक्षण प्रक्रिया और समायोज्य कक्ष प्रकाश व्यवस्था को चलाने से पहले कक्ष के लिए पूर्व-एक्सपोजर, 55 लक्स से 27,000 लक्स तक प्रकाश तीव्रता की एक श्रृंखला के उपयोग की अनुमति देता है। क्योंकि अंधेरे में अधिक समय बिताने का विकल्प भी चिंता का संकेत है, हम एक प्रकाश-स्वतंत्र चिंता परीक्षण, खुले क्षेत्र परख का भी उपयोग करते हैं, ताकि चिंता को प्रकाश-प्रतिकूल व्यवहार से अलग किया जा सके। यहां, हम प्रकाश / अंधेरे और खुले क्षेत्र के लिए एक संशोधित परीक्षण प्रतिमान का वर्णन करते हैं। इन assays के आवेदन दो माउस उपभेदों में calcitonin जीन से संबंधित पेप्टाइड (CGRP) के intraperitoneal इंजेक्शन के लिए और optogenetic मस्तिष्क उत्तेजना अध्ययन के लिए वर्णित है।

Introduction

माइग्रेन एक प्रचलित न्यूरोलॉजिकल बीमारी है, जो लगभग 17% अमेरिकियों को प्रभावित करती है1 और वैश्विक स्तर पर विकलांगता का दूसरा प्रमुख कारण है2,3। रोगियों को सिरदर्द का अनुभव होता है जो निम्नलिखित लक्षणों में से कम से कम एक के साथ 4-72 घंटे तक रहता है: मतली और / या उल्टी, या फोटोफोबिया और फोनोफोबिया 4। कैल्सीटोनिन जीन से संबंधित पेप्टाइड (सीजीआरपी) एंटीबॉडी के विकास में हाल की प्रगति जो अब एफडीए द्वारा अनुमोदित हैं, ने माइग्रेन उपचार 5,6,7 के लिए एक नया युग शुरू किया है। ये एंटीबॉडी या तो सीजीआरपी या इसके रिसेप्टर को अवरुद्ध करते हैं और लगभग 50% माइग्रेन रोगियों में माइग्रेन के लक्षणों को रोकते हैं। पिछले एक साल के भीतर, सीजीआरपी रिसेप्टर के दो छोटे-अणु विरोधी को भी माइग्रेन के गर्भपात उपचार के लिए एफडीए को मंजूरी दी गई है, और दो और पाइपलाइन 8 में हैं। इस चिकित्सीय प्रगति के बावजूद, जिन तंत्रों द्वारा माइग्रेन के हमले होते हैं, वे अभी भी मायावी बने हुए हैं। उदाहरण के लिए, CGRP कार्रवाई की साइटें ज्ञात नहीं हैं। चिकित्सीय एंटीबॉडी की प्रभावकारिता जो रक्त-मस्तिष्क बाधा को सराहनीय रूप से पार नहीं करती है, यह बताती है कि सीजीआरपी परिधीय साइटों पर कार्य करता है, जैसे कि मेनिन्जेस और / या ट्राइजेमिनल गैन्ग्लिया। हालांकि, हम सर्कमवेंट्रिकुलर अंगों पर केंद्रीय कार्यों से इनकार नहीं कर सकते हैं, जिसमें रक्त-मस्तिष्क बाधा 9 की कमी है। कम से कम फोटोफोबिया के लिए, हमें लगता है कि ट्रांसजेनिक नेस्टिन / एचआरएपी 1 चूहों का उपयोग करके प्रकाश घृणा के साथ हमारे परिणामों को देखते हुए यह कम संभावना है, जिसमें hRAMP1 तंत्रिका ऊतक 10 में अतिरंजित है। माइग्रेन पैथोफिजियोलॉजी के तंत्र को समझना माइग्रेन चिकित्सीय के विकास के लिए नए रास्ते प्रदान करेगा।

प्रीक्लिनिकल पशु मॉडल रोग तंत्र और नई दवाओं के विकास को समझने के लिए महत्वपूर्ण हैं। हालांकि, जानवरों में माइग्रेन का आकलन चुनौतीपूर्ण है क्योंकि जानवर मौखिक रूप से दर्द की अपनी संवेदनाओं की रिपोर्ट नहीं कर सकते हैं। इस तथ्य को देखते हुए कि माइग्रेन के 80-90% रोगी फोटोफोबिया 11 का प्रदर्शन करते हैं, प्रकाश घृणा को पशु मॉडल में माइग्रेन का संकेतक माना जाता है। इससे चूहों में प्रकाश घृणा का आकलन करने के लिए एक परख विकसित करने की आवश्यकता हुई।

प्रकाश / अंधेरे परख एक प्रकाश क्षेत्र और एक अंधेरे क्षेत्र शामिल हैं। यह व्यापक रूप से उपन्यास वातावरण के अपने सहज अन्वेषण के आधार पर चूहों में चिंता को मापने के लिए उपयोग किया जाता है जो प्रकाश 12 के लिए उनके जन्मजात घृणा से मुकाबला किया जाता है। कुछ अध्ययनों ने कक्ष के 1/3 हिस्से को अंधेरे क्षेत्र के रूप में निर्धारित किया, जबकि अन्य ने कक्ष के 1/2 हिस्से को अंधेरे क्षेत्र के रूप में सेट किया। पूर्व सेटिंग का उपयोग अक्सर चिंता 13 का पता लगाने के लिए किया जाता है। जबकि हमने शुरू में समान आकार के प्रकाश / अंधेरे कक्षों को चुना था, हमने दो सापेक्ष आकारों की तुलना नहीं की है। हम टिप्पणी कर सकते हैं कि दोनों कक्षों का समग्र आकार एक प्रमुख कारक नहीं है क्योंकि प्रारंभिक परीक्षण बॉक्स 14 बाद के उपकरण ों की तुलना में काफी बड़ा था15, फिर भी परिणाम अनिवार्य रूप से समान थे।

प्रकाश घृणा का आकलन करने के लिए इस प्रकाश / अंधेरे परख के लिए दो महत्वपूर्ण संशोधन थे: परीक्षण की स्थिति और प्रकाश तीव्रता (चित्रा 1)। सबसे पहले, चूहों को अन्वेषणात्मक ड्राइव 16 (चित्रा 1 ए) को कम करने के लिए प्रकाश / अंधेरे कक्ष के पूर्व-संपर्क में रखा जाता है। पूर्व-एक्सपोज़र की आवश्यकता और समय माउस उपभेदों और मॉडल पर निर्भर करता है। वाइल्डटाइप C57BL / 6J चूहों को आमतौर पर दो पूर्व-एक्सपोज़र 10 की आवश्यकता होती है, जबकि CD1 चूहों के लिए केवल एक पूर्व-एक्सपोजर पर्याप्त है। इस तरह, इन दो माउस उपभेदों में प्रकाश-प्रतिकूल व्यवहार को अनमास्क किया जा सकता है। दूसरा, चैंबर लाइटिंग को मंद (55 लक्स) से उज्ज्वल (27,000 लक्स) तक प्रकाश तीव्रता की एक समायोज्य सीमा को शामिल करने के लिए अनुकूलित किया गया है, जहां 55 लक्स एक अंधेरे ओवरकास्ट दिन के बराबर है, और 27,000 लक्स शेड 10 में एक उज्ज्वल धूप वाले दिन के बराबर है। हमने पाया है कि आवश्यक प्रकाश तीव्रता तनाव और आनुवंशिक मॉडल के साथ भिन्न होती है। इस कारण से, व्यक्तियों को पहले अपने प्रयोगात्मक प्रतिमान के लिए न्यूनतम प्रकाश तीव्रता का आकलन करना चाहिए।

यहां तक कि परख के लिए इन संशोधनों के साथ, जो एक प्रकाश-प्रतिकूल फेनोटाइप को प्रकट कर सकता है, चिंता के कारण अकेले प्रकाश के कारण प्रकाश के कारण प्रकाश घृणा के बीच अंतर करने के लिए चिंता जैसे व्यवहार का परीक्षण करना आवश्यक है। खुला क्षेत्र परख उपन्यास वातावरण के सहज अन्वेषण के आधार पर चिंता को मापने के लिए एक पारंपरिक तरीका है। यह प्रकाश / अंधेरे परख से अलग है कि अन्वेषणात्मक ड्राइव असुरक्षित खुले स्थानों के लिए जन्मजात घृणा द्वारा मुकाबला किया जाता है। कक्ष के केंद्र और किनारों दोनों प्रकाश में हैं, तो खुला क्षेत्र परख एक प्रकाश स्वतंत्र चिंता परख है. इस प्रकार, प्रकाश / अंधेरे और खुले क्षेत्र assays का संयोजन हमें चिंता में समग्र वृद्धि बनाम प्रकाश से बचने के कारण प्रकाश घृणा के बीच अंतर करने में सक्षम बनाता है।

