Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

חקירת התנהגות דמוית מיגרנה באמצעות סלידה קלה בעכברים

Published: August 11, 2021 doi: 10.3791/62839
Automatic Translation
1, 2, 3,4, 4, 3,4, 3,4,5
1Department of Neuroscience and Pharmacology, University of Iowa, 2School of Behavioral and Brain Sciences, University of Texas at Dallas, 3Center for the Prevention and Treatment of Visual Loss, Veterans Administration Health Center, Iowa City, IA, 4Department of Molecular Physiology and Biophysics, University of Iowa, 5Department of Neurology, University of Iowa

Summary

מכרסמים אינם מסוגלים לדווח על תסמיני מיגרנה. כאן, אנו מתארים פרדיגמת בדיקה הניתנת לניהול (בדיקות שדה בהירות/כהות ופתוחות) למדידת סלידה קלה, אחד הסימפטומים הנפוצים והמטרידים ביותר בחולים עם מיגרנות.

Abstract

מיגרנה היא הפרעה נוירולוגית מורכבת המאופיינת בכאבי ראש וחריגות חושיות, כגון רגישות יתר לאור, שנצפתה כפוטופוביה. אמנם אי אפשר לאשר כי עכבר חווה מיגרנה, סלידה קלה יכולה לשמש תחליף התנהגותי עבור סימפטום מיגרנה של פוטופוביה. כדי לבדוק סלידה קלה, אנו משתמשים בבדיקה הבהירה/כהה כדי למדוד את הזמן שעכברים בוחרים בחופשיות לבלות בסביבה בהירה או חשוכה. הבדיקה שופרה על ידי החדרת שני שינויים קריטיים: חשיפות מוקדמות לתא לפני הפעלת הליך הבדיקה ותאורה תאית מתכווננת, המאפשרת שימוש במגוון עוצמות אור מ-55 לוקס ל-27,000 לוקס. מכיוון שהבחירה לבלות יותר זמן בחושך מעידה גם על חרדה, אנו משתמשים גם במבחן חרדה עצמאי לאור, בדיקת השדה הפתוח, כדי להבחין בין חרדה להתנהגות מרתיעה לאור. כאן, אנו מתארים פרדיגמת בדיקה שונה עבור בדיקות שדה אור / כהה ופתוח. היישום של בדיקות אלה מתואר להזרקה תוך-אפריטונית של פפטיד הקשור לגן קלציטונין (CGRP) בשני זני עכבר ולמחקרי גירוי מוחי אופטוגנטי.

Introduction

מיגרנה היא מחלה נוירולוגית נפוצה, המשפיעה על כ -17% מהאמריקאים1 והיא הגורם המוביל השני לנכות ברחבי העולם 2,3. חולים חווים כאב ראש שנמשך 4-72 שעות מלווה לפחות באחד מהתסמינים הבאים: בחילה ו /או הקאות, או פוטופוביה ופונופוביה4. ההתפתחויות האחרונות בפיתוח נוגדני פפטיד הקשורים לגן קלציטונין (CGRP) שאושרו כעת על ידי ה-FDA החלו עידן חדש לטיפול במיגרנה5,6,7. נוגדנים אלה חוסמים את CGRP או את הקולטן שלו ומונעים תסמיני מיגרנה בכ -50% מחולי המיגרנה7. בשנה האחרונה, שני אנטגוניסטים מולקולות קטנות של קולטן CGRP אושרו גם ה-FDA לטיפול בהפלה של מיגרנה, ושניים נוספים נמצאים בצנרת8. למרות התקדמות טיפולית זו, מנגנונים שבאמצעותם מתרחשים התקפי מיגרנה עדיין נשארים חמקמקים. לדוגמה, האתרים של פעולת CGRP אינם ידועים. היעילות של נוגדנים טיפוליים שאינם חוצים באופן ניכר את מחסום הדם - מוח מרמזת כי CGRP פועל באתרים היקפיים, כגון קרום המוח ו / או הגרעינים הטריגמינליים. עם זאת, איננו יכולים לשלול פעולות מרכזיות באיברים עקיפים, אשר חסרים מחסום דם - מוח9. לפחות עבור פוטופוביה, אנחנו חושבים שזה פחות סביר בהתחשב בתוצאות שלנו עם סלידה קלה באמצעות עכברי nestin / hRAMP1 מהונדסים שבהם hRAMP1 מתבטא יתר על המידה ברקמת העצבים10. הבנת מנגנונים של מיגרנה פתופיזיולוגיה תספק אפיקים חדשים להתפתחות של טיפולי מיגרנה.

מודלים פרה-קליניים של בעלי חיים הם קריטיים להבנת מנגנוני המחלה ופיתוח תרופות חדשות. עם זאת, הערכת מיגרנה בבעלי חיים היא מאתגרת שכן בעלי חיים אינם יכולים לדווח מילולית על תחושות הכאב שלהם. בהתחשב בעובדה כי 80-90% מחולי המיגרנה מפגינים פוטופוביה11, סלידה קלה נחשבת אינדיקטור למיגרנה במודלים של בעלי חיים. זה הוביל לצורך לפתח בדיקה כדי להעריך סלידה אור בעכברים.

הבדיקה הבהירה/כהה מכילה אזור אור ואזור חשוך. הוא נמצא בשימוש נרחב למדידת חרדה בעכברים בהתבסס על המחקר הספונטני שלהם של סביבות חדשניות כי הוא נגד על ידי הסלידה המולדת שלהם לאור12. מחקרים מסוימים מגדירים 1/3 של התא כאזור החשוך, בעוד שאחרים להגדיר 1/2 של התא כאזור החשוך. ההגדרה הקודמת משמשת לעתים קרובות כדי לזהות חרדה13. בעוד שבתחילה בחרנו בתאים בהירים/כהים בגודל שווה, לא השווינו את שני הגדלים היחסיים. אנו יכולים לציין כי הגודל הכולל של שני התאים אינו גורם מרכזי מאז תיבת הבדיקה הראשונית14 היה גדול בהרבה מאשר המנגנון הבא15, עדיין התוצאות היו זהות במהותן.

שני שינויים קריטיים בבדיקה בהירה/כהה זו להערכת סלידה מאור היו: מצב הבדיקה ועוצמת האור (איור 1). ראשית, עכברים נחשפים מראש לתא הבהיר/כהה כדי להפחית את כונן האקספלורציה16 (איור 1A). הצורך והזמנים של חשיפות מוקדמות תלויים בזני עכברים ובדגמים. עכברי Wildtype C57BL/6J דורשים בדרך כלל שתי חשיפות מוקדמות10, בעוד שרק חשיפה מוקדמת אחת לעכברי CD1 מספיקה17. באופן זה, התנהגות מרתיעה קלה יכולה להיות חשוף בשני זני עכבר אלה. שנית, התאורה התאית הותאמה כך שתכלול מגוון מתכוונן של עוצמות אור מעומעם (55 לוקס) ועד בהיר (27,000 לוקס) שבו 55 לוקס דומים ליום מעונן כהה, ו-27,000 לוקס דומים ליום שמש בהיר בצל10. מצאנו שעוצמת האור הנדרשת משתנה בהתאם לזן ולמודל הגנטי. מסיבה זו, אנשים צריכים תחילה להעריך את עוצמת האור המינימלית עבור הפרדיגמה הניסיונית שלהם.

אפילו עם שינויים אלה לבדיקה, אשר יכול לחשוף פנוטיפ מרתיע אור, יש צורך לבדוק התנהגות דמוית חרדה כדי להבחין בין סלידה אור עקב אור לבד לעומת עקב חרדה. בדיקת השדה הפתוח היא דרך מסורתית למדוד חרדה המבוססת על חקר ספונטני של סביבות חדשניות. זה שונה מן הבדיקה הבהירה / כהה בכך שכונן האקספלורציה מנוגד לסלידה המולדת לשטחים פתוחים לא מוגנים. הן המרכז והן הקצוות של החדר נמצאים באור, כך שבדק השדה הפתוח הוא בדיקת חרדה עצמאית לאור. לפיכך, השילוב של בדיקות השדה הבהיר/הכהה והפתוח מאפשר לנו להבחין בין סלידה מאור עקב הימנעות מאור לעומת עלייה כוללת בחרדה.

