Summary
Nagetiere sind nicht in der Lage, Migränesymptome zu melden. Hier beschreiben wir ein überschaubares Testparadigma (Hell/Dunkel- und Freifeldassays) zur Messung der Lichtaversion, eines der häufigsten und lästigsten Symptome bei Patienten mit Migräne.
Abstract
Migräne ist eine komplexe neurologische Erkrankung, die durch Kopfschmerzen und sensorische Anomalien wie Überempfindlichkeit gegen Licht gekennzeichnet ist und als Photophobie beobachtet wird. Während es unmöglich ist zu bestätigen, dass eine Maus Migräne hat, kann Lichtaversion als Verhaltensersatz für das Migränesymptom der Photophobie verwendet werden. Um die Lichtaversion zu testen, verwenden wir den Hell-Dunkel-Assay, um die Zeit zu messen, die Mäuse frei wählen, um entweder in einer hellen oder dunklen Umgebung zu verbringen. Der Assay wurde durch die Einführung von zwei kritischen Modifikationen verfeinert: Vorbelichtungen der Kammer vor dem Testverfahren und einstellbare Kammerbeleuchtung, die die Verwendung eines Bereichs von Lichtintensitäten von 55 Lux bis 27.000 Lux ermöglichen. Da die Entscheidung, mehr Zeit im Dunkeln zu verbringen, auch auf Angst hinweist, verwenden wir auch einen lichtunabhängigen Angsttest, den Open-Field-Assay, um Angst von lichtaversivem Verhalten zu unterscheiden. Hier beschreiben wir ein modifiziertes Testparadigma für die Hell/Dunkel- und Freifeldassays. Die Anwendung dieser Assays wird für die intraperitoneale Injektion von Calcitonin-Gen-verwandtem Peptid (CGRP) in zwei Mausstämmen und für optogenetische Hirnstimulationsstudien beschrieben.
Introduction
Migräne ist eine weit verbreitete neurologische Erkrankung, von der etwa 17% der Amerikaner betroffen sind1 und weltweit die zweithäufigste Ursache für Behinderungen2,3. Bei den Patienten treten Kopfschmerzen auf, die 4-72 Stunden anhalten, begleitet von mindestens einem der folgenden Symptome: Übelkeit und / oder Erbrechen oder Photophobie und Phonophobie4. Jüngste Fortschritte bei der Entwicklung von Calcitonin-Gen-bezogenen Peptid (CGRP) -Antikörpern, die jetzt von der FDA zugelassen sind, haben eine neue Ära für die Migränebehandlung eingeleitet5,6,7. Diese Antikörper blockieren entweder CGRP oder seinen Rezeptor und verhindern Migränesymptome bei etwa 50% der Migränepatienten7. Innerhalb des vergangenen Jahres wurden auch zwei niedermolekulare Antagonisten des CGRP-Rezeptors von der FDA für die abortive Behandlung von Migräne zugelassen, und zwei weitere sind in der Pipeline8. Trotz dieses therapeutischen Fortschritts sind die Mechanismen, durch die Migräneattacken auftreten, nach wie vor schwer fassbar. Zum Beispiel sind die Seiten der CGRP-Aktion nicht bekannt. Die Wirksamkeit therapeutischer Antikörper, die die Blut-Hirn-Schranke nicht nennenswert überwinden, deutet darauf hin, dass CGRP an peripheren Stellen wie den Hirnhäuten und / oder Trigeminusganglien wirkt. Wir können jedoch zentrale Aktionen an zirkumventrikulären Organen nicht ausschließen, denen eine Blut-Hirn-Schranke fehlt9. Zumindest bei Photophobie halten wir dies angesichts unserer Ergebnisse mit Lichtaversion unter Verwendung transgener Nestin/hRAMP1-Mäuse, bei denen hRAMP1 im Nervengewebe überexprimiert wird10, für weniger wahrscheinlich10. Das Verständnis der Mechanismen der Migräne-Pathophysiologie wird neue Wege für die Entwicklung von Migräne-Therapeutika eröffnen.
Präklinische Tiermodelle sind entscheidend für das Verständnis von Krankheitsmechanismen und die Entwicklung neuer Medikamente. Die Beurteilung der Migräne bei Tieren ist jedoch eine Herausforderung, da Tiere ihre Schmerzempfindungen nicht verbal melden können. Angesichts der Tatsache, dass 80-90% der Migränepatienten Photophobie11 aufweisen, gilt Lichtaversion als Indikator für Migräne in Tiermodellen. Dies führte dazu, dass ein Assay entwickelt werden musste, um die Lichtaversion bei Mäusen zu beurteilen.
Der Hell/Dunkel-Assay enthält eine helle Zone und eine dunkle Zone. Es wird häufig zur Messung von Angstzuständen bei Mäusen verwendet, basierend auf ihrer spontanen Erforschung neuartiger Umgebungen, die durch ihre angeborene Abneigung gegen Licht konterkariert wird12. Einige Studien legen 1/3 der Kammer als dunkle Zone fest, während andere 1/2 der Kammer als dunkle Zone festlegen. Die frühere Einstellung wird häufig verwendet, um Angstzustände zu erkennen13. Während wir uns zunächst für gleich große Hell-Dunkel-Kammern entschieden haben, haben wir die beiden relativen Größen nicht verglichen. Wir können anmerken, dass die Gesamtgröße beider Kammern kein wichtiger Faktor ist, da die anfängliche Testbox14 erheblich größer war als die nachfolgende Apparatur15, aber die Ergebnisse waren im Wesentlichen die gleichen.
Zwei kritische Modifikationen an diesem Hell-Dunkel-Assay zur Beurteilung der Lichtaversion waren: die Testbedingung und die Lichtintensität (Abbildung 1). Erstens werden Mäuse vorab in der Hell-Dunkel-Kammer exponiert, um den explorativen Antrieb zu reduzieren16 (Abbildung 1A). Die Notwendigkeit und die Zeiten von Vorbelichtungen hängen von Mausstämmen und Modellen ab. Wildtyp C57BL/6J-Mäuse benötigen in der Regel zwei Vorbelichtungen10, während nur eine Vorbelichtung für CD1-Mäuse ausreicht17. Auf diese Weise kann in diesen beiden Mausstämmen lichtaversives Verhalten entlarvt werden. Zweitens wurde die Kammerbeleuchtung angepasst, um einen einstellbaren Bereich von Lichtintensitäten von schwach (55 Lux) bis hell (27.000 Lux) zu umfassen, wobei 55 Lux mit einem dunklen, bewölkten Tag und 27.000 Lux mit einem hellen sonnigen Tag im Schatten vergleichbar sind10. Wir haben festgestellt, dass die erforderliche Lichtintensität mit der Belastung und dem genetischen Modell variiert. Aus diesem Grund sollten Individuen zunächst die minimale Lichtintensität für ihr experimentelles Paradigma bewerten.
Selbst bei diesen Modifikationen des Assays, die einen lichtaversiven Phänotyp aufdecken können, ist es notwendig, angstähnliches Verhalten zu testen, um zwischen Lichtaversion allein und Angst zu unterscheiden. Der Open-Field-Assay ist eine traditionelle Methode zur Messung von Angstzuständen, die auf der spontanen Erforschung neuartiger Umgebungen basiert. Es unterscheidet sich vom Hell-Dunkel-Assay dadurch, dass dem explorativen Antrieb die angeborene Abneigung gegen ungeschützte Freiräume entgegengesetzt wird. Sowohl die Mitte als auch die Ränder der Kammer befinden sich im Licht, so dass der Freifeldassay ein lichtunabhängiger Angstassay ist. So ermöglicht uns die Kombination der Hell/Dunkel- und Freifeld-Assays, zwischen Lichtaversion aufgrund einer Lichtvermeidung und einer allgemeinen Zunahme der Angst zu unterscheiden.