CGRP एक multifunctional neuropeptide है जो vasodilation, nociception, और inflammation18 को नियंत्रित करता है। यह परिधीय और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में व्यापक रूप से व्यक्त किया जाता है। यह माइग्रेन pathophysiology18 में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। हालांकि, माइग्रेन में सीजीआरपी कार्रवाई अंतर्निहित तंत्र अस्पष्ट है। इस संशोधित परीक्षण प्रतिमान के साथ प्रकाश / अंधेरे और खुले क्षेत्र assays का उपयोग करके, हम परिधीय 10,16 (चित्रा 2) और केंद्रीय 14,15,16,19 CGRP प्रशासन के बाद चूहों में प्रकाश-प्रतिकूल व्यवहार की पहचान करने में सक्षम थे। न्यूरोपेप्टाइड्स के अलावा, प्रकाश घृणा में शामिल मस्तिष्क क्षेत्रों की पहचान भी माइग्रेन पैथोफिजियोलॉजी को समझने में महत्वपूर्ण है। पश्चवर्ती थैलेमिक नाभिक दर्द और प्रकाश प्रसंस्करण 19 के लिए एक एकीकृत मस्तिष्क क्षेत्र हैं, और थैलेमस माइग्रेन 20 के दौरान सक्रिय होता है। इस प्रकार, हमने इस क्षेत्र में चैनलरोडोप्सिन -2 (ChR2) या eYFP युक्त एडेनो-संबद्ध वायरस (एएवी) को इंजेक्ट करके पीछे के थैलेमिक नाभिक को लक्षित किया। इन दो assays के साथ इस optogenetic दृष्टिकोण के संयोजन से, हमने प्रदर्शित किया कि ChR2 की ऑप्टिकल उत्तेजना-पीछे थैलेमिक नाभिक प्रेरित प्रकाश aversion19 (चित्रा 3) में न्यूरॉन्स व्यक्त. इस प्रयोग में, इन ऑप्टोजेनेटिक रूप से हेरफेर किए गए चूहों में उत्पन्न प्रकाश घृणा पर नाटकीय प्रभाव को देखते हुए, कक्ष के पूर्व-एक्सपोजर को छोड़ दिया गया था।

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Protocol

पशु प्रक्रियाओं को आयोवा पशु देखभाल और उपयोग समिति के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया था और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों द्वारा निर्धारित मानकों के अनुपालन में प्रदर्शन किया गया था।

1. प्रकाश / अंधेरे परख

  1. प्रकाश / अंधेरे कक्ष उपकरण ( सामग्री की तालिका देखें) सेटअप। इस अनुभाग में सभी उपकरण व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं।
    1. एक शेल्फ पर, ध्वनि-क्षीण करने वाले क्यूबिकल (इंटीरियर: 59.7 x 38 x 35.6 सेमी डब्ल्यू एक्स एच एक्स डी में) रखें जिसमें कक्ष और अंधेरे सम्मिलित करने के लिए आसान पहुंच के लिए एक पुल-आउट दराज शामिल है।
    2. डीसी बिजली की आपूर्ति और ध्वनि attenuating क्यूबिकल के लिए एक डीसी विनियमित बिजली की आपूर्ति कनेक्ट करें।
    3. पारदर्शी निर्बाध खुले क्षेत्र कक्ष (27.31 x 27.31 x 20.32 सेमी L x W x H में) क्यूबिकल के पुल-आउट दराज पर रखें।
    4. खुले क्षेत्र कक्ष में काले, अवरक्त (IR)-पारदर्शी प्लास्टिक अंधेरे सम्मिलित करें (28.7 X 15 X 20.6 सेमी L x W x H में) रखें। सुनिश्चित करें कि कक्ष को एक समान आकार के दो क्षेत्रों में विभाजित किया गया है: एक अंधेरे क्षेत्र और एक प्रकाश क्षेत्र।
    5. केबल के माध्यम से IR USB नियंत्रक के लिए खुले क्षेत्र कक्ष के X, Y और Z अक्षों पर 16-बीम IR सरणियों के तीन सेट कनेक्ट करें।
    6. IR USB नियंत्रक को किसी कंप्यूटर से कनेक्ट करें।
    7. कंप्यूटर पर ट्रैकिंग सॉफ़्टवेयर स्थापित करें जो माउस स्थान और गतिविधि को रिकॉर्ड और एकत्र कर सकता है।
    8. लाइट पैनल सेटअप के लिए, पहले प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी) प्रकाश पैनल (एल एक्स डब्ल्यू में 27.70 x 27.70 सेमी; 360 एलईडी, डेलाइट-संतुलित रंग, 5600K, 60 डिग्री बाढ़ बीम स्प्रेड) को अपने मूल आवास से हटा दें।
    9. एलईडी ड्राइवर, गर्मी सिंक, और बिजली की आपूर्ति के साथ प्रकाश पैनल को इकट्ठा करें। एकाधिक एलईडी प्रकाश पैनलों को एक समान प्रकाश पैनल नियंत्रण प्राप्त करने के लिए एक बिजली की आपूर्ति, गर्मी सिंक और एलईडी ड्राइवर से जोड़ा जा सकता है।
    10. एक अनुकूलित ऐक्रेलिक प्लेटफ़ॉर्म (29.77 x 27.70 x 8.10 सेमी एल एक्स डब्ल्यू एक्स एच में) का निर्माण करें जिसमें 0.53 सेमी अंतराल पर 7 समान अलमारियां शामिल हैं (चित्रा 1 बी)। स्थायी रूप से कक्ष के ऊपर क्यूबिकल के अंदर छत के लिए अनुकूलित ऐक्रेलिक शेल्फ चिपकाएं।
    11. नीचे दो अलमारियों के बीच स्लॉट में एलईडी लाइट पैनल डालें। प्रकाश पैनल को विभिन्न ऊंचाइयों (चित्रा 1 बी, सी) में समायोजित करें, यदि आवश्यक हो (उदाहरण के लिए, यदि ऑप्टोजेनेटिक चूहों का उपयोग कर रहे हैं। विवरण धारा 3) में चर्चा की गई है।
    12. गर्मी सिंक, एलईडी ड्राइवर, और बिजली की आपूर्ति को चालू करें। पुष्टि करें कि एलईडी ड्राइवर कक्ष के फर्श पर प्रकाश तीव्रता को मापने और पुष्टि करके एलईडी प्रकाश तीव्रता को निर्देशित कर सकता है कि फर्श समान रूप से जलाया जाता है।
  2. व्यवहार परीक्षण प्रक्रिया
    नोट: चूहों को 12 घंटे के प्रकाश चक्र पर रखा जाता है। सभी व्यवहार प्रयोग प्रकाश चक्र के दौरान किए जाते हैं। चूहों, दोनों पुरुषों और महिलाओं सहित, 10-20 सप्ताह की उम्र में, का उपयोग किया जाता है। इस प्रोटोकॉल में, भोले वाइल्डटाइप CD1 और C57BL / 6J चूहों को प्रकाश / अंधेरे कक्ष के लिए दो पूर्व-एक्सपोज़र का अनुभव होता है, जिसके बाद उपचार और उपचार के बाद के जोखिम के साथ जोखिम होता है। चूहों को ठीक करने की अनुमति देने के लिए प्रत्येक जोखिम के बीच तीन दिन का अंतराल होता है (दिन 1, 4, 7 और 10 जैसा कि नीचे वर्णित है और चित्रा 1 ए)। हालांकि, सीडी 1 चूहों को दूसरे पूर्व-एक्सपोजर की आवश्यकता नहीं होती है और मंद प्रकाश में परीक्षण किया जा सकता है।
    1. दिन 1 (pretreatment 1) पर, प्रकाश / अंधेरे परख उपकरण पर बारी और 27,000 लक्स करने के लिए प्रकाश तीव्रता सेट।
    2. ट्रैकिंग सॉफ़्टवेयर खोलें और एक नया प्रोटोकॉल सेट करें. नया प्रोटोकॉल सेटिंग में, अवधि को 30 मिनट पर सेट करें । नया विश्लेषण सेटिंग में, डेटा बिन्स को अवधि के आधार पर 300 s पर सेट करें.
    3. नया ज़ोन सेटिंग में, पूर्व-निर्धारित ज़ोन चुनें. 2 चुनें और फिर क्षैतिज। जाँचें कि क्या कक्ष रिकॉर्डिंग के लिए क्षैतिज रूप से दो समान आकार के क्षेत्रों में विभाजित है।
    4. परीक्षण से पहले 1 घंटे के लिए परीक्षण कक्ष में चूहों की आदत डालें। habituation के दौरान, माउस के सर्कैडियन लय को बाधित नहीं करने के लिए कमरे की रोशनी रखें। सुनिश्चित करें कि प्रकाश / अंधेरे परख के लिए सभी उपकरणों को चालू कर दिया गया है, चूहों को परीक्षण कक्ष के वातावरण में पूरी तरह से अनुकूलित करने की अनुमति देता है।
    5. डेटा प्राप्त करें का चयन करें. माउस आईडी दर्ज करें. प्रोटोकॉल प्रारंभ करें।
    6. प्रकाश / अंधेरे कक्ष और अंधेरे डालने तक पहुंचने के लिए ध्वनि-क्षीण क्यूबिकल के बाहर दराज को खींचें। धीरे से पूंछ के आधार से माउस को उठाएं, इसे कक्ष के प्रकाश क्षेत्र में रखें, और दराज को क्यूबिकल के अंदर धकेलें। सुनिश्चित करें कि सॉफ़्टवेयर माउस का तुरंत पता लगाता है और गतिविधि रिकॉर्ड करना शुरू कर देता है।
    7. 30 मिनट के बाद रिकॉर्डिंग को स्वचालित रूप से बंद करने के लिए प्रतीक्षा करें। माउस को उसके घर के पिंजरे में वापस कर दें।
    8. कक्ष और अंधेरे डालने को अल्कोहल-गंध कीटाणुनाशक डिस्पोजेबल वाइप्स का उपयोग करके साफ करें जिसमें 55.0% आइसोप्रोपाइल अल्कोहल, 0.25% अल्काइल C12-18 डाइमिथाइल एथिलबेंजाइल अमोनियम, और 0.25% अल्काइल C12-18 डाइमिथाइल बेंज़िल अमोनियम क्लोराइड को एंटी-माइक्रोबियल सक्रिय सामग्री के रूप में पिछले माउस द्वारा छोड़े गए किसी भी घ्राण संकेतों को खत्म करने के लिए।
    9. दिन 4 (pretreatment 2) पर, 1.2.1 करने के लिए 1.2.8 कदम दोहराएँ।
    10. दिन 7 (उपचार के दिन) पर, चरण 1.2.1 और 1.2.4 को दोहराएं। habituation के बाद, CGRP (0.1 मिलीग्राम / किग्रा, माउस शरीर के वजन के आधार पर 10 μl / g, इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन (i.p.)) का प्रशासन करें, माउस के सिर को आगे की ओर झुकाएं और निचले दाएं चतुर्थांश में इंजेक्ट करें। घर के पिंजरे में माउस वापस करें।
    11. 30 मिनट के बाद, प्रोटोकॉल शुरू करें और माउस को प्रकाश / अंधेरे कक्ष में चलाएं जैसा कि चरण 1.2.5 से 1.2.7 में उल्लेख किया गया है। इंजेक्शन के बाद घर के पिंजरों में वसूली का समय उपचार के आधार पर छोटा या लंबा किया जा सकता है21।
    12. चरण 1.2.8 में वर्णित के रूप में कक्ष और अंधेरे सम्मिलित करें को साफ करें।
    13. दिन 10 (उपचार के बाद के दिन) पर, चरण 1.2.1 से 1.2.8 तक दोहराएँ। प्रयोग को खुले क्षेत्र परख शुरू करने से पहले चरण 1.2.13 पर रोका जा सकता है।

