Summary
Gnagere er ikke i stand til å rapportere migrene symptomer. Her beskriver vi et håndterbart testparadigme (lyse/mørke og åpne feltanalyser) for å måle lysaversjon, et av de vanligste og plagsomme symptomene hos pasienter med migrene.
Abstract
Migrene er en kompleks nevrologisk lidelse preget av hodepine og sensoriske abnormiteter, som overfølsomhet overfor lys, observert som fotofobi. Selv om det er umulig å bekrefte at en mus opplever migrene, kan lysaversjon brukes som en atferdssurrogate for migrenesymptomet på fotofobi. For å teste for lysaversjon bruker vi den lyse/mørke analysen til å måle tiden mus fritt velger å bruke i enten et lyst eller mørkt miljø. Analysen har blitt raffinert ved å innføre to kritiske modifikasjoner: preeksponeringer for kammeret før du kjører testprosedyren og justerbar kammerbelysning, slik at bruk av en rekke lysintensiteter fra 55 lux til 27,000 lux. Fordi valget om å tilbringe mer tid i mørket også indikerer angst, bruker vi også en lysuavhengig angsttest, den åpne feltanalysen, for å skille angst fra lys-aversiv oppførsel. Her beskriver vi et modifisert testparadigme for de lyse/mørke og åpne feltanalysene. Anvendelsen av disse analysene er beskrevet for intraperitoneal injeksjon av calcitonin genrelatert peptid (CGRP) i to musestammer og for optogenetiske hjernestimuleringsstudier.
Introduction
Migrene er en utbredt nevrologisk sykdom, som rammer omtrent 17% av amerikanerne1 og er den nest ledende årsaken til funksjonshemming globalt2,3. Pasienter opplever hodepine som varer 4-72 timer ledsaget av minst ett av følgende symptomer: kvalme og /eller oppkast, eller fotofobi og fonofobi4. Nylige fremskritt i utviklingen av calcitonin gen-relaterte peptid (CGRP) antistoffer som nå er FDA godkjent har begynt en ny epoke for migrene behandling5,6,7. Disse antistoffene blokkerer enten CGRP eller dens reseptor og forhindrer migrene symptomer hos ca. 50% av migrene pasienter7. I løpet av det siste året har to småmolekylantagonister av CGRP-reseptoren også blitt FDA-godkjent for abortiv behandling av migrene, og to til er i rørledningen8. Til tross for denne terapeutiske fremgangen forblir mekanismer som migreneangrep forekommer fortsatt unnvikende. Områdene for CGRP-handlingen er for eksempel ikke kjent. Effekten av terapeutiske antistoffer som ikke setter pris på å krysse blod-hjernebarrieren antyder at CGRP virker på perifere steder, for eksempel meningene og / eller trigeminale ganglia. Vi kan imidlertid ikke utelukke sentrale handlinger ved omkretsorganer, som mangler en blod-hjernebarriere9. I det minste for fotofobi tror vi dette er mindre sannsynlig gitt våre resultater med lett aversjon ved hjelp av transgene nestin / hRAMP1 mus der hRAMP1 er overekspressert i nervevevet10. Forståelse av mekanismer for migrene patofysiologi vil gi nye veier til utvikling av migrene terapeutiske.
Prekliniske dyremodeller er avgjørende for å forstå sykdomsmekanismer og utvikling av nye legemidler. Migrenevurdering hos dyr er imidlertid utfordrende siden dyr ikke verbalt kan rapportere sine følelser av smerte. Gitt det faktum at 80-90% av migrenepasienter viser fotofobi11, anses lysaversjon å være en indikator på migrene i dyremodeller. Dette førte til behovet for å utvikle en analyse for å vurdere lysaversjon hos mus.
Den lyse/mørke analysen inneholder en lyssone og en mørk sone. Det er mye brukt til å måle angst hos mus basert på deres spontane utforskning av nye miljøer som motvirkes av deres medfødte aversjon mot lys12. Noen studier satte 1/3 av kammeret som den mørke sonen, mens andre satte 1/2 av kammeret som den mørke sonen. Den tidligere innstillingen brukes ofte til å oppdage angst13. Selv om vi i utgangspunktet valgte like store lyse/mørke kamre, har vi ikke sammenlignet de to relative størrelsene. Vi kan kommentere at den totale størrelsen på begge kamrene ikke er en viktig faktor siden den første testboksen14 var betydelig større enn det påfølgende apparatet15, men resultatene var i hovedsak de samme.
To kritiske modifikasjoner på denne lyse/mørke analysen for å vurdere lysaversjon var: testtilstanden og lysintensiteten (figur 1). For det første er mus forututinntatt for det lyse/mørke kammeret for å redusere utforskende stasjon16 (figur 1A). Nødvendigheten og tidene for preeksponeringer avhenger av musestammer og modeller. Wildtype C57BL/6J-mus krever vanligvis to preeksponeringer10, mens bare én preeksponering for CD1-mus er tilstrekkelig17. På denne måten kan lys-aversiv oppførsel bli umaskert i disse to musestammene. For det andre har kammerbelysningen blitt tilpasset å inkludere et justerbart utvalg av lysintensiteter fra dim (55 lux) til lys (27,000 lux) hvor 55 lux er sammenlignbar med en mørk overskyet dag, og 27,000 lux er sammenlignbar med en lys solrik dag i skyggen10. Vi har funnet ut at den nødvendige lysintensiteten varierer med belastning og genetisk modell. Av denne grunn bør enkeltpersoner først vurdere minimum lysintensitet for deres eksperimentelle paradigme.
Selv med disse modifikasjonene på analysen, som kan avsløre en lett-aversiv fenotype, er det nødvendig å teste angstlignende oppførsel for å skille mellom lysaversjon på grunn av lys alene kontra på grunn av angst. Den åpne feltanalysen er en tradisjonell måte å måle angst basert på spontan utforskning av nye miljøer. Det skiller seg fra den lyse/ mørke analysen ved at den utforskende stasjonen motvirkes av den medfødte aversjon mot ubeskyttede åpne områder. Både midten og kantene på kammeret er i lyset, så den åpne feltanalysen er en lysuavhengig angstanalyse. Dermed gjør kombinasjonen av de lyse / mørke og åpne feltanalysene oss i stand til å skille mellom lysaversjon på grunn av en unngåelse av lys kontra en generell økning i angst.