CGRP הוא נוירופפטיד רב תכליתי המווסת את התרחבות כלי הדם, nociception, ודלקת18. זה בא לידי ביטוי נרחב במערכות העצבים ההיקפיות והמרכזיות. זה ממלא תפקיד חשוב מיגרנה פתופיזיולוגיה18. עם זאת, המנגנון שבבסיס פעולת CGRP במיגרנה אינו ברור. על-ידי שימוש בבדיקות השדה הבהירות/הכהות והפתוחות עם פרדיגמת בדיקה שונה זו, הצלחנו לזהות התנהגות מרתיעה של אור בעכברים בעקבות 10,16 (איור 2) ומרכזי 14,15,15,16,19 ניהול CGRP. בנוסף לנוירופפטידים, זיהוי אזורי המוח המעורבים בסלידה קלה חשוב גם בהבנת פתולוגיה של מיגרנה. הגרעינים התלמיים האחוריים הם אזור מוחי אינטגרטיבי לכאב ועיבוד אור19, והתלמוס מופעל במהלך מיגרנה20. לכן, התמקדנו גרעינים תלמיים אחוריים על ידי הזרקת וירוס הקשור אדנו (AAV) המכיל channelrhodopsin-2 (ChR2) או eYFP לאזור זה. על ידי שילוב גישה אופטוגנטית זו עם שתי הבדיקות הללו, הדגמנו כי גירוי אופטי של נוירונים המבטאים ChR2 בגרעין התלמי האחורי עורר סלידה מאור19 (איור 3). בניסוי זה, בהתחשב בהשפעה הדרמטית על הסלידה האורית המעוררת בעכברים האופטוגנטיים האלה שעברו מניפולציה אופטוגנטית, דילגו על חשיפות מוקדמות לתא.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

נהלי בעלי חיים אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת איווה ובוצעו בהתאם לסטנדרטים שנקבעו על ידי המכונים הלאומיים לבריאות.

1. בדיקת אור/חושך

  1. מנגנון תא בהיר/כהה (ראה טבלת חומרים) התקנה. כל הציוד בסעיף זה זמין מסחרית.
    1. על המדף, הניחו את התא המוחלש בצליל (פנימי: 59.7 x 38 x 38 x 35.6 ס"מ ב- W x H x D) המכיל מגירה נשלפת לגישה נוחה לתא ולהכנסה כהה.
    2. חבר את ספק הכוח DC ואת ספק הכוח המוסדר על-ידי DC לתא המוחלש באמצעות קול.
    3. מקם את תא השדה הפתוח השקוף החלק (27.31 x 27.31 x 20.32 ס"מ ב- L x W x H) במגירה הנפתחת של התא.
    4. מקם את החדר השחור, אינפרא-אדום שקוף מפלסטיק (IR) שקוף (28.7 X 15 X 20.6 ס"מ ב- L x W x H) בתא השדה הפתוח. ודא שהתא מחולק לשני אזורים בגודל שווה: אזור חשוך ואזור אור.
    5. חבר שלוש ערכות של מערכי אינפרא-אדום בעלי 16 קורות בצירי X, Y ו- Z של תא השדה הפתוח לבקר ה- USB של IR באמצעות כבלים.
    6. חבר את בקר ה- USB של IR למחשב.
    7. התקן את תוכנת המעקב במחשב שיכולה להקליט ולאסוף את מיקום ופעילות העכבר.
    8. להגדרת לוח התאורה, הסירו תחילה את לוח התאורה דיודה פולט אור (LED) (27.70 x 27.70 ס"מ ב-L x W; 360 נורות LED, צבע מאוזן באור יום, 5600K, התפשטות קרן הצפה של 60°) מהמארז המקורי שלו.
    9. הרכב את לוח האור עם מנהל ההתקן LED, כיור החום ואספקת החשמל. ניתן לחבר לוחות תאורת LED מרובים לספק כוח אחד, לכיור חום ולמנהל התקן LED אחד כדי להשיג שליטה אחידה בלוח התאורה.
    10. בנו פלטפורמת אקריליק מותאמת אישית (29.77 x 27.70 x 8.10 ס"מ ב-L x W x H) הכוללת 7 מדפים זהים במרווחים של 0.53 ס"מ (איור 1B). מצמידים לצמיתות את מדף האקריליק המותאם אישית לתקרה בתוך התא שמעל התא.
    11. הכנס את לוח נורית ה-LED לחריץ שבין שני המדפים התחתונים. התאימו את לוח האור לגבהים שונים (איור 1B,C), במידת הצורך (למשל, אם משתמשים בעכברים אופטוגנטיים). הפרטים נידונים בסעיף 3).
    12. הפעל את כיור החום, מנהל ההתקן LED ואספקת החשמל. ודא כי מנהל ההתקן LED יכול להכתיב את עוצמת אור LED על ידי מדידת עוצמת האור על רצפת התא ולאשר כי הרצפה מוארת באופן שווה.
  2. הליך בדיקה התנהגותי
    הערה: עכברים שוכנים במחזור אור של 12 שעות. כל הניסויים ההתנהגותיים מבוצעים במהלך מחזור האור. עכברים, כולל זכרים ונקבות, בגילאי 10-20 שבועות, משמשים. בפרוטוקול זה, עכברי CD1 ו- C57BL/6J תמימים חווים שתי חשיפות מוקדמות לתא הבהיר/כהה ואחריהן חשיפה לטיפול וחשיפה לאחר הטיפול. קיים מרווח של שלושה ימים בין כל חשיפה כדי לאפשר לעכברים להתאושש (יום 1, 4, 7 ו-10 כמתואר להלן ואיור 1A). עם זאת, עכברי CD1 אינם דורשים את החשיפה המוקדמת השנייה וניתן לבדוק אותם באור עמום.
    1. ביום הראשון (טיפול מקדים 1), הפעל את מנגנון הבדיקה הבהיר/כהה והגדר את עוצמת האור ל-27,000 לוקס.
    2. פתח את תוכנת המעקב והגדר פרוטוקול חדש. בהגדרה פרוטוקול חדש , הגדר את משך הזמן ל- 30 דקות. בהגדרה ניתוח חדש , הגדר את סלי הנתונים לפי משך זמן ל- 300 s.
    3. בהגדרה אזור חדש , בחר אזורים מוגדרים מראש. בחר 2 ולאחר מכן אופקי. בדוק אם התא מחולק לשני אזורים בגודל שווה אופקית להקלטה.
    4. להרגיל עכברים לחדר הבדיקות במשך 1 שעות לפני הבדיקה. במהלך ההרגלה, שמור על אור החדר כדי לא לשבש את השעון הביולוגי של העכבר. ודאו שכל הציוד לבדיקה הבהירה/כהה מופעל, ומאפשר לעכברים להסתגל באופן מלא לסביבת חדר הבדיקות.
    5. בחר רכוש נתונים. הזן מזהי עכבר. הפעל את הפרוטוקול.
    6. משוך את המגירה מחוץ לתא להחלשת הקול כדי לגשת לתא הבהיר/ הכהה ולהכנסה הכהה. הרימו בעדינות את העכבר על בסיס הזנב, הניחו אותו באזור האור של התא, ולדחוף את המגירה בתוך התא. ודא שהתוכנה מזהה את העכבר באופן מיידי ומתחילה להקליט פעילות.
    7. המתן להפסקת ההקלטה באופן אוטומטי לאחר 30 דקות. תחזיר את העכבר לכלוב הביתי שלו.
    8. נקה את התא והכנס כהה באמצעות מגבונים חד פעמיים של ריח אלכוהול המכילים 55.0% אלכוהול איזופרופיל, 0.25% אלקיל C12-18 דימתיל אתילבנזל אמוניום, ו 0.25% אלקיל C12-18 דימתיל בנזיל אמוניום כלוריד כמרכיבים פעילים אנטי מיקרוביאליים כדי לחסל את כל רמזי הריח שנותרו על ידי העכבר הקודם.
    9. ביום 4 (טיפול מקדים 2), חזור על שלבים 1.2.1 עד 1.2.8.
    10. ביום 7 (יום הטיפול), חזור על שלב 1.2.1 ו 1.2.4. לאחר ההרגלה, לנהל CGRP (0.1 מ"ג / קילוגרם, 10 μl / g מבוסס על משקל גוף העכבר, הזרקה תוך-אפריטונית (i.p.)), הטיית ראש העכבר קדימה והזרקה ברביע הימני התחתון. תחזיר את העכבר לכלוב הביתי.
    11. לאחר 30 דקות, הפעל את הפרוטוקול והפעל את העכבר בתא הבהיר/כהה כאמור בשלבים 1.2.5 עד 1.2.7. זמן ההחלמה בכלובים ביתיים לאחר זריקות ניתן לקצר או להאריך בהתאם לטיפול21.
    12. נקה את התא והכנס כהה כמתואר בשלב 1.2.8.
    13. ביום 10 (יום לאחר הטיפול), חזור על שלבים 1.2.1 עד 1.2.8. ניתן להשהות את הניסוי בשלב 1.2.13 לפני תחילת בדיקת השדה הפתוח.