2. खुला क्षेत्र परख

  1. उपकरण सेटअप
    1. खुला क्षेत्र कक्ष सेटअप: अंधेरे डालने का उपयोग किए बिना, प्रकाश / अंधेरे परख में उपयोग किए जाने वाले एक ही ध्वनि-attenuating क्यूबिकल और खुले क्षेत्र कक्ष का उपयोग करें।
    2. लाइट पैनल सेटअप: प्रकाश / अंधेरे परख में इस्तेमाल किया एक ही सेटअप का उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि प्रकाश तीव्रता प्रकाश / अंधेरे परख में इस्तेमाल के रूप में ही है।
  2. व्यवहार परीक्षण प्रक्रिया
    1. उपकरण को चालू करें। प्रकाश तीव्रता को 27,000 लक्स पर सेट करें।
    2. ट्रैकिंग सॉफ़्टवेयर खोलें.
    3. एक नया प्रोटोकॉल सेट अप करें, जैसा कि नए ज़ोन सेटिंग्स को छोड़कर प्रकाश / अंधेरे परख में उपयोग किया जाता है। नया ज़ोन सेटिंग्स में केंद्र के बाद 1 चुनें. परिधि को परिधि से 3.97 सेमी और केंद्र से 19.05 × 19.05 सेमी के रूप में सेट करें।
    4. चरण 1.2.4 में वर्णित के रूप में परीक्षण कक्ष के लिए habituate चूहों.
    5. सीजीआरपी (0.1 मिलीग्राम / किग्रा, माउस शरीर के वजन के आधार पर 10 μl / g, यानी, माउस के सिर को आगे की ओर झुकाते हुए और निचले दाएं चतुर्थांश में इंजेक्ट करना) का प्रशासन करें। घर के पिंजरे में माउस वापस करें।
    6. 30 मिनट के बाद, प्रोटोकॉल शुरू करें। ध्वनि-क्षीणन क्यूबिकल के बाहर पुल-आउट दराज खींचें और माउस को धीरे से खुले क्षेत्र कक्ष के बीच में रखें। दराज को क्यूबिकल के अंदर पुश करें।
    7. 30 मिनट के लिए व्यवहार ट्रैक करें। फिर चूहों को उनके घर के पिंजरों में वापस कर दें।
    8. चरण 1.2.8 में वर्णित के रूप में उपकरण को साफ करें।

3. ऑप्टोजेनेटिक चूहों के लिए संशोधित प्रकाश / अंधेरे परख

  1. उपकरण सेटअप
    1. अंधेरे डालने के लिए दो संशोधन करें।
      1. 5.08 x 5.08 सेमी (डब्ल्यू एक्स एच) के लिए अंधेरे डालने के उद्घाटन को संशोधित करें एक छोटे से भट्ठा के साथ 0.95 x 10.16 सेमी (डब्ल्यू एक्स एच) शीर्ष और अंधेरे डालने के उद्घाटन के बीच (चित्रा 1 डी शीर्ष बाईं ओर)।
        नोट:: यह संशोधन माउस को बिना किसी कठिनाई के अंधेरे क्षेत्र में जाने की अनुमति देता है जब माउस सिर पर फाइबर-ऑप्टिक कैनुला पैच कॉर्ड से जुड़ा होता है।
      2. एक त्रिकोणीय पोर्च (एच = 6.5 सेमी) के रूप में प्रकाश क्षेत्र पर अंधेरे डालने के शीर्ष का विस्तार करें (चित्रा 1 डी ऊपर दाएं और नीचे बाएं)। पोर्च से बाहर एक परिपत्र छेद (डी = 1.7 सेमी) काटें और रोटरी संयुक्त को रखने और स्थिर करने के लिए छेद में एक धारक डालें, जो लेजर और फाइबर-ऑप्टिक पैच कॉर्ड्स को जोड़ता है (चित्रा 1 डी ऊपर बाएं और नीचे बाएं)।
        नोट: संशोधनों के परिणामस्वरूप अंधेरे क्षेत्र के फर्श तक पहुंचने वाली प्रकाश तीव्रता में छोटे बदलाव होते हैं (संशोधनों के बिना संशोधनों बनाम 14 लक्स के साथ 17 लक्स, 27,000 लक्स के तहत अंधेरे क्षेत्र के पीछे-दाएं कोने पर मापा जाता है)।
    2. अंधेरे डालने पर धारक में रोटरी संयुक्त डालें।
    3. रोटरी संयुक्त के लिए 30.5 सेमी फाइबर ऑप्टिक पैच कॉर्ड कनेक्ट करें। पुष्टि करें कि रोटरी संयुक्त सुचारू रूप से घूम सकता है ताकि पैच कॉर्ड बिना किसी कठिनाई के घूम सके क्योंकि माउस कक्ष को पार करता है।
    4. सेटअप के बाकी हिस्सों के लिए, अनुभाग 1 (प्रकाश / अंधेरे परख) में उपयोग किए जाने वाले समान उपकरण सेटअप का उपयोग करें।
  2. व्यवहार परीक्षण प्रक्रिया
    नोट: wildtype चूहों के विपरीत, optogenetic चूहों पूर्व एक्सपोज़र (pretreatment 1 और 2) प्राप्त नहीं करते हैं।
    1. परीक्षण के दिन, पैच कॉर्ड को जोड़ने के लिए जगह की अनुमति देने के लिए एलईडी लाइट पैनल को दूसरे सबसे कम स्लॉट (कैम्बर के फर्श से 28.23 सेमी) में डालें। पर प्रकाश / अंधेरे परख उपकरण बारी और 55 लक्स करने के लिए प्रकाश तीव्रता सेट.
    2. 1.2.2 और 1.2.3 में उसी प्रोटोकॉल सेटअप का उपयोग करें सिवाय इसके कि डेटा बिन्स बाय ड्यूरेशन चरण 3.2.3 में लेजर उत्तेजना प्रोटोकॉल के अनुरूप होने के लिए नई विश्लेषण सेटिंग में 60 सेकंड पर सेट किया गया है।
    3. लेजर पावर बटन चालू करें। लेजर पल्स नियंत्रक सेट करने के लिए 1 मिनट के लिए उत्तेजित करने के लिए 1 मिनट के बाद 30 मिनट से अधिक उत्तेजना के बिना.
    4. परीक्षण से पहले 1 घंटे के लिए प्रकाश के साथ परीक्षण कक्ष में चूहों की आदत डालें।
    5. प्रोटोकॉल प्रारंभ करें। प्रकाश / अंधेरे कक्ष और अंधेरे डालने तक पहुंचने के लिए ध्वनि-क्षीण क्यूबिकल के बाहर पुल-आउट दराज खींचें।
    6. धीरे से माउस को रोकें और माउस सिर पर ऑप्टिक-फाइबर कैनुला को एक संभोग आस्तीन के माध्यम से फाइबर-ऑप्टिक पैच कॉर्ड में जोड़ें (चित्रा 1 डी नीचे दाईं ओर)। माउस को धीरे से प्रकाश क्षेत्र में रखें और दराज को क्यूबिकल के अंदर धकेलें। सुनिश्चित करें कि प्रोटोकॉल माउस व्यवहार को स्वचालित रूप से रिकॉर्ड करने के लिए शुरू हो जाएगा।
    7. 1 मिनट में, पल्स नियंत्रक पर स्विच करें और फिर failsafe कुंजी को चालू करने के लिए चालू करें। सुनिश्चित करें कि लक्षित मस्तिष्क क्षेत्र की लेजर उत्तेजना हर दूसरे मिनट में हो रही है।
    8. 30 मिनट के बाद जब प्रोटोकॉल स्वचालित रूप से बंद हो जाता है, तो failsafe कुंजी को बंद करने के लिए चालू करें। फिर पल्स कंट्रोलर को बंद कर दें।
    9. माउस और फाइबर ऑप्टिक पैच कॉर्ड uncouple. घर के पिंजरे में माउस वापस करें।
    10. चरण 1.2.8 में वर्णित के रूप में कक्ष और अंधेरे सम्मिलित करें को साफ करें।