CGRP er et multifunksjonelt nevropeptid som regulerer vasodilatasjon, nociception og betennelse18. Det er mye uttrykt i perifere og sentrale nervesystemer. Det spiller en viktig rolle i migrene patofysiologi18. Mekanismen som ligger til grunn for CGRP-virkningen i migrene er imidlertid uklar. Ved å bruke de lyse/mørke og åpne feltanalysene med dette modifiserte testparadigmet kunne vi identifisere lysvillig oppførsel hos mus etter perifer 10,16 (figur 2) og sentral14,15,16,19 CGRP-administrasjon. I tillegg til nevropeptider er identifisering av hjerneregioner involvert i lett aversjon også viktig for å forstå migrene patofysiologi. De bakre thalamic kjernene er en integrerende hjerneregion for smerte og lysbehandling19, og thalamus aktiveres under migrene20. Dermed målrettet vi bakre thalamic kjerner ved å injisere adeno-assosiert virus (AAV) som inneholder channelrhodopsin-2 (ChR2) eller eYFP i denne regionen. Ved å kombinere denne optogenetiske tilnærmingen med disse to analysene, demonstrerte vi at optisk stimulering av ChR2-uttrykkende nevroner i de bakre thalamiske kjernene induserte lysaversjon19 (figur 3). I dette eksperimentet, gitt den dramatiske effekten på den fremkalte lysaversjon i disse optogenetisk manipulerte musene, ble preeksponeringer for kammeret hoppet over.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyreprosedyrer ble godkjent av University of Iowa Animal Care and Use Committee og utført i samsvar med standardene fastsatt av National Institutes of Health.
1. Lys/mørk analyse
- Lys/mørkt kammerapparat (se Materialbord) oppsett. Alt utstyret i denne delen er kommersielt tilgjengelig.
- På en hylle plasserer du det lyddemperende avlukket (innvendig: 59,7 x 38 x 35,6 cm i B x H x D) som inneholder en uttrekksskuff for enkel tilgang til kammeret og mørk innsats.
- Koble DC-strømforsyningen og en DC-regulert strømforsyning til det lyddemperende avlukket.
- Plasser det gjennomsiktige sømløse åpne feltkammeret (27,31 x 27,31 x 20,32 cm i L x B x H) på uttrekksskuffen på avlukket.
- Plasser den svarte, infrarøde (IR)-gjennomsiktige mørke plastinnsatsen (28,7 X 15 X 20,6 cm i L x B x H) i det åpne feltkammeret. Forsikre deg om at kammeret er delt inn i to soner av samme størrelse: en mørk sone og en lyssone.
- Koble tre sett med 16-stråle IR-rekker på X-, Y- og Z-aksene i det åpne feltkammeret til IR USB-kontrolleren via kabler.
- Koble IR USB-kontrolleren til en datamaskin.
- Installer sporingsprogramvaren på datamaskinen som kan registrere og samle inn museplassering og -aktivitet.
- For lyspaneloppsettet må du først fjerne lysdiodelyspanelet (27,70 x 27,70 cm i L x B; 360 lysdioder, dagslysbalansert farge, 5600K, 60° flomstrålespredning) fra det opprinnelige huset.
- Monter lyspanelet med LED-driveren, kjøleribben og strømforsyningen. Flere LED-lyspaneler kan kobles til en strømforsyning, kjøleribbe og LED-driver for å oppnå jevn lyspanelkontroll.
- Bygg en tilpasset akrylplattform (29,77 x 27,70 x 8,10 cm i L x B x H) som består av 7 identiske hyller med intervaller på 0,53 cm (figur 1B). Fest den tilpassede akrylhyllen permanent til taket inne i avlukket over kammeret.
- Sett LED-lyspanelet inn i sporet mellom de to nederste hyllene. Juster lyspanelet til forskjellige høyder (figur 1B,C), om nødvendig (f.eks. hvis du bruker optogenetiske mus. Detaljer drøfter i avsnitt 3).
- Slå på varmeavlederen, LED-driveren og strømforsyningen. Bekreft at LED-driveren kan diktere LED-lysintensiteten ved å måle lysintensiteten på kammergulvet og bekrefte at gulvet lyser jevnt.
- Prosedyre for atferdstest
MERK: Mus er plassert på en 12 timers lyssyklus. Alle atferdseksperimenter utføres under lyssyklusen. Mus, inkludert både menn og kvinner, i alderen 10-20 uker, brukes. I denne protokollen opplever naive wildtype CD1- og C57BL/6J-mus to preeksponeringer for det lyse/mørke kammeret etterfulgt av eksponering med behandling og eksponering etter behandling. Det er et tre-dagers intervall mellom hver eksponering for å tillate mus å gjenopprette (dag 1, 4, 7 og 10 som beskrevet nedenfor og figur 1A). CD1-mus krever imidlertid ikke den andre preeksponeringen og kan testes i svakt lys.- På dag 1 (forbehandling 1) slår du på det lyse/mørke analyseapparatet og setter lysintensiteten til 27 000 lux.
- Åpne sporingsprogramvaren og sett opp en ny protokoll. I innstillingen Ny protokoll setter du Varighet til 30 min. I innstillingen Ny analyse angir du Datahyller etter Varighet til 300 s.
- Velg Forhåndsdefinerte soner i innstillingen Ny sone. Velg 2 og deretter Vannrett. Sjekk om kammeret er delt inn i to like store soner horisontalt for opptak.
- Habituate mus til testrommet i 1 time før testingen. Under habituation, holde rommet lys på for ikke å forstyrre musens døgnrytme. Sørg for at alt utstyret til den lyse/mørke analysen er slått på, slik at musene kan akklimatisere seg fullt ut til testromsmiljøet.
- Velg Hent data. Angi muse-IDer. Start protokollen.
- Trekk skuffen utenfor det lyddemperende avlukket for å få tilgang til det lyse/mørke kammeret og den mørke innsatsen. Plukk forsiktig opp musen ved foten av halen, plasser den i kammerets lyssone, og skyv skuffen innsiden av avlukket. Forsikre deg om at programvaren oppdager musen umiddelbart og begynner å registrere aktivitet.
- Vent til opptaket automatisk stopper etter 30 minutter. Returner musen til hjemmeburet.
- Rengjør kammeret og mørk innsats ved hjelp av alkohol-lukt bakteriedrepende engangsservietter som inneholder 55,0% isopropylalkohol, 0,25% alkyl C12-18 dimetyl etylbenzyl ammonium, og 0,25% alkyl C12-18 dimetylbenyl ammoniumklorid som antimikrobielle aktive ingredienser for å utrydde eventuelle olfaktoriske signaler igjen av den forrige musen.
- På dag 4 (forbehandling 2) gjentar du trinn 1.2.1 til 1.2.8.
- På dag 7 (behandlingsdagen) gjentar du trinn 1.2.1 og 1.2.4. Etter habituation, administrere CGRP (0.1 mg/kg, 10 μl/g basert på musen kroppsvekt, intraperitoneal injeksjon (dvs.)), vippe musens hode fremover og injisere i nedre høyre kvadrant. Returner musen til hjemmeburet.
- Etter 30 min starter du protokollen og kjører musen i det lyse/mørke kammeret som nevnt i trinn 1.2.5 til 1.2.7. Restitusjonstiden i hjemmebur etter injeksjoner kan forkortes eller forlenges avhengig av behandlingen21.
- Rengjør kammeret og den mørke innsatsen som beskrevet i trinn 1.2.8.
- På dag 10 (etter behandlingsdag) gjentar du trinn 1.2.1 til 1.2.8. Eksperimentet kan settes på pause i trinn 1.2.13 før du starter analysen av det åpne feltet.
2. Åpen feltanalyse
- Oppsettet av apparatet
- Oppsett av åpent feltkammer: Bruk samme lyddemperavlukke og åpne feltkammer som brukes i den lyse/mørke analysen, uten å bruke den mørke innsatsen.