2. בדיקת שדה פתוח

  1. התקנת המנגנון
    1. הגדרת תא שדה פתוח: השתמש באותו תא להחלשת קול ותא שדה פתוח המשמשים בבדיקת האור/הכהה, מבלי להשתמש בהוספה הכהה.
    2. הגדרת החלונית הקלה: השתמש/י באותה התקנה המשמשת בבדיקת האור/הכהה. ודא שעוצמת האור זהה לזו המשמשת בבדיקת האור/הכהה.
  2. הליך בדיקה התנהגותי
    1. תדליק את המנגנון. הגדר את עוצמת האור ל-27,000 לוקס.
    2. פתח את תוכנת המעקב.
    3. הגדר פרוטוקול חדש, זהה לזה המשמש בבדיקת האור/הכהה למעט הגדרות האזור החדש . בחר 1 ואחריו המרכז בהגדרות אזור חדש . הגדר את הפריפריה כ-3.97 ס"מ מהמתחם והמרכז כ-19.05 ×-19.05 ס"מ.
    4. להרגיל עכברים לחדר הבדיקות כמתואר בשלב 1.2.4.
    5. ניהול CGRP (0.1 מ"ג /ק"ג, 10 μl / g בהתבסס על משקל גוף העכבר, כלומר), הטיית ראש העכבר קדימה והזרקה ברביע הימני התחתון. תחזיר את העכבר לכלוב הביתי.
    6. לאחר 30 דקות, להתחיל את הפרוטוקול. משוך את המגירה הנפתחת מחוץ לתא להחלשת הקול והנח את העכבר בעדינות באמצע תא השדה הפתוח. לדחוף את המגירה בתוך התא.
    7. אופן הפעולה של מעקב במשך 30 דקות. ואז להחזיר עכברים לכלובי הבית שלהם.
    8. נקה את המנגנון כמתואר בשלב 1.2.8.

3. בדיקת אור/כהה מותאמת לעכברים אופטוגנטיים

  1. התקנת המנגנון
    1. בצע שני שינויים בהוספה הכהה.
      1. שנה את הפתיחה של התוספת הכהה ל-5.08 x 5.08 ס"מ (W x H) עם חריץ קטן בגודל 0.95 x 10.16 ס"מ (W X H) בין החלק העליון לבין פתיחת התוספת הכהה (איור 1D למעלה משמאל).
        הערה: שינוי זה מאפשר לעכבר לעבור לאזור החשוך ללא קושי כאשר צינורית הסיבים האופטיים בראש העכבר מחוברת לכבל התיקון.
      2. הרחיבו את החלק העליון של התוספת הכהה על אזור האור כמרפסת משולשת (H=6.5 ס"מ) (איור 1D למעלה מימין ומשמאל תחתון). חותכים חור עגול (D = 1.7 ס"מ) מהמרפסת ומכניסים מחזיק לחור כדי למקם ולייצב את המפרק הסיבובי, המחבר את הלייזר ואת כבלי התיקון הסיבים האופטיים (איור 1D למעלה משמאל ומשמאל תחתון).
        הערה: השינויים גורמים לשינוי קטן בעוצמת האור המגיע לרצפת האזור החשוך (17 לוקס עם שינויים לעומת 14 לוקס ללא שינויים, נמדד בפינה האחורית-ימנית של האזור החשוך מתחת ל -27,000 לוקס).
    2. הכנס את המפרק הסיבובי למחזיק על ההוספה הכהה.
    3. חברו את כבל הסיבים האופטיים בקוטר 30.5 ס"מ למפרק הסיבובי. ודא כי המפרק הסיבובי יכול להסתובב בצורה חלקה, כך כבל התיקון יכול לסובב ללא קושי כמו העכבר חוצה את התא.
    4. עבור שאר ההתקנה, השתמש באותה הגדרת מנגנון המשמשת בסעיף 1 (בדיקת אור/כהה).
  2. הליך בדיקה התנהגותי
    הערה: בניגוד לעכברי הפרא, העכברים האופטוגנטיים אינם מקבלים חשיפות מוקדמות (טיפול מקדים 1 ו -2).
    1. ביום הבדיקה, הכנס את לוח תאורת ה- LED לחריץ השני הנמוך ביותר (28.23 ס"מ מרצפת הקמבר) כדי לאפשר מקום לחיבור כבל התיקון. הפעילו את מנגנון הבדיקה הבהיר/כהה והגדירו את עוצמת האור ל-55 לוקס.
    2. השתמש באותה הגדרת פרוטוקול כמו זו ב- 1.2.2 ו- 1.2.3 למעט העובדה שסל נתונים לפי משך מוגדר ל- 60 s בהגדרה ניתוח חדש כך שיתאים לפרוטוקול גירוי הלייזר בשלב 3.2.3.
    3. הפעל את לחצן ההפעלה של הלייזר. הגדר את בקר פעימת הלייזר כדי לעורר במשך 1 דקה ואחריו 1 דקה ללא גירוי מעל 30 דקות.
    4. להרגיל עכברים לחדר הבדיקות עם האור דולק במשך 1 שעות לפני הבדיקה.
    5. הפעל את הפרוטוקול. משוך את המגירה הנפתחת מחוץ לתא ההחלשה בצליל כדי לגשת לתא הבהיר/כהה ולהכנסה הכהה.
    6. ריסנו בעדינות את העכבר והצמידו את צינורית הסיבים האופטיים לראש העכבר לכבל התיקון הסיבים האופטיים באמצעות שרוול ההזדווגות (איור 1D מימין למטה ). מניחים את העכבר בעדינות באזור האור ולדחוף את המגירה בתוך התא. ודא שהפרוטוקול יתחיל לתעד את אופן הפעולה של העכבר באופן אוטומטי.
    7. בדקה אחת, הפעל את בקר הדופק ולאחר מכן הפעל את מפתח האל-כשל למצב פעיל. ודא גירוי לייזר של אזור המוח ממוקד מתרחש כל דקה שנייה.
    8. לאחר 30 דקות כאשר הפרוטוקול מפסיק לפעול באופן אוטומטי, כבה את מפתח האל-כשל למצב כבוי. לאחר מכן כבה את בקר הדופק.
    9. פתח את העכבר ואת כבל התיקון של הסיב האופטי. תחזיר את העכבר לכלוב הביתי.
    10. נקה את התא והכנס כהה כמתואר בשלב 1.2.8.

4. בדיקת שדה פתוח שונה עבור עכברים אופטוגנטיים

  1. התקנת המנגנון
    1. ייצבו את המפרק הסיבובי מעל התא באמצעות מעמד ומהדק (איור 1E).
    2. חברו את כבל הסיבים האופטיים באורך של 50 ס"מ למפרק הסיבובי. בדוק אם המפרק הסיבובי יכול להסתובב בצורה חלקה.
    3. הגדר את המפרק הסיבובי לגובה המתאים על המעמד: ודא כי כבל תיקון סיבים אופטיים יכול רק להגיע לכל פינה של התא, אשר יסייע למנוע כל הפרעה עם תנועת העכבר.
    4. עבור שאר ההתקנה, השתמש באותה הגדרת מנגנון המשמשת בסעיף 1 (בדיקת אור/כהה), אך ללא הוספה כהה.
  2. הליך בדיקה התנהגותי
    1. הפעילו את מנגנון הבדיקה הבהיר/כהה והגדירו את עוצמת האור ל-55 לוקס.
    2. השתמש באותה הגדרת פרוטוקול כמו זו של בדיקת האור/הכהה שהשתנתה (סעיף 3) למעט הגדרות האזור החדש. בחר 1 להלן לפי הגדרות 'מרכז' באזור חדש. הגדר את הפריפריה כ-3.97 ס"מ מהמתחם והמרכז כ-19.05 ×-19.05 ס"מ.
    3. הפעל את לחצן ההפעלה של הלייזר. הגדר בקר דופק לייזר כדי לעורר במשך 1 דקה ואחריו 1 דקה ללא גירוי מעל 30 דקות.
    4. בצע הרגלה ואת שאר הבדיקה כמתואר בשלבים 3.2.4 עד 3.2.10 למעט שני שינויים לשלב 3.2.6: למקם את העכבר בעדינות באמצע התא במקום באזור האור; שמור את המגירה הנפתחת מחוץ לתא עקב כבל התיקון המתחבר לראש העכבר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פרדיגמת בדיקה התנהגותית זו נועדה לבחון התנהגות מרתיעה אור. זה יכול להתבצע באמצעות עכברי wildtype נאיביים ועכברים אופטוגנטיים כדי לחקור סלידה אור בזמן אמת במהלך גירוי של אוכלוסייה עצבית ממוקדת.