4. ऑप्टोजेनेटिक चूहों के लिए संशोधित खुला क्षेत्र परख

  1. उपकरण सेटअप
    1. एक स्टैंड और एक क्लैंप (चित्रा 1 ई) का उपयोग करके कक्ष के ऊपर रोटरी संयुक्त को स्थिर करें।
    2. रोटरी संयुक्त के लिए 50 सेमी की लंबाई के साथ फाइबर ऑप्टिक पैच कॉर्ड कनेक्ट करें। जांचें कि क्या रोटरी संयुक्त सुचारू रूप से घूम सकता है।
    3. रोटरी संयुक्त को स्टैंड पर उचित ऊंचाई पर सेट करें: सुनिश्चित करें कि फाइबर-ऑप्टिक पैच कॉर्ड केवल कक्ष के हर कोने तक पहुंच सकता है, जो माउस आंदोलन के साथ किसी भी हस्तक्षेप से बचने में मदद करेगा।
    4. सेटअप के बाकी हिस्सों के लिए, अनुभाग 1 (प्रकाश / अंधेरे परख) में उपयोग किए जाने वाले समान उपकरण सेटअप का उपयोग करें, लेकिन अंधेरे डालने के बिना।
  2. व्यवहार परीक्षण प्रक्रिया
    1. पर प्रकाश / अंधेरे परख उपकरण बारी और 55 लक्स करने के लिए प्रकाश तीव्रता सेट.
    2. नए क्षेत्र सेटिंग्स को छोड़कर संशोधित प्रकाश / अंधेरे परख (अनुभाग 3) में उसी प्रोटोकॉल सेटअप का उपयोग करें। नए ज़ोन सेटिंग्स में केंद्र के अनुसार 1 चुनें. परिधि को परिधि से 3.97 सेमी और केंद्र से 19.05 × 19.05 सेमी के रूप में सेट करें।
    3. लेजर पावर बटन चालू करें। 30 मिनट से अधिक उत्तेजना के बिना 1 मिनट के बाद 1 मिनट के लिए उत्तेजित करने के लिए लेजर पल्स नियंत्रक सेट करें।
    4. चरण 3.2.4 से 3.2.10 में वर्णित परीक्षण के रूप में habituation और परीक्षण के बाकी प्रदर्शन करें चरण 3.2.6 में दो परिवर्तनों को छोड़कर: माउस को प्रकाश क्षेत्र के बजाय कक्ष के बीच में धीरे से रखें; माउस के सिर से जुड़ने वाले पैच कॉर्ड के कारण क्यूबिकल के बाहर पुल-आउट दराज रखें।

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Representative Results

यह व्यवहार परीक्षण प्रतिमान प्रकाश-प्रतिकूल व्यवहार का परीक्षण करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। यह दोनों भोले wildtype चूहों और optogenetic चूहों का उपयोग कर एक लक्षित न्यूरोनल आबादी की उत्तेजना के दौरान वास्तविक समय में प्रकाश घृणा की जांच करने के लिए प्रदर्शन किया जा सकता है।

इस प्रक्रिया का उपयोग CD1 और C57BL/ 6J mice10,16 में परिधीय CGRP उपचार के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए किया गया है और प्रकाश-प्रतिकूल व्यवहार पर C57BL / 6J mice19 में पश्चवर्ती थैलेमिक नाभिक में न्यूरॉन्स की ऑप्टिकल उत्तेजना। 10-20 सप्ताह की आयु के पुरुषों और महिलाओं दोनों सहित चूहों का उपयोग प्रयोगों में किया गया था (चित्रा 2 ए, चित्रा 2 बी-डी, और चित्रा 3)। परिणामों से पता चला है कि सीजीआरपी के आई.पी. इंजेक्शन ने सीडी 1 (चित्रा 2 ए) और सी 57बीएल / 6 जे (चित्रा 2 बी) चूहों में प्रकाश / अंधेरे परख में प्रकाश क्षेत्र में प्रकाश क्षेत्र में बिताए गए समय की अवधि को काफी कम कर दिया, लेकिन सीडी 1 (डेटा नहीं दिखाया गया) और C57BL / 6J चूहों (चित्रा 2 डी) 10 में खुले क्षेत्र परख में केंद्र में बिताए गए समय चूहों को प्रभावित नहीं किया, १६ । इससे पता चलता है कि परिधीय सीजीआरपी प्रकाश घृणा को प्रेरित करता है लेकिन सामान्य चिंता नहीं है। सीजीआरपी के साथ उपचार ने अंधेरे क्षेत्र में आराम करने वाले समय चूहों की मात्रा में भी वृद्धि की, लेकिन सीडी 1 (डेटा नहीं दिखाया गया) और सी 57बीएल / 6 जे चूहों (चित्रा 2 सी) दोनों में प्रकाश क्षेत्र में नहीं।