- Oppsett av lyspanel: Bruk det samme oppsettet som brukes i den lyse/mørke analysen. Kontroller at lysintensiteten er den samme som brukes i den lyse/mørke analysen.
- Prosedyre for atferdstest
- Slå på apparatet. Sett lysintensiteten til 27 000 lux.
- Åpne sporingsprogramvaren.
- Sett opp en ny protokoll, det samme som brukes i den lyse/mørke analysen, bortsett fra innstillingene for Ny sone . Velg 1 etterfulgt av senteret i innstillingene for Ny sone . Sett periferien som 3,97 cm fra omkretsen og midten som 19,05 × 19,05 cm.
- Habituate mus til testrommet som beskrevet i trinn 1.2.4.
- Administrer CGRP (0,1 mg/kg, 10 μl/g basert på musens kroppsvekt, dvs.), vipp musens hode fremover og injiser i nedre høyre kvadrant. Returner musen til hjemmeburet.
- Etter 30 min, start protokollen. Trekk uttrekksskuffen utenfor det lyddemperende avlukket og plasser musen forsiktig midt i det åpne feltkammeret. Skyv skuffen inn i avlukket.
- Spor oppførsel i 30 min. Returner deretter mus til deres hjemmebur.
- Rengjør apparatet som beskrevet i trinn 1.2.8.
3. Modifisert lys / mørk analyse for optogenetiske mus
- Oppsettet av apparatet
- Gjør to endringer i den mørke innsatsen.
- Endre åpningen på den mørke innsatsen til 5,08 x 5,08 cm (B x H) med en liten spalte 0,95 x 10,16 cm (B X H) mellom toppen og åpningen av den mørke innsatsen (figur 1D øverst til venstre).
MERK: Denne modifikasjonen gjør at en mus kan gå til den mørke sonen uten problemer når den fiberoptiske kanylen på musehodet er festet til patch-ledningen. - Utvid toppen av den mørke innsatsen over det lyse området som en trekantet veranda (H= 6,5 cm) (figur 1D øverst til høyre og nederst til venstre). Klipp et sirkulært hull (D= 1,7 cm) ut av verandaen og sett en holder inn i hullet for å plassere og stabilisere den roterende skjøten, som forbinder laseren og de fiberoptiske patchledningene (figur 1D øverst til venstre og nederst til venstre).
MERK: Modifikasjonene resulterer i små endringer i lysintensiteten når gulvet i den mørke sonen (17 lux med modifikasjoner vs 14 lux uten modifikasjoner, målt på bakre høyre hjørne av den mørke sonen under 27,000 lux).
- Endre åpningen på den mørke innsatsen til 5,08 x 5,08 cm (B x H) med en liten spalte 0,95 x 10,16 cm (B X H) mellom toppen og åpningen av den mørke innsatsen (figur 1D øverst til venstre).
- Sett den roterende skjøten inn i holderen på den mørke innsatsen.
- Koble den 30,5 cm fiberoptiske patchledningen til den roterende skjøten. Kontroller at den roterende skjøten kan rotere jevnt slik at patch-ledningen kan rotere uten problemer når musen krysser kammeret.
- For resten av oppsettet bruker du det samme apparatoppsettet som brukes i avsnitt 1 (lys/mørk analyse).
- Gjør to endringer i den mørke innsatsen.
- Prosedyre for atferdstest
MERK: I motsetning til wildtype-musene får de optogenetiske musene ikke preeksponering (forbehandling 1 og 2).- På testdagen setter du LED-lyspanelet inn i det nest laveste sporet (28,23 cm fra gulvet på camberen) for å gi plass til å koble til patch-ledningen. Slå på det lyse/mørke analyseapparatet og sett lysintensiteten til 55 lux.
- Bruk samme protokolloppsett som i 1.2.2 og 1.2.3, bortsett fra at Data Bins By Duration er satt til 60 s i innstillingen Ny analyse for å være kongruent med laserstimuleringsprotokollen i trinn 3.2.3.
- Slå på av/på-knappen for laser. Still inn laserpulsregulatoren til å stimulere i 1 min etterfulgt av 1 min uten stimulering over 30 min.
- Habituate mus til testrommet med lyset på i 1 time før testingen.
- Start protokollen. Trekk uttrekksskuffen utenfor det lyddemperende avlukket for å få tilgang til det lyse/mørke kammeret og den mørke innsatsen.
- Hold musen forsiktig tilbake og koble den optiske fiberkanylen på musehodet til den fiberoptiske patchledningen via en parringshylse (figur 1D nederst til høyre). Plasser musen forsiktig i lyssonen og skyv skuffen inn i avlukket. Kontroller at protokollen begynner å spille inn musevirkemåte automatisk.
- På 1 min slår du på pulsregulatoren og slår deretter failsafe-tasten til PÅ. Sørg for at laserstimulering av den målrettede hjerneregionen skjer annethvert minutt.
- Etter 30 min når protokollen stopper automatisk, slår du failsafe-tasten til AV. Slå deretter av pulsregulatoren.
- Koble fra musen og den fiberoptiske patch-ledningen. Returner musen til hjemmeburet.
- Rengjør kammeret og den mørke innsatsen som beskrevet i trinn 1.2.8.
4. Modifisert åpen feltanalyse for optogenetiske mus
- Oppsettet av apparatet
- Stabiliser den roterende skjøten over kammeret ved hjelp av et stativ og en klemme (figur 1E).
- Koble den fiberoptiske patchledningen med en lengde på 50 cm til den roterende skjøten. Kontroller om den roterende skjøten kan rotere jevnt.
- Sett den roterende skjøten i riktig høyde på stativet: Sørg for at den fiberoptiske patchledningen bare kan nå hvert hjørne av kammeret, noe som vil bidra til å unngå forstyrrelser i musebevegelsen.
- For resten av oppsettet bruker du det samme apparatoppsettet som brukes i avsnitt 1 (lys/mørk analyse), men uten den mørke innsatsen.
- Prosedyre for atferdstest
- Slå på det lyse/mørke analyseapparatet og sett lysintensiteten til 55 lux.
- Bruk samme protokolloppsett som i den endrede lyse/mørke analysen (avsnitt 3), bortsett fra innstillingene for Ny sone . Velg 1 nedenfor etter senter i Innstillinger for ny sone . Sett periferien som 3,97 cm fra omkretsen og midten som 19,05 × 19,05 cm.
- Slå på av/på-knappen for laser. Still inn laserpulsregulatoren til å stimulere i 1 min etterfulgt av 1 min uten stimulering over 30 min.
- Utfør habituation og resten av testen som beskrevet i trinn 3.2.4 til 3.2.10 bortsett fra to endringer i trinn 3.2.6: Plasser musen forsiktig midt i kammeret i stedet for lyssonen; hold uttrekksskuffen utenfor avlukket på grunn av patch-ledningen som kobles til musens hode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dette atferdsmessige testparadigmet er designet for å teste lys-aversiv oppførsel. Det kan utføres ved hjelp av både naive wildtype mus og optogenetiske mus for å undersøke lysaversjon i sanntid under stimulering av en målrettet nevron populasjon.