הליך זה שימש לחקר ההשפעה של טיפול CGRP היקפי בעכברים CD1 ו- C57BL / 6J10,16 וגירוי אופטי של נוירונים בגרעין התלמי האחורי בעכברים C57BL / 6J 19 על התנהגות מרתיעה אור. בניסויים נעשה שימוש בעכברים, בהם זכרים ונקבות, בני 10-20 שבועות (איור 2A, איור 2B-D ואיור 3). התוצאות חשפו כי הזרקת i.p. של CGRP הפחיתה באופן משמעותי את משך הזמן שהושקע באזור האור בבדיקת האור/הכהה בעכברים CD1 (איור 2A) ו- C57BL/6J (איור 2B), אך לא השפיעה על הזמן שעכברים בילו במרכז בבדיקת השדה הפתוח ב- CD1 (נתונים אינם מוצגים) ובעכברים C57BL/6J (איור 2D)10, 16. זה מצביע על כך CGRP היקפי גורם סלידה אור אבל לא חרדה כללית. הטיפול ב-CGRP גם הגדיל את משך הזמן שבו עכברים נחו באזור החשוך, אך לא באזור האור הן בעכברים CD1 (נתונים שאינם מוצגים) והן בעכברים C57BL/6J (איור 2C).

עבור הפרוטוקול האופטוגנטי, התמקדנו ב- calmodulin kinase II alpha (CaMKIIa) - המבטאים נוירונים בגרעין התלמי האחורי על ידי הזרקת AAV2-CaMKIIa-hChR2(E123A)-eYFP או וירוס הבקרה AAV2-CaMKIIa-eYFP19. במקביל, צינורית סיבים אופטיים הושתלה בגרעין התלמי האחורי. שלושה שבועות לאחר ההזרקה כדי לאפשר מספיק זמן לביטוי ChR2, ביצענו גירוי אופטי של נוירונים בגרעינים התלמיים האחוריים וציינו ירידה מקבילה במשך הזמן שעכברים בילו באזור האור/כהה בבדיקת האור/כהה בעכברים המוזרקים ChR2 בהשוואה לעכברים מוזרקים על ידי וירוסים (eYFP) (איור 3A). לא היה הבדל בולט בזמן במרכז בבדיקת השדה הפתוח בין ChR2 לבין עכברי eYFP שליטה (איור 3C), מה שמעיד על תגובה מרתיעה קלה שלא הונעה אך ורק על ידי חרדה19. יתר על כן, נרשמה גם עלייה בזמן המנוחה באזור החשוך, אך לא באזור האור (איור 3B). אותן תוצאות התקבלו בעת שימוש ב-55 לוקס ו-27,000 לוקס (איור 3). הליך 55-לוקס נכלל כי חולי מיגרנה רגישים אפילו לאור עמום.

Figure 1
איור 1: ציר הזמן והמנגנון של הבדיקה הבהירה/כהה. (A) ציר הזמן של פרדיגמת הבדיקה: לאחר שתי חשיפות מוקדמות לתא הבהיר/כהה (Pre 1 ו-Pre 2), עכברים מקבלים CGRP (0.1 מ"ג/ק"ג, כלומר) ואחריו מדידה לאחר הטיפול (Post). לפחות יום אחד לאחר הבדיקה הקלה /כהה, עכברים מקבלים CGRP (0.1 מ"ג / קילוגרם, כלומר) שוב והם רצים בבדיקת השדה הפתוח. לפני: טיפול מקדים; Tx: טיפול; לאחר: לאחר הטיפול (B) לוח ה-LED מוחזק בחלקו העליון של התא על ידי מדף אקריליק ומאיר את אזור הבדיקה. ניתן לכוונן את גובה לוח האור באמצעות חריצים בגבהים שונים. (ג) התא הבהיר/כהה מכיל תוספת כהה עם פתח קטן. לוח תאורת LED נמצא מעל התא. (ד) תצוגות קדמיות, צדדיות וגבוהות של ההוספה הכהה שהשתנתה. הפתח בהוספה הכהה מורחב עם חריץ קטן לתנועת כבל התיקון (משמאל למעלה). החלק העליון של התוספת הכהה משתרע על פני אזור האור כמרפסת משולשת עם מחזיק למפרק המסתובב (למעלה מימין ומשמאל תחתון). כבל התיקון של הסיבים האופטיים מחובר לצינורית הסיבים האופטיים באמצעות שרוול הזדווגות (מימין למטה). (ה) בדיקת השדה הפתוח שהשתנתה. הדוכן וההדק מחזיקים את המפרק המסתובב. התא נשלף לחזית התא כשהדלתות נותרו פתוחות כדי לאפשר תנועה חופשית של העכבר עם כבל התיקון המחובר לראש העכבר. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: ניהול CGRP היקפי מעורר סלידה קלה באור בהיר בשני זנים של עכברי בר. עכברי CD1 ו-C57/BL6J נבדקו בהתאם לציר הזמן המתואר באיור 1A. (א) הזמן שעכברים CD1 בילו באזור האור לכל מרווח של 5 דקות במשך 30 דקות (27,000 לוקס). זמן בנתוני אור מוצג לאורך זמן במהלך הבדיקה (החלונית השמאלית) וכזמן הממוצע למרווח של 5 דקות לעכברים בודדים (החלונית הימנית). ההשוואות נעשו בין הרכב ל- CGRP בכל נקודת זמן, ובין Tx ו- Pre2 או Post כפי שצוין בסוגריים מרובעים. (Veh, n = 19; 0.1 מ"ג / קילוגרם CGRP, n = 19) (B) עכברי זמן C57BL/6J בילו באזור האור לכל מרווח של 5 דקות מעל 30 דקות (27,000 לוקס). זמן בנתוני אור מוצגים לאורך זמן במהלך הבדיקה (פאנל שמאל) וכזמן הממוצע למרווח של 5 דקות לעכברים בודדים (פאנל ימני) (Veh, n = 42; 0.1 מ"ג / קילוגרם CGRP, n = 44). (ג) העכברים מלוח ב' נותחו גם למנוחה באזורים החשוכים והבהירים במהלך בדיקת האור/הכהה. (D) העכברים מלוח ב' נבדקו לאחר מכן בבדיקת השדה הפתוח. אחוז הזמן המושקע במרכז התא למרווח של 5 דקות מעל 30 דקות לאחר טיפול ברכב או CGRP (0.1 מ"ג/ק"ג, כלומר) (Veh, n = 9; 0.1 מ"ג / קילוגרם CGRP, n = 9). אחוז הזמן בנתוני המרכז מוצג לאורך זמן במהלך הבדיקה (החלונית השמאלית) וכאחוז הזמן הממוצע במרכז למרווח של 5 דקות לעכברים בודדים (החלונית הימנית). עבור כל החלוניות, מוצג ממוצע±SEM, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001. נתון זה שונה ממייסון ואח ' 201710. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: גירוי אופטי של נוירונים מבטאי CaMKIIa בגרעינים התלמיים האחוריים גורם לסלידה מאור הן באור עמום והן באור בהיר. (A) גרעינים תלמיים אחוריים של C57BL/6J מוזרקים עם קידוד AAV או ChR2 או eYFP (ב 55 lux: eYFP n = 8, ChR2 n = 11; ב 27,000 lux: eYFP n = 12, ChR2 n = 18) היו מגורה על ידי לייזר כחול (473 ננומטר, 20 הרץ, רוחב פעימה של 5 אלפיות השנייה, 10 מ"ק/מ"מ2). החלונית השמאלית מציגה את הזמן שעכברים בילו באזור האור לכל מרווח של 5 דקות במשך 30 דקות ב-55 או 27,000 לוקס. בכל נקודת זמן נערכו השוואות בין קבוצות eYFP ו- ChR2. החלונית הימנית מציגה את הזמן הממוצע למרווח של 5 דקות עבור עכברים בודדים. (B) העכברים מלוח A נותחו גם למנוחה באזורי האור (החלונית השמאלית) והכהים (החלונית הימנית) במהלך בדיקת האור/הכהה. (ג) העכברים מלוח א' נבדקו לאחר מכן בבדיקת השדה הפתוח. האחוז הממוצע של הזמן שהושקע במרכז תא השדה הפתוח למרווח של 5 דקות על פני 30 דקות (לייזר: 473 ננומטר, 20 הרץ, רוחב פעימה של 5 מילישניות, 10 mW / mm2). (eYFP n = 8, ChR2 n = 9). עבור כל החלוניות, ממוצע±SEM מוצג, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001. נתון זה משתנה מ- Sowers ואח ' 202019. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הבדיקה האור/כהה נמצאת בשימוש נרחב להערכת התנהגות דמוית חרדה12. הבדיקה מסתמכת על הסלידה המולדת של עכברים מאור ועל הדחף שלהם לחקור כאשר הם ממוקמים בסביבה חדשנית (אזור אור). עם זאת, כפי שאנו מדווחים כאן, בדיקה זו יכולה לשמש גם כדי להעריך התנהגות מרתיעה אור גם כן.