ऑप्टोजेनेटिक प्रोटोकॉल के लिए, हमने Calmodulin kinase II अल्फा (CaMKIIa) को लक्षित किया - AAV2-CaMKIIa-hChR2 (E123A) -eYFP या नियंत्रण वायरस AAV2-CaMKIIa-eYFP19 को इंजेक्ट करके पीछे के थैलेमिक नाभिक में न्यूरॉन्स को व्यक्त किया। उसी समय, एक फाइबर-ऑप्टिक कैनुला को पीछे के थैलेमिक नाभिक में प्रत्यारोपित किया गया था। ChR2 अभिव्यक्ति के लिए पर्याप्त समय की अनुमति देने के लिए इंजेक्शन के तीन सप्ताह बाद, हमने पीछे के थैलेमिक नाभिक में न्यूरॉन्स की ऑप्टिकल उत्तेजना का प्रदर्शन किया और सीएचआर 2-इंजेक्टेड चूहों में प्रकाश क्षेत्र में बिताए गए अवधि चूहों में इसी तरह की कमी का उल्लेख किया, जो वायरस-इंजेक्टेड चूहों (eYFP) (चित्रा 3 ए) को नियंत्रित करने की तुलना में ChR2-इंजेक्टेड चूहों में प्रकाश क्षेत्र में खर्च किया गया था। ChR2 और नियंत्रण eYFP चूहों (चित्रा 3 C) के बीच खुले क्षेत्र परख में केंद्र में समय में कोई उल्लेखनीय अंतर नहीं था, जो एक प्रकाश-प्रतिकूल प्रतिक्रिया का संकेत है जो पूरी तरह से चिंता 19 से प्रेरित नहीं था। इसके अलावा, अंधेरे क्षेत्र में आराम के समय में वृद्धि, लेकिन प्रकाश क्षेत्र में नहीं, यह भी नोट किया गया था (चित्रा 3 बी)। 55 लक्स और 27,000 लक्स (चित्रा 3) का उपयोग करते समय एक ही परिणाम प्राप्त किए गए थे। 55-लक्स प्रक्रिया को शामिल किया गया था क्योंकि माइग्रेन के रोगी मंद प्रकाश के प्रति भी संवेदनशील होते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: प्रकाश / अंधेरे परख समयरेखा और उपकरण( ए) परीक्षण प्रतिमान की समयरेखा: प्रकाश / अंधेरे कक्ष (पूर्व 1 और पूर्व 2) के लिए दो पूर्व-एक्सपोजर के बाद, चूहों को सीजीआरपी (0.1 मिलीग्राम / किग्रा, आई.पी.) प्रशासित किया जाता है, जिसके बाद एक पोस्ट-उपचार माप (पोस्ट) होता है। प्रकाश / अंधेरे परख के बाद कम से कम एक दिन, चूहों को CGRP (0.1 मिलीग्राम / किग्रा, i.p.) फिर से दिया जाता है और खुले क्षेत्र परख में चलाया जाता है। पूर्व: pretreatment; Tx: उपचार; पोस्ट: पोस्ट-ट्रीटमेंट (बी) एलईडी पैनल को एक ऐक्रेलिक शेल्फ द्वारा कक्ष के शीर्ष पर आयोजित किया जाता है और परीक्षण क्षेत्र को रोशन करता है। प्रकाश पैनल की ऊंचाई को विभिन्न ऊंचाइयों पर स्लॉट का उपयोग करके समायोजित किया जा सकता है। (C) प्रकाश / अंधेरे कक्ष में एक छोटे से उद्घाटन के साथ एक अंधेरा सम्मिलित होता है। एक एलईडी लाइट पैनल कक्ष के ऊपर है। (डी) सामने, पक्ष, और संशोधित अंधेरे डालने के शीर्ष दृश्य। अंधेरे सम्मिलित में उद्घाटन पैच कॉर्ड (ऊपर बाएं) के आंदोलन के लिए एक छोटे से भट्ठा के साथ बढ़ाया जाता है। अंधेरे सम्मिलित का शीर्ष रोटेटरी संयुक्त (ऊपर दाएं और नीचे बाएं) के लिए एक धारक के साथ एक त्रिकोणीय पोर्च के रूप में प्रकाश क्षेत्र पर फैला हुआ है। ऑप्टिक-फाइबर पैच कॉर्ड एक संभोग आस्तीन (नीचे दाएं) के माध्यम से फाइबर-ऑप्टिक कैनुला से जुड़ा हुआ है। (ई) संशोधित खुला क्षेत्र परख. स्टैंड और क्लैंप रोटेटरी संयुक्त को पकड़ते हैं। कक्ष को माउस के सिर से जुड़े पैच कॉर्ड के साथ माउस के मुक्त आंदोलन की अनुमति देने के लिए खुले छोड़े गए दरवाजों के साथ क्यूबिकल के सामने खींच लिया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: परिधीय सीजीआरपी प्रशासन वाइल्डटाइप चूहों के दो उपभेदों में उज्ज्वल प्रकाश में प्रकाश घृणा पैदा करता है। CD1 और C57/BL6J चूहों का परीक्षण चित्र 1A में वर्णित समयरेखा के अनुसार किया गया था। (ए) सीडी 1 चूहों ने 30 मिनट (27,000 लक्स) से अधिक प्रति 5 मिनट के अंतराल पर प्रकाश क्षेत्र में बिताया समय। प्रकाश डेटा में समय परीक्षण (बाएं पैनल) के दौरान समय के साथ और व्यक्तिगत चूहों (दाएं पैनल) के लिए प्रति 5 मिनट के अंतराल पर औसत समय के रूप में दिखाया गया है। प्रत्येक समय बिंदु पर वाहन और सीजीआरपी के बीच तुलना की गई थी, और Tx और Pre2 या पोस्ट के बीच जैसा कि कोष्ठक द्वारा इंगित किया गया था। (Veh, n = 19; 0.1 मिलीग्राम / किग्रा सीजीआरपी, एन = 19) (बी) समय C57BL / 6J चूहों ने 30 मिनट (27,000 लक्स) से अधिक प्रति 5 मिनट के अंतराल पर प्रकाश क्षेत्र में खर्च किया। हल्के डेटा में समय परीक्षण (बाएं पैनल) के दौरान समय के साथ और व्यक्तिगत चूहों (दाएं पैनल) के लिए प्रति 5 मिनट के अंतराल पर औसत समय के रूप में दिखाया जाता है (Veh, n = 42; 0.1 मिलीग्राम / किग्रा सीजीआरपी, एन = 44)। (सी) पैनल बी से चूहों को प्रकाश / अंधेरे परख के दौरान अंधेरे और प्रकाश क्षेत्रों में आराम व्यवहार के लिए भी विश्लेषण किया गया था। (डी) पैनल बी से चूहों को बाद में खुले क्षेत्र परख में परीक्षण किया गया था। वाहन या सीजीआरपी (0.1 मिलीग्राम / किग्रा, आई.पी.) के साथ उपचार के बाद 30 मिनट से अधिक प्रति 5 मिनट के अंतराल पर चैंबर के केंद्र में बिताए गए समय का प्रतिशत (Veh, n = 9; 0.1 मिलीग्राम / किग्रा सीजीआरपी, एन = 9)। केंद्र डेटा में समय का प्रतिशत परीक्षण (बाएं पैनल) के दौरान समय के साथ और व्यक्तिगत चूहों (दाएं पैनल) के लिए प्रति 5 मिनट के अंतराल पर केंद्र में समय के औसत प्रतिशत के रूप में दिखाया गया है। सभी पैनलों के लिए, माध्य±SEM दिखाया गया है, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001. इस आंकड़े को मेसन एट अल. 201710 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: पीछे के थैलेमिक नाभिक में CaMKIIa-अभिव्यक्त न्यूरॉन्स की ऑप्टिकल उत्तेजना मंद और उज्ज्वल दोनों प्रकाश में प्रकाश घृणा को प्रेरित करती है। (A) C57BL/6J चूहों के पश्चवर्ती थैलेमिक नाभिक को AAV एन्कोडिंग के साथ इंजेक्ट किया जाता है या तो ChR2 या eYFP (55 lux पर: eYFP n = 8, ChR2 n = 11; 27,000 लक्स पर: eYFP n = 12, ChR2 n = 18) नीले रंग के लेजर (47 nm) द्वारा उत्तेजित किया गया था। 20 हर्ट्ज, 5 एमएस पल्स चौड़ाई, 10 mW / mm2)। बायां पैनल 55 या 27,000 लक्स पर 30 मिनट से अधिक प्रति 5 मिनट के अंतराल पर प्रकाश क्षेत्र में बिताए गए समय चूहों को दिखाता है। प्रत्येक समय बिंदु पर eYFP और ChR2 समूहों के बीच तुलना की गई थी। सही पैनल व्यक्तिगत चूहों के लिए प्रति 5 मिनट अंतराल प्रति औसत समय दिखाता है। (बी) पैनल ए से चूहों को प्रकाश (बाएं पैनल) और अंधेरे (दाएं पैनल) क्षेत्रों में प्रकाश / अंधेरे परख के दौरान आराम करने के व्यवहार के लिए भी विश्लेषण किया गया था। (सी) पैनल ए से चूहों को बाद में खुले क्षेत्र परख में परीक्षण किया गया था। 30 मिनट से अधिक प्रति 5 मिनट के अंतराल पर खुले क्षेत्र कक्ष के केंद्र में बिताए गए समय का औसत प्रतिशत (लेजर: 473 एनएम, 20 हर्ट्ज, 5 एमएस पल्स चौड़ाई, 10 mW / mm2)। (eYFP n = 8, ChR2 n = 9)। सभी पैनलों के लिए, माध्य±SEM दिखाया गया है, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001. इस आंकड़े को Sowers et al. 202019 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

प्रकाश / अंधेरे परख व्यापक रूप से चिंता की तरह व्यवहार का आकलन करने के लिए उपयोग किया जाता है12. परख प्रकाश के लिए चूहों के जन्मजात घृणा पर निर्भर करता है और जब एक उपन्यास वातावरण (प्रकाश क्षेत्र) में रखा जाता है तो पता लगाने के लिए उनके ड्राइव। हालांकि, जैसा कि हम यहां रिपोर्ट करते हैं, इस परख का उपयोग प्रकाश-प्रतिकूल व्यवहार का आकलन करने के लिए भी किया जा सकता है।

परीक्षण से पहले पूर्व-एक्सपोज़र की संख्या और आवश्यकता पर विचार करना महत्वपूर्ण है। यह माउस तनाव या मॉडल पर निर्भर करता है। उदाहरण के लिए, हमारे प्रकाश / अंधेरे परख प्रोटोकॉल में, भोले वाइल्डटाइप सीडी 1 और सी 57बीएल / 6 जे चूहों को उपचार परीक्षण प्रक्रिया से गुजरने से पहले दो बार प्रकाश / अंधेरे कक्ष के संपर्क में लाया जाता है, जबकि ऑप्टोजेनेटिक चूहों को पूर्व-जोखिम से नहीं गुजरना पड़ता है। हाल के एक प्रकाशन ने बताया कि एक पूर्व-एक्सपोजर सीडी 1 चूहों के लिए आई.पी. सीजीआरपी एडमिनिस्ट्रेशन 17 के बाद प्रकाश घृणा प्रदर्शित करने के लिए पर्याप्त है। नतीजतन, नवीनता पैरामीटर का महत्व उपचार दिन 10,16 के आगमन पर कम हो जाएगा। पूर्व-एक्सपोज़र अन्वेषणात्मक ड्राइव को कम करके और इस प्रकार अन्वेषण और घृणा के बीच संतुलन को बदलकर प्रकाश-प्रतिकूल फेनोटाइप को अनमास्क कर सकते हैं। कुछ मामलों में, पूर्व-एक्सपोजर आवश्यक नहीं है। उदाहरण के लिए, तंत्रिका तंत्र में बढ़ी हुई सीजीआरपी रिसेप्टर्स के साथ आनुवंशिक रूप से परिवर्तित चूहों के साथ, पूर्व-जोखिम आवश्यक नहीं था14। इसी तरह, ऑप्टोजेनेटिक रूप से हेरफेर किए गए चूहों के साथ, जिसमें पीछे के थैलेमिक नाभिक में कैमकेआईआईए-व्यक्त न्यूरॉन्स को ऑप्टिकल उत्तेजना के लिए लक्षित किया गया था, पूर्व-एक्सपोजर आवश्यक नहीं था, संभवतः क्योंकि प्रकाश-प्रतिकूल प्रतिक्रिया मस्तिष्क की प्रत्यक्ष उत्तेजना पर इतनी मजबूत थी। इस प्रकार, विभिन्न माउस उपभेदों या मॉडलों का उपयोग करते समय कक्ष में पूर्व-एक्सपोज़र की संख्या और आवश्यकता पर सावधानीपूर्वक विचार किया जाना चाहिए। दरअसल, कक्ष में चूहों का ओवरएक्सपोजर अन्वेषणात्मक व्यवहार को कम कर सकता है। इससे चूहों को उपचार की परवाह किए बिना अंधेरे क्षेत्र पर प्राथमिकता से कब्जा कर लिया जाएगा, जिसमें एक प्रकाश-प्रतिकूल प्रतिक्रिया का निरीक्षण करने की क्षमता को कम किया जा सकता है। इसके विपरीत, परख के लिए अपर्याप्त पूर्व-जोखिम संभावित प्रकाश-प्रतिकूल व्यवहार को मास्किंग अन्वेषणात्मक व्यवहार का कारण बन सकता है।

एक पोस्ट-ट्रीटमेंट एक्सपोजर यह पहचानने के लिए कार्य करता है कि क्या एक माउस 2 दिन पहले प्रशासित सीजीआरपी इंजेक्शन से पूरी तरह से ठीक हो गया है। यह खुले क्षेत्र परख या किसी भी अन्य परख को चलाने से पहले आवश्यक है यह पुष्टि करने के लिए कि कोई लंबे समय तक उपचार प्रभाव मौजूद है कि भविष्य के व्यवहार परीक्षणों को प्रभावित करेगा मौजूद है.