CGRP ist ein multifunktionales Neuropeptid, das Vasodilatation, Nozizeption und Entzündung reguliert18. Es wird häufig im peripheren und zentralen Nervensystem exprimiert. Es spielt eine wichtige Rolle in der Migräne-Pathophysiologie18. Der Mechanismus, der der CGRP-Wirkung bei Migräne zugrunde liegt, ist jedoch unklar. Durch die Verwendung der Hell/Dunkel- und Freifeld-Assays mit diesem modifizierten Testparadigma konnten wir das lichtaversive Verhalten von Mäusen nach peripherer10,16 (Abbildung 2) und zentraler14,15,16,19 CGRP-Verabreichung identifizieren. Neben Neuropeptiden ist auch die Identifizierung von Hirnregionen, die an der Lichtaversion beteiligt sind, wichtig für das Verständnis der Migräne-Pathophysiologie. Die hinteren Thalamuskerne sind eine integrative Hirnregion für die Schmerz- und Lichtverarbeitung19, und der Thalamus wird während der Migräne aktiviert20. Daher zielten wir auf posteriore thalamische Kerne ab, indem wir Adeno-assoziiertes Virus (AAV), das Kanalrhodopsin-2 (ChR2) oder eYFP enthielt, in diese Region injizierten. Durch die Kombination dieses optogenetischen Ansatzes mit diesen beiden Assays konnten wir zeigen, dass die optische Stimulation von ChR2-exprimierenden Neuronen in den hinteren thalamischen Kernen Lichtaversion induzierte19 (Abbildung 3). In diesem Experiment wurden angesichts der dramatischen Wirkung auf die evozierte Lichtaversion bei diesen optogenetisch manipulierten Mäusen die Vorexpositionen in der Kammer übersprungen.
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Protocol
Tierverfahren wurden vom Animal Care and Use Committee der University of Iowa genehmigt und in Übereinstimmung mit den von den National Institutes of Health festgelegten Standards durchgeführt.
1. Hell/Dunkel-Assay
- Aufstellung der Hell-/Dunkelkammer-Apparatur (siehe Materialtabelle). Alle Geräte in diesem Abschnitt sind im Handel erhältlich.
- Stellen Sie auf einem Regal die schalldämpfende Kabine (Innenausstattung: 59,7 x 38 x 35,6 cm in B x H x T) mit einer ausziehbaren Schublade für einen einfachen Zugang zur Kammer und einem dunklen Einsatz.
- Schließen Sie das DC-Netzteil und ein DC-geregeltes Netzteil an die schalldämpfende Kabine an.
- Stellen Sie die transparente, nahtlose Freifeldkammer (27,31 x 27,31 x 20,32 cm in L x B x H) auf die ausziehbare Schublade der Kabine.
- Legen Sie den schwarzen, infrarot (IR)-transparenten dunklen Kunststoffeinsatz (28,7 x 15 x 20,6 cm in L x B x H) in die Freifeldkammer. Stellen Sie sicher, dass die Kammer in zwei gleich große Zonen unterteilt ist: eine dunkle Zone und eine helle Zone.
- Verbinden Sie drei Sätze von 16-Strahl-IR-Arrays auf der X-, Y- und Z-Achse der Freifeldkammer über Kabel mit dem IR-USB-Controller.
- Schließen Sie den IR-USB-Controller an einen Computer an.
- Installieren Sie die Tracking-Software auf dem Computer, die den Standort und die Aktivität der Maus aufzeichnen und erfassen kann.
- Entfernen Sie für das Beleuchtungspanel-Setup zuerst die Leuchtdioden-Leuchtplatte (LED) (27,70 x 27,70 cm in L x B; 360 LEDs, tageslichtausgeglichene Farbe, 5600K, 60 ° Flutstrahlausbreitung) aus ihrem ursprünglichen Gehäuse.
- Montieren Sie die Leuchtplatte mit dem LED-Treiber, dem Kühlkörper und dem Netzteil. Mehrere LED-Lichtpaneele können an ein Netzteil, einen Kühlkörper und einen LED-Treiber angeschlossen werden, um eine gleichmäßige Steuerung der Lichtpaneele zu erreichen.
- Konstruieren Sie eine maßgeschneiderte Acrylplattform (29,77 x 27,70 x 8,10 cm in L x B x H), die aus 7 identischen Regalen in Abständen von 0,53 cm besteht (Abbildung 1B). Befestigen Sie das maßgeschneiderte Acrylregal dauerhaft an der Decke in der Kabine über der Kammer.
- Stecken Sie die LED-Leuchtplatte in den Schlitz zwischen den unteren beiden Regalen. Stellen Sie die Leuchtplatte bei Bedarf auf unterschiedliche Höhen ein (Abbildung 1B,C) (z. B. bei Verwendung optogenetischer Mäuse). Einzelheiten werden in Abschnitt 3 erläutert).
- Schalten Sie den Kühler, den LED-Treiber und das Netzteil ein. Bestätigen Sie, dass der LED-Treiber die LED-Lichtintensität bestimmen kann, indem Sie die Lichtintensität auf dem Kammerboden messen und bestätigen, dass der Boden gleichmäßig beleuchtet ist.
- Verhaltenstestverfahren
HINWEIS: Mäuse werden in einem 12-stündigen Lichtzyklus untergebracht. Alle Verhaltensexperimente werden während des Lichtzyklus durchgeführt. Mäuse, einschließlich Männchen und Weibchen, im Alter von 10-20 Wochen alt, werden verwendet. In diesem Protokoll erleben naive Wildtyp-CD1- und C57BL/6J-Mäuse zwei Vorexpositionen in der Hell-Dunkel-Kammer, gefolgt von einer Exposition mit Behandlung und einer Post-Behandlungs-Exposition. Zwischen jeder Exposition liegt ein dreitägiges Intervall, damit sich die Mäuse erholen können (Tag 1, 4, 7 und 10, wie unten beschrieben und Abbildung 1A). CD1-Mäuse benötigen jedoch nicht die 2. Vorbelichtung und können bei schwachem Licht getestet werden.- Schalten Sie am Tag 1 (Vorbehandlung 1) das Hell/Dunkel-Assay-Gerät ein und stellen Sie die Lichtintensität auf 27.000 Lux ein.
- Öffnen Sie die Tracking-Software und richten Sie ein neues Protokoll ein. Legen Sie in der Einstellung Neues Protokoll die Dauer auf 30 Minuten fest. Legen Sie in der Einstellung Neue Analyse Datenbins nach Dauer auf 300 s fest.
- Wählen Sie in der Einstellung Neue Zone die Option Vordefinierte Zonen aus. Wählen Sie 2 und dann Horizontal aus. Überprüfen Sie, ob die Kammer für die Aufnahme horizontal in zwei gleich große Zonen unterteilt ist.
- Gewöhnen Sie die Mäuse vor dem Test 1 Stunde lang an den Testraum. Halten Sie während der Gewöhnung das Raumlicht eingeschaltet, um den zirkadianen Rhythmus der Maus nicht zu stören. Stellen Sie sicher, dass alle Geräte für den Hell/Dunkel-Test eingeschaltet sind, damit sich die Mäuse vollständig an die Testraumumgebung gewöhnen können.