חשוב לקחת בחשבון את המספר והצורך של חשיפות מוקדמות לפני הבדיקה. זה תלוי במתח העכבר או במודל. לדוגמה, בפרוטוקול הבדיקה הבהיר/כהה שלנו, עכברי CD1 ו- C57BL/6J נאיביים נחשפים מראש לתא הבהיר/כהה פעמיים לפני שעברו את הליך בדיקת הטיפול, בעוד שעכברים אופטוגנטיים אינם עוברים חשיפה מוקדמת. פרסום שנערך לאחרונה דיווח כי חשיפה מוקדמת אחת מספיקה לעכברי CD1 כדי להציג סלידה קלה לאחר ניהול i.p. CGRP17. כתוצאה מכך, המשמעות של פרמטר החידוש תפחת עם הגעתו של יום הטיפול10,16. חשיפות מוקדמות יכולות לחשוף פנוטיפים מרתיעים לאור על ידי הפחתת כונן האקספלורציה ובכך לשנות את האיזון בין חקירה לסלידה. במקרים מסוימים, אין צורך בחשיפה מוקדמת. לדוגמה, עם עכברים שעברו שינוי גנטי עם קולטני CGRP מוגברת במערכת העצבים, חשיפה מראש לא היה צורך14. כמו כן, עם עכברים מניפולציה אופטוגנטית, שבו נוירונים מבטאים CaMKIIa בגרעין התלמי האחורי היו ממוקדים לגירוי אופטי, טרום חשיפה לא היה הכרחי, ככל הנראה משום התגובה מרתיעה אור היה כל כך חזק על גירוי ישיר של המוח19. לכן, את המספר ואת הצורך של חשיפות מראש לתא יש לשקול בזהירות בעת שימוש בזני עכבר שונים או מודלים. ואכן, חשיפת יתר של עכברים לתא עשויה להפחית את התנהגות החוקרים. זה יוביל את העכברים מעדיפים לכבוש את האזור האפל, ללא קשר לטיפול, ובכך להפחית את היכולת לצפות בתגובה מרתיעה אור. לעומת זאת, חשיפה מוקדמת לא מספקת לבדיקה עלולה להוביל להתנהגות חוקרת המסווה התנהגות פוטנציאלית מרתיעה אור.

חשיפה לאחר הטיפול משמשת לזיהוי אם עכבר התאושש לחלוטין מהזרקת CGRP שניתנה יומיים קודם לכן. זה חיוני לפני הפעלת בדיקת השדה הפתוח או כל בדיקה אחרת כדי לאשר כי אין אפקט טיפול ממושך קיים שישפיע על בדיקות התנהגותיות עתידיות.

בחרנו למשך פרוטוקול של 30 דקות בהתבסס על תצפיות קודמות10. בדקנו עכברים בבדיקה האור/כהה במשך 10 דקות15, 20 דקות 16 ו-30 דקות בנפרד . CGRP הפחית את כמות הזמן שעכברים בילו באור בין 0-30 דקות, אך אחרי 30 דקות עכברי הבקרה העדיפו לבלות יותר זמן בחושך לעומת 0-30 דקות, ולכן הובילו להחלטה לבדוק במשך 30 דקות. באופן דומה, ניתן להתאים את משך הבדיקה תוך התייחסות לעקומת תגובת הזמן עבור דגמי עכבר שונים. יש לציין כי הארכת זמן החשיפה לתא האור/כהה עשויה להפחית את המוטיבציה לחקור את אזור האור.

ניתחנו פרמטרים רבים ושונים כדי להעריך את התנהגות בעלי החיים. אחד המאפיינים החיוניים של הבדיקה האור/כהה הוא מדידה של הזמן שעכבר מבלה באזור האור, המשקף ישירות סלידה מאור. אחוז הזמן המושקע במנוחה, מספר הפסקות הקרן האנכית (למדידת פעילות גידול) באזורים בהירים או כהים, ומספר המעברים בין שני האזורים משמשים להערכת תנועתיות. זמן מנוחה ושברי קרן אנכיים מנורמלים לזמן המושקע בכל אזור על מנת להימנע ממסקנות שגויות לגבי תנועה. אנו כוללים את כל העכברים בניתוחים למעט: עכברים שנשארים באזור האור במשך כל 30 דקות הבדיקה, עכברים שמבלים מעל 90% מהזמן במנוחה בסך הכל (אזורים בהירים וכהים), וחריגים סטטיסטיים (>3 SDs מהממוצע). מספר העכברים שאינם נכללים הוא בדרך כלל פחות מ-1%. עבור בדיקת השדה הפתוח, אחוז הזמן במרכז הוא המדידה העיקרית המשמשת להערכת התנהגות דמוית חרדה.

בבדיקת האור/הכהה שהשתנתה, המיקום של צינורית הסיבים האופטיים באזורים מסוימים במוח יכול להגביל מאוד את תנועת העכבר, ובמקרים מסוימים למנוע מהעכבר להגיע לאזור האפל. כתוצאה מכך, הכניסה לאזור החשוך תתחזק באופן שלילי, ולאחר ניסיונות מרובים, העכבר עשוי להראות העדפה מלומדת לאור, אפילו להישאר באזור האור במהלך כל תקופת הבדיקה. ניתן לתקן זאת על-ידי שינוי הגודל והצורה של הפתח בהוספה הכהה. לדוגמה, כאשר צינורית סיבים אופטיים הותקנו במוח הקטן של עכברי C57BL / 6J, העכברים התקשו לחצות את פתח ההוספה הכהה. לאחר שינוי רוחב הפתח ל-6.10 ס"מ במקום 5.08 ס"מ, הצליחו העכברים לחצות את הפתח בחופשיות.

כבל תיקון סיבים אופטיים בקוטר 30.5 ס"מ משמש בבדיקת אור/כהה שהשתנתה, בהתבסס על גודל תא השדה הפתוח, ומאפשר לעכבר לנוע בחופשיות. אורך כבל קצר יותר ימנע מעכבר לנוע לפינות, בעוד שכבל ארוך יותר עלול להסתבך ולהפריע לתנועה. אורך כבל הסיבים האופטיים המשמש לבדיקת השדה הפתוח שהשתנתה הוא 50 ס"מ. האורך אינו קפדני כמו זה בבדיקה האור / כהה מאז הגובה של המפרק הסיבובי ניתן להתאים על פי אורך כבל תיקון סיבים אופטיים, להבטיח כי העכבר הוא מסוגל רק להגיע לפינות התא.