हमने पिछले अवलोकनों के आधार पर 30 मिनट की प्रोटोकॉल अवधि का विकल्प चुना। हम 10 min15, 20 min16 और 30 min10 अलग से के लिए प्रकाश / अंधेरे परख में चूहों का परीक्षण किया है। सीजीआरपी ने 0-30 मिनट के बीच प्रकाश में बिताए गए समय की मात्रा को कम कर दिया, लेकिन पिछले 30 मिनट के नियंत्रण चूहों ने 0-30 मिनट की तुलना में अंधेरे में अधिक समय बिताना पसंद किया, इसलिए 30 मिनट के लिए परीक्षण करने का निर्णय लिया गया। एक समान फैशन में, परीक्षण अवधि को विभिन्न माउस मॉडलों के लिए समय-प्रतिक्रिया वक्र के संदर्भ में समायोजित किया जा सकता है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि प्रकाश / अंधेरे कक्ष के लिए एक्सपोजर समय को लंबा करने से प्रकाश क्षेत्र का पता लगाने के लिए प्रेरणा कम हो सकती है।

हमने जानवरों के व्यवहार का आकलन करने के लिए कई अलग-अलग मापदंडों का विश्लेषण किया। प्रकाश / अंधेरे परख की एक आवश्यक विशेषता उस समय का एक माप है जो माउस प्रकाश क्षेत्र में खर्च करता है, सीधे प्रकाश घृणा को दर्शाता है। आराम करने में बिताए गए समय का प्रतिशत, प्रकाश या अंधेरे क्षेत्रों में ऊर्ध्वाधर बीम ब्रेक (पालन गतिविधि को मापने के लिए) की संख्या, और गतिशीलता का आकलन करने के लिए दो क्षेत्रों के बीच संक्रमण की संख्या का उपयोग किया जाता है। आंदोलन के बारे में झूठे निष्कर्षों से बचने के लिए प्रत्येक क्षेत्र में बिताए गए समय के लिए आराम करने का समय और ऊर्ध्वाधर बीम ब्रेक को सामान्यीकृत किया जाता है। हम विश्लेषण में सभी चूहों को शामिल करते हैं सिवाय इसके कि: चूहे जो परीक्षण के पूरे 30 मिनट के लिए प्रकाश क्षेत्र में रहते हैं, चूहे जो कुल (प्रकाश और अंधेरे क्षेत्र दोनों) में आराम करने में 90% से अधिक समय बिताते हैं, और सांख्यिकीय आउटलायर्स (>3 एसडी औसत से)। बाहर रखे गए चूहों की संख्या आमतौर पर 1% से कम होती है। खुले क्षेत्र परख के लिए, केंद्र में समय का प्रतिशत चिंता की तरह व्यवहार का आकलन करने के लिए उपयोग किया जाने वाला मुख्य माप है।

संशोधित प्रकाश / अंधेरे परख में, कुछ मस्तिष्क क्षेत्रों में फाइबर ऑप्टिक कैनुला की स्थिति माउस आंदोलन को बहुत प्रतिबंधित कर सकती है और कुछ उदाहरणों में, माउस को अंधेरे क्षेत्र तक पहुंचने से रोक सकती है। नतीजतन, अंधेरे क्षेत्र में प्रवेश नकारात्मक रूप से प्रबलित होगा और, कई प्रयासों के बाद, माउस प्रकाश के लिए एक सीखी हुई वरीयता दिखा सकता है, यहां तक कि पूरे परीक्षण अवधि के दौरान प्रकाश क्षेत्र में भी रह सकता है। इसे अंधेरे सम्मिलित में उद्घाटन के आकार और आकार को संशोधित करके ठीक किया जा सकता है। एक उदाहरण के रूप में, जब फाइबर-ऑप्टिक कैनुला को वाइल्डटाइप C57BL / 6J चूहों के सेरिबैलम में स्थापित किया गया था, तो चूहों को अंधेरे सम्मिलित के उद्घाटन को पार करने में कठिनाई हुई थी। उद्घाटन की चौड़ाई को 5.08 सेमी के बजाय 6.10 सेमी तक बदलने के बाद, चूहे उद्घाटन को स्वतंत्र रूप से पार करने में सक्षम थे।

एक 30.5 सेमी फाइबर ऑप्टिक पैच कॉर्ड संशोधित प्रकाश / अंधेरे परख में उपयोग किया जाता है, खुले क्षेत्र कक्ष के आकार के आधार पर, माउस को स्वतंत्र रूप से स्थानांतरित करने की अनुमति देता है। एक छोटी कॉर्ड लंबाई एक माउस को कोनों पर जाने से रोकेगी, जबकि एक लंबी केबल उलझ सकती है और आंदोलन में बाधा डाल सकती है। संशोधित खुले क्षेत्र परख के लिए इस्तेमाल फाइबर ऑप्टिक पैच कॉर्ड की लंबाई 50 सेमी है। लंबाई के रूप में के रूप में सख्त नहीं है कि प्रकाश / अंधेरे परख में के बाद से रोटरी संयुक्त की ऊंचाई फाइबर ऑप्टिक पैच केबल की लंबाई के अनुसार समायोजित किया जा सकता है, यह सुनिश्चित करते हुए कि माउस सिर्फ कक्ष के कोनों तक पहुँचने में सक्षम है.

शक्ति विश्लेषण के आधार पर, प्रति समूह 10-12 चूहों को CD1 और C57BL / 6J चूहों के लिए i.p. CGRP के साथ, और ऑप्टोजेनेटिक C57BL / 6J चूहों के लिए महत्वपूर्ण प्रकाश घृणा का पता लगाने के लिए आवश्यक है। हालांकि, C57BL/6J समूह का आकार CD1 समूह आकार (चित्रा 2A, B) से काफी बड़ा था क्योंकि C57BL/6J चूहे परीक्षण10 के सबसेट में CGRP के लिए अनुत्तरदायी थे, जिसका अर्थ है कि इन चूहों में प्रकाश-प्रतिकूल व्यवहार में इस उच्च परिवर्तनशीलता के लिए कई परीक्षण आयोजित किए गए थे। विशेष रूप से, सीडी 1 चूहों के लिए दो प्रयोगों को संयुक्त किया गया था और चार प्रयोगों को सी 57बीएल / 6 जे चूहों के लिए आई.पी. सीजीआरपी (चित्रा 2 ए, बी) 10 के साथ जोड़ा गया था। इस परिवर्तनशीलता का कारण ज्ञात नहीं है, लेकिन मनुष्य सीजीआरपी और प्रकाश के लिए अपनी प्रतिक्रियाओं में परिवर्तनशीलता भी दिखाते हैं। सीजीआरपी के अंतःशिरा (i.v.) इंजेक्शन ने माइग्रेन के लगभग 63 ~ 75% रोगियों में माइग्रेन के हमलों को प्रेरित किया, जिसमें 70 ~ 90% रोगियों ने माइग्रेन के हमलों को प्रदर्शित किया, जिन्होंने फोटोफोबिया 22,23,24,25 का प्रदर्शन करते हुए माइग्रेन के हमलों को प्रदर्शित किया। कुल मिलाकर, परख काफी परिवर्तनशीलता है और चूहों की संख्या के अलावा, यह चूहों के विभिन्न साथियों के साथ कम से कम दो और अधिमानतः तीन पूरी तरह से स्वतंत्र प्रयोग करने के लिए आवश्यक है।

प्रकाश / अंधेरे कक्ष में बिस्तर की आवश्यकता नहीं होती है और प्रयोगकर्ता को चूहों को पूर्व-संभालने या आदत डालने की आवश्यकता नहीं होती है। एक एहतियाती उपाय के रूप में दो पूर्व-एक्सपोजर प्रक्रियाएं प्रयोगकर्ता के घ्राण और शारीरिक संकेतों के लिए चूहों को अनुकूलित करने के उद्देश्य से काम करती हैं; हालांकि, Ueno H. et al. ने प्रदर्शित किया कि प्रकाश में प्रकाश में समय में कोई अंतर नहीं है / अंधेरे परख या केंद्र में समय में खुले क्षेत्र परख में चूहों के बीच बार-बार हैंडलिंग और चूहों के बाद कोई हैंडलिंग 26 के साथ।