Denne prosedyren har blitt brukt til å studere effekten av perifer CGRP-behandling i CD1- og C57BL/6J-mus10,16 og optisk stimulering av nevroner i de bakre thalamic kjernene i C57BL/6J mus19 på lys-aversiv oppførsel. Mus, inkludert både menn og kvinner i alderen 10-20 uker, ble brukt i forsøkene (figur 2A, figur 2B-D og figur 3). Resultatene viste at i.p. injeksjon av CGRP reduserte varigheten av tiden som ble brukt i lyssonen i den lyse/mørke analysen i CD1 (figur 2A) og C57BL/6J (figur 2B) mus betydelig, men påvirket ikke tiden musene tilbrakte i midten i det åpne feltanalysen i CD1 (data vist ikke) og C57BL/6J mus (figur 2D)10, 16. Dette antyder at perifer CGRP induserer lett aversjon, men ikke generell angst. Behandling med CGRP økte også tiden musene hvilte i den mørke sonen, men ikke i lyssonen i både CD1 (data ikke vist) og C57BL/6J mus (figur 2C).
For den optogenetiske protokollen målrettet vi calmodulin kinase II alfa (CaMKIIa)-uttrykkende nevroner i de bakre thalamic kjernene ved å injisere AAV2-CaMKIIa-hChR2 (E123A)-eYFP eller kontrollviruset AAV2-CaMKIIa-eYFP19. Samtidig ble en fiberoptisk kanyle implantert i de bakre thalamic kjernene. Tre uker etter injeksjon for å gi tilstrekkelig tid til ChR2-uttrykk, utførte vi optisk stimulering av nevroner i de bakre thalamiske kjernene og noterte en tilsvarende reduksjon i varigheten musene brukte i lyssonen i den lyse / mørke analysen hos ChR2-injiserte mus sammenlignet med kontroll av virusinjiserte mus (eYFP) (figur 3A). Det var ingen bemerket forskjell i tiden i midten i det åpne feltet analysen mellom ChR2 og kontroll eYFP mus (figur 3C), noe som indikerer en lett-aversiv respons som ikke bare var drevet av angst19. Videre ble det også notert en økning i hviletiden i den mørke sonen, men ikke i lyssonen (figur 3B). De samme resultatene ble oppnådd ved bruk av 55 lux og 27 000 lux (figur 3). 55-lux-prosedyren ble inkludert fordi migrenepasienter er følsomme selv for svakt lys.
Figur 1: Den lyse/mørke analysetidslinjen og apparatet. (A) Tidslinje for testparadigmet: Etter to preeksponeringer for det lyse/mørke kammeret (pre 1 og pre 2) administreres mus CGRP (0,1 mg/kg, dvs.) etterfulgt av en måling etter behandling (Post). Minst en dag etter den lyse/mørke analysen får mus CGRP (0,1 mg/kg, dvs.) igjen og kjøres i det åpne feltet. Pre: forbehandling; Tx: behandling; Innlegg: etterbehandling (B) LED-panelet holdes øverst i kammeret med en akrylhylle og lyser opp testområdet. Høyden på lyspanelet kan justeres ved å bruke spor i forskjellige høyder. (C) Det lyse/mørke kammeret inneholder en mørk innsats med en liten åpning. Et LED-lyspanel er over kammeret. (D) Forside-, side- og toppvisning av den endrede mørke innsatsen. Åpningen i den mørke innsatsen er utvidet med en liten spalte for bevegelse av patchledningen (øverst til venstre). Toppen av den mørke innsatsen strekker seg over lysområdet som en trekantet veranda med en holder for rotatorleddet (øverst til høyre og nederst til venstre). Den optiske fiberplastledningen er koblet til den fiberoptiske kanylen via en parringshylse (nederst til høyre). (E) Den endrede åpne feltanalysen. Stativet og klemmen holder rotatorleddet. Kammeret trekkes ut til forsiden av avlukket med dørene igjen åpne for å tillate fri bevegelse av musen med patch-ledningen festet til musehodet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Ekstern CGRP-administrasjon fremkaller lysaversjon i sterkt lys i to stammer av villtypemus. CD1- og C57/BL6J-mus ble testet i henhold til tidslinjen beskrevet i figur 1A. (A) Tiden CD1-mus tilbrakte i lyssonen per 5 minutters intervall over 30 min (27 000 lux). Tid i lysdata vises over tid under testen (venstre panel) og som gjennomsnittstid per 5 minutters intervall for individuelle mus (høyre panel). Sammenligninger ble gjort mellom kjøretøy og CGRP på hvert tidspunkt, og mellom Tx og Pre2 eller Post som angitt av braketter. (Veh, n=19; 0,1 mg/kg CGRP, n=19) (B) Tid C57BL/6J mus tilbrakt i lyssonen per 5 min intervall over 30 min (27,000 lux). Tid i lysdata vises over tid under testen (venstre panel) og som gjennomsnittlig tid per 5 minutters intervall for individuelle mus (høyre panel) (Veh, n = 42; 0,1 mg / kg CGRP, n = 44). (C) Musene fra panel B ble også analysert for hvileatferd i de mørke og lyse sonene under den lyse/mørke analysen. (D) Musene fra panel B ble senere testet i den åpne feltanalysen. Prosentandelen av tid brukt i midten av kammeret per 5 min intervall over 30 min etter behandling med kjøretøy eller CGRP (0,1 mg/kg, dvs.) (Veh, n=9; 0,1 mg/kg CGRP, n=9). Prosentandelen av tid i senterdataene vises over tid under testen (venstre panel) og som gjennomsnittlig prosentandel av tiden i midten per 5 minutters intervall for individuelle mus (høyre panel). For alle paneler vises middelverdi±SEM, *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, ****p<0,0001. Denne figuren er modifisert fra Mason et al. 201710. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Optisk stimulering av CaMKIIa-uttrykkende nevroner i de bakre thalamiske kjernene induserer lysaversjon i både svakt og sterkt lys. (A) Bakre thalamic kjerner av C57BL/6J mus injisert med AAV koding enten ChR2 eller eYFP (ved 55 lux: eYFP n = 8, ChR2 n = 11; ved 27,000 lux: eYFP n = 12, ChR2 n = 18) ble stimulert av blå laser (473 nm, 20 Hz, 5 ms pulsbredde, 10 mW/mm2). Venstre panel viser tiden musene brukte i lyssonen per 5 min intervall over 30 min ved 55 eller 27,000 lux. Det ble gjort sammenligninger mellom eYFP- og ChR2-grupper på hvert tidspunkt. Høyre panel viser gjennomsnittlig tid per 5 min intervall for individuelle mus. (B) Musene fra panel A ble også analysert for hvileatferd i lyssonene (venstre panel) og mørke (høyre panel) under den lyse/mørke analysen. (C) Musene fra panel A ble senere testet i den åpne feltanalysen. Gjennomsnittlig prosentandel av tiden som brukes i midten av det åpne feltkammeret per 5 min intervall over 30 min (Laser: 473 nm, 20 Hz, 5 ms pulsbredde, 10 mW / mm2). (eYFP n = 8, ChR2 n = 9). For alle paneler vises middelverdi±SEM, *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, ****p<0,0001. Denne figuren er modifisert fra Sowers et al. 202019. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den lyse/mørke analysen er mye brukt til å vurdere angstlignende atferd12. Analysen er avhengig av medfødt aversjon av mus til lys og deres drivkraft for å utforske når de plasseres i et nytt miljø (lyssone). Men som vi rapporterer her, kan denne analysen også brukes til å vurdere lys-aversiv oppførsel også.
Det er viktig å vurdere antall og nødvendighet av preeksponering før testing. Dette avhenger av musens belastning eller modell. For eksempel, i vår lyse / mørke analyseprotokoll, er naive wildtype CD1- og C57BL/6J-mus pre-utsatt for det lyse / mørke kammeret to ganger før de gjennomgår behandlingstestprosedyren, mens optogenetiske mus ikke gjennomgår preeksponering. En nylig publikasjon rapporterte at en preeksponering er tilstrekkelig for at CD1-mus skal kunne vise lysaversjon etter i.p. CGRP-administrasjon17. Følgelig vil betydningen av nyhetsparameteren ha blitt redusert ved ankomst av behandlingsdagen10,16. Preeksponeringer kan avdekke lys-aversive fenotyper ved å redusere utforskende drivkraft og dermed endre balansen mellom leting og aversjon. I noen tilfeller er det ikke nødvendig med preeksponering. For eksempel, med genetisk endrede mus med økte CGRP-reseptorer i nervesystemet, var preeksponering ikke nødvendig14. På samme måte, med optogenetisk manipulerte mus, der CaMKIIa-uttrykkende nevroner i de bakre thalamiske kjernene var rettet mot optisk stimulering, var preeksponering ikke nødvendig, antagelig fordi den lette aversive responsen var så robust ved direkte stimulering av hjernen19. Dermed må antallet og nødvendigheten av preeksponeringer til kammeret vurderes nøye når du bruker forskjellige musestammer eller modeller. Faktisk kan overeksponering av mus til kammeret redusere utforskende oppførsel. Dette vil føre til at musene fortrinnsvis okkuperer den mørke sonen, uavhengig av behandling, derav reduserer evnen til å observere en lysvillig respons. På den annen side kan utilstrekkelig preeksponering for analysen føre til utforskende atferd som maskerer potensiell lysvillig oppførsel.
En eksponering etter behandling tjener til å identifisere om en mus har fullstendig gjenopprettet fra CGRP-injeksjonen administrert 2 dager før. Dette er viktig før du kjører den åpne feltanalysen eller en annen analyse for å bekrefte at det ikke er noen langvarig behandlingseffekt som vil påvirke fremtidige atferdstester.
Vi valgte en 30-minutters protokollvarighet basert på tidligere observasjoner10. Vi har testet mus i den lyse/mørke analysen i 10 min15, 20 min16 og 30 min10 separat. CGRP reduserte tiden musene brukte i lyset mellom 0-30 min, men etter 30 minutter foretrakk kontrollmusene å tilbringe mer tid i mørket sammenlignet med 0-30 min, noe som dermed førte til beslutningen om å teste i 30 minutter. På samme måte kan testvarigheten justeres med referanse til tidsresponskurven for forskjellige musemodeller. Det skal bemerkes at forlengelse av eksponeringstiden for det lyse/mørke kammeret kan redusere motivasjonen for å utforske lyssonen.
Vi analyserte mange forskjellige parametere for å vurdere dyreatferden. Et viktig trekk ved den lyse/mørke analysen er en måling av tiden en mus tilbringer i lyssonen, som direkte reflekterer lysaversjon. Prosentandelen av tid brukt hvile, antall vertikale strålebrudd (for å måle oppdrettsaktivitet) i lyse eller mørke soner, og antall overganger mellom de to sonene brukes til å vurdere motilitet. Hviletid og vertikale strålebrudd normaliseres til tiden som brukes i hver sone for å unngå falske konklusjoner om bevegelse. Vi inkluderer alle mus i analysene unntatt: mus som forblir i lyssonen for hele 30 min med testing, mus som bruker over 90% av tiden på å hvile totalt (både lyse og mørke soner), og statistiske outliers (>3 SDer fra gjennomsnittet). Antall mus som er utelukket er generelt mindre enn 1%. For den åpne feltanalysen er prosentandelen av tid i midten hovedmålingen som brukes til å vurdere angstlignende oppførsel.
I den modifiserte lyse/mørke analysen kan plasseringen av den fiberoptiske kanylen i enkelte hjerneregioner i stor grad begrense musebevegelsen og i noen tilfeller forhindre at musen når den mørke sonen. Følgelig vil inngang i den mørke sonen bli negativt forsterket, og etter flere forsøk kan musen vise en lært preferanse for lyset, selv om den forblir i lyssonen i hele testperioden. Dette kan rettes opp ved å endre størrelsen og formen på åpningen i den mørke innsatsen. Som et eksempel, da fiberoptisk kanyle ble installert i cerebellum av wildtype C57BL / 6J mus, hadde musene problemer med å krysse åpningen av den mørke innsatsen. Etter å ha endret bredden på åpningen til 6,10 cm i stedet for 5,08 cm, kunne musene krysse åpningen fritt.
En 30,5 cm fiberoptisk patchledning brukes i den modifiserte lyse/ mørke analysen, basert på størrelsen på det åpne feltkammeret, slik at musen kan bevege seg fritt. En kortere ledningslengde vil forhindre at en mus beveger seg til hjørnene, mens en lengre kabel kan floke og hindre bevegelse. Lengden på den fiberoptiske patchledningen som brukes til den modifiserte åpne feltanalysen er 50 cm. Lengden er ikke så streng som den i den lyse / mørke analysen siden høyden på den roterende skjøten kan justeres i henhold til lengden på den fiberoptiske patchkabelen, og sikrer at musen bare kan nå hjørnene av kammeret.
Basert på kraftanalyser er det nødvendig med 10-12 mus per gruppe for CD1- og C57BL/6J-mus med i.p. CGRP, og for optogenetiske C57BL/6J-mus for å oppdage betydelig lysaversjon. Imidlertid var C57BL /6J-gruppestørrelsen betydelig større enn CD1-gruppestørrelsen (figur 2A,B) fordi C57BL/6J-musene ikke reagerte på CGRP i et delsett av testene10, noe som betyr at flere tester ble utført for å ta hensyn til denne høye variasjonen i lys-aversiv oppførsel hos disse musene. Spesielt ble to eksperimenter kombinert for CD1-musene, og fire eksperimenter ble kombinert for C57BL/6J-mus med i.p. CGRP (figur 2A,B)10. Årsaken til denne variasjonen er ikke kjent, men mennesker viser også variasjon i deres respons på CGRP og lys. Intravenøs (i.v.) injeksjon av CGRP indusert migrene angrep hos rundt 63 ~ 75% av migrene pasienter, med 70 ~ 90% av pasientene som viste migrene angrep viser photophobia22,23,24,25. Til sammen har analysen betydelig variasjon, og i tillegg til antall mus er det viktig å gjøre minst to og helst tre helt uavhengige eksperimenter med forskjellige kohorter av mus.
Sengetøy er ikke nødvendig i det lyse/mørke kammeret, og eksperimentet er ikke nødvendig for å pre-håndtere eller habituate musene. Som et forsiktighetstiltak tjener de to preeksponeringsprosedyrene formålet med å akklimatisere musene til eksperimentets olfaktoriske og fysiske signaler; Ueno H. et al. viste imidlertid at det ikke er noen forskjell i tid i lys i den lyse/mørke analysen eller tiden i midten i det åpne feltanalysen mellom mus etter gjentatt håndtering og mus uten håndtering26.
Den åpne feltanalysen kan vurdere bidraget av angst mot en lettvillig fenotype. Det er andre godt validerte angstrelaterte analyser, for eksempel den forhøyede null labyrinten og den forhøyede pluss labyrinten27; Imidlertid er den åpne feltanalysen den mest prosedyremessig relevante kontrollen til den lyse / mørke protokollen siden det samme testkammeret brukes til begge analysene. Likevel kan en vurdering av angst styrkes ved å bruke flere analyser eller ved å måle flere parametere i en enkelt test gitt at angst er en komplisert og mangesidig oppførsel. Viktig, selv om det ikke er noen angst fenotype i det åpne feltet analyse, utelukker dette ikke en angstkomponent til den lette aversive fenotypen. For eksempel kan lys utløse en angstrespons. Den åpne feltanalysen indikerer bare at angst alene ikke driver responsen på lys. Mens et anxiolytisk stoff, som benzodiazepame, kan brukes i denne analysen, vil en slik tilnærming ha komplikasjoner, for eksempel påvirker anxiolytiske legemidler bevegelse. I stedet valgte vi å bruke kliniske anti-migrene medisiner, inkludert sumatriptan, for å validere migrene-lignende status av lys-aversive fenotype. Sumatriptan reverserte vellykket CGRP-indusert lysaversjon i både CD1- og C57BL/6J-mus10.
I motsetning til den modifiserte lyse/mørke analysen, er kammeret på uttrekksskuffen utenfor avlukket med avlukkedører åpne i den modifiserte åpne feltanalysen på grunn av patchledningen som kobles til musens hode. I stedet for 55 lux når romlyset gulvet i kammeret på ~ 1000 lux. Selv om lysintensiteten er forskjellig, er den åpne feltanalysen en lysuavhengig test. I detalj, øke lysintensiteten fra 55 til 27,000 lux i det åpne feltet analysen resulterte i en trend av en nedgang i tid i sentrum i C57BL / 6J mus, noe som tyder på at lysintensiteten kan påvirke musens oppførsel28. Forskjellen mellom kontroll- og eksperimentelle grupper var imidlertid ikke signifikant under verken 55 eller 27 000 lux28. I tillegg er forskjellen i lysintensitet mellom 55 og 1000 lux langt mer subtil enn mellom 55 og 27 000 lux. Trådløs optogenetikk kan løse dette problemet, da det ikke ville være noen patch-ledning, slik at det åpne feltkammeret kan skyves innsiden av det lyddemperende avlukket.
I tillegg begrenser patch-ledningen fortsatt musebevegelsen til tross for at du velger en optimal lengde. I fremtiden vil trådløs optogenetikk tilby et ikke-invasivt alternativ til kabelbaserte optogenetiske teknikker.
Det skal bemerkes at vi brukte akutt injeksjon av CGRP, som bare replikerer delvis den langvarige CGRP-utgivelsen som følger med migreneangrep. Mens vi injiserte CGRP i mus for å modellere migrene basert på forutsetningen om at plasma CGRP-nivåene ble økt29 og at i.v CGRP induserte migreneangrep hos migrenepasienter22,23,24,25,30, Dette vil ikke gjenskape tilstanden hos pasienten der CGRP opprettholdes på høye nivåer i relativt lang tid (pasientmålinger ble tatt med en median 3 timer etter at migrene startet29 ), og det replikerer heller ikke kronisk migrene der nivåer rapporteres å være forhøyet selv mellom angrep31. Videre har andre smerteinduserte meglere ikke blitt testet i vårt paradigme.
Mogil-gruppen modifiserte den forhøyede pluss labyrinten for å måle lysaversjon hos mus, med de lukkede armene opplyst av sterkt lys og de åpne armene forblir mørke32. Standard forhøyet pluss labyrint har ofte blitt brukt til å oppdage angstrelatert oppførsel hos dyr. Denne analysen er basert på konflikten mellom musens medfødte ønske om å utforske et nytt miljø og bli plassert i en kompromissløs posisjon i de åpne ubeskyttede labyrintarmene. I den modifiserte protokollen blir mus tvunget til å velge mellom de lukkede armene, som er opplyst med sterkt lys, og de åpne ubeskyttede armene, som er mørke. Preferansen til førstnevnte antyder at angst overstyrer lysaversjon, mens preferansen til sistnevnte antyder at lett aversjon har forrang over angst. Mogil-gruppen gjennomførte også en standard forhøyet pluss labyrint for å evaluere angstlignende oppførsel32. Formålet er det samme som å gjennomføre det åpne feltanalysen i vår protokoll. Cacna1a mutantmus, en familiær hemiplegisk migrenemodell, viste fotofobi da de lukkede armene var lyse. I motsetning ble angstlignende oppførsel ikke oppdaget da standard forhøyet pluss labyrint ble utført32. Hos rotter, ved å bruke både den modifiserte forhøyede pluss labyrinten og den lyse / mørke analysen, ble det demonstrert at nitroglyserin (NTG) var i stand til å indusere fotofobi33,34, som ble reddet av sumatriptan34. I standard forhøyet pluss labyrintinnstilling der lys er fraværende i de lukkede armene, induserte NTG angstlignende oppførsel hos rotter34, noe som tyder på at NTG-indusert lysaversjon er ledsaget av angst. Så vidt vi vet er det ingen publikasjoner som bruker den lyse/mørke analysen og den modifiserte forhøyede labyrinten i samme musemodell. Alt i alt har både den modifiserte forhøyede pluss labyrinten og den lyse / mørke analysen foreslått i denne protokollen blitt demonstrert som effektive mål på lys-aversiv oppførsel hos mus.
Vi bruker dagslys LED-panelet med en dagslysbalansert farge (5600K), med en 60 ° flomstråle spredt, noe som gir ingen skygge i en høyde på ~ 30 cm fra gulvet i kammeret på enten 55 lux eller 27,000 lux. Andre studier som undersøker lysaversjon har benyttet den lyse/mørke analysen med varierende modifikasjoner. For eksempel har studier brukt forskjellige lysintensiteter for lyssonen, alt fra hundrevis til tusenvis av lux35,36,37; brukt lys ved forskjellige bølgelengder (f.eks. blå og gul)38; eller brukte forskjellige lystemperaturer (kald og varm)39. Forsiktighet bør tas for varmen som produseres av lyset, siden det kan påvirke temperaturen i de mørke og lyse sonene og forstyrre musenes oppførsel, noe som potensielt kan forårsake en preferanse til en bestemt sone. Dessuten er det også viktig å bruke lyset med en god synsvinkel for å unngå skygge på gulvet i kammeret. Lysintensitet er også viktig for testen. 25.000 -27.000 lux tilsvarer omtrent sterkt dagslys. Ved å gjennomføre den lyse/mørke analysen med så høy lysintensitet, er det mulig å forsterke behandlingseffekten; Det er imidlertid viktig å vurdere netthinneskaden40 og den negative effekten av en så høy lysintensitet på musens vilje til å gå inn i lyset. Noen studier rapporterte at museøyne utsatt for direkte lys41 og mus utsatt for sterkt lys i flere timer (f.eks. 30 000 lux i 4 timer42) opplevde retinal skade. I den lyse/mørke analysen er det en mørk sone for musen å unnslippe fra det sterke lyset hvis musen ønsker det. I tillegg fant tidligere studier at mus i kontrollgruppen (C57BL/6J mus) tilbrakte en lignende tid i lyssonen under 55, 1000 og 27.000 lux28. For CD1-mus brukte kontrollgruppen omtrent 1/3 av tiden i lyset under 27 000 lux10 og upubliserte data hadde vist lignende resultater ved 55 lux. Det antyder at 27.000 lux lys på egen hånd ikke gjør CD1 og C57BL / 6J mus bekymret. Likevel bør det utvises forsiktighet når du velger en høyere lysintensitet.
Ved siden av forskjeller i lyssetting har forskerne valgt en rekke tilnærminger for å analysere de lyse/mørke dataene. Ved vurdering av lysaversjon er tiden som brukes i lyssonen med lyset slått av (eller med rødt lysbelysning av lyssonen, gitt at musenes øyne er mindre mottakelige for rødt lys) inkludert i beregningen. For eksempel ble aversjonsindeks = (tid i lys0 lux-tid i lysest lux)/ tid i lys0 lux brukt av Gorin-gruppen til å vurdere lysaversjon43. Her er "lys av" eller "rødt lys" inkludert for å bekrefte at unngåelsen av lyssonen er betinget av at lys er til stede i motsetning til enkel stedspreferanse. Vi utførte denne prosedyren med i.p. injeksjon av CGRP og fant ut at mus som mottar CGRP ikke hadde en stedspreferanse med lys av i lyssonen, og bekreftet at CGRP-indusert aversjon er lysavhengig16. Til slutt brukte Gorin-gruppen tiden musene tilbrakte i periferien av lyssonen i den lyse / mørke analysen som et mål på angst36. Vi bruker en tradisjonell test for angst, den åpne feltanalysen. Uansett hvilken analysemetode som er valgt, bør det bemerkes at bidraget av angst til lett aversjon ikke kan ignoreres. Denne protokollen forsøker å skille ut angstlignende og lys-aversiv oppførsel ved å bruke de lyse / mørke og åpne feltanalysene i tandem.
Denne protokollen tar for seg bruken av de lyse/mørke og åpne feltanalysene for påvisning av lys-aversiv oppførsel hos mus. Dette gir et nyttig verktøy for å identifisere mekanismene til nevrale kretser og hjerneregioner som driver fotofobi. Testparadigmet kan være migrenespesifikk eller kan utvides til andre lidelser som involverer fotofobi. Med hensyn til migrene har vi testet to andre nevropeptider assosiert med migrenepatogenese: hypofyse adenylatcyklaseaktiverende polypeptid (PACAP) og vasoaktiv tarmpeptid (VIP). PACAP og VIP ble demonstrert for å indusere lysaversjon hos CD1-mus17,21. I tillegg til migrene er fotofobi også et symptom på mange andre lidelser, inkludert bradyopsi, akutt okulær skade eller betennelse, traumatiske hjernesyndromer, Lyme sykdom, albinisme og kjegledystrofi36. Dermed gir dette testparadigmet et verktøy for å undersøke mekanismer som ligger til grunn for fotofobirelaterte lidelser. Videre vil sammenkoblingen av optogenetiske metoder med konvensjonelle farmakologiske tilnærminger utvilsomt hjelpe til med utviklingen av nye terapeutiske midler for fotofobirelaterte lidelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å rapportere.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra NIH NS R01 NS075599 og RF1 NS113839. Innholdet representerer ikke synspunktene til VA eller USAs regjering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Activity monitor | Med Assoc. Inc | Software tracking mouse behavior | |
| Customized acrylic shelf | For adjusting the height of the LED panel | ||
| Dark box insert | Med Assoc. Inc | ENV-511 | |
| DC power supply | Med Assoc. Inc | SG-500T | |
| DC regulated power supply | Med Assoc. Inc | SG-506 | |
| Fiber-optic cannula | Doric | MFC_200/ 240-0.22_4.5mm_ZF1.25_FLT | |
| Germicidal disposable wipes | Sani-Cloth | SKU # Q55172 | |
| Heat Sink | Wakefield | 490-6K | Connecting to LED panel |
| IR controller power cable | Med Assoc. Inc | SG-520USB-1 | |
| IR USB controller | Med Assoc. Inc | ENV-520USB | |
| Mating sleeve | Doric | SLEEVE_ZR_1.25 | |
| Modified LED light panel | Genaray Spectro | SP-E-360D | Daylight-balanced color (5600K) |
| Power supply | MEAN WELL USA | SP-320-12 | Connecting to LED panel |
| Seamless open field chamber | Med Assoc. Inc | ENV-510S | |
| Sound-attenuating cubicle | Med Assoc. Inc | ENV-022MD-027 | |
| Stand and clamp | |||
| Three 16-beam IR arrays | Med Assoc. Inc | ENV-256 |
References
- Loder, S., Sheikh, H. U., Loder, E. The prevalence, burden, and treatment of severe, frequent, and migraine headaches in US minority populations: statistics from National Survey studies. Headache. 55 (2), 214-228 (2015).
- Collaborators, G. B. D. H. Global, regional, and national burden of migraine and tension-type headache, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet Neurology. 17 (11), 954-976 (2018).
- GBD 2017 Disease and Injury Incidence and Prevalence Collaborators. Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 354 diseases and injuries for 195 countries and territories, 1990-2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. Lancet. 392 (10159), 1789-1858 (2018).
- international headache society. Headache classification committee of the international headache society (IHS). The international classification of headache disorders, 3rd edition. Cephalalgia. 38 (1), 1 (2018).
- Edvinsson, L., Haanes, K. A., Warfvinge, K., Krause, D. N. CGRP as the target of new migraine therapies - successful translation from bench to clinic. Nature Reviews Neurology. 14 (6), 338-350 (2018).
- Rapoport, A. M., McAllister, P. The headache pipeline: Excitement and uncertainty. Headache. 60 (1), 190-199 (2020).
- Maasumi, K., Michael, R. L., Rapoport, A. M. CGRP and Migraine: The role of blocking calcitonin gene-related peptide ligand and receptor in the management of Migraine. Drugs. 78 (9), 913-928 (2018).