בהתבסס על ניתוחי כוח, 10-12 עכברים לכל קבוצה נדרשים עבור עכברי CD1 ו- C57BL/ 6J עם i.p. CGRP, ועבור עכברי C57BL/6J אופטוגנטיים כדי לזהות סלידה משמעותית מאור. עם זאת, גודל הקבוצה C57BL/6J היה גדול משמעותית מגודל קבוצת ה- CD1 (איור 2A,B) מכיוון שעכברי C57BL/6J לא הגיבו ל- CGRP בקבוצת משנה של הבדיקות10, כלומר נערכו בדיקות מרובות כדי להסביר את השונות הגבוהה הזו בהתנהגות מרתיעה באור בעכברים אלה. באופן ספציפי, שני ניסויים שולבו עבור עכברי CD1 וארבעה ניסויים שולבו עבור עכברי C57BL/6J עם i.p. CGRP (איור 2A, B)10. הסיבה לשונות זו אינה ידועה, אך בני אדם גם מראים שונות בתגובותיהם ל- CGRP ואור. הזרקת מיגרנה תוך ורידי (i.v.) של התקפי מיגרנה מושרה CGRP בסביבות 63 ~ 75% מחולי המיגרנה, עם 70 ~ 90% מהחולים שהציגו התקפי מיגרנה המציגים פוטופוביה22,23,24,25. בסך הכל, הבדיקה יש שונות ניכרת בנוסף למספר העכברים, זה חיוני לעשות לפחות שניים ועדיף שלושה ניסויים עצמאיים לחלוטין עם קבוצות שונות של עכברים.

מצעים אינם נדרשים בתא האור/כהה והנסיין אינו נדרש לטפל מראש בעכברים או להרגיל אותם. כאמצעי זהירות, שני הליכי טרום החשיפה משרתים את המטרה של התאקלמות העכברים לרמזים הריחיים והפיזיים של הנסיין; עם זאת, Ueno H. et al. הוכיח כי אין הבדל בזמן באור בבדיקה אור / כהה או זמן במרכז בשדה הפתוח לבדוק בין עכברים לאחר טיפול חוזר ונשנה ועכברים ללא טיפול26.

בדיקת השדה הפתוח יכולה להעריך את תרומת החרדה כלפי פנוטיפ מרתיע קל. יש עוד בדיקות הקשורות לחרדה מאומתות היטב, כגון מבוך האפס המוגבה ומבוך פלוס מוגבה27; עם זאת, בדיקת השדה הפתוח היא השליטה הרלוונטית ביותר מבחינה פרוצדורלית לפרוטוקול האור/ הכהה מכיוון שאותו תא בדיקה משמש לשתי הבדיקות. עם זאת, הערכה של חרדה ניתן לחזק על ידי ניצול בדיקות מרובות או על ידי מדידת פרמטרים מרובים במבחן אחד בהתחשב בכך חרדה היא התנהגות מסובכת ורבת פנים. חשוב לציין, גם אם אין פנוטיפ חרדה בשדה הפתוח לבדוק, זה לא פוסל מרכיב חרדה פנוטיפ מרתיע אור. לדוגמה, ייתכן שהאור מעורר תגובת חרדה. בדיקת השדה הפתוח רק מצביעה על כך שהחרדה לבדה אינה מניעה את התגובה לאור. בעוד תרופה חרדה, כגון בנזודיאזפמה, עשוי לשמש בבדיקה זו, גישה כזו תהיה סיבוכים, למשל, תרופות חרדה להשפיע על תנועה. במקום זאת, בחרנו להשתמש בתרופות קליניות נגד מיגרנה, כולל סומטריפטן, כדי לאמת את המצב דמוי המיגרנה של פנוטיפ מרתיע אור. סומטריפטן הצליח להפוך סלידה אור המושרה CGRP הן CD1 ו C57BL / 6J עכברים10.

שלא כמו בדיקת האור/הכהה שהשתנתה, התא במגירה הנפתחת נמצא מחוץ לתא עם דלתות תא פתוחות בבדיקת השדה הפתוח שהשתנתה בשל כבל התיקון המתחבר לראשו של העכבר. במקום 55 לוקס, אור החדר מגיע לרצפת התא במחיר של ~ 1000 לוקס. למרות שעוצמת האור שונה, בדיקת השדה הפתוח היא מבחן עצמאי לאור. בפירוט, הגדלת עוצמת האור מ-55 ל-27,000 לוקס בבדיקת השדה הפתוח הביאה למגמה של ירידה בזמן במרכז בעכברים C57BL/6J, דבר המצביע על כך שעוצמת האור עשויה להשפיע על התנהגות העכבר28. עם זאת, ההבדל בין קבוצות הבקרה והניסוי לא היה משמעותי מתחת לא 55 ולא 27,000 lux28. בנוסף, ההבדל בעוצמת האור בין 55 ל 1000 לוקס הוא הרבה יותר עדין מאשר בין 55 ל 27,000 לוקס. אופטוגנטיקה אלחוטית יכולה לפתור בעיה זו מכיוון שלא יהיה כבל תיקון, מה שמאפשר לדחוף את תא השדה הפתוח בתוך התא המוחלש בצליל.

בנוסף, כבל התיקון עדיין מגביל את תנועת העכבר למרות בחירת אורך אופטימלי. בעתיד, אופטוגנטיקה אלחוטית תציע חלופה לא פולשנית לטכניקות אופטוגנטיות מבוססות כבלים.

יש לציין כי השתמשנו הזרקה חריפה של CGRP, אשר רק משכפל בחלקו את שחרור CGRP ממושך המלווה התקפי מיגרנה. בעוד שהזרקנו CGRP לעכברים כדי לדגמן מיגרנה בהתבסס על ההנחה כי רמות CGRP פלזמה היו מוגברות29 וכי i.v CGRP המושרה התקפי מיגרנה בחולי מיגרנה22,23,24,24,25,30, זה לא ישכפל את המצב בחולה שבו CGRP נשמר ברמות גבוהות במשך זמן רב יחסית (מדידות המטופל נלקחו בחציון 3 שעות לאחר המיגרנה התחילה29 ), כמו גם לא לשכפל מיגרנה כרונית שבו רמות מדווחים להיות גבוה אפילו בין התקפות31. יתר על כן, מתווכים אחרים המושרים בכאב לא נבדקו בפרדיגמה שלנו.

קבוצת מוגיל שינתה את המבוך המוגבה פלוס כדי למדוד סלידה מאור בעכברים, כאשר הזרועות הסגורות מוארות באור בהיר והזרועות הפתוחות נותרו כהות32. מבוך פלוס מוגבה סטנדרטי שימש לעתים קרובות כדי לזהות התנהגות הקשורה חרדה בבעלי חיים. בדיקה זו מבוססת על הקונפליקט בין הרצון המולד של עכבר לחקור סביבה חדשנית לבין הצבתו בעמדה מתפשרת בזרועות המבוך הפתוחות והלא מוגנות. בפרוטוקול שהשתנה, עכברים נאלצים לבחור בין הזרועות הסגורות, המוארות באור בהיר, לבין הזרועות הפתוחות והלא מוגנות, שהן כהות. ההעדפה לראשון מרמזת על חרדה גוברת על סלידה קלה בעוד ההעדפה לאחרון מרמזת על סלידה קלה מקבלת עדיפות על פני חרדה. קבוצת מוגיל גם ערכה מבוך סטנדרטי מוגבה פלוס כדי להעריך התנהגות דמוית חרדה32. המטרה זהה לעריכת בדיקת השטח הפתוח בפרוטוקול שלנו. עכברים מוטנטיים Cacna1a, מודל מיגרנה חציפלגית משפחתית, הראו פוטופוביה כאשר הזרועות הסגורות היו בהירות. לעומת זאת, התנהגות דמוית חרדה לא זוהתה כאשר מבוך פלוס מוגבה סטנדרטי נערך32. בחולדות, על ידי שימוש הן במבוך מוגבה שונה פלוס ואת הבדיקה האור / כהה, הוכח כי ניטרוגליצרין (NTG) היה מסוגל לגרום פוטופוביה33,34, אשר חולץ על ידי sumatriptan34. בסביבה סטנדרטית מוגבהת בתוספת מבוך שבו האור נעדר בתוך הזרועות הסגורות, NTG המושרה התנהגות דמוית חרדה בחולדות34, מה שמרמז כי סלידה אור הנגרמת על ידי NTG מלווה חרדה. למיטב ידיעתנו, אין פרסומים המשתמשים בבדיקה האור/כהה ובמבוך המוגבה שהשתנה באותו דגם עכבר. בסך הכל, הן מבוך פלוס מוגבה שונה ואת הבדיקה האור / כהה המוצע בפרוטוקול זה הוכחו כאמצעי יעיל של התנהגות מרתיעה אור בעכברים.