- Wählen Sie Daten erfassen aus. Geben Sie die Maus-IDs ein. Starten Sie das Protokoll.
- Ziehen Sie die Schublade außerhalb der schalldämpfenden Kabine, um Zugang zur Hell/Dunkel-Kammer und zum dunklen Einsatz zu erhalten. Nehmen Sie die Maus vorsichtig an der Basis des Schwanzes auf, legen Sie sie in die Lichtzone der Kammer und drücken Sie die Schublade in die Kabine. Stellen Sie sicher, dass die Software die Maus sofort erkennt und mit der Aufzeichnung der Aktivität beginnt.
- Warten Sie, bis die Aufnahme nach 30 Minuten automatisch gestoppt wird. Bringen Sie die Maus in ihren Heimatkäfig zurück.
- Reinigen Sie die Kammer und den dunklen Einsatz mit keimtötenden Einwegtüchern mit Alkoholgeruch, die 55,0% Isopropylalkohol, 0,25% Alkyl-C12-18-Dimethylethylbenzylammonium und 0,25% Alkyl-C12-18-Dimethylbenzylammoniumchlorid als antimikrobielle Wirkstoffe enthalten, um alle olfaktorischen Hinweise zu beseitigen, die von der vorherigen Maus hinterlassen wurden.
- Wiederholen Sie an Tag 4 (Vorbehandlung 2) die Schritte 1.2.1 bis 1.2.8.
- Wiederholen Sie am Tag 7 (dem Behandlungstag) die Schritte 1.2.1 und 1.2.4. Nach der Gewöhnung CGRP (0,1 mg/kg, 10 μl/g basierend auf dem Körpergewicht der Maus, intraperitoneale Injektion (i.p.) verabreichen, den Kopf der Maus nach vorne neigen und in den unteren rechten Quadranten injizieren. Bringen Sie die Maus in den Heimkäfig zurück.
- Starten Sie nach 30 Minuten das Protokoll und führen Sie die Maus in der Hell/Dunkel-Kammer aus, wie in den Schritten 1.2.5 bis 1.2.7 erwähnt. Die Erholungszeit in Heimkäfigen nach Injektionen kann je nach Behandlung verkürzt oder verlängert werden21.
- Reinigen Sie die Kammer und den dunklen Einsatz wie in Schritt 1.2.8 beschrieben.
- Wiederholen Sie am Tag 10 (Tag nach der Behandlung) die Schritte 1.2.1 bis 1.2.8. Das Experiment kann in Schritt 1.2.13 pausiert werden, bevor der Freifeldassay gestartet wird.
2. Freiland-Assay
- Das Geräte-Setup
- Einrichtung der Freifeldkammer: Verwenden Sie die gleiche schalldämpfende Kabine und die gleiche Freifeldkammer, die im Hell/Dunkel-Assay verwendet wird, ohne den dunklen Einsatz zu verwenden.
- Einrichtung des Lichtpanels: Verwenden Sie das gleiche Setup, das auch für den Hell/Dunkel-Assay verwendet wurde. Stellen Sie sicher, dass die Lichtintensität die gleiche ist wie beim Hell/Dunkel-Assay.
- Verhaltenstestverfahren
- Schalten Sie das Gerät ein. Stellen Sie die Lichtintensität auf 27.000 Lux ein.
- Öffnen Sie die Tracking-Software.
- Richten Sie ein neues Protokoll ein, das mit Ausnahme der Einstellungen für die neue Zone im Hell/Dunkel-Assay verwendet wird. Wählen Sie 1 gefolgt von der Mitte in den Einstellungen für neue Zone . Stellen Sie die Peripherie als 3,97 cm vom Umfang und die Mitte als 19,05 × 19,05 cm ein.
- Gewöhnen Sie die Mäuse wie in Schritt 1.2.4 beschrieben in den Testraum.
- Verabreichen Sie CGRP (0,1 mg/kg, 10 μl/g basierend auf dem Körpergewicht der Maus, i.p.), neigen Sie den Kopf der Maus nach vorne und injizieren Sie in den unteren rechten Quadranten. Bringen Sie die Maus in den Heimkäfig zurück.
- Starten Sie nach 30 Minuten das Protokoll. Ziehen Sie die ausziehbare Schublade außerhalb der schalldämpfenden Kabine und legen Sie die Maus vorsichtig in die Mitte der offenen Feldkammer. Schieben Sie die Schublade in die Kabine.
- Verfolgen Sie das Verhalten für 30 min. Dann bringen Sie die Mäuse in ihre Heimkäfige zurück.
- Reinigen Sie das Gerät wie in Schritt 1.2.8 beschrieben.
3. Modifizierter Hell-Dunkel-Test für optogenetische Mäuse
- Das Geräte-Setup
- Nehmen Sie zwei Änderungen am dunklen Einsatz vor.
- Ändern Sie die Öffnung des dunklen Einsatzes auf 5,08 x 5,08 cm (B x H) mit einem kleinen Schlitz von 0,95 x 10,16 cm (B x H) zwischen der Oberseite und der Öffnung des dunklen Einsatzes (Abbildung 1D oben links).
HINWEIS: Diese Modifikation ermöglicht es einer Maus, problemlos in die dunkle Zone zu gelangen, wenn die faseroptische Kanüle am Mauskopf am Patchkabel befestigt ist. - Verlängern Sie die Oberseite des dunklen Einsatzes über den hellen Bereich als dreieckige Veranda (H = 6,5 cm) (Abbildung 1D oben rechts und unten links). Schneiden Sie ein kreisförmiges Loch (D = 1,7 cm) aus der Veranda und führen Sie eine Halterung in das Loch ein, um die Drehverbindung zu platzieren und zu stabilisieren, die den Laser und die faseroptischen Patchkabel verbindet (Abbildung 1D oben links und unten links).
HINWEIS: Die Modifikationen führen zu einer kleinen Änderung der Lichtintensität, die den Boden der dunklen Zone erreicht (17 Lux mit Modifikationen gegenüber 14 Lux ohne Modifikationen, gemessen in der hinteren rechten Ecke der dunklen Zone unter 27.000 Lux).
- Ändern Sie die Öffnung des dunklen Einsatzes auf 5,08 x 5,08 cm (B x H) mit einem kleinen Schlitz von 0,95 x 10,16 cm (B x H) zwischen der Oberseite und der Öffnung des dunklen Einsatzes (Abbildung 1D oben links).
- Setzen Sie die Drehdurchführung in die Halterung am dunklen Einsatz ein.
- Schließen Sie das 30,5 cm große LWL-Patchkabel an die Drehdurchführung an. Vergewissern Sie sich, dass sich die Drehverbindung sanft drehen kann, so dass sich das Patchkabel problemlos drehen kann, wenn die Maus die Kammer durchquert.
- Für den Rest des Aufbaus ist derselbe Geräteaufbau wie in Abschnitt 1 (Hell/Dunkel-Assay) zu verwenden.
- Nehmen Sie zwei Änderungen am dunklen Einsatz vor.
- Verhaltenstestverfahren
HINWEIS: Im Gegensatz zu den Wildtyp-Mäusen erhalten die optogenetischen Mäuse keine Vorexpositionen (Vorbehandlung 1 und 2).- Setzen Sie am Testtag die LED-Leuchtplatte in den zweitniedrigsten Schlitz (28,23 cm vom Boden des Sturzes entfernt) ein, um Platz für das Anschließen des Patchkabels zu schaffen. Schalten Sie das Hell/Dunkel-Assay-Gerät ein und stellen Sie die Lichtintensität auf 55 Lux ein.