- Caronna, E., Starling, A. J. Update on calcitonin gene-related peptide antagonism in the treatment of migraine. Neurologic Clinics. 39 (1), 1-19 (2021).
- Eftekhari, S., Edvinsson, L. Possible sites of action of the new calcitonin gene-related peptide receptor antagonists. Therapeutic Advances in Neurological Disorders. 3 (6), 369-378 (2010).
- Mason, B. N., et al. Induction of migraine-like photophobic behavior in mice by both peripheral and central cgrp mechanisms. Journal of Neuroscience. 37 (1), 204-216 (2017).
- Russell, M. B., Rasmussen, B. K., Fenger, K., Olesen, J. Migraine without aura and migraine with aura are distinct clinical entities: A study of four hundred and eighty-four male and female migraineurs from the general population. Cephalalgia. 16 (4), 239-245 (1996).
- Crawley, J. N. Exploratory behavior models of anxiety in mice. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 9 (1), 37-44 (1985).
- Crawley, J., Goodwin, F. K. Preliminary report of a simple animal behavior model for the anxiolytic effects of benzodiazepines. Pharmacology, Biochemistry and Behavior. 13 (2), 167-170 (1980).
- Recober, A., et al. Role of calcitonin gene-related peptide in light-aversive behavior: implications for migraine. Journal of Neuroscience. 29 (27), 8798-8804 (2009).
- Recober, A., Kaiser, E. A., Kuburas, A., Russo, A. F. Induction of multiple photophobic behaviors in a transgenic mouse sensitized to CGRP. Neuropharmacology. 58 (1), 156-165 (2010).
- Kaiser, E. A., Kuburas, A., Recober, A., Russo, A. F. Modulation of CGRP-induced light aversion in wild-type mice by a 5-HT(1B/D) agonist. Journal of Neuroscience. 32 (44), 15439-15449 (2012).
- Kuburas, A., et al. PACAP induces light aversion in mice by an inheritable mechanism independent of CGRP. Journal of Neuroscience. , (2021).
- Russo, A. F. Calcitonin gene-related peptide (CGRP): a new target for migraine. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55, 533-552 (2015).
- Sowers, L. P., et al. Stimulation of Posterior Thalamic Nuclei Induces Photophobic Behavior in Mice. Headache. 60 (9), 1961-1981 (2020).
- Afridi, S. K., et al. A positron emission tomographic study in spontaneous migraine. Archives of Neurology. 62 (8), 1270-1275 (2005).
- Mason, B. N., et al. Vascular actions of peripheral CGRP in migraine-like photophobia in mice. Cephalalgia. 40 (14), 1585-1604 (2020).
- Guo, S., Vollesen, A. L. H., Olesen, J., Ashina, M. Premonitory and nonheadache symptoms induced by CGRP and PACAP38 in patients with migraine. Pain. 157 (12), 2773-2781 (2016).
- Christensen, C. E., et al. Migraine induction with calcitonin gene-related peptide in patients from erenumab trials. Journal of Headache and Pain. 19 (1), 105 (2018).
- Younis, S., et al. Investigation of distinct molecular pathways in migraine induction using calcitonin gene-related peptide and sildenafil. Cephalalgia. 39 (14), 1776-1788 (2019).
- Asghar, M. S., et al. Evidence for a vascular factor in migraine. Annals of Neurology. 69 (4), 635-645 (2011).
- Ueno, H., et al. Effects of repetitive gentle handling of male C57BL/6NCrl mice on comparative behavioural test results. Scientific Reports. 10 (1), 3509 (2020).
- Campos, A. C., Fogaca, M. V., Aguiar, D. C., Guimaraes, F. S. Animal models of anxiety disorders and stress. Revista Brasileira De Psiquiatria. 35, 101-111 (2013).
- Kuburas, A., Thompson, S., Artemyev, N. O., Kardon, R. H., Russo, A. F. Photophobia and abnormally sustained pupil responses in a mouse model of bradyopsia. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 55 (10), 6878-6885 (2014).
- Goadsby, P. J., Edvinsson, L., Ekman, R. Vasoactive peptide release in the extracerebral circulation of humans during migraine headache. Annals of Neurology. 28 (2), 183-187 (1990).
- Lassen, L. H., et al. CGRP may play a causative role in migraine. Cephalalgia. 22 (1), 54-61 (2002).
- Cernuda-Morollon, E., et al. Interictal increase of CGRP levels in peripheral blood as a biomarker for chronic migraine. Neurology. 81 (14), 1191-1196 (2013).
- Chanda, M. L., et al. Behavioral evidence for photophobia and stress-related ipsilateral head pain in transgenic Cacna1a mutant mice. Pain. 154 (8), 1254-1262 (2013).
- Mahmoudi, J., et al. Cerebrolysin attenuates hyperalgesia, photophobia, and neuroinflammation in a nitroglycerin-induced migraine model in rats. Brain Research Bulletin. 140, 197-204 (2018).
- Farajdokht, F., Babri, S., Karimi, P., Mohaddes, G. Ghrelin attenuates hyperalgesia and light aversion-induced by nitroglycerin in male rats. Neuroscience Letters. 630, 30-37 (2016).
- Jacob, W., et al. Endocannabinoids render exploratory behaviour largely independent of the test aversiveness: Role of glutamatergic transmission. Genes, Brain, and Behavior. 8 (7), 685-698 (2009).
- Thiels, E., Hoffman, E. K., Gorin, M. B. A reliable behavioral assay for the assessment of sustained photophobia in mice. Current Eye Research. 33 (5), 483-491 (2008).
- Ramachandran, R., et al. Role of Toll-like receptor 4 signaling in mast cell-mediated migraine pain pathway. Molecular Pain. 15, 1744806919867842 (2019).
- Marek, V., et al. Implication of Melanopsin and Trigeminal Neural Pathways in Blue Light Photosensitivity in vivo. Frontiers in Neuroscience. 13, 497 (2019).
- Christensen, S. L. T., Petersen, S., Sorensen, D. B., Olesena, J., Jansen-Olesen, I. Infusion of low dose glyceryl trinitrate has no consistent effect on burrowing behavior, running wheel activity and light sensitivity in female rats. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 80, 43-50 (2016).
- De Vera Mudry, M. C., Kronenberg, S., Komatsu, S., Aguirre, G. D. Blinded by the light: retinal phototoxicity in the context of safety studies. Toxicologic Pathology. 41 (6), 813-825 (2013).
- White, D. A., Fritz, J. J., Hauswirth, W. W., Kaushal, S., Lewin, A. S. Increased sensitivity to light-induced damage in a mouse model of autosomal dominant retinal disease. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (5), 1942-1951 (2007).
- Song, D., et al. Retinal pre-conditioning by CD59a knockout protects against light-induced photoreceptor degeneration. PloS One. 11 (11), 0166348 (2016).
- Matynia, A., et al. Light aversion and corneal mechanical sensitivity are altered by intrinscally photosensitive retinal ganglion cells in a mouse model of corneal surface damage. Experimental Eye Research. 137, 57-62 (2015).