אנו משתמשים בלוח LED לאור יום עם צבע מאוזן באור יום (5600K), עם התפשטות קרן הצפה של 60°, ללא הצללה בגובה של ~ 30 ס"מ מרצפת התא ב 55 לוקס או 27,000 לוקס. מחקרים אחרים שחוקרים סלידה מאור ניצלו את הבדיקה הקלה/אור עם שינויים שונים. לדוגמה, מחקרים השתמשו בעוצמות אור שונות עבור אזור האור, הנעות בין מאות לאלפי לוק35,36,37; אור משומש באורכי גל שונים (למשל כחול וצהוב)38; או השתמש בטמפרטורות שונות של אור (קר וחם)39. יש לנקוט זהירות על החום המיוצר על ידי האור שכן הוא יכול להשפיע על הטמפרטורה של האזורים הכהים והבהירים ולהפריע להתנהגות העכברים, מה שעלול לגרום להעדפה לאזור מסוים. חוץ מזה, חשוב גם להשתמש באור עם זווית צפייה טובה כדי למנוע צל על רצפת החדר. עוצמת האור חשובה גם למבחן. 25,000 -27,000 לוקס שווה בערך לאור יום בהיר. על ידי ביצוע הבדיקה האור / כהה בעוצמה כה גבוהה של אור, ניתן להגביר את אפקט הטיפול; עם זאת, חיוני לשקול את הנזק ברשתית40 ואת ההשפעה השלילית של עוצמת אור גבוהה כל כך על נכונותו של העכבר ללכת לאור. מספר מחקרים דיווחו כי עיני עכבר שנחשפו לאור ישיר41 ועכברים שנחשפו לאור בהיר במשך מספר שעות (למשל 30,000 לוקס במשך 4 שעות 4 שעות42) חוו נזק לרשתית. בבדיקת האור/הכהה, יש אזור חשוך לעכבר לברוח מהאור הבהיר אם העכבר רוצה. בנוסף, מחקרים קודמים מצאו כי עכברים בקבוצת הביקורת (עכברי C57BL/6J) בילו כמות דומה של זמן באזור האור מתחת לגיל 55, 1000 ו -27,000 lux28. עבור עכברי CD1, קבוצת הביקורת בילתה כשליש מהזמן באור מתחת ל-27,000 lux10 ונתונים שלא פורסמו הראו תוצאות דומות ב-55 לוקס. זה מרמז כי 27,000 אור לוקס בכוחות עצמו לא עושה CD1 ו C57BL / 6J עכברים במצוקה. עם זאת, יש לנקוט זהירות בעת בחירה בעוצמה גבוהה יותר של אור.

לצד הבדלים בהגדרת האור, החוקרים בחרו במגוון גישות בניתוח הנתונים הבהירים/כהים. בעת הערכת סלידה מאור, כמות הזמן המושקעת באזור האור כשהאור כבוי (או עם תאורת אור אדום של אזור האור, בהתחשב בכך שעיני עכברים פחות פתוחות לאור אדום) כלולים בחישוב. לדוגמה, מדד סלידה= (זמן באור לוקס-זמן בלוקס הקל ביותר)/ זמן בלוקס light0 שימש את קבוצת גורין להערכת סלידה קלה43. כאן, תנאי 'כיבוי' או 'אור אדום' כלולים כדי לאשר כי הימנעות מאזור האור מותנית בכך שהאור נמצא בניגוד להעדפת מקום פשוטה. ערכנו הליך זה עם הזרקת i.p. של CGRP ומצאנו כי עכברים המקבלים CGRP לא היה העדפת מקום עם אור כבוי באזור האור, המאשר כי סלידה הנגרמת CGRP תלוי אור16. לבסוף, קבוצת גורין השתמשה בזמן שעכברים בילו בפריפריה של אזור האור בבדיקת האור/הכהה כמדד לחרדה36. אנו משתמשים במבחן מסורתי לחרדה, בדיקת השדה הפתוח. לא משנה איזו שיטת ניתוח נבחרה, יש לציין כי לא ניתן להתעלם מתרומת החרדה לסלידה קלה. פרוטוקול זה מנסה לחלק התנהגות דמוית חרדה ומרתיעה לאור על ידי שימוש בבדיקות השדה הבהירות / הכהות והפתוחות במקביל.

פרוטוקול זה מתייחס לשימוש בבדיקות השדה הבהיר/הכהה והפתוח לאיתור התנהגות מרתיעה באור בעכברים. זה מספק כלי שימושי כדי לזהות את המנגנונים של מעגלים עצביים ואזורי המוח נהיגה פוטופוביה. פרדיגמת הבדיקה יכולה להיות ספציפית למיגרנה או שניתן להרחיב אותה להפרעות אחרות הכרוכות בפוטופוביה. לגבי מיגרנה, בדקנו שני neuropeptides אחרים הקשורים פתוגנזה מיגרנה: בלוטת יותרת המוח אדנילט ציקלאט-הפעלת פוליפפטיד (PACAP) ופפטיד מעיים vasoactive (VIP). PACAP ו VIP הודגמו כדי לגרום לסלידה קלה בעכברים CD1111. בנוסף למיגרנה, פוטופוביה היא גם סימפטום של הפרעות רבות אחרות, כולל ברדיופיה, פגיעה חריפה בעיניים או דלקת, תסמונות מוח טראומטיות, מחלת ליים, לבקנות וניוון חרוט36. לכן, פרדיגמת בדיקה זו מספקת כלי לחקור מנגנונים העומדים בבסיס הפרעות הקשורות לפוטופוביה. יתר על כן, זיווג שיטות אופטוגנטיות עם גישות פרמקולוגיות קונבנציונליות ללא ספק יסייע בפיתוח של טיפולים חדשניים להפרעות הקשורות לפוטופוביה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגוד אינטרסים לדווח.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מ- NIH NS R01 NS075599 ו- RF1 NS113839. התוכן אינו מייצג את התצוגות של VA או ממשלת ארצות הברית.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Activity monitor Med Assoc. Inc Software tracking mouse behavior
Customized acrylic shelf For adjusting the height of the LED panel
Dark box insert Med Assoc. Inc ENV-511
DC power supply Med Assoc. Inc SG-500T
DC regulated power supply Med Assoc. Inc SG-506
Fiber-optic cannula Doric MFC_200/ 240-0.22_4.5mm_ZF1.25_FLT
Germicidal disposable wipes Sani-Cloth SKU # Q55172
Heat Sink Wakefield 490-6K Connecting to LED panel
IR controller power cable Med Assoc. Inc SG-520USB-1
IR USB controller Med Assoc. Inc ENV-520USB
Mating sleeve Doric SLEEVE_ZR_1.25
Modified LED light panel Genaray Spectro SP-E-360D Daylight-balanced color (5600K)
Power supply MEAN WELL USA SP-320-12 Connecting to LED panel
Seamless open field chamber Med Assoc. Inc ENV-510S
Sound-attenuating cubicle Med Assoc. Inc ENV-022MD-027
Stand and clamp
Three 16-beam IR arrays Med Assoc. Inc ENV-256