- Verwenden Sie das gleiche Protokoll-Setup wie in 1.2.2 und 1.2.3, mit der Ausnahme, dass Data Bins By Duration in der Einstellung Neue Analyse auf 60 s festgelegt ist, um mit dem Laserstimulationsprotokoll in Schritt 3.2.3 kongruent zu sein.
- Schalten Sie den Laser-Power-Button ein. Stellen Sie den Laserpulsregler so ein, dass er für 1 Minute stimuliert, gefolgt von 1 Minute ohne Stimulation über 30 Minuten.
- Gewöhnen Sie die Mäuse vor dem Test 1 Stunde lang mit eingeschaltetem Licht in den Testraum.
- Starten Sie das Protokoll. Ziehen Sie die ausziehbare Schublade außerhalb der schalldämpfenden Kabine, um Zugang zur Hell/Dunkel-Kammer und zum dunklen Einsatz zu erhalten.
- Halten Sie die Maus vorsichtig fest und koppeln Sie die Glasfaserkanüle am Mauskopf über eine Gegenhülse mit dem Glasfaser-Patchkabel (Abbildung 1D unten rechts). Legen Sie die Maus vorsichtig in die Lichtzone und drücken Sie die Schublade in die Kabine. Stellen Sie sicher, dass das Protokoll beginnt, das Mausverhalten automatisch aufzuzeichnen.
- Schalten Sie nach 1 min den Impulsregler ein und schalten Sie dann die Failsafe-Taste auf ON. Stellen Sie sicher, dass die Laserstimulation der Zielhirnregion alle zwei Minuten stattfindet.
- Wenn das Protokoll nach 30 Minuten automatisch beendet wird, schalten Sie die Failsafe-Taste auf OFF. Schalten Sie dann den Impulsregler aus.
- Entkoppeln Sie die Maus und das Glasfaser-Patchkabel. Bringen Sie die Maus in den Heimkäfig zurück.
- Reinigen Sie die Kammer und den dunklen Einsatz wie in Schritt 1.2.8 beschrieben.
4. Modifizierter Freilandassay für optogenetische Mäuse
- Das Geräte-Setup
- Stabilisieren Sie das Drehgelenk über der Kammer mit einem Ständer und einer Klemme (Abbildung 1E).
- Verbinden Sie das LWL-Patchkabel mit einer Länge von 50 cm mit der Drehverbindung. Prüfen Sie, ob sich die Drehdurchführung sanft drehen lässt.
- Stellen Sie die Drehverbindung auf die entsprechende Höhe auf dem Ständer ein: Stellen Sie sicher, dass das LWL-Patchkabel nur knapp jede Ecke der Kammer erreichen kann, wodurch Interferenzen mit der Mausbewegung vermieden werden.
- Für den Rest des Aufbaus ist derselbe Geräteaufbau wie in Abschnitt 1 (Hell/Dunkel-Assay) zu verwenden, jedoch ohne den dunklen Einsatz.
- Verhaltenstestverfahren
- Schalten Sie das Hell/Dunkel-Assay-Gerät ein und stellen Sie die Lichtintensität auf 55 Lux ein.
- Verwenden Sie das gleiche Protokoll-Setup wie im modifizierten Hell/Dunkel-Assay (Abschnitt 3), mit Ausnahme der Einstellungen für die neue Zone. Wählen Sie in den Einstellungen für neue Zone 1 nach Mitte aus. Stellen Sie die Peripherie als 3,97 cm vom Umfang und die Mitte als 19,05 × 19,05 cm ein.
- Schalten Sie den Laser-Power-Button ein. Stellen Sie den Laserpulsregler so ein, dass er für 1 Minute stimuliert, gefolgt von 1 Minute ohne Stimulation über 30 Minuten.
- Führen Sie die Gewöhnung und den Rest des Tests wie in den Schritten 3.2.4 bis 3.2.10 beschrieben durch, mit Ausnahme von zwei Änderungen an Schritt 3.2.6: Platzieren Sie die Maus vorsichtig in der Mitte der Kammer anstelle der Lichtzone. Bewahren Sie die ausziehbare Schublade außerhalb der Kabine auf, da das Patchkabel mit dem Kopf der Maus verbunden ist.
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Representative Results
Dieses Verhaltenstestparadigma wurde entwickelt, um lichtaversives Verhalten zu testen. Es kann sowohl mit naiven Wildtypmäusen als auch mit optogenetischen Mäusen durchgeführt werden, um die Lichtaversion in Echtzeit während der Stimulation einer gezielten neuronalen Population zu untersuchen.
Dieses Verfahren wurde verwendet, um die Wirkung der peripheren CGRP-Behandlung bei CD1- und C57BL/6J-Mäusen10,16 und der optischen Stimulation von Neuronen in den hinteren thalamischen Kernen bei C57BL/6J-Mäusen19 auf das lichtaversive Verhalten zu untersuchen. Mäuse, einschließlich Männchen und Weibchen im Alter von 10-20 Wochen, wurden in den Experimenten verwendet (Abbildung 2A, Abbildung 2B-D und Abbildung 3). Die Ergebnisse zeigten, dass die i.p. Injektion von CGRP die Dauer der in der Lichtzone verbrachten Zeit im Hell/Dunkel-Assay bei CD1 (Abbildung 2A) und C57BL/6J (Abbildung 2B) Mäusen signifikant verringerte, aber die Zeit, die Mäuse im Zentrum des Freifeld-Assays bei CD1- (Daten nicht gezeigt) und C57BL/6J-Mäusen (Abbildung 2D)10 verbrachten, nicht beeinflusste. 16. Dies deutet darauf hin, dass periphere CGRP Lichtaversion, aber keine allgemeine Angst induziert. Die Behandlung mit CGRP erhöhte auch die Zeit, die Mäuse in der dunklen Zone, aber nicht in der hellen Zone ruhten, sowohl bei CD1- (Daten nicht gezeigt) als auch bei C57BL/6J-Mäusen (Abbildung 2C).
Für das optogenetische Protokoll zielten wir auf Calmodulkinase II alpha (CaMKIIa)-exprimierende Neuronen in den hinteren thalamischen Kernen ab, indem wir AAV2-CaMKIIa-hChR2(E123A)-eYFP oder das Kontrollvirus AAV2-CaMKIIa-eYFP19 injizierten. Gleichzeitig wurde eine faseroptische Kanüle in die hinteren thalamischen Kerne implantiert. Drei Wochen nach der Injektion, um genügend Zeit für die ChR2-Expression zu haben, führten wir eine optische Stimulation von Neuronen in den hinteren thalamischen Kernen durch und stellten eine entsprechende Abnahme der Dauer fest, die Mäuse im Hell-Dunkel-Assay in ChR2-injizierten Mäusen in der Lichtzone verbrachten, verglichen mit Kontrollvirus-injizierten Mäusen (eYFP) (Abbildung 3A). Es gab keinen festgestellten Unterschied in der Zeit im Zentrum im Freifeldassay zwischen ChR2- und Kontroll-eYFP-Mäusen (Abbildung 3C), was auf eine lichtaversive Reaktion hindeutet, die nicht nur von Angstzuständen angetrieben wurde19. Darüber hinaus wurde auch eine Zunahme der Ruhezeit in der dunklen Zone, aber nicht in der hellen Zone festgestellt (Abbildung 3B). Die gleichen Ergebnisse wurden bei der Verwendung von 55 Lux und 27.000 Lux erzielt (Abbildung 3). Das 55-Lux-Verfahren wurde eingeschlossen, da Migränepatienten auch bei schwachem Licht empfindlich sind.
Abbildung 1: Zeitleiste und Vorrichtung des Hell/Dunkel-Assays. (A) Zeitleiste des Testparadigmas: Nach zwei Vorexpositionen in der Hell-Dunkel-Kammer (Pre 1 und Pre 2) wird den Mäusen CGRP (0,1 mg/kg, i.p.) verabreicht, gefolgt von einer Nachbehandlungsmessung (Post). Mindestens einen Tag nach dem Hell-Dunkel-Assay erhalten die Mäuse erneut CGRP (0,1 mg/kg, i.p.) und werden im Freifeld-Assay durchgeführt. Vorbehandlung: Vorbehandlung; Tx: Behandlung; Post: Nachbehandlung (B) Das LED-Panel wird an der Oberseite der Kammer von einem Acrylregal gehalten und beleuchtet den Testbereich. Die Höhe der Leuchtplatte kann über Schlitze in verschiedenen Höhen eingestellt werden. (C) Die Hell-Dunkel-Kammer enthält einen dunklen Einsatz mit einer kleinen Öffnung. Eine LED-Leuchtplatte befindet sich über der Kammer. (D) Vorder-, Seiten- und Oberansicht des modifizierten dunklen Einsatzes. Die Öffnung im dunklen Einsatz wird mit einem kleinen Schlitz für die Bewegung der Patchschnur (oben links) verlängert. Die Oberseite des dunklen Einsatzes erstreckt sich über den hellen Bereich als dreieckige Veranda mit einer Halterung für das Drehgelenk (oben rechts und unten links). Das Glasfaser-Patchkabel ist über eine Gegenhülse (unten rechts) mit der Lichtwellenleiterkanüle verbunden. (E) Der modifizierte Freifeld-Assay. Der Ständer und die Klemme halten die Drehfuge. Die Kammer wird nach vorne in die Kabine gezogen, wobei die Türen offen gelassen werden, um die freie Bewegung der Maus mit dem am Mauskopf befestigten Patchkabel zu ermöglichen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Die periphere CGRP-Verabreichung ruft bei hellem Licht bei zwei Stämmen von Wildtyp-Mäusen Lichtaversion hervor. CD1- und C57/BL6J-Mäuse wurden gemäß dem in Abbildung 1A beschriebenen Zeitplan getestet. (A) Die Zeit, die CD1-Mäuse pro 5-Minuten-Intervall über 30 min (27.000 Lux) in der Lichtzone verbracht haben. Die Zeit in den Lichtdaten wird im Laufe der Zeit während des Tests (linkes Feld) und als durchschnittliche Zeit pro 5-Minuten-Intervall für einzelne Mäuse (rechtes Feld) angezeigt. Zu jedem Zeitpunkt wurden Vergleiche zwischen Fahrzeug und CGRP sowie zwischen Tx und Pre2 oder Post durchgeführt, wie durch Klammern angegeben. (Veh, n=19; 0,1 mg/kg CGRP, n=19) (B) Zeit C57BL/6J Mäuse in der Lichtzone pro 5 min Intervall über 30 min (27.000 Lux). Die Zeit in Lichtdaten werden im Laufe der Zeit während des Tests (linkes Feld) und als durchschnittliche Zeit pro 5-Minuten-Intervall für einzelne Mäuse (rechtes Panel) angezeigt (Veh, n=42; 0,1 mg/kg CGRP, n=44). (C) Die Mäuse von Panel B wurden während des Hell/Dunkel-Assays auch auf ihr Ruheverhalten in den dunklen und hellen Zonen analysiert. (D) Die Mäuse aus Panel B wurden anschließend im Freifeld-Assay getestet. Der Prozentsatz der Zeit, die in der Mitte der Kammer pro 5-minütigem Intervall über 30 min nach der Behandlung mit Vehikel oder CGRP verbracht wird (0,1 mg/kg, i.p.) (Veh, n=9; 0,1 mg/kg CGRP, n=9). Der Prozentsatz der Zeit in den Center-Daten wird im Laufe der Zeit während des Tests (linkes Feld) und als durchschnittlicher Prozentsatz der Zeit in der Mitte pro 5-Minuten-Intervall für einzelne Mäuse (rechtes Panel) angezeigt. Für alle Panels wird Mittelwert±SEM angezeigt, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001. Diese Figur wurde von Mason et al. 201710 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Die optische Stimulation von CaMKIIa-exprimierenden Neuronen in den hinteren thalamischen Kernen induziert Lichtaversion sowohl bei schwachem als auch bei hellem Licht. (A) Hintere thalamische Kerne von C57BL/6J-Mäusen, denen AAV injiziert wurde, das entweder ChR2 oder eYFP kodiert (bei 55 Lux: eYFP n = 8, ChR2 n = 11; bei 27.000 Lux: eYFP n = 12, ChR2 n = 18) wurden durch einen blauen Laser (473 nm, 20 Hz, 5 ms Pulsbreite, 10 mW/mm2). Das linke Feld zeigt die Zeit, die Mäuse in der Lichtzone pro 5-Minuten-Intervall über 30 Minuten bei 55 oder 27.000 Lux verbracht haben. Zu jedem Zeitpunkt wurden Vergleiche zwischen eYFP- und ChR2-Gruppen durchgeführt. Das rechte Feld zeigt die durchschnittliche Zeit pro 5-Minuten-Intervall für einzelne Mäuse an. (B) Die Mäuse von Panel A wurden während des Hell/Dunkel-Assays auch auf ihr Ruheverhalten in den Hell- (linkes Panel) und Dunkel- (rechtes Panel) Zonenprinzip analysiert. (C) Die Mäuse aus Panel A wurden anschließend im Freifeld-Assay getestet. Durchschnittlicher Prozentsatz der Zeit, die im Zentrum der Freifeldkammer pro 5-minütigem Intervall über 30 min verbracht wird (Laser: 473 nm, 20 Hz, 5 ms Pulsbreite, 10 mW/mm2). (eYFP n = 8, ChR2 n = 9). Für alle Panels wird Mittelwert±SEM angezeigt, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001. Diese Zahl wurde von Sowers et al. 202019 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Der Hell-Dunkel-Assay wird häufig verwendet, um angstähnliches Verhalten zu beurteilen12. Der Assay beruht auf der angeborenen Abneigung von Mäusen gegen Licht und ihrem Drang zu erforschen, wenn sie in einer neuartigen Umgebung (Lichtzone) platziert werden. Wie wir hier berichten, kann dieser Assay jedoch auch zur Beurteilung des lichtaversiven Verhaltens verwendet werden.
Es ist wichtig, die Anzahl und Notwendigkeit der Vorexpositionen vor dem Test zu berücksichtigen. Dies hängt von der Mausbelastung oder dem Modell ab. Zum Beispiel werden in unserem Hell-Dunkel-Assay-Protokoll naive Wildtyp-CD1- und C57BL/6J-Mäuse zweimal vor dem Behandlungstestverfahren in der Hell-Dunkel-Kammer vorbelichtet, während optogenetische Mäuse keiner Vorexposition unterzogen werden. In einer kürzlich veröffentlichten Veröffentlichung wurde berichtet, dass eine Vorbelichtung ausreicht, damit CD1-Mäuse nach i.p. CGRP-Verabreichung Lichtaversion aufweisen können17. Folglich wird die Bedeutung des Neuheitsparameters mit Ankunft des Behandlungstages abgenommen haben10,16. Vorbelichtungen können lichtaversive Phänotypen entlarven, indem sie den explorativen Antrieb reduzieren und so das Gleichgewicht zwischen Exploration und Abneigung verändern. In einigen Fällen ist eine Vorbelichtung nicht erforderlich. Bei genetisch veränderten Mäusen mit erhöhten CGRP-Rezeptoren im Nervensystem war beispielsweise eine Präexposition nicht notwendig14. Ebenso war bei optogenetisch manipulierten Mäusen, bei denen CaMKIIa-exprimierende Neuronen in den hinteren thalamischen Kernen für eine optische Stimulation ins Visier genommen wurden, eine Vorbelichtung nicht notwendig, vermutlich weil die lichtaversive Reaktion bei direkter Stimulation des Gehirns so robust war19. Daher muss die Anzahl und Notwendigkeit von Vorbelichtungen in der Kammer sorgfältig abgewogen werden, wenn verschiedene Mausstämme oder -modelle verwendet werden. In der Tat kann eine übermäßige Exposition von Mäusen gegenüber der Kammer das explorative Verhalten reduzieren. Dies führt dazu, dass die Mäuse unabhängig von der Behandlung bevorzugt die dunkle Zone besetzen, wodurch die Fähigkeit, eine lichtaversive Reaktion zu beobachten, verringert wird. Umgekehrt kann eine unzureichende Vorexposition gegenüber dem Assay zu explorativem Verhalten führen, das potenzielles lichtaversives Verhalten maskiert.
Eine Exposition nach der Behandlung dient dazu, festzustellen, ob sich eine Maus vollständig von der 2 Tage zuvor verabreichten CGRP-Injektion erholt hat. Dies ist vor der Durchführung des Freifeld-Assays oder eines anderen Assays unerlässlich, um zu bestätigen, dass kein längerer Behandlungseffekt vorhanden ist, der zukünftige Verhaltenstests beeinflussen wird.
Basierend auf früheren Beobachtungen haben wir uns für eine Protokolldauer von 30 Minuten entschieden10. Wir haben Mäuse im Hell/Dunkel-Assay für 10 min15, 20 min16 und 30 min10 separat getestet. CGRP verringerte die Zeit, die Mäuse im Licht zwischen 0-30 min verbrachten, aber nach 30 min zogen es die Kontrollmäuse vor, mehr Zeit im Dunkeln als 0-30 min zu verbringen, was zu der Entscheidung führte, 30 min lang zu testen. In ähnlicher Weise kann die Testdauer in Bezug auf die Zeit-Antwort-Kurve für verschiedene Mausmodelle angepasst werden. Es sollte beachtet werden, dass die Verlängerung der Belichtungszeit in der Hell-Dunkel-Kammer die Motivation zur Erkundung der Lichtzone verringern kann.
Wir haben viele verschiedene Parameter analysiert, um das Verhalten der Tiere zu beurteilen. Ein wesentliches Merkmal des Hell-Dunkel-Assays ist eine Messung der Zeit, die eine Maus in der Lichtzone verbringt und die Lichtaversion direkt reflektiert. Der Prozentsatz der Ruhezeit, die Anzahl der vertikalen Balkenbrüche (zur Messung der Aufzuchtaktivität) in hellen oder dunklen Zonen und die Anzahl der Übergänge zwischen den beiden Zonen werden zur Beurteilung der Motilität verwendet. Ruhezeit und vertikale Strahlbrüche werden auf die in jeder Zone verbrachte Zeit normalisiert, um falsche Rückschlüsse auf die Bewegung zu vermeiden. Wir beziehen alle Mäuse in die Analysen ein, außer: Mäuse, die während der gesamten 30 Minuten des Tests in der Lichtzone bleiben, Mäuse, die insgesamt über 90% der Zeit ruhen (sowohl helle als auch dunkle Zonen) und statistische Ausreißer (>3 SDs vom Mittelwert). Die Anzahl der ausgeschlossenen Mäuse beträgt im Allgemeinen weniger als 1%. Für den Freifeldassay ist der Prozentsatz der Zeit im Zentrum die Hauptmessung, die zur Beurteilung von angstähnlichem Verhalten verwendet wird.
Im modifizierten Hell-Dunkel-Assay kann die Positionierung der faseroptischen Kanüle an einigen Gehirnregionen die Mausbewegung stark einschränken und in einigen Fällen verhindern, dass die Maus die dunkle Zone erreicht. Folglich wird der Eintritt in die dunkle Zone negativ verstärkt und nach mehreren Versuchen kann die Maus eine erlernte Präferenz für das Licht zeigen und sogar während des gesamten Testzeitraums in der Lichtzone bleiben. Dies kann korrigiert werden, indem die Größe und Form der Öffnung in der dunklen Einlage geändert wird. Als beispielsweise Glasfaserkanülen im Kleinhirn von Wildtyp-C57BL/6J-Mäusen installiert wurden, hatten die Mäuse Schwierigkeiten, die Öffnung des dunklen Einsatzes zu überqueren. Nachdem die Breite der Öffnung auf 6,10 cm anstelle von 5,08 cm geändert wurde, konnten die Mäuse die Öffnung frei durchqueren.
Ein 30,5 cm großes faseroptisches Patchkabel wird im modifizierten Hell-Dunkel-Assay verwendet, basierend auf der Größe der Freifeldkammer, so dass sich die Maus frei bewegen kann. Eine kürzere Kabeldauer verhindert, dass sich eine Maus in die Ecken bewegt, während ein längeres Kabel sich verheddern und die Bewegung behindern kann. Die Länge des faseroptischen Patchkabels, das für den modifizierten Freifeldassay verwendet wird, beträgt 50 cm. Die Länge ist nicht so streng wie bei der Hell-Dunkel-Untersuchung, da die Höhe der Drehverbindung entsprechend der Länge des LWL-Patchkabels eingestellt werden kann, wodurch sichergestellt wird, dass die Maus nur die Ecken der Kammer erreichen kann.
Basierend auf Leistungsanalysen werden 10-12 Mäuse pro Gruppe für CD1- und C57BL/6J-Mäuse mit i.p. CGRP und für optogenetische C57BL/6J-Mäuse benötigt, um eine signifikante Lichtaversion zu erkennen. Die C57BL/6J-Gruppengröße war jedoch erheblich größer als die CD1-Gruppengröße (Abbildung 2A,B), da die C57BL/6J-Mäuse in einer Teilmenge der Tests10 nicht auf CGRP ansprachen, was bedeutet, dass mehrere Tests durchgeführt wurden, um diese hohe Variabilität des lichtaversiven Verhaltens bei diesen Mäusen zu berücksichtigen. Insbesondere wurden zwei Experimente für die CD1-Mäuse und vier Experimente für C57BL/6J-Mäuse mit i.p. CGRP kombiniert (Abbildung 2A,B)10. Der Grund für diese Variabilität ist nicht bekannt, aber Menschen zeigen auch Variabilität in ihren Reaktionen auf CGRP und Licht. Intravenöse (i.v.) Injektion von CGRP-induzierten Migräneattacken bei etwa 63 ~ 75% der Migränepatienten, wobei 70 ~ 90% der Patienten, die Migräneattacken zeigten, Photophobie aufwiesen22,23,24,25. Insgesamt weist der Assay eine beträchtliche Variabilität auf und zusätzlich zur Anzahl der Mäuse ist es wichtig, mindestens zwei und vorzugsweise drei völlig unabhängige Experimente mit verschiedenen Kohorten von Mäusen durchzuführen.
Bettwäsche ist in der Hell-Dunkel-Kammer nicht erforderlich und der Experimentator ist nicht verpflichtet, die Mäuse vorzubehandeln oder zu gewöhnen. Als Vorsichtsmaßnahme dienen die beiden Präexpositionsverfahren dem Zweck, die Mäuse an die olfaktorischen und physikalischen Hinweise des Experimentators zu gewöhnen; Ueno H. et al. zeigten jedoch, dass es keinen Zeitunterschied zwischen Mäusen nach wiederholter Handhabung und Mäusen ohne Behandlung gibt26.
Der Freifeldassay kann den Beitrag der Angst zu einem lichtaversiven Phänotyp beurteilen. Es gibt andere gut validierte angstbezogene Assays, wie das erhöhte Nulllabyrinth und das erhöhte Plus-Labyrinth27; Der Open-Field-Assay ist jedoch die verfahrenstechnisch relevanteste Kontrolle für das Hell/Dunkel-Protokoll, da für beide Assays dieselbe Testkammer verwendet wird. Dennoch kann eine Beurteilung der Angst durch die Verwendung mehrerer Assays oder durch die Messung mehrerer Parameter in einem einzigen Test gestärkt werden, da Angst ein kompliziertes und facettenreiches Verhalten ist. Wichtig ist, dass selbst wenn es keinen Angstphänotyp im Freifeldassay gibt, dies eine Angstkomponente des lichtaversiven Phänotyps nicht ausschließt. Zum Beispiel könnte Licht eine Angstreaktion auslösen. Der Open-Field-Assay zeigt nur, dass Angst allein nicht die Reaktion auf Licht antreibt. Während ein anxiolytisches Medikament wie Benzodiazepam in diesem Assay verwendet werden könnte, hätte ein solcher Ansatz Komplikationen, z. B. anxiolytische Medikamente beeinflussen die Fortbewegung. Stattdessen entschieden wir uns für die Verwendung klinischer Anti-Migräne-Medikamente, einschließlich Sumatriptan, um den migräneähnlichen Status des lichtaversiven Phänotyps zu validieren. Sumatriptan kehrte die CGRP-induzierte Lichtaversion sowohl bei CD1- als auch bei C57BL/6J-Mäusen erfolgreich um10.
Im Gegensatz zum modifizierten Hell/Dunkel-Assay befindet sich die Kammer auf der ausziehbaren Schublade außerhalb der Kabine mit geöffneten Kabinentüren im modifizierten Freifeldassay, da das Patchkabel mit dem Kopf der Maus verbunden ist. Statt 55 Lux erreicht das Raumlicht mit ~1000 Lux den Boden der Kammer. Obwohl die Lichtintensität unterschiedlich ist, ist der Freifeldassay ein lichtunabhängiger Test. Im Detail führte die Erhöhung der Lichtintensität von 55 auf 27.000 Lux im Freilandtest bei C57BL/6J-Mäusen zu einer Abnahme der Zeit im Zentrum, was darauf hindeutet, dass die Lichtintensität das Verhalten der Maus beeinflussen könnte28. Der Unterschied zwischen der Kontrollgruppe und der experimentellen Gruppe war jedoch weder unter 55 noch unter 27.000 lux28 signifikant. Darüber hinaus ist der Unterschied in der Lichtintensität zwischen 55 und 1000 Lux weitaus subtiler als zwischen 55 und 27.000 Lux. Drahtlose Optogenetik kann dieses Problem lösen, da es keine Patchschnur geben würde, so dass die offene Feldkammer in die schalldämpfende Kabine geschoben werden kann.
Darüber hinaus schränkt das Patchkabel trotz Auswahl einer optimalen Länge die Mausbewegung noch ein. In Zukunft wird die drahtlose Optogenetik eine nicht-invasive Alternative zu kabelbasierten optogenetischen Techniken bieten.
Es sollte beachtet werden, dass wir eine akute Injektion von CGRP verwendet haben, die nur teilweise die verlängerte CGRP-Freisetzung repliziert, die Migräneattacken begleitet. Während wir CGRP in Mäuse injizierten, um Migräne zu modellieren, basierend auf der Prämisse, dass die Plasma-CGRP-Spiegel erhöht waren29 und dass i.v. CGRP-induzierte Migräneattacken bei Migränepatienten22,23,24,25,30, wird dies nicht den Zustand beim Patienten replizieren, bei dem CGRP relativ lange auf hohem Niveau gehalten wird (Patientenmessungen wurden im Median 3 Stunden nach Beginn der Migräne durchgeführt29 ), noch repliziert es chronische Migräne, bei der berichtet wird, dass die Werte sogar zwischen den Anfällen erhöht sind31. Darüber hinaus wurden andere schmerzinduzierte Mediatoren nicht in unserem Paradigma getestet.
Die Mogil-Gruppe modifizierte das erhöhte Plus-Labyrinth, um die Lichtaversion bei Mäusen zu messen, wobei die geschlossenen Arme von hellem Licht beleuchtet wurden und die offenen Arme dunkel blieben32. Das Standard-Plus-Labyrinth wurde oft verwendet, um angstbedingtes Verhalten bei Tieren zu erkennen. Dieser Assay basiert auf dem Konflikt zwischen dem angeborenen Wunsch einer Maus, eine neuartige Umgebung zu erkunden, und der Platzierung in einer kompromittierenden Position in den offenen, ungeschützten Labyrintharmen. Im modifizierten Protokoll sind Mäuse gezwungen, zwischen den geschlossenen Armen, die mit hellem Licht beleuchtet werden, und den offenen, ungeschützten Armen, die dunkel sind, zu wählen. Die Präferenz für erstere deutet darauf hin, dass Angst die Lichtaversion überstimmt, während die Präferenz für die letztere darauf hindeutet, dass Lichtaversion Vorrang vor Angst hat. Die Mogil-Gruppe führte auch ein standardmäßiges erhöhtes Plus-Labyrinth durch, um angstähnliches Verhalten zu bewerten32. Der Zweck ist derselbe wie die Durchführung des Freifeldtests in unserem Protokoll. Cacna1a-mutierte Mäuse, ein familiäres hemiplegisches Migränemodell, zeigten Photophobie, wenn die geschlossenen Arme hell waren. Im Gegensatz dazu wurde angstähnliches Verhalten nicht erkannt, wenn das standardmäßige erhöhte Plus-Labyrinth durchgeführt wurde32. Bei Ratten wurde durch die Verwendung sowohl des modifizierten erhöhten Plus-Labyrinths als auch des Hell/Dunkel-Assays gezeigt, dass Nitroglycerin (NTG) in der Lage war, Photophobie33,34 zu induzieren, die von Sumatriptan34 gerettet wurde. In der standardmäßigen erhöhten Plus-Labyrinth-Einstellung, in der Licht in den geschlossenen Armen fehlt, induzierte NTG bei Ratten34 angstähnliches Verhalten, was darauf hindeutet, dass NTG-induzierte Lichtaversion mit Angst einhergeht. Unseres Wissens gibt es keine Publikationen, die den Hell/Dunkel-Assay und das modifizierte erhöhte Labyrinth im selben Mausmodell verwenden. Alles in allem haben sich sowohl das modifizierte erhöhte Plus-Labyrinth als auch der in diesem Protokoll vorgeschlagene Hell-Dunkel-Assay als wirksame Messungen des lichtaversiven Verhaltens bei Mäusen erwiesen.
Wir verwenden das Tageslicht-LED-Panel mit einer tageslichtausgeglichenen Farbe (5600K) mit einer 60 ° -Flutlichtstrahlspreizung, die in einer Höhe von ~ 30 cm vom Kammerboden bei 55 Lux oder 27.000 Lux keine Schatten liefert. Andere Studien, die die Lichtaversion untersuchen, haben den Hell/Dunkel-Assay mit unterschiedlichen Modifikationen verwendet. Zum Beispiel haben Studien unterschiedliche Lichtintensitäten für die Lichtzone verwendet, die von Hunderten bis Tausenden von Lux35,36,37 reichen; verwendetes Licht in verschiedenen Wellenlängen (z. B. blau und gelb)38; oder verschiedene Lichttemperaturen (kalt und warm) verwendet39. Vorsicht ist auf die vom Licht erzeugte Wärme zu achten, da sie die Temperatur der dunklen und hellen Zonen beeinflussen und das Verhalten der Mäuse beeinträchtigen kann, was möglicherweise zu einer Präferenz für eine bestimmte Zone führt. Außerdem ist es auch wichtig, das Licht mit einem guten Betrachtungswinkel zu verwenden, um Schatten auf dem Boden der Kammer zu vermeiden. Auch die Lichtintensität ist für den Test wichtig. 25.000 -27.000 Lux entsprechen in etwa hellem Tageslicht. Durch die Durchführung des Hell-Dunkel-Assays bei einer so hohen Lichtintensität ist es möglich, den Behandlungseffekt zu verstärken; Es ist jedoch wichtig, die Netzhautschädigung40 und die negativen Auswirkungen einer so hohen Lichtintensität auf die Bereitschaft einer Maus, ins Licht zu gehen, zu berücksichtigen. Einige Studien berichteten, dass Mausaugen, die direktem Licht ausgesetzt waren41, und Mäuse, die mehrere Stunden lang hellem Licht ausgesetzt waren (z. B. 30.000 Lux für 4 Stunden42), Netzhautschäden erlitten. Im Hell/Dunkel-Assay gibt es eine dunkle Zone, in der die Maus dem hellen Licht entkommen kann, wenn die Maus dies wünscht. Darüber hinaus ergaben frühere Studien, dass Mäuse in der Kontrollgruppe (C57BL/6J-Mäuse) eine ähnliche Zeit in der Lichtzone unter 55, 1000 und 27.000 lux28 verbrachten. Für CD1-Mäuse verbrachte die Kontrollgruppe etwa 1/3 der Zeit im Licht unter 27.000 lux10 und unveröffentlichte Daten hatten ähnliche Ergebnisse bei 55 Lux gezeigt. Es deutet darauf hin, dass 27.000 Lux Licht allein CD1- und C57BL / 6J-Mäuse nicht in Bedrängnis bringen. Dennoch ist Vorsicht geboten, wenn man sich für eine höhere Lichtintensität entscheidet.
Neben Unterschieden in der Lichteinstellung haben sich die Forscher für eine Vielzahl von Ansätzen bei der Analyse der Hell-Dunkel-Daten entschieden. Bei der Beurteilung der Lichtaversion wird die Zeit, die in der Lichtzone mit ausgeschaltetem Licht (oder mit Rotlichtbeleuchtung der Lichtzone, da Mäuseaugen weniger empfänglich für rotes Licht sind) in die Berechnung einbezogen. Zum Beispiel wurde der Aversionsindex= (Zeit in Licht0 Lux-Zeit in Lichttestlux) / Zeit in Licht0 Lux von der Gorin-Gruppe verwendet, um die Lichtaversion zu bewerten43. Hier werden die Bedingungen "Licht aus" oder "rotes Licht" einbezogen, um zu bestätigen, dass die Vermeidung der Lichtzone davon abhängig ist, dass Licht im Gegensatz zur einfachen Ortspräferenz vorhanden ist. Wir führten dieses Verfahren mit einer i.p. Injektion von CGRP durch und stellten fest, dass Mäuse, die CGRP erhielten, keine Ortspräferenz bei ausgeschaltetem Licht in der Lichtzone hatten, was bestätigte, dass die CGRP-induzierte Aversion lichtabhängig ist16. Schließlich verwendete die Gorin-Gruppe die Zeit, die Mäuse in der Peripherie der Lichtzone im Hell-Dunkel-Assay verbrachten, als Maß für die Angst36. Wir verwenden einen traditionellen Test für Angstzustände, den Open-Field-Assay. Unabhängig davon, welche Analysemethode gewählt wird, sollte beachtet werden, dass der Beitrag der Angst zur Lichtaversion nicht ignoriert werden kann. Dieses Protokoll versucht, angstähnliches und lichtaversives Verhalten zu unterteilen, indem es die Hell / Dunkel- und Freifeldassays im Tandem verwendet.
Dieses Protokoll befasst sich mit der Verwendung der Hell/Dunkel- und Freifeldassays zur Detektion von lichtaversivem Verhalten bei Mäusen. Dies bietet ein nützliches Werkzeug, um die Mechanismen neuronaler Schaltkreise und Gehirnregionen zu identifizieren, die die Photophobie antreiben. Das Testparadigma kann migränespezifisch sein oder auf andere Erkrankungen mit Photophobie ausgeweitet werden. In Bezug auf Migräne haben wir zwei weitere Neuropeptide getestet, die mit der Migränepathogenese assoziiert sind: Hypophysen-Adenylatcyclase-aktivierendes Polypeptid (PACAP) und vasoaktives intestinales Peptid (VIP). Es wurde gezeigt, dass PACAP und VIP bei CD1-Mäusen Lichtaversion induzieren17,21. Neben Migräne ist Photophobie auch ein Symptom für viele andere Erkrankungen, darunter Bradypsie, akute Augenverletzungen oder -entzündungen, traumatische Hirnsyndrome, Lyme-Borreliose, Albinismus und Zapfendystrophie36. Somit bietet dieses Testparadigma ein Werkzeug, um Mechanismen zu untersuchen, die Photophobie-bedingten Störungen zugrunde liegen. Darüber hinaus wird die Kombination optogenetischer Methoden mit konventionellen pharmakologischen Ansätzen zweifellos bei der Entwicklung neuartiger Therapeutika für Photophobie-bedingte Erkrankungen helfen.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu melden.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des NIH NS R01 NS075599 und RF1 NS113839 unterstützt. Die Inhalte stellen nicht die Ansichten von VA oder der Regierung der Vereinigten Staaten dar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Activity monitor | Med Assoc. Inc | Software tracking mouse behavior | |
| Customized acrylic shelf | For adjusting the height of the LED panel | ||
| Dark box insert | Med Assoc. Inc | ENV-511 | |
| DC power supply | Med Assoc. Inc | SG-500T | |
| DC regulated power supply | Med Assoc. Inc | SG-506 | |
| Fiber-optic cannula | Doric | MFC_200/ 240-0.22_4.5mm_ZF1.25_FLT | |
| Germicidal disposable wipes | Sani-Cloth | SKU # Q55172 | |
| Heat Sink | Wakefield | 490-6K | Connecting to LED panel |
| IR controller power cable | Med Assoc. Inc | SG-520USB-1 | |
| IR USB controller | Med Assoc. Inc | ENV-520USB | |
| Mating sleeve | Doric | SLEEVE_ZR_1.25 | |
| Modified LED light panel | Genaray Spectro | SP-E-360D | Daylight-balanced color (5600K) |
| Power supply | MEAN WELL USA | SP-320-12 | Connecting to LED panel |
| Seamless open field chamber | Med Assoc. Inc | ENV-510S | |
| Sound-attenuating cubicle | Med Assoc. Inc | ENV-022MD-027 | |
| Stand and clamp | |||
| Three 16-beam IR arrays | Med Assoc. Inc | ENV-256 |
References
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