खुला क्षेत्र परख एक प्रकाश-प्रतिकूल फेनोटाइप की ओर चिंता के योगदान का आकलन कर सकते हैं। अन्य अच्छी तरह से मान्य चिंता से संबंधित assays हैं, जैसे कि ऊंचा शून्य भूलभुलैया और ऊंचा प्लस भूलभुलैया 27; हालांकि, खुला क्षेत्र परख प्रकाश / अंधेरे प्रोटोकॉल के लिए सबसे अधिक प्रक्रियात्मक रूप से प्रासंगिक नियंत्रण है क्योंकि एक ही परीक्षण कक्ष दोनों assays के लिए उपयोग किया जाता है। फिर भी, चिंता के मूल्यांकन को कई assays का उपयोग करके या एक ही परीक्षण में कई मापदंडों को मापकर मजबूत किया जा सकता है, यह देखते हुए कि चिंता एक जटिल और बहुआयामी व्यवहार है। महत्वपूर्ण रूप से, भले ही खुले क्षेत्र परख में कोई चिंता फेनोटाइप न हो, यह प्रकाश-प्रतिकूल फेनोटाइप के लिए एक चिंता घटक को खारिज नहीं करता है। उदाहरण के लिए, प्रकाश एक चिंता प्रतिक्रिया को ट्रिगर कर सकता है। खुला क्षेत्र परख केवल इंगित करता है कि चिंता अकेले प्रकाश के लिए प्रतिक्रिया ड्राइविंग नहीं है. जबकि एक anxiolytic दवा, जैसे benzodiazepame, इस परख में इस्तेमाल किया जा सकता है, इस तरह के एक दृष्टिकोण जटिलताओं होगा, उदाहरण के लिए, anxiolytic दवाओं लोकोमोशन को प्रभावित करते हैं। इसके बजाय, हमने प्रकाश-प्रतिकूल फेनोटाइप की माइग्रेन जैसी स्थिति को मान्य करने के लिए सुमाट्रिप्टन सहित नैदानिक एंटी-माइग्रेन दवाओं का उपयोग करने का विकल्प चुना। Sumatriptan सफलतापूर्वक CD1 और C57BL / 6J mice10 दोनों में CGRP-प्रेरित प्रकाश घृणा उलट दिया।

संशोधित प्रकाश / अंधेरे परख के विपरीत, पुल-आउट दराज पर कक्ष माउस के सिर से जुड़ने वाले पैच कॉर्ड के कारण संशोधित खुले क्षेत्र परख में खुले क्यूबिकल दरवाजों के साथ क्यूबिकल के बाहर है। 55 लक्स के बजाय, कमरे की रोशनी ~ 1000 लक्स पर कक्ष के फर्श तक पहुंचती है। भले ही प्रकाश तीव्रता अलग है, खुले क्षेत्र परख एक प्रकाश स्वतंत्र परीक्षण है. विस्तार से, खुले क्षेत्र परख में 55 से 27,000 लक्स तक प्रकाश तीव्रता में वृद्धि के परिणामस्वरूप C57BL / 6J चूहों में केंद्र में समय में कमी की प्रवृत्ति हुई, यह सुझाव देते हुए कि प्रकाश तीव्रता माउस व्यवहार को प्रभावित कर सकती है28। हालांकि, नियंत्रण और प्रयोगात्मक समूहों के बीच का अंतर न तो 55 और न ही 27,000 लक्स 28 के तहत महत्वपूर्ण नहीं था। इसके अतिरिक्त, 55 और 1000 लक्स के बीच प्रकाश तीव्रता में अंतर 55 और 27,000 लक्स के बीच की तुलना में कहीं अधिक सूक्ष्म है। वायरलेस ऑप्टोजेनेटिक्स इस समस्या को हल कर सकते हैं क्योंकि कोई पैच कॉर्ड नहीं होगा, जिससे खुले क्षेत्र कक्ष को ध्वनि-क्षीण करने वाले क्यूबिकल के अंदर धकेल दिया जा सकता है।

इसके अलावा, पैच कॉर्ड अभी भी एक इष्टतम लंबाई का चयन करने के बावजूद माउस आंदोलन को सीमित करता है। भविष्य में, वायरलेस ऑप्टोजेनेटिक्स केबल-आधारित ऑप्टोजेनेटिक तकनीकों के लिए एक गैर-इनवेसिव विकल्प प्रदान करेगा।

यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि हमने सीजीआरपी के तीव्र इंजेक्शन का उपयोग किया, जो केवल लंबे समय तक सीजीआरपी रिलीज के हिस्से में दोहराता है जो माइग्रेन के हमलों के साथ होता है। जबकि हमने इस आधार पर माइग्रेन को मॉडल करने के लिए चूहों में सीजीआरपी इंजेक्ट किया कि प्लाज्मा सीजीआरपी के स्तर में वृद्धि हुई थी29 और माइग्रेन रोगियों में आईवी सीजीआरपी प्रेरित माइग्रेन के हमले 22,23,24,25,30, यह रोगी में स्थिति को दोहराएगा नहीं जहां सीजीआरपी को अपेक्षाकृत लंबे समय तक उच्च स्तर पर बनाए रखा जाता है (माइग्रेन शुरू होने के 3 घंटे बाद रोगी माप लिया गया था29 ), और न ही यह क्रोनिक माइग्रेन को दोहराता है जहां स्तरों को हमलों के बीच भी ऊंचा होने की सूचना दी जाती है31। इसके अलावा, अन्य दर्द-प्रेरित मध्यस्थों को हमारे प्रतिमान में परीक्षण नहीं किया गया है।

मोगिल समूह ने चूहों में प्रकाश घृणा को मापने के लिए ऊंचा प्लस भूलभुलैया को संशोधित किया, जिसमें बंद हथियारों को उज्ज्वल प्रकाश से रोशन किया जा रहा था और खुली बाहों को अंधेरे 32 शेष रखा गया था। मानक ऊंचा प्लस भूलभुलैया अक्सर जानवरों में चिंता से संबंधित व्यवहार का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया है। यह परख एक माउस की जन्मजात इच्छा के बीच संघर्ष पर आधारित है एक उपन्यास वातावरण का पता लगाने के लिए और खुले असुरक्षित भूलभुलैया हथियारों में एक समझौता करने की स्थिति में रखा जा रहा है। संशोधित प्रोटोकॉल में, चूहों को बंद हथियारों के बीच चयन करने के लिए मजबूर किया जाता है, जो उज्ज्वल प्रकाश से रोशन होते हैं, और खुली असुरक्षित बाहों, जो अंधेरे होते हैं। पूर्व के लिए वरीयता से पता चलता है कि चिंता प्रकाश घृणा को खत्म कर देती है जबकि उत्तरार्द्ध की प्राथमिकता से पता चलता है कि प्रकाश घृणा चिंता पर प्राथमिकता लेती है। मोगिल समूह ने चिंता जैसे व्यवहार का मूल्यांकन करने के लिए एक मानक ऊंचा प्लस भूलभुलैया भी आयोजित किया। उद्देश्य हमारे प्रोटोकॉल में खुले क्षेत्र परख के संचालन के रूप में ही है। Cacna1a उत्परिवर्ती चूहों, एक पारिवारिक hemiplegic माइग्रेन मॉडल, photophobia दिखाया जब बंद हथियार उज्ज्वल थे. इसके विपरीत, चिंता जैसे व्यवहार का पता नहीं चला था जब मानक ऊंचा प्लस भूलभुलैया आयोजित किया गया था32। चूहों में, संशोधित ऊंचा प्लस भूलभुलैया और प्रकाश / अंधेरे परख दोनों का उपयोग करके, यह प्रदर्शित किया गया था कि नाइट्रोग्लिसरीन (एनटीजी) फोटोफोबिया 33,34 को प्रेरित करने में सक्षम था, जिसे सुमाट्रिप्टन 34 द्वारा बचाया गया था। मानक ऊंचा प्लस भूलभुलैया सेटिंग में जहां प्रकाश बंद हथियारों के भीतर अनुपस्थित है, NTG प्रेरित चिंता की तरह व्यवहार चूहों 34 में, यह सुझाव देते हुए कि NTG-प्रेरित प्रकाश aversion चिंता के साथ है। हमारे ज्ञान के लिए, वहाँ प्रकाश का उपयोग कर कोई प्रकाशन नहीं कर रहे हैं / कुल मिलाकर, दोनों संशोधित ऊंचा प्लस भूलभुलैया और इस प्रोटोकॉल में प्रस्तावित प्रकाश / अंधेरे परख चूहों में प्रकाश-प्रतिकूल व्यवहार के प्रभावी उपायों के रूप में प्रदर्शित किया गया है।

हम एक दिन के उजाले-संतुलित रंग (5600K) के साथ डेलाइट एलईडी पैनल का उपयोग करते हैं, जिसमें 60 डिग्री बाढ़ बीम फैलता है, जिससे 55 लक्स या 27,000 लक्स पर चैंबर के फर्श से ~ 30 सेमी की ऊंचाई पर कोई छायांकन नहीं होता है। प्रकाश घृणा की जांच करने वाले अन्य अध्ययनों ने अलग-अलग संशोधनों के साथ प्रकाश / अंधेरे परख का उपयोग किया है। उदाहरण के लिए, अध्ययनों ने प्रकाश क्षेत्र के लिए अलग-अलग प्रकाश तीव्रता का उपयोग किया है, जो सैकड़ों से लेकर हजारों लक्स 35,36,37 तक है; विभिन्न तरंग दैर्ध्य (जैसे नीले और पीले) पर प्रकाश का उपयोग किया जाता है 38; या प्रकाश के विभिन्न तापमान (ठंडा और गर्म) 39 का उपयोग किया। प्रकाश द्वारा उत्पादित गर्मी के लिए सावधानी बरती जानी चाहिए क्योंकि यह अंधेरे और प्रकाश क्षेत्रों के तापमान को प्रभावित कर सकता है और चूहों के व्यवहार में हस्तक्षेप कर सकता है, संभावित रूप से एक विशिष्ट क्षेत्र को वरीयता दे सकता है। इसके अलावा, कक्ष के फर्श पर छाया से बचने के लिए एक अच्छे देखने के कोण के साथ प्रकाश का उपयोग करना भी महत्वपूर्ण है। परीक्षण के लिए प्रकाश की तीव्रता भी महत्वपूर्ण है। 25,000 -27,000 लक्स लगभग उज्ज्वल दिन के उजाले के बराबर है। इस तरह के एक उच्च प्रकाश तीव्रता पर प्रकाश / अंधेरे परख का संचालन करके, उपचार प्रभाव को बढ़ाना संभव है; हालांकि, रेटिना क्षति 40 और माउस की प्रकाश में जाने की इच्छा पर इस तरह के उच्च प्रकाश तीव्रता के नकारात्मक प्रभाव पर विचार करना आवश्यक है। कुछ अध्ययनों ने बताया कि माउस आंखें प्रत्यक्ष प्रकाश 41 के संपर्क में आती हैं और चूहों को कई घंटों के लिए उज्ज्वल प्रकाश के संपर्क में लाया जाता है (उदाहरण के लिए 4 घंटे 42 के लिए 30,000 लक्स) रेटिना क्षति का अनुभव होता है। प्रकाश / अंधेरे परख में, माउस के लिए उज्ज्वल प्रकाश से बचने के लिए एक अंधेरे क्षेत्र है यदि माउस चाहता है। इसके अलावा, पिछले अध्ययनों में पाया गया कि नियंत्रण समूह (C57BL / 6J चूहों) में चूहों ने 55, 1000 और 27,000 lux28 के तहत प्रकाश क्षेत्र में समान समय बिताया। CD1 चूहों के लिए, नियंत्रण समूह ने 27,000 lux10 के तहत प्रकाश में लगभग 1/3 समय बिताया और अप्रकाशित डेटा ने 55 लक्स पर समान परिणाम दिखाए थे। यह सुझाव देता है कि अपने दम पर 27,000 लक्स प्रकाश CD1 और C57BL / 6J चूहों को परेशान नहीं करता है। फिर भी, उच्च प्रकाश तीव्रता का चयन करते समय सावधानी बरतनी चाहिए।

प्रकाश सेटिंग में अंतर के साथ- साथ, शोधकर्ताओं ने प्रकाश / अंधेरे डेटा का विश्लेषण करने में विभिन्न दृष्टिकोणों का विकल्प चुना है। प्रकाश घृणा का आकलन करते समय, प्रकाश क्षेत्र में बिताए गए समय की मात्रा को बंद कर दिया जाता है (या प्रकाश क्षेत्र की लाल रोशनी की रोशनी के साथ, यह देखते हुए कि चूहों की आंखें लाल रोशनी के लिए कम ग्रहणशील हैं) गणना में शामिल हैं। उदाहरण के लिए, aversion index = (lighttest lux में light0 lux-time में समय)/ light0 lux में समय का उपयोग गोरिन समूह द्वारा प्रकाश aversion43 का आकलन करने के लिए किया गया था। यहां, 'लाइट ऑफ' या 'रेड लाइट' शर्तों को यह पुष्टि करने के लिए शामिल किया गया है कि प्रकाश क्षेत्र से बचने के लिए प्रकाश पर सशर्त है जो सरल स्थान वरीयता के विपरीत मौजूद है। हमने सीजीआरपी के आई.पी. इंजेक्शन के साथ इस प्रक्रिया का आयोजन किया और पाया कि सीजीआरपी प्राप्त करने वाले चूहों के पास प्रकाश क्षेत्र में प्रकाश के साथ एक जगह वरीयता नहीं थी, यह पुष्टि करते हुए कि सीजीआरपी-प्रेरित घृणा प्रकाश-निर्भर 16 है। अंत में, गोरिन समूह ने चिंता 36 के उपाय के रूप में प्रकाश / अंधेरे परख में प्रकाश क्षेत्र की परिधि में बिताए गए समय चूहों का उपयोग किया। हम चिंता के लिए एक पारंपरिक परीक्षण का उपयोग करें, खुले क्षेत्र परख. कोई फर्क नहीं पड़ता कि कौन सी विश्लेषण विधि चुनी गई है, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि प्रकाश घृणा में चिंता के योगदान को अनदेखा नहीं किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल अग्रानुक्रम में प्रकाश / अंधेरे और खुले क्षेत्र के assays का उपयोग करके चिंता की तरह और प्रकाश-प्रतिकूल व्यवहार को विभाजित करने का प्रयास करता है।

यह प्रोटोकॉल चूहों में प्रकाश-प्रतिकूल व्यवहार का पता लगाने के लिए प्रकाश / अंधेरे और खुले क्षेत्र assays के उपयोग को संबोधित करता है। यह तंत्रिका सर्किट और मस्तिष्क क्षेत्रों के तंत्र की पहचान करने के लिए एक उपयोगी उपकरण प्रदान करता है जो फोटोफोबिया चलाता है। परीक्षण प्रतिमान माइग्रेन-विशिष्ट हो सकता है या फोटोफोबिया से जुड़े अन्य विकारों में विस्तारित किया जा सकता है। माइग्रेन के संबंध में, हमने माइग्रेन रोगजनन से जुड़े दो अन्य न्यूरोपेप्टाइड्स का परीक्षण किया है: पिट्यूटरी एडेनिलेट साइक्लेज़-सक्रिय पॉलीपेप्टाइड (PACAP) और वैसोएक्टिव आंत्र पेप्टाइड (वीआईपी)। PACAP और वीआईपी CD1 mice17,21 में प्रकाश घृणा को प्रेरित करने के लिए प्रदर्शित किया गया था। माइग्रेन के अलावा, फोटोफोबिया कई अन्य विकारों का लक्षण भी है, जिसमें ब्रैडियोप्सिया, तीव्र ओकुलर चोट या सूजन, दर्दनाक मस्तिष्क सिंड्रोम, लाइम रोग, एल्बिनिज़म और शंकु डिस्ट्रॉफी 36 शामिल हैं। इस प्रकार, यह परीक्षण प्रतिमान फोटोफोबिया से संबंधित विकारों के अंतर्निहित तंत्र की जांच करने के लिए एक उपकरण प्रदान करता है। इसके अलावा, पारंपरिक औषधीय दृष्टिकोण के साथ ऑप्टोजेनेटिक तरीकों की जोड़ी निस्संदेह फोटोफोबिया से संबंधित विकारों के लिए उपन्यास चिकित्सीय के विकास में सहायता करेगी।

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Disclosures

लेखकों के पास रिपोर्ट करने के लिए हितों का कोई संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को NIH NS R01 NS075599 और RF1 NS113839 से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। सामग्री वीए या संयुक्त राज्य सरकार के विचारों का प्रतिनिधित्व नहीं करती है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Activity monitor Med Assoc. Inc Software tracking mouse behavior
Customized acrylic shelf For adjusting the height of the LED panel
Dark box insert Med Assoc. Inc ENV-511
DC power supply Med Assoc. Inc SG-500T
DC regulated power supply Med Assoc. Inc SG-506
Fiber-optic cannula Doric MFC_200/ 240-0.22_4.5mm_ZF1.25_FLT
Germicidal disposable wipes Sani-Cloth SKU # Q55172
Heat Sink Wakefield 490-6K Connecting to LED panel
IR controller power cable Med Assoc. Inc SG-520USB-1
IR USB controller Med Assoc. Inc ENV-520USB
Mating sleeve Doric SLEEVE_ZR_1.25
Modified LED light panel Genaray Spectro SP-E-360D Daylight-balanced color (5600K)
Power supply MEAN WELL USA SP-320-12 Connecting to LED panel
Seamless open field chamber Med Assoc. Inc ENV-510S
Sound-attenuating cubicle Med Assoc. Inc ENV-022MD-027
Stand and clamp
Three 16-beam IR arrays Med Assoc. Inc ENV-256

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व्यवहार समस्या 174
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Wang, M., Mason, B. N., Sowers, L.… More

Wang, M., Mason, B. N., Sowers, L. P., Kuburas, A., Rea, B. J., Russo, A. F. Investigating Migraine-Like Behavior Using Light Aversion in Mice. J. Vis. Exp. (174), e62839, doi:10.3791/62839 (2021).

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