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Loder, S., Sheikh, H. U., Loder, E. The prevalence, burden, and treatment of severe, frequent, and migraine headaches in US minority populations: statistics from National Survey studies. Headache. 55 (2), 214-228 (2015).
  2. Collaborators, G. B. D. H. Global, regional, and national burden of migraine and tension-type headache, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet Neurology. 17 (11), 954-976 (2018).
  3. GBD 2017 Disease and Injury Incidence and Prevalence Collaborators. Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 354 diseases and injuries for 195 countries and territories, 1990-2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. Lancet. 392 (10159), 1789-1858 (2018).
  4. international headache society. Headache classification committee of the international headache society (IHS). The international classification of headache disorders, 3rd edition. Cephalalgia. 38 (1), 1 (2018).
  5. Edvinsson, L., Haanes, K. A., Warfvinge, K., Krause, D. N. CGRP as the target of new migraine therapies - successful translation from bench to clinic. Nature Reviews Neurology. 14 (6), 338-350 (2018).
  6. Rapoport, A. M., McAllister, P. The headache pipeline: Excitement and uncertainty. Headache. 60 (1), 190-199 (2020).
  7. Maasumi, K., Michael, R. L., Rapoport, A. M. CGRP and Migraine: The role of blocking calcitonin gene-related peptide ligand and receptor in the management of Migraine. Drugs. 78 (9), 913-928 (2018).
  8. Caronna, E., Starling, A. J. Update on calcitonin gene-related peptide antagonism in the treatment of migraine. Neurologic Clinics. 39 (1), 1-19 (2021).
  9. Eftekhari, S., Edvinsson, L. Possible sites of action of the new calcitonin gene-related peptide receptor antagonists. Therapeutic Advances in Neurological Disorders. 3 (6), 369-378 (2010).
  10. Mason, B. N., et al. Induction of migraine-like photophobic behavior in mice by both peripheral and central cgrp mechanisms. Journal of Neuroscience. 37 (1), 204-216 (2017).
  11. Russell, M. B., Rasmussen, B. K., Fenger, K., Olesen, J. Migraine without aura and migraine with aura are distinct clinical entities: A study of four hundred and eighty-four male and female migraineurs from the general population. Cephalalgia. 16 (4), 239-245 (1996).
  12. Crawley, J. N. Exploratory behavior models of anxiety in mice. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 9 (1), 37-44 (1985).
  13. Crawley, J., Goodwin, F. K. Preliminary report of a simple animal behavior model for the anxiolytic effects of benzodiazepines. Pharmacology, Biochemistry and Behavior. 13 (2), 167-170 (1980).
  14. Recober, A., et al. Role of calcitonin gene-related peptide in light-aversive behavior: implications for migraine. Journal of Neuroscience. 29 (27), 8798-8804 (2009).
  15. Recober, A., Kaiser, E. A., Kuburas, A., Russo, A. F. Induction of multiple photophobic behaviors in a transgenic mouse sensitized to CGRP. Neuropharmacology. 58 (1), 156-165 (2010).
  16. Kaiser, E. A., Kuburas, A., Recober, A., Russo, A. F. Modulation of CGRP-induced light aversion in wild-type mice by a 5-HT(1B/D) agonist. Journal of Neuroscience. 32 (44), 15439-15449 (2012).
  17. Kuburas, A., et al. PACAP induces light aversion in mice by an inheritable mechanism independent of CGRP. Journal of Neuroscience. , (2021).
  18. Russo, A. F. Calcitonin gene-related peptide (CGRP): a new target for migraine. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55, 533-552 (2015).
  19. Sowers, L. P., et al. Stimulation of Posterior Thalamic Nuclei Induces Photophobic Behavior in Mice. Headache. 60 (9), 1961-1981 (2020).
  20. Afridi, S. K., et al. A positron emission tomographic study in spontaneous migraine. Archives of Neurology. 62 (8), 1270-1275 (2005).
  21. Mason, B. N., et al. Vascular actions of peripheral CGRP in migraine-like photophobia in mice. Cephalalgia. 40 (14), 1585-1604 (2020).
  22. Guo, S., Vollesen, A. L. H., Olesen, J., Ashina, M. Premonitory and nonheadache symptoms induced by CGRP and PACAP38 in patients with migraine. Pain. 157 (12), 2773-2781 (2016).
  23. Christensen, C. E., et al. Migraine induction with calcitonin gene-related peptide in patients from erenumab trials. Journal of Headache and Pain. 19 (1), 105 (2018).
  24. Younis, S., et al. Investigation of distinct molecular pathways in migraine induction using calcitonin gene-related peptide and sildenafil. Cephalalgia. 39 (14), 1776-1788 (2019).
  25. Asghar, M. S., et al. Evidence for a vascular factor in migraine. Annals of Neurology. 69 (4), 635-645 (2011).
  26. Ueno, H., et al. Effects of repetitive gentle handling of male C57BL/6NCrl mice on comparative behavioural test results. Scientific Reports. 10 (1), 3509 (2020).
  27. Campos, A. C., Fogaca, M. V., Aguiar, D. C., Guimaraes, F. S. Animal models of anxiety disorders and stress. Revista Brasileira De Psiquiatria. 35, 101-111 (2013).
  28. Kuburas, A., Thompson, S., Artemyev, N. O., Kardon, R. H., Russo, A. F. Photophobia and abnormally sustained pupil responses in a mouse model of bradyopsia. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 55 (10), 6878-6885 (2014).
  29. Goadsby, P. J., Edvinsson, L., Ekman, R. Vasoactive peptide release in the extracerebral circulation of humans during migraine headache. Annals of Neurology. 28 (2), 183-187 (1990).
  30. Lassen, L. H., et al. CGRP may play a causative role in migraine. Cephalalgia. 22 (1), 54-61 (2002).
  31. Cernuda-Morollon, E., et al. Interictal increase of CGRP levels in peripheral blood as a biomarker for chronic migraine. Neurology. 81 (14), 1191-1196 (2013).
  32. Chanda, M. L., et al. Behavioral evidence for photophobia and stress-related ipsilateral head pain in transgenic Cacna1a mutant mice. Pain. 154 (8), 1254-1262 (2013).
  33. Mahmoudi, J., et al. Cerebrolysin attenuates hyperalgesia, photophobia, and neuroinflammation in a nitroglycerin-induced migraine model in rats. Brain Research Bulletin. 140, 197-204 (2018).
  34. Farajdokht, F., Babri, S., Karimi, P., Mohaddes, G. Ghrelin attenuates hyperalgesia and light aversion-induced by nitroglycerin in male rats. Neuroscience Letters. 630, 30-37 (2016).
  35. Jacob, W., et al. Endocannabinoids render exploratory behaviour largely independent of the test aversiveness: Role of glutamatergic transmission. Genes, Brain, and Behavior. 8 (7), 685-698 (2009).
  36. Thiels, E., Hoffman, E. K., Gorin, M. B. A reliable behavioral assay for the assessment of sustained photophobia in mice. Current Eye Research. 33 (5), 483-491 (2008).
  37. Ramachandran, R., et al. Role of Toll-like receptor 4 signaling in mast cell-mediated migraine pain pathway. Molecular Pain. 15, 1744806919867842 (2019).
  38. Marek, V., et al. Implication of Melanopsin and Trigeminal Neural Pathways in Blue Light Photosensitivity in vivo. Frontiers in Neuroscience. 13, 497 (2019).
  39. Christensen, S. L. T., Petersen, S., Sorensen, D. B., Olesena, J., Jansen-Olesen, I. Infusion of low dose glyceryl trinitrate has no consistent effect on burrowing behavior, running wheel activity and light sensitivity in female rats. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 80, 43-50 (2016).
  40. De Vera Mudry, M. C., Kronenberg, S., Komatsu, S., Aguirre, G. D. Blinded by the light: retinal phototoxicity in the context of safety studies. Toxicologic Pathology. 41 (6), 813-825 (2013).
  41. White, D. A., Fritz, J. J., Hauswirth, W. W., Kaushal, S., Lewin, A. S. Increased sensitivity to light-induced damage in a mouse model of autosomal dominant retinal disease. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (5), 1942-1951 (2007).
  42. Song, D., et al. Retinal pre-conditioning by CD59a knockout protects against light-induced photoreceptor degeneration. PloS One. 11 (11), 0166348 (2016).
  43. Matynia, A., et al. Light aversion and corneal mechanical sensitivity are altered by intrinscally photosensitive retinal ganglion cells in a mouse model of corneal surface damage. Experimental Eye Research. 137, 57-62 (2015).

Tags

התנהגות גיליון 174
חקירת התנהגות דמוית מיגרנה באמצעות סלידה קלה בעכברים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, M., Mason, B. N., Sowers, L.… More

Wang, M., Mason, B. N., Sowers, L. P., Kuburas, A., Rea, B. J., Russo, A. F. Investigating Migraine-Like Behavior Using Light Aversion in Mice. J. Vis. Exp. (174), e62839, doi:10.3791/62839 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter